優化的串連細胞因子及其在誘導多能性幹細胞中的應用的製作方法

2023-07-14 18:40:21

專利名稱：：優化的串連細胞因子及其在誘導多能性幹細胞中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
的幹細胞研究，具體涉及串連的密碼子優化的人源細胞因子，並將該細胞因子用於iPS細胞(inducedPluripotentStemcells)的誘導的技術。
背景技術：
：iPS(inducedPluripotentStemcells)技術作為一個新興的技術解決了胚胎幹細胞的來源的限制，並繞開了倫理的約束，為再生醫學研究的提供了新的希望。早期的iPS使用0ct3/4，Klf4，Sox2與Myc組合或0ct3/4，Klf4，Nanog與Lin28組合。為了簡化試驗操作，提高iPS效率以及提高iPS的安全性，人們對iPS誘導技術方面進行了諸多改進，主要可以分為以下幾個方面1)減少細胞因子個數。Myc和Klf有導致細胞癌變的特性，使用較少的細胞因子將會有更高的安全性。實驗證明可以使用0ct3/4和Klf4(Kim，J.B.etal，Pluripotentstemcellsinducedfromadultneuralstemcellsbyr印rogrammingwithtwofactors.Nature454(2008)，646-50.該文獻中文名為，使用兩個重編程細胞因子從小鼠神經幹細胞中誘導多能幹細胞。)，或者單獨使用0ct3/4誘導出iPS(Kim，J.B.，etal.0ct4-inducedpluripotencyinadultneuralstemcells.Cell136(2009)，411-9.該文獻中文名為，0ct4在成體神經幹細胞中誘導的多能性。)2)使用同一載體表達多個誘導因子。在做iPS誘導的過程中，同時轉染或者感染多個誘導因子在實驗操作上比較繁瑣，特別使用質粒進行轉染。多個研究小組使用串聯的基因進行iPS誘導(Carey，B.W.，etal.R印rogrammingofmurineandhumansomaticcellsusingasinglepolycistronicvector.ProcNatlAcadSciUSA106(2009)，157-62.該文獻中文名為，用單個多順反子載體重編程小鼠和人體細胞。Gonzalez,F.，etal.Generationofmouse—inducedpluripotentstemcellsbytransientexpressionofasinglenonviralpolycistronicvector.ProcNatlAcadSciUSA106(2009)，8918-22.該文獻中文名為，通過瞬時表達一個單個非病毒多順反子載體來產生小鼠的iPS細胞。)。3)使用安全的非整合誘導方式。如腺病毒，質粒，和蛋白形式的外源誘導因子。由於腺病毒載體不整合到細胞的基因組並具有感染多種細胞的能力，人們用腺病毒進行iPS誘導，但是此種方法得到的iPS誘導效率較低(Stadtfeld，M.，etal.Inducedpluripotentstemcellsgeneratedwithoutviralintegration.Science322(2008)，945-9.該文獻中文名為，產生非病毒整合的iPS細胞。)。這可能是由於腺病毒攜帶了太多的病毒基因所致。為了避免外源的細胞因子整合到細胞的基因組，人們也採取了多次轉染質粒的方法來獲得iPS細胞(0kita，K.，etal.Generationofmouseinducedpluripotentstemcellswithoutviralvectors.Science322(2008)，949-53.該文獻中文名為，使用非病毒載體產生小鼠iPS細胞。)。為了徹底避免核酸引入，人們也開發了通過直接在細胞培養基中加入細胞因子蛋白來誘導iPS(Kim，D.，etal.Generationofhumaninducedpluripotentstemcellsbydirectdeliveryofr印rogrammingproteins.CellStemCell4(2009)，472-6.該文獻中文名為，直接使用重編程蛋白產生人iPS細胞。Li，W.，etal.Generationofratandhumaninducedpluripotentstemcellsbycombininggeneticr印rogrammingandchemicalinhibitors.CellStemCell4(2009)，16_9.