快速構建目標基因高表達的哺乳動物細胞株的體系和方法
2023-07-19 10:05:51
專利名稱：快速構建目標基因高表達的哺乳動物細胞株的體系和方法
技術領域：
本發明涉及應用突變與重組技術篩選可擴增性的高轉錄活性位點，並在位點處插入標記的方法。本發明還涉及應用位點特異性重組機制快速構建並獲得目標基因高表達的哺乳動物細胞系的方法，即應用重組酶識別和切割一對重組信號序列(整合標記載體與靶向表達載體各具有一個)，完成位點特異性重組，實現目標基因的穩定高表達。本發明還涉及本發明方法中的整合標記載體和靶向表達載體以及包括整合標記載體、靶向表達載體、重組酶載體以及出發哺乳動物細胞株的體系。
背景技術：
隨著基因工程技術的飛速發展，已有許多重組蛋白作為藥物用於臨床，在眾多重組蛋白質表達系統中，原核和酵母表達系統雖然成本低，但往往不能正確裝配、摺疊與糖基化，難以表達具有生物學功能的哺乳動物蛋白。而這恰恰是哺乳動物細胞表達系統的優勢，重組蛋白在這些系統的表達無一例外的涉及遺傳物質的重新組合和分配。
遺傳物質可以通過幾種不同的獨立機制發生重組，包括同源重組、位點特異性重組、以及非同源重組、異常重組。同源重組涉及那些序列極其類似的DNA片斷之間的重組，同源序列沿其鏈形成配對，然後鏈與鏈之間發生交叉與交換，交叉可以發生在同源片段中的任何位點。重組效率與同源序列的長度，序列的相同程度，以及構建體中同源與非同源DNA的比例成正比。一般來說至少需要2～10千鹼基對，或更大。
位點特異性重組涉及遺傳物質在預定位點的交換，在該反應中，重組酶蛋白結合到重組信號序列上，形成一個鏈的斷裂，進而發生DNA鏈的交換。位點特異性重組由三部分組成，重組酶蛋白、重組信號序列與輔助因子，有些系統僅由前兩個組分組成，而不需要輔助因子，例如，FRT/flp系統、Loxp/Cre系統。重組信號序列一般很短，大約為幾十個鹼基，所以對這種DNA構建體進行操作比同源重組的大片斷而言更容易。
非同源重組和異常重組，發生在沒有顯著序列同源性的遺傳物質之間，其交叉點不發生在位點特異性重組序列處，外源DNA在非同源位點處整合到染色體，造成染色體的易位或缺失，通過末端連接、雙鏈斷裂修復、橋斷裂以及轉染序列的連環化完成重組。
為獲得穩定轉染的哺乳動物細胞系，實現目標基因高水平持續性的表達，非同源重組的方式被大量採用，穩定轉染的哺乳動物細胞系的產生通常包括以下步驟；將克隆有目標基因以及藥物抗性基因的DNA載體導入宿主細胞，隨後在藥物的存在下選擇培養已成功整合外源DNA的細胞，在大多數的應用中，目標基因與在藥物作用下可使相鄰基因拷貝數增加的選擇性標記相聯，編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因是最常見的標記基因。在DHFR的競爭性抑制劑氨甲碟呤的存在下培養細胞會因DHFR基因的擴增導致DHFR的產量增加。DHFR基因擴增的同時，其側翼區的DNA序列也可被擴增，擴增的範圍可長達幾十千鹼基，由於目標基因與DHFR基因相連，所以目標基因也得到了大量擴增，拷貝數的增加導致蛋白質產量的增加，從而實現日標基因高水平表達。儘管此方法已被證明是成功的，但非同源性重組具有很大的局限性，例如不具有靶向性，受整合的位置效應控制，適合整合併具有很高轉錄活性的位點在染色體上數量很少，常需要從上萬個轉染子中篩選穩定高表達細胞系，而且獲得的過程最少需要半年的時間，可控性非常差。
非同源重組的問題可通過同源重組或位點特異性重組來克服，因為這兩種重組方式均具有很強的靶向性，1998年美國艾德公司使用同源重組快速實現重組蛋白的表達，其專利為將基因整合至哺乳動物細胞特定位點的方法及所用載體(中國專利申請號98804988.0)。雖然同源重組在酵母和其它真菌生物中自然發生重組的頻率很高，但在高等真核生物中，此類重組的機率極低，在哺乳動物細胞中，同源重組發生的頻率是非同源重組發生頻率的百分之一到五千分之一。另外，發生同源重組的頻率高低受同源片段長度的影響，一般至少需要2～10千鹼基，或更大，實際採用的一般都超過了10千鹼基，對這種分子量的DNA構建體的操作十分麻煩。本發明與之不同的是採用非同源重組和位點特異性重組兩種機制實現重組蛋白的高效表達。
發明內容
本發明一方面涉及一種整合標記載體，它包括以下元件或序列A.顯性選擇標記；
B.篩選標記；C.一或多個擴增基因；D.在微生物中增殖的遺傳元件；E.重組信號序列；其中，篩選標記和顯性選擇標記以融合蛋白形式表達，啟動子和融合蛋白之間插入重組信號序列，起始密碼子ATG位於重組信號序列之前，共同受控於一個弱化的啟動子；而擴增基因也採用弱化的病毒啟動子。
在優選的實施方案中，調控融合蛋白表達的弱化啟動子是弱化的病毒啟動子。調控所述擴增基因和融合蛋白表達的啟動子可以相同，也可以不同。
本發明另一方面涉及一種靶向表達載體，它包括以下元件或序列A.顯性選擇標記；B.在微生物中增殖的遺傳元件；C.重組信號序列；D.目標基因表達盒；E.真核生物病毒的複製起點，其中，該載體中的顯性選擇標記不同於本發明的整合標記載體中的顯性選擇標記，該顯性選擇標記基因沒有啟動子和起始密碼子；重組信號序列插入顯性選擇標記之前，該重組信號序列與本發明的整合標記載體中的重組信號序列相同。
在優選的實施方案中，所述載體中的目標基因表達盒包括SP163增強子、CMV立早基因啟動子、內質網膜信號肽、目標基因序列和牛生長激素腺苷酸加尾信號。
