幹擾素拮抗劑和Flt3L拮抗劑的用途的製作方法

2023-07-15 07:39:46 2

專利名稱：：幹擾素拮抗劑和Flt3L拮抗劑的用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及自身免疫疾病治療和與自身免疫疾病相關的診斷測定.
背景技術：
：自身免疫疾病是破壞性的和致殘的疾病，並且當患者的自身免疫系統通過攻擊患者自己的身體或組織而對抗自身時發生.自身免疫疾病的一個示例為系統性紅斑狼瘡(SLE),其特徵為涉及多器官及包括存在自身反應性T細胞和B細胞在內的免疫異常.抗核小體的自身抗體表現為SLE的標誌性特性，這表明對瀕死(凋亡)細胞的不適當處理可能代表了在SLE發展過程中的關鍵致病亊件.SLE是由免疫系統的體液和細胞免疫的調節陣礙引起的，表明最初的改變可能是在參與並控制免疫效應物的細胞，即樹突細胞(DC)的細胞水平上.樹突細胞(DC)是特化的、可引發T細胞介導的免疫應答的抗原呈遞細胞(Steinman，R.M.(1991)Ann.Rev.I咖unology，Vol.9，pp.271-296和Banchereauetal.(2000)Ann.Rev.Inimunol.18:767).DC誘導並支持免疫應答，並且已經證明其可捕獲瀕死細胞並將它們的抗原呈遞給004+T細胞，而CD4+T細胞隨後激活包括B細胞在內的其他免疫效應物.骨拔中的DC祖細胞產生了循環中的祖細胞，它們到達各組織，在其中作為具有高吞噬能力的未成熟細胞而停留.當組織受到損傷時，DC捕獲抗原(Ag)並隨後遷移到淋巴器官，它們在此選擇稀有的Ag-特異性T細胞從而引發免疫應答.DC細胞將抗原呈遞給004+T細胞，其隨後調節包括如004+T細胞和B細胞等抗原特異性的以及如巨噬細胞、嗜酸性細胞和NK細胞等非特異性的免疫效應物.DC也可直接激活B細胞並誘導它們體外分化為漿細胞.三種DC前體("DCpre")亞型在血液中循環(1)CD14+單核細胞，(2)CDllcf拔樣DCpre以及(3)CDllc漿細胞樣(淋巴樣)DCpre.單核細胞可分化為展示出未成熟DC或巨噬細胞(M必)的特徵的細胞.當利用CD40L和/或LPS處理或當利用包括TNF、IL1和IL-6在內的細胞因子聯合培養時，未成熟DC成為成熟DC,CDllc+號樣DCpre產生了間質DC(intDC)、朗氏細胞(LC)或依賴於局部細胞因子環境的M屯.CDllcIL-3Rot+淋巴樣DC前體是幹擾素-ot(IFN-ct)的主要來源.在狼瘡血清中常常發現高水平的IFN-ot(Kimetal.，Clin.Exp.Immunol.70:562-269,1987),此外，IFN-cx治療常常諸導出現自身抗體並最終發展成為包括SLE在內的自身免疫疾病(Ronnblumetal.,J.Intern.Med.227:207-210,1990).已經報導了在SLE患者中存在抗IFN-ot抗體(Suitetal.，Clin.Exp,Rhe鵬tol.1:133-135),已經有報導漿細胞樣(plasniacytoid)DC可產生能夠隨後影響髄樣DC分化及B細胞生長和激活的IFN-ot.Spits等(JExpMedl921775-84，2000)和Blom等(JExpMed192(12):1785-96.2000)報導，人CDllcT漿細胞樣DCs是淋巴來源.Siegal等(Science284:1835，1999)報導，當暴露於失活的單純皰疹病毒時，淋巴樣DC(漿細胞樣DC)產生了大量的IFN-a,Cella等(NatureMedicine5(8):868-70，1999)報導，淋巴樣DC(漿細胞樣DC)反應於產生了大量的IFN-ot及CD40連接。SLE中的自身抗體(autoAb)可鑑定為三類(l)抗核和抗雙鏈DNA抗體；(2)直接抗內皮細胞和血小板表面(抗磷脂/^糖蛋白)的autoAb;以及(3)直接抗造血細胞表面上的分子的autoAb(見如Cabral和Alarcon-Segovia的綜述，(1998)Curr.Open.Rheuniatol.10:409).除由細胞和/或組織抗原-抗體相互作用引起的直接損傷之外，這些疾病症狀中的許多症狀是由免疫複合物在組織上的沉積造成的間接損傷.已經證明此機理對某些形式的SLE腎炎、關節炎和血管炎負責(Lahita，R.G.1999.SystemicLupusErythematosus.AcademicPress;Kammer，G.M.，andG.C.Tsokos.1999.Lupus,HumansPress),包括包含Fc受體("FcR")和C3b-受體("C3b-R")功能陣礙及補體蛋白和C-反應蛋白(均為抗DNA/核小體複合物清除的必需作用分子)的遣傳缺陷在內的免疫複合物清除缺陷均有助於SLE的發展(Lahita,R.G.1999.AcademicPress;Ka咖er,G.M.，andG.C.Tsokos.1999HumanaPress).B細胞在SLE的發病機制中起主要作用，因為它們負責產生自身抗體和高Y球蛋白血症.Hooks等(N,Bngl.J.Med.301:5，1979)對患有包括SLB在內的自身免疫疾病的患者中存在的循環免疫幹擾素進行了描述.Kim等公開了與臨床活性指數相關的IFN-ot水平.Preble等(J.Exp.Med.157:214，1983)和vonWussow等(ArthritisRhum.32:914,1989)公開了在血清IFN陽性和血清IFN陰性SLE患者單核細胞中發現高水平2-5A合成酶和MX蛋白，它們是由IPN-ot特異性誘導產生的兩種蛋白.Vallin等(J.Immunol.163:63061999)公開了IFN-ot誘導的因子作用於具有未成熟DC的特徵的白細胞.Batteux等(Eur.CytokineNetw.10:509，1999)公開了利用SLE血清誘導產生IFN-a是依賴於Fc-II(CD32)的.IFN-ot治療的一種併發症為誘導自身免疫紊亂(約W一19X的患者中)，其中最普遍的為甲狀腺功能陣礙(Ehrensteinetal.，ArthritisRhe亂36:279,1993;0kanoueetal.，J.Hepatol.25:283,1996;Ronnblometal.，Ann.Intern.Med.115:178，1991，Kalkneretal.,Qim.91:393，1998),的確，Schi11ing等(Cancer68:1536，1991)公開了IFN-a治療也可誘發機率為0.15^-0，W的SLE.每個病例都與誘導或顯著增加抗核抗體和抗DNA抗體的滴度相關聯.I型糖尿病為另一種自身免疫疾病，其中IFN-a起了重要的致病作用，Foulis等(Lancet2:1423,1987)和H訓g等(Diabetes44:658，1995)公開了胰烏對IFN-oc的表達和人自身免疫糖尿病的產生間存在強關聯.此外，Chakrabarti等(J.Immunol.157:522，1996)公開了胰島中的B細胞對IFN-a的表達在轉基因小鼠模型中引起了糖尿病，此夕卜,Fabris等(Lancet340:548，1992)和Guerci等(Lancet343:1167，1994)公開了IFN-a治療可誘導人I型糖尿病.FMS樣駱氨酸激酶3("Flt3")是也包括KIT(c-kitRTK)、FMS(M-CSFRTK)和血小板來源的生長因子(PDGF)受體在內的III型路氨酸激酶受體家族中的成員，與KIT和FMS受體的配體，即幹細胞因子和M-CSF類似，Flt3受體由命名為Flt3-配體("FU3L'，)的相關分子所激活.Flt3為與c-fms和c-kit受體相關的酪氨酸受體的變體形式(Rosnetetal，Oncogene,6,16411650,1991).Flt3L為已經證明可促進DC的增殖並產生抗腫瘤免疫應答的造血細胞因子(見美國專利No.5，"4，512，"Flt3受體的配體").已經發現FU3L可調節祖細胞和幹細胞的生長與分化(Blazaretal.(2001)BiologyofBloodandMarrowTransplantation7:197-207及見美國專利No.5,843,423)，已經證明單核細胞培養物的Flt3L處理可造成徵樣和淋巴樣相關的DC絕對數目的顯著增加以及供體脾T細胞比例減少(Blazaretal).本專利申請中參考的所有出版物的公開內容(包括美國專利、公開的PCT申請、科學文獻、書、手冊等)在此處全文引用作為參考文獻.