該文獻中文名為，綜合使用基因重編程蛋白和化學抑制物產生大鼠和人iPS細胞。)，但是遇到同樣的問題iPS細胞的誘導效率較低。4)結合輔助手段提高iPS效率。化學小分子藥物丙戊酸(valproicacid(VPA))可以提高0ct3/4禾口Sox2的誘導效率(Huangfu，D.，etal.Inductionofpluripotentstemcellsbydefinedfactorsisgreatlyimprovedbysmall—moleculecompounds.NatBiotechnol26(2008)，795-7.該文獻中文名為，小分子化合物可以大大提高固定因子的多能幹細胞誘導過程。)使用MicroRNA也可以提高iPS的誘導效率(Judsonetal.，Embryonicstemcell—specificmicroRNAspromoteinducedpluripotency.NatBiotechnol27(2009)，459-61.該文獻中文名為，胚胎幹細胞特異的microRNA提高誘導效率。)。由此可見，iPS誘導技術呈現出多樣性的特徵。高效的iPS誘導系統是可以減少樣本細胞的用量，簡化實驗操作，提高成功率，更加有利於iPS細胞在臨床上的應用。在同一個質粒上表達多個基因的策略有多種1)使用多個啟動子，每個啟動子啟動獨立的編碼框。這個策略的缺陷是由於不同啟動子的啟動能力不同，並且重複串聯的相同啟動子之間的相互幹擾導致兩個啟動子的表達效率都降低。2)在一個啟動子內部使用內部核糖體進入位點(IRES)元件表達兩個基因。IRES容易導致串聯的表達框中的第二個基因表達水平低於第一個基因。3)在融合蛋白的連接位點引入蛋白酶切位點，利用細胞內的蛋白酶將串聯蛋白切割成單個的功能蛋白，但是細胞內的蛋白酶酶切不充分，這個策略是最不常用。能夠在蛋白水平實現自我剪切的蛋白酶元件的發現為串聯基因的發現提供了新的可能性。研究表明，一些正鏈病毒的基因組編碼一個全長的融合蛋白，該融合蛋白沒有活性。其中有一段2A短肽(18-22胺基酸)可以在融合蛋白中自我切割，產生單個獨立的蛋白(參見如下文獻SzymczakAL，WorkmanCJ，WangY，VignaliKM，DilioglouS，VaninEF，VignaliDA(2004)Correctionofmulti-genedeficiencyinvivousingasingle'self-cleaving'2Ap印tide-basedretroviralvector.Naturebiotechnology22:589-594;該文獻中文名為使用單個基於2A短肽'自剪切'的逆轉錄病毒載體可以在體內矯正多基因缺陷)。通過串聯的2A序列可以實現多個基因的同時表達，其特點為，1)串聯基因由同一個啟動子轉錄產生單個長片段信使RNA(mRNA)用於表達融合蛋白，2)融合蛋白高效自我切割，切割後的蛋白可以行使其獨立的功能，3)串聯基因等物質的量表達，前後兩個蛋白的表達量一致。
發明內容為了提高iPS的誘導效率，本發明提供了一種優化的串連細胞因子並將該細胞因子用於誘導iPS中。為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案。本發明所採用的細胞因子包含0ct4opt、Klf4opt禾口Sox2opt，所述0ct4opt、Klf4opt禾口Sox2opt的基因序列分另U如SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。本發明使用人源0ct4，Sox2和Klf4基因，在優化的過程使用了人偏好的密碼子，並去掉了潛在的內含子和外顯子位點，我們稱之為0ct4opt、Klf4opt禾口Sox2opt。優選的，所述0ct4opt、Klf4opt和Sox2opt的基因連接順序由5'端到3'端依次為0ct4opt、Klf4opt禾口Sox2opt。優選的，所述優化的串連細胞因子還含有串聯片段，所述串聯片段為2A多肽，所述2A多肽包括F2A多肽和P2A多肽，所述F2A多肽和P2A多肽的胺基酸序列分別如SEQIDNO:1禾PSEQIDNO:2所示。所述F2A多肽和P2A多肽的基因序列分別如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。所述優化的串連細胞因子為0ct4opt-F2A-Klf4opt-P2A-Sox2opt(命名為OKSopt)。