本發明再一方面涉及基因組中含有可擴增高轉錄活性位點的細胞株的構建方法，包括以下步驟A.將本發明的整合標記載體在非關鍵的位置處線性化，以不影響所有元件的正常功能為準，然後使用該線性化載體通過非同源重組機制轉化出發哺乳動物細胞株；B.利用針對顯性選擇標記的選擇壓力篩選步驟A獲得的轉化細胞，獲得整合標記載體在基因組較高轉錄活性位點處整合的克隆；C.測定步驟B獲得的克隆的篩選標記基因表達量，獲得篩選基因高表達的克隆，即整合標記載體插入基因組中高轉錄活性位點處的克隆；
D.利用針對擴增基因的選擇壓力篩選步驟C獲得的克隆，獲得擴增基因被擴增的克隆，即基因組中含有可擴增的高轉錄活性位點的細胞株。
在本發明的該方法，步驟B和D中的選擇壓力可以是逐步增加的。
本發明又一方面涉及獲得目標基因高表達的哺乳動物重組細胞株的方法，包括以下步驟A.利用本發明的基因組中含有可擴增高轉錄活性位點的細胞株的構建方法獲得基因組中含有可擴增的高轉錄活性位點的細胞株；B.用本發明的靶向表達載體和重組酶表達載體以超螺旋形式共轉染步驟A獲得的細胞株，所述重組酶表達載體瞬時表達位點特異性重組酶，該重組酶催化靶向表達載體和整合在基因組上的整合標記載體在重組信號序列處發生位點特異性重組；C.利用針對靶向表達載體中選擇標記的選擇壓力篩選步驟B獲得的轉染克隆，獲得目標基因插入擴增基因側翼的克隆，即目標基因高表達的哺乳動物重組細胞株。
在優選的實施方案中，本發明獲得目標基因高表達的哺乳動物重組細胞株的方法還包括以下步驟D利用針對擴增基因的選擇壓力篩選步驟C獲得的克隆，獲得目標基因高表達的哺乳動物重組細胞株。
在更加優選的實施方案中，本發明的獲得目標基因高表達的哺乳動物重組細胞株的方法還包括以下步驟E對步驟C或者步驟D獲得的目標基因高表達的哺乳動物重組細胞株進行傳代。所述步驟E可以在選擇壓力下進行。所述選擇壓力是針對擴增基因的選擇壓力。該選擇壓力可以是逐步增加的。
本發明還涉及一種快速構建高分泌重組蛋白細胞株的體系，該體系包括A.本發明的整合標記載體；B.本發明的靶向表達載體；C.重組酶表達載體，該重組酶表達載體可瞬時表達位點特異性重組酶，所述重組酶可以催化整合在出發哺乳動物細胞株基因組上的整合標記載體與靶向表達載體在重組信號序列處發生位點特異性重組；D.出發哺乳動物細胞株。
所述出發哺乳動物細胞株可以選自CHO-dhfr-、COS、Hela、NIH3T3和NS0骨髓瘤細胞。
圖1A整合標記載體pTGS-FRT-DHFR示意圖。
SV40啟動子弱化的SV40病毒早期啟動子ATG起始密碼子FRT siteFlp重組酶識別與切割位點LacZ-Zeocin融合蛋白(β-半乳糖苷酶與腐草黴素抗性蛋白)bla氨苄抗性基因dhfr二氫葉酸還原酶基因pUC origin大腸桿菌複製子圖1BFRT重組信號序列示意圖。
圖2pWS3載體示意圖。
ori大腸桿菌複製子bla氨苄抗性基因dhfr二氫葉酸還原酶(DHFR)基因pMT-1金屬硫蛋白I啟動子VK抗體輕鏈可變區序列CK抗體Kappa鏈恆定區序列VH抗體重鏈可變區序列CH1/FcIgG1型抗體恆定區序列圖3pCMV-VKH-SARS示意圖。
ColEI ori大腸桿菌複製子bla氨苄抗性基因sp163增強子pCMV人巨細胞病毒立早啟動子VK抗體輕鏈可變區序列CK抗體Kappa鏈恆定區序列VH抗體重鏈可變區序列CH1/hinge/CH2/CH3IgG1型抗體恆定區序列dhfr二氫葉酸還原酶(DHFR)基因pA牛生長激素腺苷酸加尾信號
SV40pASV40病毒多聚腺苷酸加尾信號圖4靶向表達載體pTGS-site示意圖。
目標基因表達盒子FRTFlp重組酶識別與切割位點hgr潮黴素磷酸轉移酶基因ori大腸桿菌複製子bla氨苄抗性基因圖5IgG1型抗體表達盒子(pTGS-SARS1-site屬於此種類型)。
pCMV人巨細胞病毒立早啟動子VK抗體輕鏈可變區序列CK抗體Kappa鏈恆定區序列VH抗體重鏈可變區序列CH1/hinge/CH2/CH3IgG1型抗體恆定區序列pA牛生長激素腺苷酸加尾信號圖6IgG1型抗體表達盒子(pTGS-GL-site屬於此種類型)。
pCMV人巨細胞病毒立早啟動子sp163增強子VK抗體輕鏈可變區序列CK抗體Kappa鏈恆定區序列VH抗體重鏈可變區序列CH1/hinge/CH2/CH3IgG1型抗體恆定區序列pA牛生長激素腺苷酸加尾信號圖7Fab抗體表達盒子(pTGS-MH-140屬於此種類型)。
pCMV人巨細胞病毒立早啟動子VK抗體輕鏈可變區序列CK抗體Kappa鏈恆定區序列VH抗體重鏈可變區序列CH1IgG1型抗體恆定區序列pA牛生長激素腺苷酸加尾信號圖8Western Blot雜交。
APierce公司生產人IgG；BSARS抗體；CCD20抗體圖9流式細胞分析(FACS)及間接免疫螢光結果圖。
左圖陰性對照右圖CD20抗體圖10普通轉染方法與本申請轉染方法傳代次數與克隆陽性率的比較。
圖11穩定分泌抗SARS抗體細胞株抗體累積分泌量圖。
圖12穩定分泌抗SARS抗體細胞株倍增曲線和存活率。
a未加壓細胞株倍增曲線b加壓細胞株倍增曲線c未加壓細胞株存活率 d加壓細胞株存活率圖13亞克隆細胞株倍增曲線和存活率。
圖14亞克隆細胞株抗體累積分泌量曲線。
表1ELISA分析瞬時轉染靶向表達載體抗體分泌量表2CHO-DZ工程細胞株加壓前後β-半乳糖苷酶活性表3普通轉染方法與本申請轉染方法的比較結果具體實施方式
本發明提供了快速篩選並獲得哺乳動物細胞基因組可擴增性的轉錄活性位點，並在此位點處插入標記的方法。本發明還提供了經由位點特異性重組將所需外源DNA整合至哺乳動物細胞基因組內靶位點的新方法。應用該方法可重複實現不同目標基因的高表達。
具體而言，首先用整合標記載體，將標記插入哺乳動物基因組可擴增性的轉錄活性位點，接著用靶向表達載體和重組酶表達載體雙質粒共轉染哺乳動物細胞，使目標基因在位點特異性重組系統的作用下整合至基因組的標記處，通過擴增基因的擴增作用，快速增加基因拷貝數，實現基因高表達。