發明內容本發明涉及治療受試者的自身免疫疾病的方法，其包括給予受試者有效量的(a)至少一種降低I型幹擾素活性的幹擾素拮抗刑，以及(b)至少一種降低FU3L活性的Flt3配體(Flt3L)拮抗刑，從而減少受試者的單核細胞到樹突細胞的分化並治療自身免疫疾病.本發明也涉及抑制單核細胞分化為能夠進行抗原呈遞的樹突細胞的治療組合物，該組合物包含(a)至少一種降低I型幹擾素活性的幹擾素拮抗刑，以及(b)至少一種降低Flt3L活性的FU3配體(Flt3L)拮抗刑.這樣的組合物構成了用於治療包括但並不局限於SLE以及其他包括但並不局限於糖尿病、關節炎、AIDS、銀屑病及甲狀腺炎在內的IFN-ot介導的自身免疫疾病的治療組合物，本發明也涉及確定受試者發生自身免疫疾病的風險的體外測定法，該方法包括(a)從受試者獲取血清樣品，(b)對血清樣品中的IFN-a和Flt3配體(Plt3L)進行定量；以及(c)將IFN-a和FU3L的量與患有自身免疫疾病的患者血清中的IFN-a和PlUL量進行比較，從而確定受試者發生自身免疫疾病的風險.本發明也涉及用於確定受試者發生自身免疫疾病的風險或用於監測受試者的自身免疫疾病狀態的試刑盒，該試劑盒包含可有效檢測受試者生物樣品中的Flt3L和IFN-ot的量的特異性結合於FltSL和IFN-oc的組合物.此試刑盒含有的組合物中包含(a)結合Flt3L的單克隆抗體及(b)結合IFN-a的單克隆抗體.此外，這些組合物是可進行檢測的。此試刑盒可以包含一種或多種用於檢測與一個或多個樣品結合的組合物的量的試刑.圖1圖示了SLE中的樹突細胞亞型間的相互作用，其展示了淋巴樣(漿細胞樣)DC和/或它們的產物如I型幹擾素間的關係以及髄樣DC的分化。拔樣DC的分化起始了抗原呈遞級聯從而導致了有助於SLE發病的自身反應性T細胞和B細胞分化.圖2A_2E為展示從正常供體純化的單核細胞的照片，當利用SLE患者血清培養時而不是利用自體血清(AS)培養時，這些單核細胞可聚成簇並獲得樹突細胞的形態學.利用AS血清(圖2C)或SLE血清(圖2A-2B)對單核細胞進行培養.圖2D描述了SLE血清誘導的面紗細胞簇，在圖2E中，對利用SLE血清培養了24小時的細胞自旋(cytospun)單核細胞進行吉姆薩染色展示了具有典型的成熟DC形態學的細胞("SLE-DCs"-SLE血清誘導的DC),圖3圖示了用SLE血清培養的獲得了成熟DC表型的單核細胞的流式細胞術結果.每個圖展示了對特異於每個圖下所列的細胞表面標記的標記抗體進行的檢測的增加.利用SLE血清(下困)培養的單核細胞，而不是利用自體血清(上圖)培養的單核細胞下調CD14表達、上調HLA-DR及共刺激分子如CD86、CD80和CD40的表達並獲得了成熟DC標記CD83的表達.水平軸表示同種型對照(虛線)和特異性抗體(實線)的螢光強度的對數值.縱軸表示相關的細胞頻率.圖4A-4E圖示了流式細胞術結果，其表明利用SLE血清培養的富集的單核細胞可捕獲可溶性抗原，利用SLE血清(困40和48)(SLE1和SLE2表示取自兩個不同SLE患者的血清)或AS血清(圖4C)對富集的單核細胞進行培養並在4TC(細線)和"1C(粗線)下利用FITC-葡聚糖(FITC-DX)攝取確定它們的內吞活性，利用GM-CSF和IFN-ex("GM-IFNa")培養的細胞(圖4B)以及利用GM-CSF和IL-4("GM/IL4")培養的細胞(圖4A)(其為體外DC培養的標準)展示出相當的FITC-DX攝取水平，利用AS血清培養的單核細胞不攝取FITC-DX,圖5為一直方圖，其表明利用SLE血清培養，而不是利用AS血清培養的單核細胞誘導了異體幼稚CD"T細胞的增殖.對利用GM/IFN-oc、GM/IL4、SLE1、SLE2和AS血清培養的單核細胞進行洗滌，並在分級劑量(1000細胞和5000細胞)下利用lxl0'個幼稚CD4+CD45RA+8異體T淋巴細胞培養5天，利用胸苷摻入對T細胞增殖進行確定(cpmx103，縱軸)。圖6圖示了在AS血清中培養的SLE-DC或DC誘導的T細胞產生的T細胞細胞因子水平.利用ELISA測定法測定了細胞因子的釋放，且在縱軸上以pgx107mL顯示IL-10和IFN-y,圖7A、7B和7C利用照片展示了SLE-DC對自體凋亡細胞的捕獲.對利用SLE血清(圖7A和7B)和AS血清(困7C)的過夜培養物的細胞自旋進行吉姆薩染色，箭頭表示對利用SLE血清培養的培養物中的細胞碎片的捕獲.圖8A和8B圖示了對異體凋亡細胞的捕獲以及將它們的抗原呈遞給自體CD4+T細胞.圖8A描迷了利用7AAD水平的升高表示的SLE-DC對含有凋亡小體的DNA的捕獲的流式細胞術結果.加栽了抗原的DC用作自體CD4+T細胞增殖的刺激物(利用胸苷摻入測定，縱軸)(圖8B).困9A-9B圖示了SLE疾病活動與SLE-DC的IFN-ot誘導活性間的關係。圖9A展示了誘導活性和SLEDAI間的關係.圖9B展示了誘導能力和血清中IFN-ct水平之間的關係，每個困上的每個點表示從患者中取出的血清.圖10圖示了對SLE患者血清中的IFN-a的阻斷.如圖所示，在不添加或添加同種型對照或抗體中和IFN-a的情況下，利用SLE血清產生了抗原呈遞細胞.對細胞進行洗滌，並以指定劑量利用純化的異體CD4+T細胞(lx105)將其作為刺激物細胞進行培養5天.利用胸苷摻入對T細胞增殖進行確定(cpmx103，縱軸).圖11表明SLE患者具有高IFN-a血清水平.從45個SLE患者和28個正常患者中採取血清樣品.圖12圖示了SLE患者外周血單核細胞(PBMC)反應於病毒引發而體外分泌IFN-ot.在存在或不存在流感病毒(10ng/mL)的96孔板中培養總PBMC。培養24小時後收集上清液，並利用ELISA進行IFN-oc釋放測定."All-"表示不舍病毒的對照培養物中的水平."+"表示利用病毒進行的培養."ND"表示正常供體.圖13A和13B展示了IFN-a體外誘導BAFF/Blys(TNF家族的B細胞激活因子)/Blys(B淋巴細胞刺激物)在單核細胞上的表達以及BCMA(B細胞成熟抗原)在PBMC上的表達.圍13A展示了在指定條件下(IFN-otU/mL)進行72小時培養的單核細胞中的相對BAFF表達(ng/ng1SS核糖體RNA).NI指取自同一供體的對照未培養單核細胞.圖1SB展示了在未培養的(NI)或利用1000U/mLIFN-a進行指定時間培養的PBMC中的相對BCMA表達(ng/ng18S).利用ABIPRISM7700序列檢測系統(ABI)進行實時PCR以評估相對RNA表達.利用靶表達(BAFF或BCMA)對參照(18S核糖體RNA)的比值對表達水平進行標準化.圖14A-14C圖示了利用漿細胞樣DC(pDC)對IFN-cx分泌進行的TNF調節，圖l"表明內源TNF的中和導致由CD123+pDC持續釋放IFN-cc,垂直軸展示了在指定條件下產生的、以ng/mL表示的IFN-a水平，圖14B-14C表明向pDC中添加TNF抑制了病毒誘導的IFN-a釋放.圖14B在垂直軸上表明分泌到培養物上清液中的IFN-a的抑制百分比.圖14C在垂直軸上展示了培養物上清液中以ng/mL表示的IFN-a的水平.圖15圖示了流式細胞術實驗，其表明TNF阻斷了漿細胞樣DC的分化，而有利於徵樣DC的分化.此圖描述了從定向造血祖細胞產生pDC的TNF抑制.在進行培養的笫一周，在Flt3L(100ng/mL)、TPO(30ng/mL)及IL-6(25ng/mL)或TNF100ng/mL存在下培養CD34+CD45RA-造血祖細胞.其後，對細胞進行洗滌，並僅僅利用FU3L(100ng/mL)對其進行為期3周的額外培養.利用CDllc陰性CD123陽性染色對pDC進行鑑定，對細胞表面標記表達進行流式細胞術以確定pDC的分化.圖16圖示表明漿細胞樣DC中的途徑，該途徑可被作為幹擾素拮抗刑的外源TNF所抑制.圖17圖示了SLB患者血清中FU3L(pg/mL)水平的升高，圖18圖示了SLE患者中的FU3L血清水平與利用SLEDAI測得的疾病活動度間的關係.利用線性回歸和Pearson分析確定了其統計學圖19A-19D利用照片展示了利用添加有Flt3L的培養基培養的單核細胞向具有DC形態的細胞的分化.圖20困示表明利用添加有FU3L(100ng/mL)的培養基培養的單核細胞能夠激發幼稚(^)4+T細胞.圖21圖示了DC亞型發育和分化中的幾個途徑，並且可通過阻斷Flt3L和IFNot的活性來對這些途徑進行改變.閨"圖示了SLE中的細胞因子和DC間的相互作用並對有意用於本發明中的治療組合物的細胞因子和/或細胞把進行鑑定.具體實施例方式本發明涉及治療受試者的自身免疫疾病的方法，其包括給予受試者有效量的(a)至少一種降低I型幹擾素活性的幹擾素拮抗刑，以及(b)至少一種降低Flt3L活性的Flt3配體(Flt3L)拮抗刑，從而減少受試者的單核細胞到樹突細胞的分化並治療自身免疫疾病，此外，本(DC)的組合物，該組合物包含(a)至少一種降低I型幹擾素活性的幹擾素拮抗劑，以及(b)至少一種降低Flt3L配體活性的Flt3配體拮抗刑。例如，組合物的一種成分可為減少或抑制I型幹擾素(如IFN-a)及其受體間結合或相互作用的拮抗刑，此組合物也包含減少或抑制Flt3L及其受體間的結合或相互作用的拮抗刑.此處所用的"SLE-DC"指通過利用SLE患者血清("SLB血清")培養單核細胞而獲得的樹突細胞.此處所用的"幹擾素拮抗刑"包括能夠降低受試者的細胞中或體外細胞中I型幹擾素的活性或功能的抗體、抗體的抗原結合片段、多肽、肽模擬物、編碼多肽的核酸、有機分子或其組合.此處所用的"多肽"包括任何長度的肽及蛋白質，不管它們的功能如何，此處所用的"I型幹擾素"包括IFN-(x、IFN-P、IFN-varpi和IFN-tau,Oritani等((2001)CytokirzeGrowthFactor-Rev.12(4):337-48)提供了對其他I型幹擾素示例的描述.幹擾素拮抗劑幹預了I型幹擾素(如IFN-cx)及其受體間的相互作用，通過減少單核細胞到成為抗原呈遞細胞的DC的分化而減少抗原呈遞細胞的產生.可通過一或多種不同的機理來實現抗原呈遞細胞的生成減少，但確切的機理對於本發明來講並非重要的.例如，TNF和/或激動性抗TNF受體抗體可通過加速pDC到I型IFN非生產細胞的分化來減少I型幹擾素的分泌.可利用多種測定方法來鑑定化合物是否為在本發明中有用的幹擾素拮抗劑，這些測定法對於本領域中的技術人員來講是已知的，一種測定法為樹突細胞分化測定，其中在適於單核細胞分化為DC的條件下將待測定化合物添加到單核細胞培養物中.實驗條件包括添加SLE血清或幹擾素，這樣單核細胞就可誘導分化為DC.