其中，所述0ct4opt、F2A、Klf4opt、P2A和Sox2opt的基因序列分別如SEQIDNO:6、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:4禾PSEQIDNO:8所示。本發明還提供了一種將上述優化的串連細胞因子應用在誘導多能性幹細胞中的方法。作為實驗的對照，我們構建了基因子編碼沒有修改的原始基因序列，並且其連接方式與優化的序列保持一致，0ct4-F2A-Klf4-P2A-Sox2命名為(OKS(N))。為了驗證優化的OKS在iPS誘導方面的效率提高效果，我們選擇相應的表達載體來攜帶這三個串聯基因。優選的，選擇逆轉錄病毒載體，特別是pMXs載體用於攜帶優化的串聯基因，這是因為逆轉錄病毒載體可以在誘導了iPS細胞後可以有效的沉默。攜帶OKSopt的載體也包括腺病毒載體、慢病毒載體和質粒等其它多種形式的載體。本發明使用的構建的串聯OKSopt序列可以提高iPS的誘導效率，高效的iPS誘導系統是可以減少樣本細胞的用量，簡化實驗操作，提高成功率，更加有利於iPS細胞在臨床上的應用。本發明使用的串聯OKSopt序列可以潛在的應用於人，猴，豬，馬，牛，羊，狗，小鼠，大鼠等諸多種屬哺乳動物原代細胞的iPS細胞誘導。圖1是本發明中的串聯三個因子的酶切鑑定圖；圖2是本發明中的pMX-OKSopt和pMX-OKS(N)酶切鑑定圖；圖3是本發明中的pMX-OKSopt和pMX-OKS(N)質粒包裝成為逆轉錄病毒後的表達鑑定圖；圖4是本發明所得到的iPS效率差異的統計圖。具體實施例方式下列實施例舉例了發明人的標準實驗室實踐，用於示例本發明的模式，而不應將本發明理解為限定於這些實施例的範圍。這些實施例，根據本文公開和本領域技術人員的普遍水平，技術人員將理解下列僅用於示例，可以在不超過本發明的範圍內進行各種變動、修飾和改造。其中所涉及的技術，除非特別說明，均是本領域技術人員熟知的分子生物學、細胞生物學、生物化學等各個領域的常規技術。為使本發明更加容易理解，下面將進一步闡述本發明的具體實施例。實施例1:優化的誘導因子基因序列的獲得根據人偏好的密碼子編碼，我們對四個細胞因子的編碼序列進行了統計分析，在進行基因優化的同時，我們也去除了基因內部可能的內含子剪接位點，這個可以最大程度的保持mRNA的完整性，提高蛋白的表達水平。原始的編碼序列與優化後的編碼序列的差異見表l，表1所示為本發明中優化後與優化前序列使用的密碼子差異比較。表1優化前後密碼子差異分析tableseeoriginaldocumentpage6優化基因的序列見序列表，優化序列在商業化公司合成。連接到pMD18T-simple載體(TaKaRa公司，大連)上pT-0ct4opt-F2A-P2A，pT-Klf4opt，pT-Sox2opt。實施例2:密碼子未優化細胞因子的T載體構建以0ct4(NCBI登錄號為NM_002701.4)基因為模板，以h0ct4(1+20)HS與h0ct4(1077-22)BEI為引物，進行PCR，Tm=63°C;以Klf4(NCBI登錄號為NM_004235.4)基因為模板，以hKlf4(l+20)HS與hKlf4(1410-25)BEI為引物，進行PCR，Tm=63°C;Sox2(NCBI登錄號為NMJ)03106.2)基因為模板，以hSox2(1+25)HS與hSox2(951-22)BEI為引物，進行PCR，Tm=63°C。引物名稱引物序列h0ct4(l+20)HSGGAaagctactagtATGGCGGGACACCTGGCTTCh0ct4(1077-22)BEIGATgaattctttaggatccGTTTGAATGCATGGGAGAGCCChKlf4(l+20)HSGGAaagcttactagtATGGCTGTCAGCGACGCGCThKlf4(1410-25)BEIGATgaattctttaggatccAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGCGhSox2(l+25)HSGGAaagcttactagtATGTACAACATGATGGAGACGGAGChSox2(951-22)BEIGATgaattctttaggatccCATGTGTGAGAGGGGCAGTGTG在構建過程中使用了復能公司高保真PCR反應試劑。引物序列如上。