整合標記載體本申請的整合標記載體包括以下元件或序列。
第一，顯性選擇標記。該顯性選擇標記有助於分離和鑑定通過非同源重組機制將整合標記載體插入到基因組的細胞。顯性選擇標記的例子包括編碼下列物質的基因印度異壁鏈黴菌腐草黴素抗性(Sh ble)、潮黴素磷酸轉移酶(hph)、新黴素抗性(neo)、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)、嘌呤黴素(pac)、二氫乳清酸酶穀氨醯胺合成酶(GS)、組氨酸D(hisD)、氨甲醯磷酸合成酶(CAD)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、天冬氨酸轉氨甲醯酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(gpt)和腺苷脫氨酶(ada)。
第二，篩選標記。篩選標記能使含有載體的細胞分離出來，而不需要給它們施加藥物或其它選擇壓力。篩選標記的例子包括編碼細胞表面蛋白質、螢光蛋白和酶的基因。包含載體的細胞可以通過流式細胞儀(FACS)利用細胞表面蛋白螢光標記的抗體或者用被載體編碼的酶轉化為螢光產物的底物來分離，或者通過酶與底物的特異性反應來選擇。
第三，一或多個擴增基因。擴增基因的存在，使細胞具有克服相應藥物致死效應的能力，但隨著藥物濃度的升高，含有較少擴增基因拷貝的細胞無法抵禦藥物的作用而死亡，只有含有較多擴增基因拷貝的細胞才能存活下來，並形成集落，從而挑選出包括拷貝數增加的整合標記載體的細胞。擴增標記的例子包括，但不限於，二氫葉酸還原酶(DHFR)、腺苷脫氨酶(ada)、二氫乳清酸酶穀氨醯胺合成酶(GS)和氨甲醯磷酸合成酶(CAD)。要實現基因擴增，不同系統對宿主細胞的要求不同，例如常見的系統，二氫葉酸還原酶(DHFR)/氨甲喋呤(MTX)系統需要突變的細胞系作為宿主細胞，二氫乳清酸酶穀氨醯胺合成酶(GS)/甲硫氨酸(MSX)系統不需要突變的細胞系。
第四，在微生物中增殖的遺傳元件，例如微生物的複製起始點和抗生素抗性標記。
第五，重組信號序列，包括，但不限於FRT、Loxp、AttB/AttP。
在該整合標記載體中，調控序列包括啟動子和增強子等元件。通常調控序列上含有轉錄因子的結合位點，所述轉錄因子例如TATA結合蛋白，CAAT結合蛋白，SP-1，AP-1。調控序列的來源可以是細胞基因組或病毒基因組。細胞調控序列的例子包括，但不限於，金屬硫蛋白I基因、免疫球蛋白基因、酪蛋白I基因。病毒調控序列的例子包括，但不限於，巨細胞病毒(CMV)立早基因、SV40基因、腺病毒晚期基因、皰疹病毒基因的調控元件。在優選實施方案中，調控序列是病毒啟動子。
本申請的有利之處在於將篩選標記和顯性選擇標記以融合蛋白形式表達，共同受控於一個弱化的啟動子，降低轉錄活性和使翻譯受損，這樣當宿主細胞處於針對顯性選擇標記藥物的最低致死濃度下，那些整合標記載體插入位點為低轉錄活性位點的克隆，便不能抵禦藥物的作用而死亡，只有整合在轉錄活性較高的位置處的克隆才能生存，再通過篩選標記基因表達量的測定，挑選表達量高的克隆，這些克隆為整合標記載體插入到基因組高轉錄活性位點的克隆。
本申請的有利之處在於擴增基因採用弱化的病毒啟動子，這樣在很低濃度的藥物作用下就可以達到很高濃度藥物作用才能達到的基因拷貝數，既快速又節省藥物。例如用氨甲喋呤來選擇二氫葉酸還原酶(DHFR)基因的擴增，不使用弱化啟動子的情況下，氨甲喋呤的濃度需要達到1-100nM，為起始藥物濃度的1000倍左右，才能達到滿意的拷貝數。由於藥物濃度的使用是逐級增加的，這樣藥物選擇的過程，長達半年，甚至更長的時間。採用本申請的方法，氨甲喋呤的濃度僅需達到0.01-1nM，為起始藥物濃度的10倍，最多需要兩個月的時間，基因就可擴增達到滿意的拷貝數。
雖然本申請採用非同源重組實現整合標記載體的整合，但是有利之處在於篩選並獲得高轉錄活性位點是十分快速的，只需通過藥物即可淘汰絕大多數低轉錄活性位點處的整合，而普通的非同源重組需要從幾千個克隆中去除淘汰低轉錄活性位點的整合。
本申請的另一有利之處在於在啟動子和融合蛋白之間插入重組信號序列，而且起始密碼子ATG位於重組信號序列之前。
靶向表達載體本申請的靶向表達載體包括以下元件或序列。
第一，顯性選擇標記。該顯性選擇標記不同於整合標記載體中的顯性選擇標記，可以是以下例子中的一種，印度異壁鏈黴菌腐草黴素抗性(Shble)、潮黴素磷酸轉移酶(hph)、新黴素抗性(neo)、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)、嘌呤黴素(pac)、二氫乳清酸酶穀氨醯胺合成酶(GS)、組氨酸D(hisD)、氨甲醯磷酸合成酶(CAD)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、天冬氨酸轉氨甲醯酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(gpt)和腺苷脫氨酶(ada)。
第二，在微生物中增殖的遺傳元件，例如微生物的複製起始點和抗生素抗性標記。
第三，與整合標記載體相同的重組信號序列，包括，但不限於FRT、Loxp、AttB/AttP。