因此，與沒有進行化合物添加的培養物中的單核細胞分化相比，如果化合物引起了對幹擾素和/或SLE血清驅動的單核細胞到DC的分化的抑制，那麼此化合物便為幹擾素拮抗劑.另一種可鑑定幹擾素拮抗刑化合物的測定法為結合測定，其中測定了對標記的幹擾素與細胞上的受體間的結合的抑制.如果化合物能夠抑制幹擾素與其受體或與具有幹擾素受體的細胞的結合，則此化合物為幹擾素拮抗刑.此外，一種可確定化合物是否為幹擾素拮抗刑的測定法為測定細胞對反應於正常情況下誘導幹擾素產生和/或分泌的觸發因素，如病毒而產生的幹擾素的抑制的測定法.因此，如果存在化合物和觸發因素(如病毒)，能夠正常產生幹擾素的細胞不產生幹擾素或產生了水平降低的幹擾素，那此化合物為幹擾素抑制刑.另一種確定化合物是否為幹擾素拮抗刑的測定法為腫瘤細胞存活測定.幹擾素通過直接生長抑制和/或誘導腫瘤細胞死亡而具有抗腫瘤活性.這些易感於幹擾素的腫瘤細胞的示例包括黑色素瘤細胞系，這種腫瘤細胞存活測定法測定了在幹擾素和幹擾素拮抗劑存在情況下培養的易感黑色素瘤細胞的存活.因此，與不含待測化合物的完全相同的培養物相比，如果腫瘤細胞在含有待測化合物的培養基中能夠存活，那此化合物為幹擾素拮抗刑.作為實例，另一種鑑定化合物是否為幹擾素拮抗刑的測定法為對包括MXA蛋白在內的幹擾素可誘導的蛋白以及幹擾素調節因子的表達(在蛋白質和/或RNA水平上)進行定量的測定法，因此，將待測化合物添加到培養基中並測定特定幹擾素可誘導的蛋白的蛋白質和RNA水平，如果化合物的添加降低了蛋白質和/或mRNA表達水平，那麼此化合物為幹擾素拮抗刑，另一種確定化合物是否為幹擾素拮抗劑的測定法為體外保護測定.正常情況下，向細胞培養物中添加幹擾素可保護細胞免於遭受由導入細胞培養物中的病毒引起的細胞裂解，從而提高了培養基中細胞的存活.因此，添加幹擾素拮抗刑取消了此保護且細胞存活將不會增加.因此，如果測定到對幹擾素的抗病毒活性的抑制，那麼此化合物為幹擾素拮抗刑.此抑制性測定是基於對易感於病毒的細胞的死亡確定.幹擾素拮抗刑的示例包括但並不局限於特異性結合IPN-ci的單克隆抗體.幹擾素拮抗刑的另一實施例為可溶性IFN-oc受體.可溶性受體可用於結合循環I型幹擾素從而防止其與其天然受體結合併阻止單核細胞到DC的分化.在本發明的另一實施方案中，幹擾素拮抗刑可為與結合IFN-oc受體結合但並不引起此結合的下遊效應的有機分子，也即非功能性受體配體模擬物.這樣的有機分子可與受體的IFN-ct結合袋特異性結合而不引起受體激活，從而替代可進行這樣的結合的IPN-a並使受體無效.在本發明進一步的實施方案中，幹擾素拮抗劑包括含有可特異性結合幹擾素或Plt3L或二者的單克隆抗體互補決定區(CDR)的肽.而在本發明的另一實施方案中，幹擾素拮抗刑為融合蛋白.本發明中有用的幹擾素拮抗刑可通過多種不同的機理降低I型幹擾素的活性，並且本發明不依賴於任何特定機理.本發明的幹擾素拮抗刑包括但並不局限於具有降低的體內活性或不具有體內活性的修飾的IFN-ct.對於利用I型幹擾素破壞抗原呈遞細胞的產生來講，幹擾素可在幹擾素信號傳遞途徑中的多種不同的接合部位影響I型幹擾素的活性.正如一些例子，拮抗刑可阻斷幹擾素蛋白本身的活性；可阻斷I型幹擾素受體的活性；抑制幹擾素與受體的結合；阻斷I型幹擾素信號傳遞和/或轉導途徑；阻斷I型幹擾素從正常產生l型幹擾素的細胞中釋放；阻斷正常產生I型幹擾素的細胞的生成；以及阻斷I型幹擾素從正常分泌I型幹擾素的細胞中分泌.對正常產生幹擾素的細胞的分化或產生的抑制可通過給予細胞TNF和/或激動性抗TNF受體抗體和/或可提供給細胞TNF樣信號的分子來實現.這些類型的化合物是本發明提供的幹擾素拮抗刑示例，此外，抗原呈遞細胞的分化和生長所需的I型幹擾素輔因子的滅活為本發明的幹擾素拮抗劑的另一可能機理，此處所用的"FU3L拮抗劑"包括能夠降低Flt3L活性的抗體、抗體的抗原結合片段、多肽、肽模擬、編碼多舦的核酸、及有機分子或它們的組合.例如，FU3L拮抗刑可幹擾FU3配體("FU3L'，)及其受體間的相互作用從而抑制祖細胞分化為樹突細胞.抗原呈遞細胞產生的減少可通過一或多種不同機理來實現.例如，FU3L有助於持續的DC激13活，從而依次驅動SLE中的自身抗原呈遞，因此，Flt3LI為治療幹預的靶，F1UL有可能在SLE自身免疫病的發生或持續中起重要的作用，從而使得Flt3L拮抗刑在自身免疫疾病治療中具有有用性.在一個實施方案中，鑑定幹擾素拮抗刑的治療性有效刑量的測定法為確定降低幹擾素受體與待治療的受試者血清體外結合所必需的幹擾素拮抗刑量.在該實例中，降低50%體外結合所必需的濃度為體內治療的有效濃度.可利用一相同的FU3L測定來確定用於特定患者或受試者的Flt3L拮抗刑的有效量，可利用多種測定法來測定一種化合物是否為本發明中有用的FU3L拮抗劑，一個測定法為樹突細胞分化測定法，其中要在適於單核細胞分化為DC的條件下將待檢測化合物添加到單核細胞培養物中，這些條件包括向單核細胞培養物中添加Flt3L，這樣可誘導單核細胞分化為DC.因此，與沒有添加化合物的單核細胞培養物相比，如果化合物至少抑制了50。/。的單核細胞到DC的分化，那麼此化合物為Flt3L拮抗刑.另一確定化合物是否為FU3L拮抗刑的測定法是確定對標記的Flt3L與其受體間結合的抑制的測定法.在此測定法中，將可檢測標記連接到Flt3L上，並在存在和不存在化合物的條件下允許此標記的Plt3L與其受體進行結合.如果在存在化合物的條件下引起Flt3L與其受體結合下降，則此化合物為FU3L拮抗刑.另一用於確定化合物是否為Flt3L拮抗刑的測定法為體外增殖測定，為了誘導它們的分化和/或增殖，將人造血祖細胞與Flt3L進行培養，將待檢測化合物添加到一些培養物中，而另一些培養物不添加化合物。對比添加和不添加化合物的培養物以確定增殖和分化的量.如果存在對Flt3L驅動的人造血祖細胞的增殖和/或分化的抑制，那此化合物為Flt3L拮抗劑.另一用於確定化合物是否為PU3L拮抗刑的測定法為體外增殖測定。在向培養物中添加或不添加化合物的情況下培養人因子依賴型B細胞系.這樣的細胞系的一個示例為進行工程化來表達Flt3的細胞系，如果添加有化合物的培養物展示出PU3L驅動的、對人因子依賴型B細胞系增殖至少50%的抑制，那麼此化合物為Flt3L拮抗刑，另一用於確定化合物是否為Flt3L拮抗刑的測定法為體內測定，給予小鼠FU3L,對它們的包括樹突細胞在內的造血細胞進行體內增殖.給予對這些小鼠待檢測化合物或不給予待檢測化合物，並對小鼠中的造血細胞水平進行測定.因此，小鼠體內包括樹突細胞在內的造血細胞的Flt3L介導的增殖的抑制表明此化合物為FU3L拮抗刑，Flt3L拮抗刑的一個示例為特異性結合Flt3L的單克隆抗體.另一Flt3L拮抗刑示例為可溶性Flt3L受體，可溶性受體可用於結合循環Flt3L從而防止其與其天然受體結合併阻止單核細胞到DC的分化.在本發明的一個實施方案中，FU3L拮抗刑可為與Flt3L受體結合但並不引起此結合的下遊效應的有機分子，也即受體配體模擬物.這樣的有機分子可與受體的FU3L結合袋特異性結合，從而替代可進行這樣的結合的Flt3L,本發明的Flt3L拮抗刑也包括含有上述單克隆抗體的互補決定區(CDR)的多肽，或為其融合蛋白.此處應用的術語"人單克隆抗體"(HuMAb)指從人B細胞獲得的HuMAb(例如，不管抗體是通過培養永生化和/或激活的人B細胞製備得到的，還是從編碼此HuMAb的人B細胞cDNA重組獲得的，也不管此抗體與可改變其生物活性的分子如受體或配體、酶、毒素、栽體等結合與否)以及將本發明中一個同種型(如IgG4)的HuMAb的可變區與另一同種型(如人IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgD，IgM或IgE)的人抗體的恆定區重組製得的抗體.製備這些HuMAb的重組方法在本領域中是已知的(見美國專利No.5,959,085).給予幹擾素拮抗刑和FU3L拮抗刑的聯合可取得利用較少的每種分子來減少DC產生的優勢.這樣的協同性在允許降低本發明的方法和組合物中每種拮抗刑的治療有效量方面是有益的.在本發明的一個實施方案中，幹擾素拮抗刑和F1UL拮抗刑或二者可為多肽.此多肽可為肽模擬物、合成多肽、天然多肽的衍生物、修飾的多肽、標記的多肽、或包含非天然肽的多肽.此多肽可完全或部分為具有自然界未發現的手性，也即D-胺基酸或L-胺基酸之外的手性的非天然多肽.這些肽中非天然鍵的應用可延長半衰期並保護肽免於天然酶的降解.在本發明的另一實施方案中，自身免疫疾病選自獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)、強直性脊柱炎、關節炎、再生陣礙性貧血、白塞氏病、糖尿病、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、溶血性貧血、低y球蛋白血症、高IgE症候群、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、多發性硬化症(MS)、重症肌無力、牛皮褲、狼瘡及它們的任何組合.糖尿病(diabetes)可為但並不局限於糖尿病(diabetesmellitus)、I型糖尿病、II型糖尿病、幼年起病型糖尿病及它們的組合.關節炎可為但並不局限於類風溼性關節炎、幼年型類風溼關節炎、牛皮癬關節炎或它們的任何組合.狼瘡可為系統性紅斑狼掩(SLE)或藥物誘導的狼瘡.在本發明的一個實施方案中，受試者為哺乳動物.哺乳動物可為人或靈長類動物.受試者可為人類患者或展示人免疫疾病症狀的動物，因此也可為人疾病的動物模型，如鼠轉基因疾病模型或靈長類動物疾病模型或在SCID小鼠中利用人免疫系統重建的人疾病模型.哺乳動物可為但並不局限於人、靈長類動物、大鼠、狗、貓、豬.在本發明的另一方面，受試者為鼠受試者、牛受試者、靈長類動物受試者、馬受試者、豬受試者或犬受試者.在本發明的另一方面，受試者患有SLE.在本發明的一個實施方案中，幹擾素拮抗劑包括抗IFN-ct抗體或其抗原結合片段.在本發明的另一實施方案中，幹擾素拮抗刑為TNF.在本發明的另一實施方案中，FU3L拮抗刑包括抗Fl13L抗體或其抗原結合片段.在本發明的一個實施方案中，可作為組合物的成分的抗體包括單克隆抗體、嵌合抗體、抗獨特型抗體、人源化抗體、靈長類動物化(primatized)抗體及它們的任何結合.在本發明的另一實施方案中，幹擾素拮抗刑和Flt3L拮抗刑為一個分子的部分.在本發明的一個實施方案中，幹擾素拮抗刑的有效量為相對於受試者血清中幹擾素量約i-io倍摩爾過量.在本發明的另一方面，PU3L拮抗刑的有效量為相對於受試者血清中F1UL量約1-10倍摩爾過量.