PCR反應體系的配製(50iU):Buffer(5X):10ii110XMgS04母液5iUd證(10ilM)1模板100ng引物(20iiM):0.5iU/條Ultr即fuTaq酶2UH20S50iilPCR反應條件步驟198°Clmin步驟298。C10sec步驟3Tm63。C30sec步驟472。C30sec步驟5回到步驟2共28個循環步驟672。C7min步驟616。ClhPCR產物經過純化後，插入到pMD18T-simple載體(TaKaRa公司，大連)中，分別得到pT-0ct4，pT-Klf4與pT-Sox2。實施例3:串聯因子的質粒構建優化OKSopt序列的構建按如下步驟進行步驟1:pT-0ct4opt-F2A-P2A經過Spel和BamHI酶切，回收質粒骨架，pT-Klf4opt也經Spel和BamHI酶切，得到Klf4opt基因片段，連接得到pT-0ct4opt-F2A-Klf4opt-P2A。步驟2:此質粒進一步經過NheI和EcoRI酶切，回收質粒骨架，pT-Sox2opt同樣經過Nhel和EcoRI得到Sox2opt基因片段，連接得到pT-0ct4opt-F2A-Klf4opt-P2A-Sox2opt(簡寫pT-0KSopt)，酶切結果見圖1，預期酶切後，得到的片段大小分別為3644bp，1760bp，932bp。圖1中#1和#2分別為構建的兩個獨立的pT-0KSopt質粒克隆，由圖1中#1和#2可知，酶切結果與預期一致，初步鑑定質粒構建正確。非優化hu0KS序列的構建步驟1:pT-0ct4opt-F2A-P2A經過Xbal和BglII酶切，回收質粒骨架，pT-0ct4也經Spel和BamHI酶切，得到0ct4基因片段，連接得到pT-0ct4-F2A-P2A。步驟2:pT-0ct4-F2A-P2A經過Spel和BamHI酶切，回收質粒骨架，pT-Klf4也經Spel和BamHI酶切，得到Klf4基因片段，連接得到pT-0ct4-F2A-Klf4-P2A。步驟3:此質粒進一步經過Nhel和EcoRI酶切，回收質粒骨架，pT_Sox2同樣經過Spel和EcoRI得到Sox2基因片段，連接得到pT-0ct4-F2A-Klf4-P2A-Sox2(N)(簡寫pT-0KS(N))。其酶切結果見圖l，預期酶切後，得到的片段大小分別為3644bp，1760bp和932bp。圖1中#7和#8分別為兩個獨立的pT-0KS(N)質粒克隆，由圖1中#7和#8可知，酶切結果與預期一致，初步鑑定質粒構建正確。實施例4:逆轉錄病毒載體pMXs-0KSopt和pMXs-0KS(N)的構建逆轉錄病毒載體質粒pMXs-Flag(Addgene公司)經過PmeI單酶切，酶切產物經過去磷酸化處理(NEB公司，具體參照說明書)。質粒骨架採用瓊脂糖凝膠電泳回收。pT-0KSopt和pT-0KS(N)分別經EcoRV酶切，所得0KSopt和0KS(N)片段採用瓊脂糖凝膠電泳回收，分別插入到線性化的平端pMX載體骨架，分別得到上述pMXs-0KSopt和pMXs-0KS(N)質粒。圖2A是pMXs-0KSopt的酶切圖，pMXs-0KSopt經過BglII酶切後的預期片段大小為6791bp、1495bp，pMXs-0KSopt經過BamHI酶切的預期片段大小為5678bp、2608bp;由圖2A可見，#2號克隆的樣品酶切鑑定結果與預期結果一致，初步確定，pMXs-0KSopt質粒構建成功。圖2B是pMXs-0KS(N)的酶切圖，pMXs-0KS(N)經過HindIII和EcoRI酶切後，預期片段大小為4664bp、2588bp、921bp、116bp，pMXs-0KS(N)經過BamHI酶切的預期片段大小為4661、2596、1032bp;由圖2B可見，#2，4，6為三管獨立的pMXs-0KS(N)克隆樣品，同時進行酶切，其酶切鑑定結果與預期結果一致，初步確定，pMXs-OKS(N)質粒構建成功。實施例5:逆轉錄病毒的包裝與基因表達鑑定與小鼠iPS的誘導逆轉錄病毒的包裝在293細胞中進行，按照標準的磷酸鈣轉染的方法得到，參見《分子克隆實驗指南(第三版)》第16章。包裝的病毒按照相同的劑量感染MEF小鼠胚胎成纖維細胞，48小時後，收集細胞。基因表達進行WesternBlot鑑定。使用抗0ct4和抗Sox2的抗體可以檢測到基因的表達，結果見圖3，圖3是pMX-OKSopt和pMX-OKS(N)質粒包裝成為逆轉錄病毒後的表達鑑定圖，圖3中左邊的圖是檢測0ct4的表達的比較結果圖，右邊的圖是檢測Sox2的表達的比較結果圖。由圖3可見，優化的0ct4和Sox2比非優化的0ct4和Sox2表達水平稍高。