第四，待大量表達的目標基因表達盒。所述目標基因包括，但不限於免疫球蛋白基因，細胞表面受體，胞內受體，激素，細胞因子，生長因子，轉錄因子，酶等。該表達盒中的調控序列包括啟動子和增強子等元件。通常調控序列上含有轉錄因子的結合位點，所述轉錄因子例如TATA結合蛋白，CAAT結合蛋白，SP-1，AP-1。調控序列的來源可以是細胞基因組或病毒基因組。細胞調控序列的例子包括，但不限於，金屬硫蛋白I基因、免疫球蛋白基因、酪蛋白I基因。病毒調控序列的例子包括，但不限於，巨細胞病毒(CMV)立早基因、SV40基因、腺病毒晚期基因、皰疹病毒基因的調控元件。在優選實施方案中，調控序列是病毒啟動子。
第五，真核生物病毒的複製起點。病毒複製起點的存在使得靶向表達載體可作為游離體短時間存在於細胞中，在短時間內載體拷貝數劇增，瞬時高表達目標基因，有利之處在於在三天內可獲得大量的目標基因蛋白，用於下遊分析，以及評價載體經各種改造後，是否對目標基因的表達不產生影響。有用的病毒複製起點的例子包括，但不限於SV40ori和EBV ori。
本申請的有利之處在於在靶向表達載體上顯性選擇標記前插入重組信號序列，該顯性選擇標記基因沒有啟動子和起始密碼子，只有當靶向表達載體和整合標記載體之間發生了正確的位點特異性重組，這樣整合標記載體上的啟動子和起始密碼子可以啟動顯性選擇標記的表達，在靶向表達載體的選擇標記藥物壓力下，細胞才能生存。這樣就快速完成發生正確位點重組的克隆篩選。
根據本申請的優選實施方案，目標基因表達盒中，啟動子是CMV立早基因啟動子，增強子是SP163，信號肽是內質網膜信號肽，加尾信號是牛生長激素腺苷酸加尾信號。此種表達盒子，可以實現目標基因的高表達。
重組酶表達載體重組酶表達載體可商購於invitrogen或promega公司，該載體可瞬時高表達位點特異性重組酶，重組酶表達載體包括以下元件。
第一，在微生物中增殖的遺傳元件，例如微生物的複製起始點和抗生素抗性標記。
第二，重組酶基因表達盒子，包括病毒啟動子，重組酶基因，腺苷酸加尾信號。
重組酶表達載體與靶向表達載體共轉染到宿主細胞後，重組酶載體表達重組酶，導致靶向表達載體整合在基因組重組信號序列處，一旦靶向表達載體整合進基因組，則不再需要重組酶，相反，過多的重組酶會造成靶向表達載體從基因組中切割下來。正因為如此，本申請選用的重組酶表達載體缺乏靶向表達載體的顯性選擇標記，因此，隨著細胞的傳代，這種質粒會較快的丟失。
含有可擴增的高轉錄活性位點的細胞株的構建首先將整合標記載體在非關鍵的位置處線性化，以不影響所有元件的正常功能為標準，採用非同源重組機制，利用本領域已知方法將載體導入細胞(如CHO-dhfr-、COS、Hela、NIH 3T3、NS0骨髓瘤細胞等)，導入方法包括，但不限於，電穿孔、磷酸鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖、脂質體轉染。在整合標記載體上同時採用了兩個弱化的啟動子，第一個是篩選標記和顯性選擇標記融合蛋白的啟動子，第二個是擴增基因的弱化病毒啟動子。在選擇壓力存在的情況下，應用第一個啟動子的弱化功能可以快速挑選出較高轉錄活性位點處整合的克隆。由於採用了這種策略，使篩選成功率達到十分之一左右。然後，測定整合標記載體隨機插入的克隆的篩選標記基因表達量，篩選標記基因表達量高的克隆即為整合標記載體插入基因組中高轉錄活性位點處的克隆。
雖然高轉錄活性位點的獲得可以實現外源基因的高表達，但是表達量並未達到滿意的程度，解決的有效方法之一是實現高轉錄活性位點處基因的拷貝數劇增，甚至達到上千的拷貝數。但不是所有的轉化細胞系都可以經受染色體特定位點DNA在局部重複循環複製，只有部分轉化細胞系能經受那些區域產生數千拷貝的轉染基因，另外，不同的轉錄活性位點其允許基因拷貝數增加的能力差異很大，因此，實現外源基因在此區域的高表達，有必要首先篩選出具有高擴增性的高轉錄活性位點，減少轉化細胞系構建的盲目性。
本申請有利之處在於當快速篩選到高轉錄活性位點後，由於第二個弱化啟動子的使用，隨後即可以快速篩選到具有可擴增性的高轉錄活性位點，篩選成功的比例大約在四十分之一左右。整合標記載體將標記插入到基因組可擴增的高轉錄活性位點的細胞為含有擴增的高轉錄活性位點的細胞株。
目標基因高表達的重組哺乳動物細胞株的構建獲得了含有可擴增的高轉錄活性位點的細胞株後，接著用靶向表達載體和重組酶表達載體以超螺旋形式共轉染該細胞株，利用位點特異性重組機制，採用本領域已知方法將載體導入細胞，這些方法包括，但不限於，電穿孔、磷酸鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖、脂質體轉染。
單獨使用靶向表達載體和重組酶表達載體，細胞不表現出靶向表達載體上的顯性選擇標記抗性，這樣，在靶向表達載體的選擇標記藥物壓力下，細胞不能生存。只有當靶向表達載體和整合標記載體之間發生了正確的位點特異性重組，細胞才能生存，生長的克隆即為插入到可擴增性轉錄活性位點的克隆。通過靶向表達載體的插入，目標基因實現了與擴增基因相鄰的目的。
在含有一或多種選擇試劑的選擇培養基中培養細胞。每次增加藥物濃度均可得到一些抗性集落，可以挑選出單個集落並鑑定擴增標記和目的基因的拷貝數，分析目的基因的表達，挑選出目的基因表達水平最高的單個克隆用於在更高藥物濃度下的進一步的擴增。
本申請的有利之處在於僅需要很少輪次的藥物濃度升高篩選，即可實現普通轉染細胞系在最高藥物濃度才能達到的目標基因的擴增拷貝數。本申請的有利之處還在於已經在靶向表達載體轉染細胞前，在可擴增性轉錄活性位點處插入了重組信號序列。因此，使用本申請的方法和系統，待表達的目標基因的擴增和高表達實現的可能性為100％，而普通的轉染法卻只有萬分之一左右。
以下通過具體實例來具體說明本申請的技術方案。為了說明本申請的優越效果，在實例中選擇了表達難度高於一般蛋白的大分子量抗體。