本發明的方法包括給予患者組合物，其中組合物抑制了通過IFN-oc誘導拔樣DC成熟為具有抗原呈遞活性的DC,組合物給藥可通過靜脈內注射、硬膜下注射、口服、局部給藥、皮膚給藥、皮下給藥、腸胃外給藥和通過氣溶膠給藥本發明中的組合物對受試者的給藥方式包括病變內、腹膜內、肌內或靜脈內注射；輸注；脂質體介導的遞送；或局部、弄、口、眼或耳遞送.在進一步的實施方案中，給藥包括氣管內給藥、肛門或鞘內給藥.本發明中的組合物可進行每小時、每天、每周、每月、每年給藥(如以緩釋形式)或一次性遞送.此遞送可為持續一段時間的連續遞送，如靜脈內遞送.本領域中的技術人員可很容易的確定優選的給藥途徑和給藥時間.在本發明的一個實施方案中，幹擾素拮抗刑減少了I型幹擾素與其受體的結合.在另一實施方案中，幹擾素拮抗刑幹預了幹擾素與受試者細胞上受體結合後的信號轉導，在另一實施方案中，幹擾素拮抗刑減少受試者體內細胞產生的幹擾素，在另一實施方案中，幹擾素拮抗刑減少了患者體內細胞的幹擾素分泌.而在另一實施方案中，幹擾素拮抗刑降低了患者體內幹擾素的生物利用度.在進一步的實施方案中，幹擾素拮抗刑為TNF.在本發明的另一個實施方案中，組合物進一步包含栽體.在本發明的另一實施方案中，栽體包括含水栽體、脂質體或脂質栽體.包含在本發明的組合物中的化合物可以是至少部分為非天然的肽模擬化合物.肽模擬化合物可為具有FU3L或Flt3L受體或I型幹擾素或I型幹擾素受體的部分胺基酸序列的小分子類似物.此化合物由於其模擬作用而具有提高的穩定性、有效性、效力和生物利用度.此外，化合物具有降低的毒性.肽模擬化合物具有增強的黏膜腸通透性.此化合物可通過合成方法製備.本發明的化合物可包括L-、D-或非天然胺基酸、d，cc-二取代胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸(丙氨酸的等電類似物).化合物的肽主鏈至少可以具有至少一個被PSI-[CH-CH]所取代的鍵.化合物可以進一步包括三氟酪氨酸、對氟苯丙氛酸、對溴苯丙氨酸、聚-L-炔丙基甘氨酸、聚-D，L-烯丙基甘氨酸或聚-L-烯丙基甘氨酸，本發明的一個實施方案為肽模擬化合物，其中此化合物具有被合適的模擬物取代的鍵、肽主鏈或胺基酸成分.可被合適的氡基酸模擬物取代的非天然氛基酸的示例包括P-丙氨酸、L-a-氨基丁酸、L-v-氨基丁酸、L-a-氨基異丁酸、L-s-氨基己酸、7-氨基庚酸、L-天冬氨酸、L-穀氨酸、半胱氨酸(乙酖氨基甲基)、N-s-Boc-N-a-CBZ-L-賴氨酸、N-e-Boc-N-a-Fmoc-L-賴氨酸、L-甲碟氨酸鞏、L-正亮氨酸、L-正纈氨酸、N-a-Boc-N-8CBZ-L-烏氨酸、N-5-Boc-N-ot-CBZ-L-鳥氨酸、Boc-對硝基-L-苯丙氨酸、Boc-羥基脯氨酸、Boc-L-疏代脯氨酸.在一個實施方案中，化合物為肽，其中游離氨基已通過衍生作用進行了滅活.例如，肽可為芳基衍生物、烷基衍生物或酐衍生物，可對肽進行乙醯化.對肽進行衍生以中和其淨電荷.本發明中的組合物的一個實施方案為能夠切割編碼I型幹擾素或FU3L的mRNA的核酶.見Cech等，美國專利No.4,987,071;Altman等，美國專利No.5,168,053;Haseloff等，美國專利No.5,254,678;公開的歐洲專利申請No，Hampel等，EP360，257.在一個實施方案中，本發明的治療組合物為重組核醉，並對其進行工程化以切割I型幹擾素mRNA和/或FU3LmRNA.在本發明的另一方面，組合物可以包含重組的核酸，該重組核酸為能夠切割編碼IFN-ot的mRNA及編碼Flt3L的mRNA的核酶，此外，本發明提供了能夠結合編碼Flt3L或I型幹擾素的mRNA並抑制這樣的mRM翻譯為蛋白質的反義核酸.本發明表明樹突細胞是SLE和其他自身免疫疾病發病中的關鍵因素，這樣，樹突細胞和/或它們的產物是治療SLE和其他自身免疫疾病的關鍵把.作為自身免疫疾病的一個示例，SLB是淋巴樣DC釋放大量包括IFN-cc在內的細胞因子的疾病，隨後這些細胞因子激活敗樣DC以激發並維持自身免疫反應.DC亞型間的相互作用可用來解釋在SLE患者血清中發現的(l)具有廣譜的、主要抗核抗原的自身抗體的顯著B細胞改變，(2)自身反應性CD4+T細胞和(3)高水平I型幹擾素.這些觀察結果支持了樹突細胞明顯參與SLE和其他自身免疫疾病的發病。如此處所公開的，圖1圖解了不受控制的IFN-cx釋放的結果及其在SLE發病機制中的作用，SLE起始損傷是觸發漿細胞樣(淋巴樣)DC以不受控制的方式分泌IFN-a的一個因素.觸發成分包括病毒、細菌及它們的產物如CpGDNA以及藥物.不受控制的IFN-a幹放由持續存在的漿細胞樣(淋巴樣)DC激活劑如慢性病度感染、或沒有從循環中適當清除的免疫複合物，如通過FcR多態性或缺乏補體成分所起始，漿細胞樣DC分化為可向T細胞呈遞觸發成分的成熟DC.釋放的IFN-oc(可能有其他細胞因子)誘導包括單核細胞在內的徵樣DC循環前體的激活，而這些前體可捕獲SLE血液中日益增加的凋亡細胞.號樣DC對洞亡細胞進行加工並將它們的抗原呈遞給自身反應性T細胞和/或B細胞，自身反應性T細胞和加栽了凋亡細胞的DC—起進一步激活了自身反應性B細胞.在DC的幫助下，這些細胞分化為漿細胞，IFN-ct也直接促成自身反應性B細胞的產生，因為其可打開SLE中特徵為循環血B細胞的部分生發中心表型(CD38誘導)，利用單核細胞，即健康供體血液中鏈樣DC的最豐富的前體，開發了利用SLE患者血清誘導免疫原性DC的方法.這樣的DC是活性抗原呈遞細胞，它們可捕獲凋亡細胞並將它們的抗原呈遞到自體004+T細胞，從而推動它們的激活和增殖.這樣的亊件序列解釋了SLB的致病亊件.狼瘡血清中I型幹擾素的阻斷可防止這樣的DC的形成，可通過將DC前體與I型幹擾素一起培養來增殖DC.漿細胞樣(淋巴樣)DC的產物誘導徵樣DC的分化，因此支持抗原呈遞，從而推動了致病進程.在本發明的一個實施方案中，本發明中的治療組合物包括兩種成分(l)Flt3L拮抗刑和(2)幹擾素拮抗刑.在本發明的另一實施方案中，可將這些成分一起融合到一種化合物或分子中，如包含抗每種Fl13L和IFN-ot或另一I型幹擾素的拮抗性或竟爭性肽的融合蛋白.罔此，融合肽可以包含作為PU3L活性的竟爭性抑制刑和作為IFN-cx的活性的竟爭性抑制刑的肽的部分.在本發明的另一方面，組合物可以包含抗每種Flt3L和IFN-ot、每種抗體的抗原結合片段(如CDR片段)或包含抗體的活性(抗原結合)片段的融合蛋白的單克隆抗體.在本發明的另一方面，組合物可由能夠幹擾FU3L及其受體間的相互作用且能夠幹擾IFN-oc活性的小有機分子組成.在本發明的一個方面，組合物可包含與Flt3L和IPN-ot特異性結合的單克隆抗體的互補決定區(CDR).可用作I型幹擾素如IFN-ot或Flt3L的拮抗刑的多肽可為源於各自的受體的結合位點的多肽.此外，可合成非功能性IFN-ot或Flt3L(竟爭受體結合但並不在具有受體的細胞中激發應答的多肽).這樣的非功能性肽的示例為具有與受體結合的完全能力但不具有激活具有受體的細胞的任何能力的肽.可對多肽中的正常胺基酸進行取代或添加或缺失.保守胺基酸取代包括纈氨酸取代丙氨酸；賴氨酸取代精氨酸；穀氨跣胺取代天冬跣胺；穀氨酸取代天冬氨酸；絲氨酸取代半胱氨酸；天冬醯胺取代谷氡跣胺；天冬氨酸取代穀氨酸；脯氨酸取代甘氨酸；精氨酸取代組氨酸；亮氨酸取代異亮氛酸；精氨酸取代賴氨酸；亮氨酸取代蛋氨酸、亮氨酸取代苯丙氨酸；甘氨酸取代脯氨酸、蘇氨酸取代絲氨酸；絲氨酸取代蘇氨酸；路氨酸取代色氨酸；苯丙氨酸取代酪氨酸以及亮氨酸取代纈氨酸.本發明提供了治療自身免疫疾病的新穎方法，其包括阻斷I型幹擾素對抗原呈遞細胞產生的促進能力.此外，本發明也提供了體外診斷測定法以評估患者發生自身免疫疾病的相對風險和/或監測患者的疾病進展.本發明提供了(a)降低I型幹擾素活性(例如降低I型幹擾素及其受體間的結合)的幹擾素拮抗劑，以及(b)降低Flt3配體(Flt3L)活性(例如減少FU3L及其受體間的結合)的Flt3配體(Flt3L)拮抗劑在製備可用於治療受試者的自身免疫疾病的組合物中的應用，在本發明的一個實施方案中，在分開的時間給予受試者至少一種幹擾素拮抗刑和至少一種FU3L拮抗刑.在另一實施方案中，同時給予兩者.例如，可在早上給予一種拮抗刑而在晚上給予另外一種拮抗刑.拮抗刑給藥的時間和頻率不一定相同.如本發明所示，I型幹擾素或含有I型幹擾素的血清是產生包括但並不局限於DC的抗原呈遞細胞的必要因素.本發明展示了這些抗原呈遞細胞，它們可通過呈遞捕獲的凋亡細胞的抗原來驅動自體004+T細胞的增殖.在本發明中，通過阻斷I型幹擾素的活性就可減少分化、抗原捕獲和抗原呈遞這一過程.此治療方法可用於通過在具有適當的遺傳背景和高發病風險的患者中抑制疾病的進展(治療應用)和抑制疾病發生(預防性治療)來治療自身免疫疾病.I型幹擾素蛋白和/或FU3L的阻斷包括但並不局限於利用抗體(多種抗體)來中和它們產生抗原呈遞細胞的能力.I型幹擾素受體或Flt3L受體的阻斷包括但並不局限於利用抗體、肽或化學物質特異性阻斷可導致抗原呈遞細胞產生的配體及其受體間相互作用.本發明中有用的用於遞送抑制性拮抗刑(也即本發明中的組合物)的方法包括但並不局限於蛋白和編碼蛋白的栽體.在本發明的一個實施方案中，給予受試者編碼阻斷I型幹擾素和/或Flt3L的功能的肽的核酸.例如，可利用基於病毒的栽體(例如基因轉移栽體)將這些核酸遞送至受試者，這樣可在體內對肽進行翻譯，基因轉移栽體可為能夠在宿主細胞內複製的任何構建體，包括但並不局限於質粒、DNA病毒、逆轉錄病毒以及分離的核苷酸分子.例如，可選用基於逆轉錄病毒或腺病毒的栽體.在作為表達栽體，尤其是人基因治療方面，腺病毒吸引了越來越多的注意(Berkner，Curr.Top.Microbiol.I邁咖nol.，158:39-66(1992)).這些病毒含有所有的或部分病毒基因組，例如長末端重複("LTRs")、啟動子(如CMV啟動子、SV"啟動子、RSV啟動子)、增強子等.無論如何，栽體可含有不只一種病毒的元件.本發明中應用的腺病毒的例子在本領域中是眾所周知的，其包括40多種不同的人腺病毒，如Adl2(亞屬A)、Ad3和Ad7(亞屬B)、Ad2和Ad5(亞屬C)、Ad8(亞屬D)、Ad4(亞屬E)、AcHO(亞屬F)(Wigandetal，In:AdenovirusDNA，Doerfler，Ed-，Mar"nusNijhoffPublishing,Boston,pp.408-441(1986)),製備腺病毒栽體的方法在本領域中是眾所周知的(Berkneretal，NucleicAcidsRes.