用於診斷性dna檢測的方法和裝置的製作方法

2023-07-15 01:59:06 4

專利名稱：用於診斷性dna檢測的方法和裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增，再通過電泳分離所得片段以檢測突變缺損等可能的基因變體的DNA診斷檢測方法；本發明更具體地涉及與在變性梯度凝膠中進行雙向電泳分離相結合的新的和改良的多重PCR技術。
本發明具體地涉及檢測患有遺傳疾病的病人中DNA突變的存在，所述遺傳疾病包括出生時即有的缺陷(如囊性纖維化)和成人慢性病(如癌症)的遺傳傾向。本發明更具體地涉及通過新的兩步聚合酶鏈反應(PCR)擴增快速製備基因片段，隨後有效並精確地檢查它們中的突變。
背景技術：
通過DNA診斷檢測可鑑定出具有突變缺損的基因(基因變體或等位基因)。基因變體可由父母遺傳給孩子，一些基因變體的作用很強，它們獨自作用即可導致疾病，例如導致囊性纖維化的囊性纖維化跨膜傳導性調節物(CFTR)基因的多種突變體。其他基因變體與其他基因座的基因變體聯合作用，例如許多常見(多基因)病，如心臟病和癌症。可以在早期，即從胚胎細胞中檢測(出生前檢測)基因缺損，也可以在晚期檢測幼兒，成人或老年人細胞中的基因缺損。
通過DNA診斷檢測，可以得到疾病的有關信息，有時在疾病發生前即可得到該病的信息，這大大便利了對疾病的處理，如預防、治療。例如可以檢測癌症或傳染性病因中特殊基因變體的存在以預測例如疾病的進程，對治療的反應。也可以檢測個體攜帶特殊基因變體的情況，他們不願意眼睜睜地讓這些基因變體傳遞給他們的後代(攜帶者檢測)。最後，還可以在任何時候(從出生前至晚年)檢測個體患遺傳性基因編碼的疾病的傾向。該適用譜的一端的例子是囊性纖維化，對它而言，出生前檢測和攜帶者篩選已經相對常見，該譜的另一端涉及後期爆發的疾病，如癌症和神經變性病。
DNA診斷檢測包括分析個體基因的序列完整性。目前，該項工作花費大，因為精確的檢測需要進行勞動強度大的對基因的測序或解碼。迄今為止，還沒有經濟實惠普遍適用的DNA診斷標準化系統可供使用(參見Cotton，1993，突變檢測的現有方法，Mutat.Res.285125-144)。為了經濟實惠又能被廣泛接受，DNA診斷系統必須是準確的(超過95％)，具有高的生產率，而且勞動強度要低。
分析技術的一般背景首先有必要簡單回顧涉及PCR擴增和電泳分離片段的一般技術，本技術領域已經使用過並正在使用該技術。
首先用化學和物理的方法處理如來自血液的細胞樣品以提取僅佔細胞基因組總DNA材料百分之二的攜帶基因的DNA鏈，其餘的DNA材料將背景佔滿。當每個細胞具有兩拷貝每種基因時(這一點可通過構件或鹼基對來鑑定，所述構件或鹼基對由字母A、C、G和T作為字母密碼的序列來辨認)，它們構成了DNA長鏈如此小的一部分以致於必須通過製備多拷貝的基因擴增之以使它們被檢測出。通過熱分離或變性DNA鏈對，與適當的引物混合以與欲研究的基因片段(如基因外顯子或編碼區)的始端和末端結合或退火(下文將更詳細地討論)並加入足夠的構件以產生基因外顯子的拷貝可完成基因擴增。連續重複此循環步驟產生漸增拷貝的外顯子以得到純化和擴增的數量，此方法通常指的是前述的聚合酶鏈反應或PCR擴增，它更詳細地闡述於例如分子病理學，Hein and Silvenman，Carolia學術出版社，1994，第2章，分子技術及其在臨床實驗室中的自動化，5-31頁(Winn-Deen)。
在此階段，然後是檢查或分析基因外顯子以測定與正常狀態相比是否有突變，一般優選以大小和鹼基對序列為基礎，通過電泳分離DNA純化片段可做到這一點，更詳細的描述見共同申請人Vijg和A.G.Uitterlinden的雙向DNA分型基因組分析的平行方法，EllisHorwood，1994，尤其是p33-40。