應用實例1整合標記載體pTGS-FRT-DHFR和靶向標記載體pTGS-SARS1-site或pTGS-CD20-site的構建實例構建使用的材料和方法本實例所使用的生物材料包括COS7；293T；Escherichia coliXL1-Blue(購自invitrogen)；pFRT/lacZeo2、pOG44、pcDNA5/FRT、pcDNA3.1/hgr+(購自invitrogen)；pWS3、pWSD3、pTGS-VKH(北京天廣實生物技術有限公司)、pGEM-T easy(購自promega)。限制性內切酶購自Acc65I、ApaLI、BglII、BssHII、EcoNI、MfeI、NaeI、PciI、PmlI、PmeI、SnaBI(購自New England Biolabs)；ApaI、BamHI、BglII、EcoO65I、EcoRI、EcoRV、HindIII、NcoI、NdeI、PstI、PvuII、SacII、XbaI、XhoI(購自Takara公司)。T4DNA連接酶、klenow片段、T4DNA聚合酶、鹼性磷酸酶；蛋白預染分子量標準(購自NewEngland Biolabs)；Premix Taq(購自Takara公司)；Lipofextamine 2000、Platinum Pfx聚合酶(購自invitrogen)；DNA分子量標準DL2000、DLl5000(購自Takara公司)；Gene ruler 1Kb DNA梯度分子量標準；DNA片段純化回收試劑盒購自Qiagen；質粒抽提試劑盒購自promega與博大泰克。
本實例電轉感受態的製備，引物設計、片段回收與純化、DNA的酶切與連接、片段的補平與去磷酸化均可參考分子克隆第二版(冷泉港實驗室)。
整合標記載體pTGS-FRT-DHFR(圖1)，其中含有第一，一個顯性選擇標記基因印度異壁鏈黴菌腐草黴素抗性基因(Shble)，該基因蛋白賦予細胞抵禦Zeocin抗生素的能力。
第二，一個篩選標記β-半乳糖苷酶基因。
第三，一個擴增基因二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，擴增基因採用弱化的SV40病毒啟動子，該啟動子刪除其中一個72bp增強子序列(-321～-250)，將另一個72bp增強子序列的5～7位鹼基由TGG突變為GTT(-245～-243)，該擴增基因表達盒子來源於本公司已有的載體pWS3。該擴增基因及其啟動子可以位於載體上任何位置，只要不影響其他元件的功能即可。
第四，在微生物中增殖的遺傳元件，複製起始點ColE1和表達氨苄青黴素抗性的bla基因。
第五，重組信號序列FRT。
在該載體中，按轉譯方向，依次是病毒SV40弱化啟動子(缺失98個鹼基增強子序列(-321～-224))，起始密碼子ATG，重組信號序列FRT，篩選標記β-半乳糖苷酶基因，顯性選擇標記印度異壁鏈黴菌腐草黴素抗性基因。篩選標記和顯性選擇標記形成融合蛋白，融合蛋白的第一個起始密碼子即為重組信號序列前的起始密碼子ATG。FRT重組信號序列為34bp，包括三個13bp反向重複序列，一個8bp的核心序列，鏈的切割和連接發生在8bp序列的兩側(圖1B)。
靶向表達載體pTGS-SARS1-site(圖4、圖5)與pTGS-CD20-site(圖4、圖6)，其中第一，含有與整合標記載體完全相同的重組信號序列FRT。
第二，含有在微生物中增殖的遺傳元件，複製起始點ColE1和表達氨苄青黴素抗性的bla基因。
第三，含有一個顯性選擇標記潮黴素磷酸轉移酶(hph)基因，該基因前為重組信號序列FRT，整個盒子無啟動子和起始密碼子，但有加尾信號。它的表達依賴於靶向表達載體與整合在基因組的整合標記載體之間的正確重組。兩個相同的FRT重組信號序列在重組酶(FLP)的作用下發生位點特異性重組，兩條鏈交換的結果使篩選標記β-半乳糖苷酶基因前的啟動子和起始密碼子直接放置在潮黴素磷酸轉移酶(hph)基因前，形成完整的表達讀框，賦予細胞抵禦潮黴素的能力。
第四，目標基因表達盒子分別為抗體基因輕鏈的表達盒子和IgG1型抗體的重鍊表達盒子。抗體基因輕鏈的表達盒子，按轉譯方向依次是SP163增強子，CMV立早基因啟動子，內質網膜信號肽，輕鏈可變區，輕鏈恆定區，牛生長激素腺苷酸加尾信號。IgG1型抗體的重鍊表達盒子按轉譯方向依次是SP163增強子，CMV立早基因啟動子，內質網膜信號肽，重鏈可變區，重鏈恆定區，牛生長激素腺苷酸加尾信號。
第五，包含真核生物病毒完整的複製起點SV40ori。由於含有SV40複製起點，該載體在293T，COS7以及中華倉鼠卵巢細胞CHO中均可實現瞬時高表達。表1ELISA分析靶向表達載體的瞬時轉染結果，瞬時轉染採用普通的脂質體轉染方法。
靶向表達載體pTGS-SARS1-site，插入來源於人靶向庫中篩選的抗體基因，表達抗體是人源SARS抗體。該載體不僅在COS7細胞中有很高的瞬時表達量，在CHO-dhfr-細胞中同樣能達到μg/mL的瞬時表達量。表中數據為三次瞬時轉染的ELISA結果。
靶向表達載體pTGS-GL-site，表達人-鼠嵌合IgG1抗體-抗CD20抗體，該抗體序列為NCBI公開抗體序列ZH7，該載體在293T細胞中有很高的瞬時表達量，表中數據為三次瞬時轉染的ELISA結果。
靶向表達載體pTGS-MH-140-site，抗體基因來源於雜交瘤p140，表達人-鼠嵌合Fab抗體。該載體在293T細胞中有較高的瞬時表達量，表中數據為三次瞬時轉染的ELISA結果。