，11:6003-6020(1983);vanDorenetal,Mol.Cell.Biol,，4:1653-1656(1984);Ghosh-Choudhuryetal，Biochem.Biophys.Res.Commun，，147:964-973(1987);McGroryetal，Virol.，163:614-617(1988);及Gluzmanetal,In:Eurkaryo"cViralVectors,Ed.Gluzman，Y.pl87-192，ColdSpringHarborLaboratory(1982)),將得到的栽體導入(例如通過轉染或轉化，或感染，或通過注射等)受試者體內或體外的宿主細胞.在本發明中也施行了脂質體介導的基因轉移栽體的轉移.用於將基因轉移到細胞中以施行本發明中治療患者自身免疫疾病的方法的病毒栽體示例包括，但並不局限於逆轉錄病毒如Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV);乳頭多瘤空泡病毒如JC、SV40、多瘤病毒、腺病毒、Epstein-Barr病毒(EBV);乳頭狀瘤病毒如I型乳頭狀瘤病毒(BPV);牛痘和脊拔灰質炎病毒；慢病毒栽體和其他人類和動物病毒，在本發明中有用的I型幹擾素和FLT3L信號傳遞和/或轉導途徑的阻斷包括，但並不局限於應用可特異性靶定相關的信號傳遞和/或轉導途徑的化學試刑.本發明中有用的I型幹擾素釋放和/或產生的阻斷包括，但並不局限於(l)利用特異性的化學試刑阻斷細胞的I型幹擾素的合成；(2)靶定可產生I型幹擾素的細胞從而降低它們產生I型幹擾素的能力，以及(3)耗定細胞產生和/或釋放I型幹擾素的信號傳遞所必需的受體從21而減少或抑制其產生和釋放.在本發明的一個方面，這些細胞為漿細胞樣樹突細胞.在本發明的另一方面，可產生本發明中的組合物所把定的I型幹擾素的細胞包括，但並不局限於處於不同分化時期的成纖維細胞、內皮細胞以及漿細胞樣樹突細胞(如骨拔前體和血液前體)，上述的通過組合物靶定細胞並降低其作用包括，但並不局限於遞送特異性阻斷造血前體細胞分化為漿細胞樣樹突細胞的化學試刑，而不管這些分化在何處發生.利用本發明中的組合物靶定I型幹擾素信號產生和/或釋放的信號傳遞所必需的受體包括，但並不局限於利用組合物阻斷細胞上的甘露糖受體和/或CD32的功能.在一個方面，本發明提供了體外診斷測定法，其在監測受試者的自身免疫疾病的狀況或鑑定受試者是否具有發生自身免疫疾病的風險方面是有用的.診斷測定法包括以下步驟(1)從待檢測受試者獲取一定量的血清；(2)利用任何已知方法(如利用通過特異於Flt3L和IFN-ot的抗體進行的ELISA)確定受試者血清樣品中的Flt3L水平和IFN-ot水平；(3)比較受試者血清與從年齡匹配和性別匹配的正常、健康受試者獲取的血清樣品中測得的Flt3L水平和IFN-a水平；(4)確定從待檢測受試者測得的水平是否高於或低於健康個體的水平，從而監測患者的自身免疫疾病的狀況或評估受試者發生自身免疫疾病的風險.本發明也涉及確定受試者發生自身免疫疾病的風險的體外測定法，包括(a)從受試者獲取血清樣品；(b)對血清樣品中的IFN-ct和FU3配體(PU3L)進行定量；以及(c)將步驟(b)中測得的IFN-a和Flt3L量與從健康受試者獲取的血清和從自身免疫疾病患者獲取的血清中的IFN-a和FU3L量進行比較，從而確定受試者發生自身免疫疾病的風險.當通過上文步騍(b)得到的重在從自身免疫疾病患者測得的量的30X範圍內時，表示發生自身免疫疾病的高風險.當其量為20%時風險增加.在本發明的另一方面，患者為年齡匹配的.本發明也涉及用於確定受試者發生自身免疫疾病的風險或用於監測受試者自身免疫疾病狀況的試刑盒，該試劑盒包含特異性結合受試者生物樣品中的Flt3L和IFN-a的組合物，其中的組合物時可進行檢測的。可檢測的標記包括，但並不局限於螢光標記、放射性標記、酶標記、比色標記、化學發光標記或它們的任何組合.在本發明的一個實施方案中，生物樣品為血液樣品或血清樣品.在本發明的另一實施方案中，組合物包含(a)結合Fl13L的單克隆抗體和(b)結合IFN-oc的單克隆抗體的混合物.在本發明的進一步的方面中，試刑盒進一步含有用於檢測和比較與一個或多個樣品結合的組合物的量的一種或多種試劑.在本發明的另一實施方案中，試刑盒進一步含有用於在與生物樣品結合的組合物的量和發生自身免疫疾病的相對風險或自身免疫疾病的相對狀況間建立聯繫的成分.在本發明的另一方面，利用可檢測的標記對組合物進行了標記.可檢測的標記可為，但並不局限於螢光標記、放射性標記、酶標記、比色標記、化學發光標記及它們的任何組合。試刑盒也包括在樣品中進行標準化或規範化的組分，從而確保診斷測定法比較相對等量的細胞或血清體積.本發明提供了用於確定受試者發生自身免疫疾病的風險的體外測定法，包括(a)從受試者獲取血清樣品；(b)對血清樣品中的IFN-ot和Flt3配體(Flt3L)進行定量；及(c)將IFN-a和Flt3L的量與患有自身免疫疾病的受試者血清中的IFN-a和F1"L量進行比較，從而確定受試者發生自身免疫疾病的風險.此外，本發明也提供了用於確定受試者發生自身免疫疾病的風險的體外測定法，包括(a)從受試者獲取血清樣品；(b)在適於單核細胞分化的條件下將血清與單核細胞混合；(c)測定受試者的血清誘導單核細胞分化為能夠進行抗原呈遞的樹突細胞的能力；以及(d)將步驟(c)中測定的能力與(i)從健康受試者獲取的血清的能力和與(ii)從患有自身免疫疾病的受試者獲取的血清的能力進行比較，從而確定受試者發生自身免疫疾病的風險，在另一方面，本發明提供了體外診斷測定法，通過此方法可確定並監測患者發生自身免疫疾病的風險.此診斷測定法測定了患者血清誘導單核細胞體外分化為樹突細胞的能力，從而對患者患自身免疫疾病的風險進行評估.在此方面，如果患者血清較已知正常標準(其可利用一些年齡匹配、性別匹配的健康個體的血清來確定)更有效地誘導單核細胞分化為樹突細胞，則此測定就是自身免疫疾病患者中疾病發作的預示和/或不管患者是否存在發生自身免疫疾病的風險都必需進行詳細診斷評估的指徵.此外，此診斷測定在監測患者疾病狀況方面是有用的，如果已經診斷為患有自身免疫疾病，則患者可在家中或其他方便的地點利用本發明中的診斷測定法以便監測自身免疫疾病的進程或改善並相應調整他/她的治療方案.組合物的有效量依賴於應用的實際組合物.實際的有效量是基於化合物的大小、化合物的生物降解能力、化合物的生物活性及化合物的生物利用度.如果化合物不會很快降解並且是生物可利用的且具有高度活性，那只需很少量就有效.本領域中的熟練技術人員可對有效劑量進行確定；此有效劑量也依賴於化合物的形式、化合物的大小以及化合物的生物活性.本發明中的熟練技術人員可常規進行經驗化合物活性測定以確定生物測定中的生物活性，從而確定有效量.本發明提供的藥物組合物包含治療有效量的多肽組合物和化合物以及合適的稀釋刑、防腐刑、增溶劑、乳化刑、佐刑和/或栽體.這些組合物可為液體或凍幹的或其他乾燥製劑，並且包含多種緩沖組分(如Tris-HCI、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強度的稀釋劑、添加刑如白蛋白和明膠以防止為表面所吸附、去汙刑(如TWEEN"20，TWEEJT80,PluronicF68，膽酸鹽)、增溶試刑(如甘油、聚乙二醇)、抗氣化刑(如抗壞血酸、焦亞疏酸鈉)、防腐刑(如疏柳汞、苯甲醇、對羥基苯甲酸酯)、膨脹物質或滲透壓調節劑(如乳糖，甘露醇)、聚乙二醇等聚合物與與化合物共價附著物、與金屬離子形成絡和物，或將化合物摻入如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝膠等聚合物顆粒制刑中或表面上，或摻入到脂質體、微乳刑、微膠粒、單層或多層囊泡、紅細胞血影或原生質球.這些組合物將會影響化合物或組合物的生理狀態、溶解度、穩定性、體內釋放速度以及體內清除速度，組合物的選擇依賴於組合物的物理和化學特性.控制的或持續釋放的組合物包括親脂貯存物(如脂肪酸、蠟、油)中的制刑，本發明也包括包被有聚合物(如poloxamers或poloxamines)的顆粒組合物及偶聯於抗組織特異性受體、配體或抗原的抗體的治療性組合物，或偶聯於組織特異性受體的配體或其他靶向於組織或細胞的肽的治療組合物.本發明的治療組合物的其他實施方案包括用於包括腸胃外、肺、鼻和口的多種給藥途徑的顆粒形式的保護性包衣、蛋白酶抑制刑或滲透增強刑，當進行給藥時，化合物常常很快的就從循環系統中清除，因此引24起相對短的藥理活性.因此，維持治療效果需要經常注射相對大刑量的生物活性化合物.相對於沒有進行修飾的相應化合物，已知利用水溶性聚合物如聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷稱或聚脯氨酸共價連接而修飾的化合物靜脈注射後在血液中展示出顯著更長的半襲期.這樣的修飾也可增加化合物在水溶液中的溶解度、消除聚集、增強化合物的物理和化學穩定性並顯著降低化合物的免疫原性和反應性.結果，通過以較未修飾的化合物低的頻率或較低的刑量給予這樣的聚合物-化合物加合物獲得了需要的體內生物活性.聚乙二醇(PEG)與化合物的連接尤其有用，這是因為PEG在哺乳動物中具有很低的毒性(Carpenteretal.，1971).例如，腺苷脫氨酶的PEG加合物已經在美國得到批准用於治療人重症聯合免疫缺陷症候群.PEG偶聯的另一優點為其可有效降低異源化合物的免疫原性和抗原性.例如，人肽的PEG加合物可用於治療其他哺乳動物物種的疾病而不存在觸發嚴重的免疫應答的風險.本發明中的多肽或組合物可在微膠囊化裝置中進行遞送，這樣就可降低或避免抗多肽或抗產生此多肽的細胞的宿主免疫應答，本發明中的多肽或組合物也可微膠囊化在膜，如脂質體中進行遞送.作為示例，聚合物如PEG可很方便的連接到治療組合物的肽中的一或多個反應性胺基酸殘基上，例如氡基末端胺基酸的oc-氨基、賴氨酸側鏈的s-氡基、半胱氨酸側鏈的巰基、天冬氨醯和穀氨跣側鏈的羧基、羧基末端胺基酸的ot-羧基、酪氨酸側鏈，或連接到與某些天冬醯胺、絲氨酸或蘇氨酸殘基連接的糖基鏈的活性衍生物上，PEG的多種活性形式適於與已經進行描述的蛋白進行直接反應.與蛋白質氨基反應的有用的PEG試刑包括羧酸的活性醋或羧酸醋衍生物，尤其是那些其中的離去基團為N-羥基琥珀醯亞胺、對硝基苯酚、咪唑或1-羥基-2-確基苯-4-橫酸薛的羧酸醋或羧酸酯衍生物.含有馬來醯亞胺或卣代醯基基團的PEG衍生物是用於對蛋白的游離巰基進行修飾的有用試刑.同樣的，含有氨基肼或醯肼基的PEG試刑在與蛋白質中糖基的高碘酸鹽氣化產生的搭進行反應時是有用的.