MEF小鼠成纖維細胞的iPS誘導操作參照文獻(QinD，LiW，etal.DirectgenerationofES—likecellsfromunmodifiedmouseembryonicfibroblastsby0ct4/Sox2/Myc/Klf4.CellRes.17(2007):959-62.該文獻中文名為，使用0ct4/Sox2/Myc/Klf4直接從未修飾的小鼠胚胎成纖維細胞中直接產生幹細胞樣細胞。)。iPS實驗過程聯合使用了表達Myc(Addgene公司)的逆轉錄病毒。得到的iPS克隆經過計數，其實驗結果見圖4，圖4是iPS效率差異的統計圖，該圖表明優化的OKS可以明顯地提高iPS效率。最後所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護範圍的限制，儘管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和範圍。序列表〈160>8〈210>1〈211>29〈212>F2APRT〈400>1ArgSerLyslieValAlaProValLysGinThrLeuAsnPheAspLeu151015LeuLysLeuAlaGlyAspValGluSerAsnProGlyPro25〈210>1〈211>22〈212>P2APRT〈400>2GlySerGlyAlaThrAsnPheSerLeuLeuLysGinAlaGlyAspVal151015GluGluAsnProGlyPro0089]200090]〈210>10091]〈211>870092]〈212>F2ADNA0093]〈400>30094]agatcteagattgtggcccctgtg朋gC3g0095]ggcgatgtggagtccaaccctggcccc0096]〈210>10097]〈211>660098]〈212>P2ADNA0099]〈400>40100]ggatccggcgccaccaacttctccctgctg0101]gggccc0102]〈210>10103]〈211>12860104]〈212>Hu0ct4opt-F2A-P2ADNA0105]〈400>50106]gatetc朋gctttctegaatggctggccat0107]cctggaggtgg￡lggCg￡ltggccctggaggt0108]tggctgtccttccagggcccccctggcggc0109]tctgaggtctggggcatccccccatgccct0110]tectgtggccctc朋gtgggagtgggactg0111]cctgagggcgaggctggcgtgggCgtggElg0112]tgC3C3gtg3cccctggcgctgtg朋gctg0113]gagtcccagg3C3tC朋ggCcctgcag朋g0114]C3g朋g3gg3tcaccctgggctecacccag0115]tttggc朋ggtcttctcccagaccaccatc0116]朋g朋catgtgcaagctgaggcccctgctg0117]gag朋cctgc郷卿tttgcaaggctgag0118]acctccattgag朋ccgcgtg郷ggc雄0119]cccaccctgcagcaaatctcccacattgcc0120]agggtctggttctgcaacagg3ggC卿3g0121]3ggg3gg3Ctttgaggctgctggctcccca0122]gcccctggcccccactttggcacccctggc0123]tcctctgtgccattccctgagggcg郷cc0124]tcccccatgcactccaacagatctaagatt0125]gacctgctgaagctggctggcgatgtggag0126]ggcgccaccaacttctccctgctgaagcag0127]gctagctaaagaattctaaagatatcaccctgaactttgacctgctg朋gctggct6087aagcaggctggcgatgtggaggag朋ccct6066ctggcctctgactttgccttctctcctcct60cctgaacctggCtgggtggElccccaggacc120cctggcattggccctggcgtgggccctggc180cctccatetgagttctgtggcggcatggcc240gtgccccagggcggcctggagacctcccag300tccaactctgatggcgcctcccctgagcca360g卿3gg卿agctggagcag朋ccctgag420gagctggagcagtttgccaagctgctg朋g■gctgatgtgggcctgaccctgggcgtgctg540tgcaggtttgaggccctgcagctgtccttc600C卿3gtgggtgg郷郷ctgac朋c朋t660accctggtgc3ggCC3gg朋g郷El卿gg720ctggag朋cctgttcctgcagtgccccaag780cagcagctgggcctggagaaggEltgtggtg840ggC3卿ggtcctcctctgactetgcccag■ttctctggcggccctgtctccttccccctg960tetggctccccccacttcacagccctgtec1020ttcccccctgtctctgtgaccaccctgggc1080gtggcccctgtg朋gcagaccctgaacttt1140tccaaccctggccccactegtgccggatcc1200gctggcgatgccctgggccc126012860128]〈210>10129]〈211>10800130]〈212〉Hu0ct4optDNA0131]〈400>60132]atggctggccatctggcctctgactttgcc0133]ggccctggaggtcctgaacctggctgggtg0134]ccccctggcggccctggcattggccctggc0135]cccccatgccctcctccatetgagttctgt0136]gg3gtggg3Ctggtgccccagggcggcctg0137]gtgggcgtggagtccaactctgatggcgcc0138]gctgtg朋gctggagaaggag朋gCtggElg0139]gccctgcaga郷ElgCtggElgcagtttgcc0140]ggctecacccaggctgatgtgggcctgacc0141]C3g3CC3CC3tctgcaggtttgaggccctg0142]aggcccctgctgC卿3gtgggtgg郷3g0143]tgc朋ggctgagaccctggtgcaggccagg0144]gtg3ggggC33CCtgg3g朋cctgttcctg0145]tcccacattgcccagcagctgggCCtggElg0146]gtcctcctct0147]gctggctccccattctctggcggccctgtc0148]ggcacccctggctetggctccccccacttc0149]g郷gcg郷ccttcccccctgtctctgtg0150]〈210>10151]〈211>14380152]〈212〉HuKlf4optDNA0153]〈400>70154]aagcttectegtetggctgtctctgatgcc0155]ggccctgctggC3ggg卿3gaccctgagg0156]gaggagctgtcccacatgaagaggctgccc0157]gctgctgccacagtggccacagacctggag0158]tccaacctggcccccctgccC￡lgg￡lggg￡lg0159]gacttcatcctgtccaactccctgacccat0160]tcctctgcctctgcctcctcctcctcctcc0161]tccacctgctccttcaccteccccatcagg0162]ggc織ggcggcggcctgctgtetggcagg0163]aacctggctg3C3tC朋tg3tgtctcccca0164]cctgagctggaccctgtctecatccccccc0165]3tgggC朋gtttgtgctgaaggcctccctg0166]tctgtgatctctgtctccaagggctcccctttctctcctcctcctggaggtggaggcgat60g3CCCC3gg3cctggctgtccttccagggc120gtgggccctggctctgaggtctggggcatc180ggCggCEltggcctectgtggccctcaagtg240gagacctcccagcctgagggcgaggctggc300tcccctgagccatgcacagtgacccctggc360cagaaccctg3gg3gtCCC3ggacatc朋g420朋gctgctga3gC3g朋g3ggatcaccctg■ctgggcgtgctgtttggcaaggtcttctcc540cagctgtccttc朋g朋catgtgc朋gctg600gctgac朋caatgag朋cctgcaggagatt660朋gagg朋gaggacctccattgag朋ccgc720cagtgccccaagcccaccctgC3gC3朋tC780朋gg3tgtggtgagggtctggttctgcaac840gactetgccc卿ggg郷Elctttgaggct■tccttccccctggcccctggcccccacttt960acagccctgtactcctctgtgccattccct1020accaccctgggctcccccatgcactccaac1080ctgctgccatccttctccacctttgcctct60caggctggcgccccc朋c朋C3ggtgg郷120cctgtgctgcctggcaggccatetgacctg180tctggcggcgctggcgctgcctgtggcggc2403C3g3gg3gttcaatgacctgctggacctg300ccccctgagtctgtggctgccacagtctcc360ccatcctcctctggccctgcctctgcccca420gctggc朋tgaccctggcgtggcccctggc■gagtctgcccCCCCCCCC3Ccgccccattc540tctggcggctttgtggctgagctgctgagg600cagcagccccagccccctggcggcggcctg660tctgcccctggctctgagtetggctcccca720gatggctcccatcctgtggtggtggcccca780tec皿tggcggcccccccaggacctgcccc皿gatc皿gcaggaggctgtctcctcctgc840acccatctgggcgctggcccccccctgtcc皿tggCC3C3ggcctgctgcccatgacttc■cccctgggcaggcagctgccatccaggacc3CCCCC3CCCtgggcctggagg郷tgctg960tcctccagggactgccatcctgccctgcccctgccccctggcttccatccccatcctggc1020ccc皿ctecccatccttcctgcctgaccagatgcagccccaggtgccccccctgcactac1080C3gg3gCtg3tgccccctggctcctgcatgcctgaggagccc皿gccc皿gaggggcagg1140aggtcctggcCC3gg朋g3ggacagccacccacacctgtgactetgctggctgtggc皿g12003cctecacc3agtcctcccatctgaaggcccatctgaggaCCC3C3C3ggCg3g皿gCC31260teccactgtg3Ctggg3tggctgtggctggaagtttgccaggtctgatgagctgaccagg1320cactec3gg33gC3C3C3ggccacaggccattccagtgcc3g皿gtgtg3cagggccttc1380tccaggtctgaccatctggccctgcacatgttggatccteaagaattc1438〈210〉1〈211〉973〈212〉HuSox2optDNA〈400〉8aagcttgctegcatgtec皿ratgatggagagccccctggcccccagcag60acctctggcggcggcggcggC皿CtCC3C3gctgctgctgctggcggc皿CC3g皿g皿C120tcccctgacagggtga卿ggcccatgaatgccttcatggtctggtcraggggcc卿gg180CCC3gg3g皿ccccaagatgcacaactctg3皿tctcc皿gaggctgggc240gctgagtggaagctgctgtctrattgatg3ggcc皿gagg300ctgagggcccggagcatcctgactec皿gt3C3ggCCC3gg3gg皿g3CC360皿gaccctgatg皿g朋ggacaagtecaccctgcctggcggcctgctggcccctggcggc420aactccatggcctctggcgtgggcgtgggcgctg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