ELISA分析方法將羊抗人Fab或IgG抗體用包被液稀釋，100μL/孔包被ELISA親和96孔板，4℃過夜，以200μL/孔的10％小牛血清37℃封閉30min～1小時，PBST洗板三次，將標準品和待測樣品以100μL/孔加至96孔板，室溫2小時，或4℃過夜。PBST洗板三次，加入辣根過氧化物酶標羊抗人抗體Fc、Fab或IgG100μL/孔，室溫放置40min，PBST洗板四次，以OPD顯色系統顯色，測OD492nm吸光度。選定線性範圍內的數據，以標準品吸光度(OD492)對標準品濃度的對數(lnC)作曲線，以濃度為橫坐標，OD492為縱坐標，做折線圖，得標準曲線OD492＝alnC+b，根據標準曲線計算樣品濃度。
表1ELISA分析靶向表達載體的瞬時轉染結果
應用實例二可擴增性轉錄活性位點的篩選PstI核酸內切酶單酶切整合標記載體pTGS-FRT-DHFR，Qiagen膠回收試劑盒回收，回收後濃度為100ng/mL，採用BioRad電擊儀，200ng線性化載體電轉二氫葉酸還原酶基因缺陷型的中華倉鼠卵巢細胞CHO-dhfr-，電擊細胞密度為3×105cell/mL，DMEM電轉緩衝液，最終質粒濃度為1μg/mL，將質粒與細胞的混合液轉入電擊杯，Square wave模式160伏特，15毫秒電擊一次，立即轉移細胞至培養基中培養，12小時後換液；48小時後分瓶，使細胞融片率小於20％，此時的培養基換成選擇培養基(含100μg/mL Zeocin抗生素)，100μg/mL Zeocin抗生素濃度是宿主細胞最低藥物致死濃度。大約30天出現克隆。分別挑400個單克隆到96孔板，測試單克隆的β-半乳糖苷酶活性(使用invitrogen公司的β-半乳糖苷酶活性檢測試劑盒(貨品目錄K1455-01)和藥典上常用的Bradford法定量蛋白質)。400個克隆均表達β-半乳糖苷酶，有四分之一的克隆酶活達到100米勒單位。對這100個克隆進行亞克隆，連續20代測試亞克隆的β-半乳糖苷酶活性，結果10％的亞克隆具有穩定高表達β-半乳糖苷酶的特性。選擇100個單克隆用4×10-7M氨甲蝶呤，無次黃嘌呤和胸苷的選擇培養基培養細胞，這個過程是細胞加壓過程，一旦細胞轉入選擇培養基，細胞很快出現大量死亡，只有二氫葉酸還原酶基因插入在可擴增位點的細胞才能抵禦藥物的作用。18天後新克隆相繼出現，胰酶消化克隆，測試這些克隆的β-半乳糖苷酶活性，結果有12％的克隆表現出酶活增加，表明這些克隆被標記的高轉錄活性位點具有可擴增性。表2是12株在可擴增性的轉錄活性位點處整合了整合標記載體的細胞系，這些細胞株命名為CHO-DZ工程細胞株。
表2CHO-DZ工程細胞株加壓前後β-半乳糖苷酶活性
應用實例3高分泌SARS人源抗體穩定轉染細胞系的構建脂質體轉染CHO-DZ工程細胞，1×105個細胞，100ng靶向表達載體pTGS-SARS1-site與1μg FLP重組酶表達載體pOG44共轉染，pOG44可商購於invitrogen，pOG44瞬時表達位點特異性重組酶，該酶作用於CHO-DZ工程細胞株和靶向表達載體上的FRT位點，通過兩個位點鏈的切割與交換，將靶向表達載體定點整合至染色體上。轉染48小時後稀傳，使細胞融片率小於20％，此時的培養基換成新的選擇培養基(含250μg/mL潮黴素，無Zeocin抗生素)，250μg/mL潮黴素濃度是CHO-DZ工程細胞株最低藥物致死濃度。
同時，採用普通的穩定轉染細胞系構建的方法，評價構建細胞系的效率，350ng pCMV-VKH-SARS(抗體基因與pTGS-SARS1-site相同，基因表達盒子也完全相同)轉染CHO-dhfr-細胞，轉染條件與本申請位點特異性重組方法相同。轉染後隨機挑取100個克隆分析抗體分泌量、陽性率和克隆穩定性。
靶向表達載體上有單一的FRT位點，單獨轉染不會賦予細胞潮黴素抗性。靶向表達載體與FLP重組酶表達載體共轉染CHO-DZ工程細胞，發生FRT/FLP位點特異性重組，細胞表達潮黴素抗性，以此作為篩選標記，轉染後25天左右可見明顯的潮黴素抗性克隆生長，ELISA測定抗體分泌量，胰酶消化傳代，連續測定17代，陽性率均為100％。用此方法獲得的克隆陽性率為100％，各克隆間的蛋白表達量基本都處在相同的範圍內，對這些克隆進行整體加壓可大量提高重組蛋白的分泌量。
一旦靶向表達載體整合到基因組中，則不再需要重組酶，重組酶的持續會造成整合效率的降低，本發明中重組酶表達質粒在哺乳動物細胞中只表達重組酶，不表達抗性篩選標記，因此會逐漸被降解。
對pTGS-SAR1-site定點整合後獲得的細胞株進行加壓，第一周採用4×10-7M氨甲蝶呤加壓，第二周繼續加壓，甲氨蝶呤濃度增加至1×10-6M，第三周用二甲基亞碸(DMSO)凍存細胞，第五周復甦細胞，復甦兩天後測試細胞倍增性能和蛋白分泌量。未加壓的樣品傳代2個月，與加壓後復甦的細胞，以1.5×105cell/mL共2mL接種6孔板，每24小時收上清，ELISA分析蛋白分泌量，臺盼籃染色計算細胞的總數和死亡率。圖11是穩定分泌抗SARS抗體細胞株抗體累積分泌量曲線，圖12是穩定分泌抗SARS抗體細胞株倍增曲線和存活率。圖11與12數據為三次實驗的平均值。測試結果表明細胞24小時可倍增，加壓細胞在第5天達到快速分泌期，其產量達160μg/mL以上。對復甦一周的細胞進行亞克隆，選擇高表達的亞克隆，以1.5×105cell/mL共2mL接種6孔板，每24小時收上清，ELISA分析蛋白分泌量，臺盼籃染色計算細胞的總數和死亡率，測試細胞倍增性能和蛋白分泌量，圖13顯示亞克隆細胞株倍增曲線和存活率，圖14是亞克隆細胞株抗體累積分泌量曲線。抗體分泌最旺盛的一天是第六天，1.68×106個細胞總數，抗體分泌量為203.1111ug/mL，因此，產量為203.1111ug/mL×2mL/1.68＝241.8ug/24h/1×106個細胞。7天抗體分泌總量為564.5556ug/mL，即1.129mg/7天/6孔板培養，其表達量已達到商用標準。