在一個優選實施方案中，藥物栽體可為液體並且藥物組合物將以溶液形式存在.在另一同樣優選的實施方案中，藥物可接受栽體為固體並且組合物是以粉劑或片刑形式存在.在進一步的實施方案中，藥物栽體為凝膠，而組合物是以栓劑或乳骨的形式存在.在進一步的實施方案中，活性成分可制刑化為藥物可接受的經皮貼劑的一部分.固體栽體可包括能夠作為調味刑、潤滑刑、增溶刑、懸浮刑、填料、助流劑、壓縮助劑、粘合劑或片刑崩解劑的一種或多種物質；其也可作為膠囊化的物質.在粉刑中，載體是進行了精細分割的固體，與精細分割的活性成分混合.在片刑中，活性成分與具有適當比例的必需壓縮特性並壓縮為所需形狀和大小的栽體相混合.粉刑和片刑優選含有高達99%的活性成分.合適的固體栽體包括，如磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、糊精、澱粉、明膠、纖維素、聚乙烯吡咯烷、低熔點蠟和離子交換樹脂.在製備溶液、懸浮液、乳刑、糖漿、醯刑和壓縮組合物中應用液體栽體.可以將活性成分溶解或懸浮在藥物可接受的液體栽體如水、有機溶劑、二者的混合物或藥物可接受的油或脂中.液體栽體可含有其他合適的藥物添加劑如增溶劑、乳化刑、緩沖刑、防腐劑、增甜刑、調味刑、懸浮刑、增稠刑、色素、粘度調節刑、穩定刑或滲透壓調節劑.用於口服給藥和腸胃外給藥的液體栽體的適當示例包括水(部分含有上述添加刑如纖維素衍生物，優選羧甲基纖維素鈉溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，如乙二醇)及它們的衍生物以及油(如分餾的椰子油和花生油)，對於腸胃外給藥來講，栽體也可為油性醋如油酸乙酯和十四酸異丙酯，無菌液體栽體在用於腸胃外給藥的無菌液體形式的組合物中是有用的.用於壓縮組合物的液體栽體可為卣代烴或其他藥物上可接受的推進刑.無菌溶液或懸浮液形式的液體藥物組合物可用於如肌肉內、鞘內、硬腦膜外、腹膜內或皮下注射.無菌溶液也可以靜脈內給藥.活性成分可製備成無菌固體組合物，當對其進行給藥時可利用無菌水、鹽水或其他合適的無菌可注射介質對其進行溶解或懸浮.栽體包括必需且惰性的粘合劑、懸浮劑、潤滑刑、調味刑、甜味劑、防腐刑、染料和包衣.本發明中的治療組合物的活性成分(也即Flt3L拮抗劑和擾素拮抗劑)可以以含有使溶液等滲的其他溶質或懸浮刑，如足夠的鹽水或葡萄糖、膽鹽、阿拉伯膠、明膠、脫水山梨糖醇單油酸酯、聚山梨醉酯80(山梨醇的油酸醋及其與環氧乙烷共聚化的酐)等的無菌溶液和懸浮液形式進行口服給藥.活性成分也可以液體或固體組合物形式進行口服給藥.適於口服給藥的組合物包括固體形式，如丸刑、膠嚢、顆粒、片刑和粉刑，及液體形式如溶液、糖漿、脈劑和懸浮液.在腸胃外給藥中有用的形式包括無菌溶液、乳刑和懸浮液.除非另外指明，本發明應用了本領域技術人員掌握的分子生物學、微生物學、重組DNA技術和免疫學等傳統技術.這些技術在下列文獻中有說明見如Sambrook,Fritsch&ManUtis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition(1989);DNACloning,Vols.IandII(D.N,Glovered,1985)jOligonucleotideSynthesis(M,J.Gaited.1984);NucleicAcidHybridization(B,D.Hames&S.J,Higginseds.198化AnimalCellCulture0LK.Freshneyed.1986);ImmobilizedCellsandEnzymes(IRLpress,1986);Perbal，B.,APracticalGuidetoMolecularCloning(1984);theseries,MethodsInEnzymology(S.ColowickandN,Kaplaneds.,AcademicPress,Inc.);及HandbookofExperimentalImmunology,Vols.I-IV(D.M.WeirandC.C.Blackwelleds.，1986，BlackwellScientificPublications),正如此處所用，單詞"或"指特定列表中的任一成員並且也包括這些成員的任何組合.正如此處所用，除非具有其他清楚的指示，單數形式"一個"、及"一種"包括複數形式.本發明將通過下列實施例進行進一步描迷，然而，我們應該理解，本發明並不局限於這些實施例.更正確的，對於描述目前用來實踐本發明的最佳方式的本公開內容來講，在不偏離本發明的領域和精神的條件下會有和多改進和變化.在本發明的權利要求相當的目的和範圍之內的所有改變、改進和變化都在本發明的範圍之內.實施例1:SLE血清誘導單核細胞分化為具有與樹突細胞相似的特性的細胞正常單核細胞體外暴露於SLB血清在12-24小時內，注意到單核細胞成簇；在24-48小時內，成簇的細胞展示出很好的DC培養物胞質突出物發光(圖2A和2B).僅僅SLE血清在12-24小時內誘導單核細胞成簇並獲得了面紗細胞的形態學(閨2A-2B,與圖2C中的AS相比)。SLE血清在知情同意後，從符合美國風溼病學會(ACR)制定的SLE診斷標準的患者獲取血液.將全血收集到含有EDTA或肝素的管中，並在立即在4"C下以lOOxg轉速進行離心分離.收取血漿，利用纖維蛋白酶(JonesPharmaIncorporated,M0)進行處理並在-80"C下貯存直至應用.利用在獲取血液標本當天確定的SLE疾病活動度指數(SLEDAI)評分(Lahita，R.G.1999.SystemicLupusErythematosus.AcademicPress3rdedition)評估疾病的活動度，細胞培養和表型分析在Ficoll-Paque"梯度離心後，通過利用純化的抗-CD3、抗-CD19、抗-CD56和抗-血型糖蛋白A抗體去除T-細胞、B-細胞和細胞及隨後利用免疫磁性去除(Dynabeads),從而從血液單核細胞中分離單核細胞.在100ng/mLGM-CSF和lOOOUI/mLIFN-ct、或100ng/mLGM-CSF和2Ong/mLIL-4、或狼裔血清、或自體血清存在下，在6孔板(lxl07孔)中對富集的CD14+單核細胞進行為期3天的培養，在笫三天時，收穫細胞並利用抗CD14-PE抗體、抗CD83-PE抗體、抗HLA-DR-PrCP(peridnine葉綠素蛋白)抗體、抗甘露糖-受體-PE抗體、抗CD80PE(藻紅蛋白)抗體、抗CD86-PE抗體、抗CD"PE抗體、抗CD16-PE抗體、抗CD32PE抗體、抗CD64-PE抗體和抗CDla-FITC抗體進行染色.將取自正常供體的富集的CD14+單核細胞與20%狼瘡血清或自體血清進行培養(lxl07孔).將單核細胞與SLE-DC進行培養，並且在第三天時，收穫細胞，並通過流式細胞術評估其表達特定細胞表面分子的能力.流式細胞術證明，CD14下調、MHCII類、共刺激分子CD40、CD86和CD80、CD83及甘露糖受體、CD32和CD36的表達增加(圖3).單核細胞分化為具有DC的形態學和表型的細胞而不是巨噬細胞(MO))的誘導限定於那些在SLE血清中生長的DC.實際上，自體或異源血清都沒有誘導這樣的表型(圖2C).利用了下列抗原的單克隆抗體(mAbs):CD14、HLA-DR(BectonDickinson))CD86、CD40、HU-ABC、CDla(Dako，Carpinteria,28CA);CD80、CD83(BeckmanCoulter/Im,otech,NewYork),由於SLE血清誘導的細胞展示了抗原捕獲受體並且由於捕獲抗原的能力是DC的重要特性，所以確定了在培養物中分化的細胞是否能夠捕獲可溶性抗原.為了此目的，用FITC-葡聚糖孵育SLE血清培養的單核細胞，如圖4A_4B中所示，SLE血清誘導的細胞與GM-CSF/IL-4誘導的DC在FITC-葡聚糖攝取方面同樣有效.通過在37TC下用100ng/mLPITC-葡聚糖孵育細胞1小時確定了在培養物中分化的細胞的內呑活性.作為對照，將一些細胞在冰上用FITC-葡聚糖孵育.利用冷PBS/FCS對細胞進行洗塗並進行流式細胞術。因此，形態學、表型和抗原捕獲表明SLE血清指導單核細胞分化為能夠捕獲抗原的細胞，也即表達抗原捕獲分子如CD14、甘露糖受體和CD36(未成熟DC和M(J)的特徵)，以及表達包括HLA-DR、共刺激分子和成熟DC的標記CD83在內的對於抗原呈遞來講重要的分子，下一步確定利用SLE血清培養的單核細胞是否能夠誘導幼稚CD4+T細胞的分化，即所有抗原呈遞細胞中DC的一個獨特特性.如圖5中所示，利用自體血清培養的單核細胞誘導了異體CD"T淋巴細胞的增殖，而利用SLE血清培養的單核細胞誘導了與GM-CSF/IL-4DC所誘導的相似的強T細胞增殖，這是DC在體外的標準特徵.圖6展示了AS血清中培養的SLE-DC或DC誘導的T細胞產生的T細胞細胞因子的水平'SLE-DC誘導T細胞產生IFN-Y而不是產生IL-10(除可忽略的水平外)，從而證明了I型極化(Thl),對利用SLE血清、AS血清、GM-CSF/IFN-oc或GM-CSF/IL-4培養的單核細胞進行洗滌並與異體CD4十T細胞一起鋪板.培養5天後收取上清液，並利用PHA重新刺激過夜，利用ELISA測定對細胞因子釋放進行測定，IL-10和IFN-y在縱軸上以pgx107mL來表達，因此，激活的CD"T淋巴細胞分泌了與I型極化相一致的高水平的幹擾素-Y、低水平的IL-10以及不分泌IL-4,T-細胞增殖和細胞因子測定在cRPMI加IOX人AB血清中，將分級刑量的DC與1"05個新分離的CD《異體T細胞培養5天或與幼稚的CD4+CD45RA+異體T淋巴細胞進行培養.為了對自體T細胞增殖進行測定，利用DNA小體對M-CSF/IFN-ot或GM-CSF/IL4或狼瘙細胞進行4小時的脈衝處理並以分級刑量與lxl05個自體T細胞進行培養.每個孔中的細胞利用0.5uCi[3H胸苷(NewEnglandNuclear,Boston,MA)脈衝處理最後16個小時.對於細胞因子分析來講，在培養5天後收取上清液，在新鮮培養基中利用PHA對細胞進行為期24小時的重刺激.利用ELISA試刑盒(RftDSystems,Minneapolis,MN)對細胞因子的釋放進行測定.實施例2:SLE-DC從捕獲的消亡細胞呈遞抗原免疫系統對凋亡細胞的非正常和不適當處理是SLE的一個致病亊件，因此，下一步需要確定是否SLE-DC能從捕獲的凋亡細胞呈遞抗原。對此目的來講，已經證明SLE-DC能夠捕獲培養物中的凋亡細胞碎片(困7A-7B).SLE-DC也可捕獲含有源自黑色素瘤細胞的凋亡小體的DNA,圖8A和8B展示了對異體凋亡細胞的捕獲及將它們的抗原呈遞給自體CD4+T細胞.