電泳不僅已用於DNA片段的分離，還可用於分離除基因外的其他物質，如Electrophoresis 1993，14，1091-1198中描述的蛋白質分析。通過帶螢光染料標記的電泳進行單向DNA分離的機器已有提供，如Perkin Elmer的ABI Prism 377 DNA測序儀；雙向DNA分型(typing)的機器也有提供，如共同申請人Vijg和E.Mullaart等人在Nature，365，1993年9月30日中所述通過雙向DNA分型平行分析基因組，p469-471，描述了荷蘭的Ingeny B.V.的裝置。將電場的第一維(稱為水平向)施加到其中已引入純化的DNA片段的適當凝膠基質(下文將討論)中，通過大小的不同(較大顆粒移動得比較小顆粒要慢)可導致片段的分離。通過在具有化學梯度(如在凝膠中設置連續的越來越濃的脲/甲醯胺)或沿膠設置的溫度梯度的垂直方向(豎向)施加電場，DNA片段將遷移(此次為豎直方向)，直至它們在特定的垂直序列所決定的位置處解鏈並被阻留在凝膠基質中的某處。為了防止整個DNA片段的解鏈，需讓它附著(電泳前)大量的G和C，G和C與A、T相比對解鏈的抗性更大。所謂的GC-加強(clamping)在完全由片段外顯子一部分之序列決定的位置處有效地阻留了每個片段。如果此序列僅在一個位置發生改變，例如AT對代替了GC對，解鏈將會延遲或提前，因此與正常的參照片段相比，被阻留至不同的垂直位置。
這種雙向基因掃描(TDGS)有望成為經濟實惠而又能被廣泛接受的DNA診斷系統。在此系統中，如上所述，通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增從給定DNA樣品中得到的大量DNA片段基於大小和鹼基對序列被電泳分離。此系統高度精確(即99％)，因為第二向分離是以變性的梯度凝膠電泳(DGGE)為基礎的。實際上，DGGE是唯一的具有如此高精確度的系統(Sheffield et al.，1993，用於檢測單鹼基取代的單鏈構象多態性分析的靈敏度，Genomics 16，325-332；Grompe，1993，核酸中未知突變的快速檢測，Nature Genet.5，111-117；Guldberg et al.，1993，在丹麥對苯丙酮尿症的分子學分析99％的突變被變性梯度凝膠電泳檢出，Genomics 17，141-146)。用於TDGS的自動化儀器在某種程度上是可以使用的，在某種程度上還有待開發。TDGS能夠同時檢測得自一個或多個基因的DNA片段中所有可能的突變，其生產率高，人為幹擾最低。
在DNA診斷中廣泛使用TDGS的一個主要障礙是在同一反應試管中通過PCR(多重PCR)同時擴增許多片段的困難。實際上，經常甚至不可能同時滿足PCR和變性梯度凝膠電泳的需求，即最適的PCR反應和擴增片段最適的解鏈行為。最新的方法開始於通過PCR擴增靶DNA區，通常是基因的蛋白質編碼區(外顯子)。這些擴增反應是分開進行的，例如，如果需分析基因中27個外顯子，則需進行27個獨立的PCR反應。在實際操作中，通常可以在一個試管中進行幾個PCR反應(例見Edwards and Gibbs，1994，多重PCR優點、發展及應用，PCR Methods and Applications 3，565-575)。
顯然，在大量個體需被檢測的情況下，以及當在相同的TDGS試驗中需同時檢測一個以上基因時，移液步驟和需進行的單個反應的總數會很高。這增加了試驗的勞動強度，也使工作更複雜，人為出錯的機會升高。實際上，鑑於這種複雜性，甚至在所有移液步驟都可以自動進行的完全自動化的實驗室中也解決不了這一難題。
不能在同一試管中的同一反應條件下同時PCR擴增多個片段這一難題是TDGS滿足臨床檢測標準(即對實驗者友好)的重大技術障礙。通過多重PCR，即通過使用多套引物在一個反應中進行幾個PCR擴增以減少PCR反應的數目是非同尋常的進步。
目前的多重PCR法有時簡單到混合其反應條件已分別被確定的幾套引物。然而，大多情況下，應仔細考慮欲擴增的區域，片段的相對大小，引物的動力學和PCR實驗條件的最佳化來開發多重PCR以適應多種片段。
主要的難題是引物的定位，為了基因診斷，人們一般的目的是擴增外顯子序列，剪接位點和調節區。外顯子擴增PCR反應的引物理想的是被置於與外顯子相鄰的內含子序列中。這提供了一些調節片段長度或擴增質量以及受突變影響的剪接位點的有關信息的限制，這些是選擇引物的首要限制。