採用普通的穩定細胞系構建的方法，隨著細胞的傳代，陽性率不斷下降，表達量也不斷下降。表3是普通轉染方法與本申請轉染方法的比較結果，圖9是普通轉染方法與本申請轉染方法傳代次數與克隆陽性率的比較。
表3普通轉染方法與本申請轉染方法的比較結果
應用實例4高分泌CD20嵌合抗體穩定轉染細胞系的構建轉染方法與應用實例3完全相同，該方法同樣適用於其它抗體高產細胞株的構建。該實例靶向表達載體採用pTGS-GL-site。待潮黴素抗性克隆生長後，胰酶消化並收集克隆傳代，加壓前的抗體分泌量為25ug/24小時/1×106個細胞。目前正在對該高分泌抗CD20抗體細胞株進行加壓擴增。
對應用實例3和4表達的抗體採用SDS-PAGE電泳分離，標準品選用Pierce公司生產的人IgG，樣品為SARS IgG1型抗體和CD20IgG1型抗體，電泳分離後轉印至硝酸纖維素膜，4℃、100V、轉移50min。取出膜，5％脫脂奶TBST室溫封閉1h，洗膜三次，加辣根過氧化物酶標羊抗人抗體IgG(H+L)室溫反應1h，洗滌三次，ECL系統(Pierce)顯色，X感光膠片曝光30～60s，顯影、定影。Western Blot結果顯示表達的蛋白分子量與人IgG相等，圖7是Western Blot結果圖。
對應用實例4的CD20IgG1型抗體進行間接免疫螢光及流式細胞分析儀(FACS)分析，取對數生長期的Daudi細胞，2％FBS-PBS洗3次，每管分裝2×105個細胞，取相應樣品50uL與Daudi細胞4℃孵育20min，2％FBS-PBS洗3次，加入FITC-羊抗人IgG Fc 50uL，4℃避光反應20min。2％FBS-PBS洗4次，倒置螢光顯微鏡觀察細胞膜表面螢光，1％多聚甲醛固定，流式細胞分析儀(FACS)分析細胞表面平均螢光強度及陽性率。圖8是流式細胞分析(FACS)及間接免疫螢光結果圖，顯示表達的抗CD20抗體具有很強的結合活性。
本領域技術人員在了解本申請說明書中的教導以後，完全可以理解，本申請的範圍並不局限於本申請實施例中的具體實例，本申請的範圍由權利要求書限定。
權利要求
1.一種整合標記載體，包括以下元件或序列A.顯性選擇標記；B.篩選標記；C.一或多個擴增基因；D.在微生物中增殖的遺傳元件；E.重組信號序列；其中，篩選標記和顯性選擇標記以融合蛋白形式表達，啟動子和融合蛋白之間插入重組信號序列，起始密碼子ATG位於重組信號序列之前，共同受控於一個弱化的啟動子；而擴增基因也採用弱化的病毒啟動子。
2.權利要求1的載體，其中調控融合蛋白表達的啟動子是弱化的病毒啟動子。
3.權利要求1的載體，其中調控融合蛋白和擴增基因表達的啟動子是相同的弱化病毒啟動子。
4.權利要求1的載體，其中顯性選擇標記選自編碼下列物質的基因印度異壁鏈黴菌腐草黴素抗性、潮黴素磷酸轉移酶、新黴素抗性、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶、嘌呤黴素、二氫乳清酸酶穀氨醯胺合成酶、組氨酸D、氨甲醯磷酸合成酶、二氫葉酸還原酶、天冬氨酸轉氨甲醯酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶和腺苷脫氨酶。
5.權利要求1的載體，其中篩選標記為編碼細胞表面蛋白質、螢光蛋白和酶的基因。
6.權利要求1的載體，其中擴增基因選自二氫葉酸還原酶、腺苷脫氨酶、二氫乳清酸酶穀氨醯胺合成酶和氨甲醯磷酸合成酶。
7.權利要求1的載體，其中在微生物中增殖的遺傳元件包括微生物的複製起始點和抗生素抗性標記。
8.權利要求1的載體，其中重組信號序列選自FRT、Loxp和AttB/AttP。
9.權利要求1的載體，其中含有A.顯性選擇標記基因印度異壁鏈黴菌腐草黴素抗性基因；B.篩選標記β-半乳糖苷酶基因；C.擴增基因二氫葉酸還原酶基因，該基因受弱化的SV40病毒啟動子調控，該啟動子中刪除了-321～-250位的72bp增強子序列，將-245～-243位的72bp增強子序列的5～7位鹼基由TGG突變為GTT；D.複製起始點ColE1和表達氨苄青黴素抗性的bla基因；E.重組信號序列FRT；其中，在載體中，按轉譯方向，依次是病毒SV40弱化啟動子，起始密碼子ATG，重組信號序列FRT，篩選標記β-半乳糖苷酶基因，顯性選擇標記印度異壁鏈黴菌腐草黴素抗性基因；其中該SV40弱化啟動子中缺失了-321～-224位的98bp增強子序列。
10.權利要求1的載體，其為pTGS-FRT-DHFR。
11.一種靶向表達載體，包括以下元件或序列A.顯性選擇標記；B.在微生物中增殖的遺傳元件；C.重組信號序列；D.目標基因表達盒；E.真核生物病毒的複製起點，其中，該載體中的顯性選擇標記不同於權利要求1的整合標記載體中的顯性選擇標記，該顯性選擇標記基因沒有啟動子和起始密碼子；重組信號序列插入顯性選擇標記之前，該重組信號序列與權利要求1的整合標記載體中的重組信號序列相同。
12.權利要求11的載體，其中顯性選擇標記選自編碼以下蛋白質的基因印度異壁鏈黴菌腐草黴素抗性、潮黴素磷酸轉移酶、新黴素抗性、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶、嘌呤黴素、二氫乳清酸酶穀氨醯胺合成酶、組氨酸D、氨甲醯磷酸合成酶、二氫葉酸還原酶、天冬氨酸轉氨甲醯酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶和腺苷脫氨酶。
13.權利要求11的載體，其中在微生物中增殖的遺傳元件為微生物的複製起始點和抗生素抗性標記。
14.權利要求11的載體，其中重組信號序列選自FRT、Loxp和AttB/AttP。
15.權利要求11的載體，其中目標基因表達盒中包括SP163增強子，CMV立早基因啟動子，內質網膜信號肽，目標基因序列和牛生長激素腺苷酸加尾信號。
16.權利要求15的載體，其中目標基因編碼選自以下的蛋白免疫球蛋白、細胞表面受體、胞內受體、激素、細胞因子、生長因子、轉錄因子、酶。
17.權利要求11的載體，其中真核生物病毒複製起點為SV40 ori或EBV ori。
18.權利要求11的載體，其中含有A.顯性選擇標記潮黴素磷酸轉移酶基因；B.複製起點ColE1和表達氨苄青黴素抗性的bla基因；C.重組信號序列FRT；D.SP163增強子，CMV立早基因啟動子，內質網膜信號肽，抗體輕鏈可變區、輕鏈恆定區和牛生長激素腺苷酸加尾信號；E.真核生物病毒複製起點SV40 ori。
19.權利要求11的載體，其中含有A.顯性選擇標記潮黴素磷酸轉移酶基因；B.複製起點ColE1和表達氨苄青黴素抗性的bla基因；C.重組信號序列FRT；D.SP163增強子，CMV立早基因啟動子，內質網膜信號肽，抗體重鏈可變區、重鏈恆定區和牛生長激素腺苷酸加尾信號；E.真核生物病毒複製起點SV40 ori。
20.權利要求11的載體，其為pTGS-SARS1-site、pTGS-GL-site或pTGS-MH-140-site。
21.基因組中含有可擴增高轉錄活性位點的細胞株的構建方法，包括以下步驟A.將權利要求1-10之一的整合標記載體在非關鍵的位置處線性化，以不影響所有元件的正常功能為準，然後使用該線性化載體通過非同源重組機制轉化出發哺乳動物細胞株；B.利用針對顯性選擇標記的選擇壓力篩選步驟A獲得的轉化細胞，獲得整合標記載體在基因組較高轉錄活性位點處整合的克隆；C.測定步驟B獲得的克隆的篩選標記基因表達量，獲得篩選基因高表達的克隆，即整合標記載體插入基因組中高轉錄活性位點處的克隆；D.利用針對擴增基因的選擇壓力篩選步驟C獲得的克隆，獲得擴增基因被擴增的克隆，即基因組中含有可擴增的高轉錄活性位點的細胞株。
22.權利要求21的方法，其中步驟B和D中的選擇壓力是逐步增加的。
23.權利要求21的方法，其中步驟A中的轉化方式是電穿孔、磷酸鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖或脂質體轉染。
24.權利要求21-23之一的方法，其中整合標記載體是權利要求10的載體，出發哺乳動物細胞株是CHO-dhfr-。
25.獲得目標基因高表達的哺乳動物重組細胞株的方法，包括以下步驟A.利用權利要求21-24之一的方法獲得基因組中含有可擴增的高轉錄活性位點的細胞株；B.用權利要求11-20之一的靶向表達載體和重組酶表達載體以超螺旋形式共轉染步驟A獲得的細胞株，所述重組酶表達載體瞬時表達位點特異性重組酶，該重組酶催化靶向表達載體和整合在基因組上的整合標記載體在重組信號序列處發生位點特異性重組；C.利用針對靶向表達載體中選擇標記的選擇壓力篩選步驟B獲得的轉染克隆，獲得目標基因插入擴增基因側翼的克隆，即目標基因高表達的哺乳動物重組細胞株。
26.權利要求25的方法，還包括以下步驟D利用針對擴增基因的選擇壓力篩選步驟C獲得的克隆，獲得目標基因高表達的哺乳動物重組細胞株。
27.權利要求26的方法，還包括以下步驟E對步驟C或者步驟D獲得的目標基因高表達的哺乳動物重組細胞株進行傳代。
28.權利要求27的方法，其中步驟E在選擇壓力下進行。
29.權利要求28的方法，其中選擇壓力是針對擴增基因的選擇壓力。
30.權利要求25的方法，其中步驟B中共轉染的方式是電穿孔、磷酸鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖或脂質體轉染。
31.權利要求25-30之一的方法，其中選擇壓力是逐步增加的。
32.權利要求31的方法，其中整合標記載體是權利要求10的載體，靶向表達載體是權利要求20的載體，重組酶載體是pOG44，出發哺乳動物細胞株是CHO-dhfr-。
33.一種快速構建高分泌重組蛋白細胞株的體系，該體系包括A.權利要求1-10之一的整合標記載體；B.權利要求11-20之一的靶向表達載體；C.重組酶表達載體，該重組酶表達載體可瞬時表達位點特異性重組酶，所述重組酶可以催化整合在出發哺乳動物細胞株基因組上的整合標記載體與靶向表達載體在重組信號序列處發生位點特異性重組；D.出發哺乳動物細胞株。
34.權利要求33的體系，其中出發哺乳動物細胞株選自CHO-dhfr-、COS、Hela、NIH 3T3和NS0骨髓瘤細胞。
35.權利要求33的體系，其中所述整合標記載體是權利要求10的載體，靶向標記載體是權利要求20的載體，重組酶表達載體是pOG44，出發哺乳動物細胞株是CHO-dhfr-。
全文摘要
本發明涉及應用突變與重組技術篩選可擴增性的高轉錄活性位點，並在位點處插入標記的方法。本發明還涉及應用位點特異性重組機制快速構建並獲得目標基因高表達的哺乳動物細胞系的方法，即應用重組酶識別和切割一對重組信號序列(整合標記載體與靶向表達載體各具有一個)，完成位點特異性重組，實現目標基因的穩定高表達。
文檔編號C12N15/65GK1693467SQ20051006433
公開日2005年11月9日 申請日期2005年4月14日 優先權日2005年4月14日
發明者黃英, 王琰, 沈倍奮, 黎燕 申請人:北京天廣實生物技術有限公司