如0)4+T細胞增殖的誘導所展示的(圖8B)，SLE-DC捕獲了含有;月亡小體的DNA(困8人)並將它們的抗原呈遞004+T細胞.AS血清、SLE血清和GM-CSF/IL-4謙導的HLA-DR+單核細胞捕獲了*7AAD標記的DNA小體(通過y-照射(150Gy)殺滅的黑色素瘤細胞系).為了對凋亡小體進行捕獲，將抗原呈遞細胞與已殺滅的細胞混合併在37t:下孵育1小時.其後，利用流式細胞術對這些SLE-DC進行分類並與自體CD4+T細胞進行培養.5天後確定T細胞的增殖.隨後將這些被加栽的SLE-DC與自體CD4+T細胞進行培養.如圖8B中所展示的，被加栽的SLE-DC能夠誘導自體0)4+T細胞的增殖.因此，SLE血清誘導單核細胞分化為能夠捕獲並呈遞凋亡細胞加工的抗原的功能性DC,實施例3:只有含活性IFN-a的SLE血清誘導單核細胞分化為SLE-DC進行了實驗來確定是否所有SLE血清能夠指導單核細胞分化為DC.利用19種不同的待測SLE血清培養單核細胞以測定它們刺激混合的白細胞反應或混合的淋巴細胞反應(MLR)的能力.如表1所示，用自體血清培養的單核細胞只能誘導很低的T細胞增殖(陰性對照)，用GM-CSF/IL-4培養的單核細胞產生了誘導100XMLR的DC(陽性對照)，平均增為7.(±6.4X,n-5).當以同樣的方式對SLE血清培養的單核細胞進行評估時，考慮到作為分界點(利用自體血清培養的單核細胞的平均值+MD)的20%增殖，19種血清中的ll種血清誘導了單核細胞分化為異體刺激DC，平均增殖為41X土15V由於患有皮肌炎的患者血清不能產生此偏移，並且由於患有皮肌炎的患者是利用與SLE患者相同的類固醇治療方案，所以我們得出結論SLE血清的影響不依賴於類固醇.此外，取自兩個新診斷的但未進行治療的患者的血清有效使單核細胞分化為SLE-DC.重要的是，在可誘導SLB-DC的11種血清中，進行IPN-a水平檢測的7種血清含有大於190pg/mLIPN-ct，而其他絕大多數不能誘導SLE-DC的血清含有較測定法中可檢測到的IFN-ot(12pg/mL)少的IFN-a(表1).此外，SLE血清的DC誘導能力與疾病活動度相關，在圖9A-9B中，展示了SLE疾病活動度與SLE-DC的誘導活性間的關係.利用取自患有活動性狼瘡(SLE疾病活動度指數(SLEDAI)>6)或非活動性狼瘡(SLEDAI<6)患者的ll種不同SLE血清培養單核細胞，並對產生的細胞誘導T細胞增殖的能力進行測定.作為對照，利用GM-CSF和IL-4培養單核細胞.縱軸展示了誘導的異體刺激能力的百分比.因此，SLE血清傾向於使單核細胞分化為DC的能力是疾病特異性的且與IFN-a的水平相關.表1:含有IPN-a的SLE血清誘導單核細胞獲得刺激混合淋巴細胞反應的能力tableseeoriginaldocumentpage32利用不同的SLE血清(表l,笫1列)培養單核細胞並對生成的細胞誘導異體T細胞增殖的能力進行測定(混合淋巴細胞反應{第2列，表1，MLR}),作為對照，利用GM-CSF和IL-4對單核細胞進行培養並作為IOOX標準.利用SLE血清培養的單核細胞的異體刺激活性以相對於GM-CSF和IL-4的T細胞增殖的百分比來表示，並且與血清中的IFN-oc水平(笫3列，表l)和疾病活動度(SLEDAI，笫4列，表l)相關.SLEDAI由9組臨床和實驗室標準組成，其包括對下列器官系統的評估CNS、血管、腎臟、肌肉骨骼、漿膜、皮膚、免疫系統和血液系統.ND指未進行實驗，AS指健康供體的自體血清，SLE指SLE患者的血清.實施例4:通過阻斷IFN-a可破壞SLE血清謙導SLE-DC的能力DC使單核細胞的分化傾斜於產生抗原呈遞細胞的能力與SLE血清中IFN-ot的水平相關.SLE-DC的表型讓人想到通過GM-CSF和IFN-ct進行的誘導，因此，用抗IPN-ot中和抗體預孵育SLE血清，與測定它們誘導MLR的能力一樣，對利用這些血清培養的細胞誘導單核細胞分化為DC的能力進行檢測.IFN-oc的中和抑制了SLE血清誘導功能性DC的能力，但同種型對照(如困10中所示)和其他IL-4、CD40-L和IL-10的阻斷性抗體則不能抑制，其表明IFN-ot對誘導SLE-DC來講是必需的.圖IO例示了從SLE患者獲得的單核細胞培養血清中IPN-oc的阻斷.幹擾素阻斷抗體的添加造成誘導異體CD4+T細胞增殖的能力大幅下降，結果表明，SLE血清的DC誘導活性是依賴於IFN-cx的並可為用於培養單核細胞的SLE血清中的阻斷性IFN-ct所破壞，在IFN-a阻斷性Ab(SLEab)(Biosource)的飽和濃度下和利用相應濃度的同種型對照(SLEctrl),利用SLE血清培養純化的單核細胞或利用血清進行30min預醉育，3天後，對細胞誘導異體004+T-細胞增殖的能力進行評估.實施例5:SLE患者具有高血清水平的IFN-a確定了兒科SLB患者體內的IFN-a的血清水平.如圖11中所示，從SLE患者中取得的血清較從健康受試者(對照)取得的血清具有高的多的IFN-cx水平.從SLE患者獲取血清.利用基於人幹擾素國際參考標準(為國家衛生部所認可)的ELISA試刑盒(BioSource，按照製造者的推薦)對血清中的IFN-a進行測定.利用HRP和TNB對比色反應進行顯色.利用微量滴定板閱讀器確定450mn的吸光度.應用測定法的延伸範圍採作規程，其可確定的血清水平範圍為10-5000pg/mL,實施例6:PBMCSLE患者可反應於病毒觸發而分泌IFN-ot當暴露於流感病毒時，SLE患者的PBMC較暴露於流感病毒的健康成人的PBMC釋放出高水平的IFN-ot(見圖12).實施例7:IFN-a誘導了單核細胞上的BAPF/Blys表達和PBMC上的BCMA表達在DC和T-細胞上發現了命名為BAFF/Blys-L(屬於TNF族的B細胞激活因子)的TNF族新成員，它們結合到B細胞上的兩個受體，也即BCMA和TACI上，並誘導它們的增殖和免疫球蛋白分泌.因此，確定了IFN-a是否調節在兩種細胞類型上的兩種分子(也即BCMA和TACI)的表達，如圖13A-13B所示，如通過實時PCR所確定的，IFN-a，而不是其他因子，誘導了單核細胞中高水平的BAFF/Blys.此外，IFN-a誘導了正常PBMC上BCMA表達.實施例8:篩選可在體外診斷測定中誘導單核細胞分化的患者血清按照其誘導單核細胞分化為樹突細胞的能力篩選患者血清，而此分化作用可隨後為中和性I型幹擾素所阻斷.按照實施例1中詳細敘述的程序，獲得了患者血清.按照實施例1中概述的程序，將一等份患者血清添加到一等份從正常患者取得的純化的單核細胞中.大約3天後，利用本領域中已知的任何方法評估單核細胞分化為樹突細胞的程度，示範性的測定法包括直接的形態分析、利用流式細胞術進行表型分析、利用FITC-葡聚糖攝取進行可測定的抗原捕獲、以及通過胸苷摻入誘導可測定的異體幼稚(:1)4十T細胞.為了對從受試者血清樣品中獲得的結果進行分類，此體外診斷測定法包括已知的一組標準.簡單來講，對正常患者，也即已知未患自身免疫疾病的患者的血清進行測定並將獲得的結果作為發生自身免疫疾病的低風險指示標準.同樣的，獲取已知患有自身免疫疾病，如SLE的患者的血清並進行測定，將獲得的結果作為發生自身免疫疾病的高風險指示標準.我們認為，支持可被I型幹擾素阻斷的單核細胞向樹突細胞的高度分化的患者血清將患者置於患自身免疫疾病的高風險境地，在測定法中，利用以前確定的高風險、低風險和任何其他中間風險值的患者血清，通過對比單核細胞的分化數量就可確定"高度"的單核細胞分化。每個自身免疫疾病風險水平都與測定中觀察到的單核細胞分化水平相關聯.如果患者血清不支持可被I型幹擾素阻斷的單核細胞向樹突細胞的高度分化，那麼患者發生自身免疫疾病的風險水平會很低或者沒有此風險.對於診斷患有自身免疫疾病的患者來講，以這種測定法對患者血清進行周期性的評估提供了一種檢測疾病發作或其進展的方法.實施例9:TNF抑制pDC分泌I型幹擾素Kadowaki等(J.Bxp.Med.2000,192:1785-96)公開了雖然自分泌TNP-oc誘導了它們成熟為不能產生IFN-ot的成熟pDC，但自分泌IFN-ot支持了pDC的存活.因此，進行了研究來確定向正常DC培養物中添加中和性TNF抗體是否維持它們反應於病毒觸發而產生IFN-a.對於這些研究來講，通過流式細胞術對CDllc陰性和CD123陽性細胞進行分類，從而從CD34+造血前體培養物中分離pDC.用純化的流感病毒(5mL)和對照抗體或中和性抗-TNP抗體培養濃度為50,000個細胞/孔/200pL的分離的pDC(第一次培養)經過24小時的初次培養後，對培養板進行離心，收集上清液，並將細胞重新培養在添加有新鮮刑量(5mL)流感病毒的新鮮培養基中進行重培養(第二次培養).在笫二次培養額外的24小時後，收集上清液並對其中的IFN-a水平進行評估.圖14A-14C展示了通過漿細胞樣DC(pDC)進行的IFN-a分泌的TNF調節.用FU3L(100ng/mL)及血小板生成素(TPO)(30ng/mL)培養CD34+造血前體細胞，而體外產生的純化DC以50，000個細胞/孔的濃度用純化的流感病毒(5/iL)及對照抗體(5jig/mL)或中和性抗TNF抗體(5yg/mL)或外源TNF(lOOng/mL)進行培養(笫一次培養)，笫一次培養24小時後，對培養板進行離心，收集上清液，並將細胞重新培養在添加有新鮮刑量流感病毒的新鮮培養基中進行重培養(笫二次培養).在笫二次培養額外的"小時後，收集上清液並對其中的IFN-a水平進行評估.如圖14A所示，中和性抗TNF抗體的添加造成了第二次培養物中IFN-ot釋放3倍增加.相反的，添加TNF造成pDC的笫一次培養物中高達70%的IFN-a釋放的抑制(見圖HB)如圖WC中所示，第一次培養物上清液中的IFN-cx濃度從100ng/mL降至40ng/mL*此研究提供了困16中總結的關於未成熟pDC怎樣通過在TNF(或拮抗性抗TNF受體結合試刑)中進行孵育來阻斷IFN-oc分泌的非限制性理論.因此，可促使TNF孵育的pDC變成不能分泌IFN-a的成熟的pDC.實施例10:TNP抑制pDC個體發生然後進行實驗來確定是否TNF對pDC的影響限於它們的成熟/IFN-ot產生，或是否TNF，這一主要的促炎細胞因子參與拔樣樹突細胞細胞分化的調節，以及是否影響造血細胞前體到pDC的分化.