其次，引物的定位必須使除靶序列外的其他位點處非特異性擴增不會發生。實際上，人類基因組為3×109個鹼基對長，這給靶序列和其他非靶序列之間偶然發生的序列同源性提供了充足的機會。這對多重PCR而言不是一典型的難題，但是當人們希望一次僅擴增一個片段時也會出現這一難題。這是選擇引物的第二個限制。
為了進行多重PCR，應選擇引物以使其預測的雜交動力學與多重反應中其他引物的相類似，這是選擇引物的第三個限制。以總基因組DNA作為模板選擇引物的這些限制是為何多重組通常較小(典型地少於5個片段)的原因。
為了在TDGS中最好地分離，選擇引物有第四個難以克服的限制。TDGS需要平均為100-600bp的DNA片段，兩個引物中的一個應與富含GC的片段偶聯以提供GC夾(GC-clamp)作為欲通過PCR產生的片段中最高的解鏈區，這對於確保在第二(變性梯度)向凝膠中檢測突變的最高敏感性是必需的(Myers et al.，1985，在與GC夾結合的DNA片段中幾乎所有的單鹼基取代均可被變性梯度凝膠電泳檢出，Nucl.Acids Res.13，3131-3145；Myers，et al.，1987，通過變性梯度凝膠電泳檢測和定位單鹼基變化，Meth.Enzymol.，155，501-527)。然後，引物應按下述方法定位，即靶片段僅含有一個這樣的單一功能區，它與其上結合有GC夾時相比，解鏈較早(在較低的脲、甲醯胺濃度或溫度下)，這證明對於PCR(不只是多重的)和最適解鏈曲線都最適合的PCR條件是難以(如果不是不可能的話)實現的(如將Blanquet等人，1993，通過變性梯度凝膠電泳鑑別RBl基因中的種系突變，Hum.Molec.Genet.2，975-979所述的RB DGGE設計與本發明的設計相比較)。
本發明涉及將所謂長-PCR與短-PCR相聯合。最近，PCR擴增法的發展已允許擴增來自基因組DNA的大片段(高至40kb)。我們已經利用了這一進展，通過使用長-PCR以儘可能最少數目的片段起始擴增靶基因的所有編碼區。然後我們使用這些長的擴增子作為模板以多重形式PCR擴增TDGS所需的小片段。藉此，首先從混雜的基因組DNA中擴增出靶序列，它允許在同一條件下從該預純化的模板得到小的PCR片段。
使用上述方法，僅以PCR擴增子的最適解鏈行為為基礎選擇引物套，也顯示了PCR的最適行為，甚至允許廣泛的多重PCR。此現象可部分歸於經長-PCR的預純化，實際上，相對於其他基因組DNA序列而言，長-PCR大大增加了靶序列的量，從而大大降低了反應的複雜性並增加了它的特異性。
儘管上述現象可以由通過製備純化的模板可降低複雜性來解釋，但仍未得到精確的解釋。實際上，作用的絕對值是驚人的，迫使我們重新評價PCR最優化所涉及的因子。然而有一件事是清楚的，僅通過本發明就使得能設計和進行有效的TDGS試驗，因為現在可以僅以解鏈曲線為基礎選擇引物，多重PCR十分的便利。
本發明也是通用的，實際上，在每一個以PCR為基礎的診斷反應中選擇引物是一項重要的問題，很多潛在的引物位點最終的結果卻很差，而多重PCR又會帶來另外的問題，這就是它不能被廣泛使用的原因。長-PCR/短-PCR兩步擴增系統提供一直接而簡單的解決問題的方法。
發明目的因此，本發明的一個目的是提供克服了上述困難的用於診斷性DNA檢測的新的改良的方法和裝置。
另一個目的是提供通過兩步多重聚合酶鏈反應擴增檢測基因突變的新方法，所述擴增使用長和短的多重PCR，接著以大小和鹼基對序列為基礎進行片段的雙向電泳分離。
其他目的將在下文解釋，並聯繫所附權利要求被指出。
附圖簡述以下將參照附圖描述本發明，其中

圖1闡明了進行本發明方法步驟的順序。
圖2表示帶和不帶GC夾的RB外顯子12(即成視網膜細胞瘤基因)的解鏈曲線。
圖3顯示了腫瘤抑制基因RB的圖譜，示出長和短-PCR反應的PCR引物位置。
圖4是2-D凝膠電泳模式中短-PCR片段預測位置的計算機圖。
圖5顯示出與理論預測模式一致的實際凝膠分離模式。
圖6表示以外顯子18-23的長-PCR產物為模板，得到所有6個短的PCR片段(泳道7-12)，而以總基因組DNA為模板，大多數產物丟失了(泳道1-6)，還顯示出僅5ng總基因組DNA就足以作為長-PCR的起始物質(泳道13)，並且用長-PCR產物作為模板得到所有短的PCR產物(泳道20-24)。