對於這些研究來說，利用流式細胞術對CD34+CD45RA-造血前體細胞分類至超過90%的純度，並隨後在FU3L(100ng/mL,RftD)、血小板生成素(TPO,30ng/mL,R&D)以及白細胞介素-6(IL-6,25ng/mL，RftD)或腫瘤壞死因子(TNF,100ng/mL，R&D)存在下進行培養，在培養笫一周的密度為2/5x105-5x105個/孔.其後，對細胞進行洗滌並僅僅利用FU3L(100ng/mL)對其進行額外的3周培養，圖15展示了流式細胞術實驗結果，其表明TNF阻斷了漿細胞樣的分化而支持了髄樣DC的分化.對利用經CDllc陰性CD123陽性染色鑑定的pDC表達的細胞表面標記進行流式細胞術確定了pDC的分化.因此，在第一個周添加TNF造成了前體細胞分化為CD123+CDllc-pDC的完全抑制並將分化向CD123-DC11C+拔樣DC傾斜，因此，均可刺激前體細胞表面上的TNF受體的TNF和/或激動性性抗TNF受體抗體阻斷了pDC的分化並更改了前體細胞向拔樣DC的分化.此研究提供了圖16所展示的關於IFN-cx產生和分泌怎樣為前體細胞暴露於TNF(和拮抗性抗TNP受體結合試劑)所阻斷的非限制性理論.這樣的暴露導致了可產生幹擾素的PDC的發育抑制，從而阻斷了幹擾素產生和分泌.實施例ll:在患有SLE的患者血清中FU3L水平升高如上述實施例中所描述的，我們認為未減少的DC誘導驅動了SLE中破壞性的自身免疫應答，如此處所描述的，其通過靶定IFN-a和Flt3L所控制.然而，此處命名為"DC-生成素'，的其他細胞因子可動員和/或激活DC以在體內分化為抗原呈遞細胞.DC的動員或激活可以多種不同方式進行.例如，這些DC-生成素可提高preDC到成熟的樹突細胞的分化，而成熟的樹突細胞可進一步增強免疫原性應答並惡化自身免疫應答，作為另一示例，DC-生成素可增加新成熟的DC的實際產生，而新成熟的DC有助於個體的自身免疫應答，或者DC-生成素可增強成熟DC的活性.一個非限制性DC-生成素為FU3L,已經證明其可在人和小鼠模型中體內動員大量的I4樣DC和漿細胞樣DC(Maraskovskyetal(1997)Adv.Exp.Med.Biol.417:33-40;(1996)J.Exp.Med.184(5):1953-62;(2000)Blood96(3):878-84).此外，如本發明所證明的，利用Flt3L培養CD34+造血幹細胞不僅生成了漿細胞樣DC，也生成了CDllc+徵樣DC和單核細胞.利用商業購買的ELISA(R&D)對SLE患者(83個血液樣品)及健康對照(35個血液樣品)的Flt3L血清水平進行了確定，如困17所示，SLE患者較從健康個體獲得的血清具有顯著較高的Flt3L(p<0.002)血清水平，其範圍為〈12.5-582pg/mL.利用商業購買的ELISA對83個SLE患者血液樣品和35個健康患者(健康對照)血液樣品進行測定.利用參數和非參數分析確定了血清樣品中的FU3L水平差異在統計學上是顯著的.實施例12:Flt3L的血清水平與自身免疫疾病活動度相關利用SLE疾病活動度指數(SLEDAI)進行的測定，確定了FU3L的血清水平與疾病活動度相關.如圖18所展示的，存在顯著的正相關(p-0.02)，這表明具有高血清水平FU3L的那些個體也展示出高SLE疾病活動度.因此，血清中出現升高的Flt3L水平是個體中自身免疫風險和活性指徵.實施例13:TU3L允許單核細胞分化為DC將從健康供體外周血液單核細胞(PBMCs)中分離的單核細胞利用CD14珠進行陽性篩選或通過粘附進行富集，隨後在添加有Flt3L(100ng/mL)和IL-3(10ng/mL)和/或IFN-oc(1000U/mL)的完全培養基(添加有10%熱滅活的胎牛血清的RPMI1640)中進行為期2天的培養.利用GM-CSF和IL-4進行對照培養.困19A展示了利用Flt3L/IFN-a(1000u/mL)培養的細胞，困19B展示了利用GM-CSF(100ng/mL)/IL-4(5ng/mL)培養的細胞.圖19C展示了利用IFN-ot(1000u/mL)/IL-3(10ng/mL)培養的細胞.圖19D展示了利用Flt3L/IFN-a(1000WmL)/IL-3(10ng/mL)培養的細胞.培養2天後，對細胞自旋單核細胞進行吉姆薩染色.因此，利用F1"L和IFN-a培養的單核細胞分化成的細胞展示出通過形態學(困19A-19D)、表型(CD14低，DC-SIGN+，CD40+，HLA-DR+，CD1lc+)和功能確定的DC特徵，也即誘導作為樹突細胞功能標誌的異體CD4+T細胞的增殖的能力(困20).在圖20中，將10S個純化的異體CD4+T細胞與分級數量的抗原呈遞細胞(水平軸)共培養5天，通過胸苷摻入(縱軸，cpmx103)以及隨後利用添加有FU3L的培養基進行培養來測定T細胞增殖.圖21展示了一個圖表，總結了可通過阻斷Flt3L和IFN-cx的活性而進行改變的DC亞型的幾個發育和分化途徑.這些治療把包括l)從造血前體細胞到pDC的分化途徑，其可為TNF或Flt3L拮抗劑或TNF和Flt3L拮抗刑的聯合所阻斷，其最終結果為通過抑制可生產幹擾素的細胞的分化而抑制幹擾素的產生，2)pDC成熟途徑，其可為TNF所加速，最終結果為pDC成為非幹擾素生產細胞從而降低幹擾素水平，3)從單核細胞到樹突細胞的分化途徑，其可為幹擾素拮抗劑或Flt3L拮抗刑或幹擾素拮抗刑與PU3L拮抗刑的聯合所阻斷，最終結果為抑制能夠通過誘導自身反應性B細胞和自身反應性T細胞分化而捕獲並呈遞凋亡細胞且驅動自身免疫疾病的樹突細胞的分化.實施例14:SLE血清中的中和性Plt3L抑制了SLE血清誘導的單核細胞分化為樹突細胞利用SLE患者的血清培養單核細胞.在適於單核細胞分化的培養條件下，將飽和濃度，也即約l-10倍摩爾過量的濃度範圍內的、有效量的可與Flt3L特異性結合的單克隆抗體(抗-Flt3L單克隆抗體)添加到單核細胞培養物中.孵育3天後，分化為DC的單核細胞數目較沒有接受單克隆抗體的完全相同的單核細胞培養物要少.因此，可中和培養物中的FU3L活性的抗F1"L單克隆抗體抑制了SLE誘導的單核細胞分化為DC.實施例15:向生長在SLE血清中的單核細胞中添加F1UL拮抗刑和幹擾素拮抗刑的組合物可抑制單核細胞分化為抗原呈遞DC此處示範了治療患者的自身免疫疾病的方法，其中給予患者本發明中的治療組合物以減少或抑制抗原呈遞細胞的產生，而抗原呈遞細胞可引起能夠在受試者中產生自身抗體的自身反應性T細胞和自身反應性B細胞的刺激.利用分別約l-10倍於待治療的患者的血清中的FU3L和IFN-a水平的量的(a)抗FU3L單克隆抗體和(b)抗IFN-ot單克隆抗體製備治療組合物.製備抗FU3L的單克隆抗體的方法是已知的，例如美國專利No.5，843，423，"利用fU3配體刺激造血細胞的方法"實施例6中的方法.製備抗IFN-ot的單克隆抗體的方法是已知的，例如，美國專利No.5,919,453中給出的方法.從患有自身免疫疾病的受試者中獲取血清並進行檢測以確定血清中具有足夠的Flt3L和IFN-ot水平來保證治療組合物的給藥.每曰通過注射或通過靜脈遞送方法給予組合物，以保證組合物中兩種成分的血清水平在Flt3L和/或IFN-cx的約l-10倍摩爾過量的範圍內.在整個治療期內監測受試者的狀況以便確定APC的產生水平.在整個治療期內對患者中存在的DC進行監測.當自身免疫紊亂症狀平息時停止治療，當在連續兩次血液分析中Flt3L和/或IFN-ot水平表現出升高的趨勢時和/或當自身免疫紊亂症狀惡化時重新進行治療.權利要求1.選自(i)特異性結合於Flt3L的抗體，(ii)有機分子；(iii)抗體的抗原結合片段；(iv)核酸；(v)它們的任何組合的Flt3L拮抗劑在製備用於治療有需要的受試者的自身免疫疾病的藥物中的用途，其中所述Flt3L拮抗劑減少單核細胞分化為樹突細胞，從而治療自身免疫疾病。2.權利要求l的用途，其中Flt3L拮抗刑減少造血幹細胞分化為I型幹擾素產生細胞.3.權利要求2的用途，其中I型幹擾素產生細胞包括漿細胞樣樹突細胞.4.權利要求l中的用途，其中自身免疫疾病選自獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)、強直性脊柱炎、關節炎、再生障礙性貧血、白塞氏病、糖尿病、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、溶血性貧血、低y球蛋白血症、高IgE症候群、特發性血小板減少性紫瘢(ITP)、多發性硬化症(MS)、重症肌無力、牛皮褲、狼瘡及它們的任何組合.5.權利要求l中的用途，其中的自身免疫疾病包括系統性紅斑狼瘡(SLE)、藥物誘導的狼瘡或其組合.6.權利要求l中的用途，其中的自身免疫疾病包括糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病、幼年起病型糖尿病或它們的任何組合.7.權利要求l中的用途，其中的自身免疫疾病包括類風溼性關節炎、幼年型類風溼關節炎、牛皮癬關節炎或它們的任何組合.8.權利要求l中的用途，其中FU3L拮抗刑以包括約l-10倍摩爾過量於FU3L或Flt3L受體的量存在於藥物中.9.(a)至少一種降低I型幹擾素活性的幹擾素拮抗刑，以及(b)至少一種降低Flt3L活性的Flt3配體(Plt3L)拮抗刑在製備用於抑制CD14+單核細胞分化為能夠進行抗原呈遞的樹突細胞的藥物中的用途，其中所述幹擾素拮抗刑包括抗IFN-a抗體或其抗原結合片段，所述Flt3L拮抗刑包括抗FU3L抗體或其抗原結合片段.10.權利要求9的用途，其中所述抗IFN-a抗體是單克隆抗體、嵌合抗體、抗獨特型抗體、人源化抗體、靈長類動物化抗體或其任意組合.11.權利要求9的用途，其中所述幹擾素拮抗刑和F1UL拮抗刑是一個分子的部分.12.權利要求9的用途，其中幹擾素拮抗刑以包括約1-約10倍摩爾過量於幹擾素的量存在於藥物中.13.權利要求9的用途，其中Flt3L拮抗刑以包括約1-約10倍摩爾過量於FU3L的量存在於藥物中.14.權利要求9的用途，其中所述抗F1UL抗體是單克隆抗體、嵌合抗體、抗獨特型抗體、人源化抗體、靈長類動物化抗體或其任意組合，全文摘要本發明涉及幹擾素拮抗劑和Flt3L拮抗劑的用途。具體地，本發明提供了通過給予受試者幹擾素拮抗劑和Flt3L配體(Flt3L)拮抗劑從而對自身免疫疾病進行治療的方法。本發明也提供了含有一種或多種幹擾素拮抗劑和一種或多種Flt3L拮抗劑的組合物、確定受試者發生自身免疫疾病的風險的體外測定法、以及用於此測定的試劑盒。文檔編號A61P19/02GK101612402SQ200910160480公開日2009年12月30日申請日期2002年1月8日優先權日2001年1月9日發明者A·K·帕盧卡,J·F·班策羅,P·布蘭科申請人:貝勒研究院