圖7表示野生型(純合正常)片段和幾個雜合突變體的詳細情況。
發明概述簡單地說，在重要的一方面，本發明包含分析來自DNA的預定基因外顯子的方法，該方法包括，作為第一步和相對較長的多重聚合酶鏈反應，加入針對連續的基因外顯子組的引物對，接著在一共用試管中完成聚合酶鏈反應擴增；作為第二步和短的多重聚合酶鏈反應，進一步加入針對每種基因外顯子的引物對，在所述共用試管中完成聚合酶鏈反應擴增；電泳分離基因片段。
下面將描述優選的和最好的技術模式。
優選實施方案的描述如上文所提及，本發明涉及以最低數目的兩步多重PCR反應與片段的自動雙向分離的聯合為基礎，設計精確而有效的突變檢測試驗以同時檢測基因中所有可能的突變。
表1列出了以RB(成視網膜細胞瘤)腫瘤抑制基因作為模型設計的TDGS試驗的不同步驟。首先，從資料庫(如Genbank)中獲取基因序列，靶區域(即外顯子、剪接位點，調節區)是確定的。然後定位引物以得到作為儘可能最少數目的仍可以通過長-PCR(即高至至少20kb)(TakaRa LA PCR試劑盒，Product Insert)擴增之片段的所用靶區域。選擇長-PCR引物序列的一些一般性指南已有描述(Foord and Rose，1994，長距離PCR，PCR方法和應用3，S149-S161)，但憑經驗確定最理想的引物仍有必要。
表1 TDGS試驗的設計1、從資料庫中獲取序列。
2、定位長-PCR的引物以用最少數目的擴增子覆蓋所有想要的區域(如編碼序列，剪接位點，調節區，突變熱點)。
3、根據下列標準定位短-PCR的引物；a、所希望的靶序列應該被100-600bp的擴增子覆蓋b、擴增子應該具有最理想的解鏈行為，即由一個最低解鏈區加上與引物之一結合的GC夾組成c、擴增子在2-D凝膠中最理想地分布d、類似的反應動力學
4、以長-PCR產物作為模板，為每套引物單獨建立PCR條件5、通過將引物套分組並調節反應成分來開發多重共擴增條件如表1第3項所列，然後使用長-PCR片段作為模板，選擇短-PCR的引物以產生100-600bp的片段。此處主要選擇標準必需是片段的解鏈行為，在理想狀態下，每個擴增子應僅含有一個解鏈區，它應該比與之結合的GC夾低(較不穩定)。通過使GC夾成為引物之一的一部分可完成30-40bp的GC-夾的引入(Sheffield etal.，1989，用於檢測單鹼基取代的單鏈構象多態性分析的靈敏度，Genomics 16，325-332)。通過使用電腦程式可確定每個候選靶序列的最理想的解鏈行為(例如MELT 87；Lerman and Silverstein，1987，DNA解鏈的計算機模擬及其在變性梯度凝膠電泳中的應用，Meth.Enzymol.155，482-501)。通過GC-加強具有最優化解鏈行為的擴增子例子示於圖2，它是有關RB的外顯子12的。
一般而言，引物集合的選擇是允許針對大小和DGGE方面在2-D凝膠中都有最理想的分布。由於2-D凝膠的高解析度(5-10bp大小的差異很容易辨認)，一般做到這一點不太難。實際上，50個或更少片段的點分布幾乎不是問題，根據它們的解鏈行為可簡單地選擇引物。
圖3示出為RB基因選擇的擴增子集合，以及用作模板的長-PCR片段。所有短-PCR片段加在一起代表90％以上的RB編碼區。
圖4和5示出被圖3所示擴增子覆蓋的RB基因的24個外顯子在理論上和經驗上的點分布。儘管有差異，最明顯的是表示外顯子11的點，我們的結論是整個解鏈程序精確地預示出點的位置。
沒有第一個長-PCR步驟，最理想的解鏈標準通常會與以總基因組DNA作為模板的PCR所用的其他引物設計標準相衝突，認識到這一點很重要。實際上，對於RB基因而言，發現不可能選擇到對於在DGGE中最理想的分離和在PCR中最適宜的引發都適合的條件。由長-PCR代表的預純化步驟對於TDGS最優化PCR引物套的設計顯然是絕對重要的。
當確立了試驗形式後，以多重形式進行兩步PCR擴增，設計和進行多重PCR反應的可能性代表了本發明的核心。圖6所示結果闡明了第一步，即長-PCR步驟對於成功的多重PCR的必要性。圖6中左邊6個泳道含有使用不同量的總基因組DNA作模板，對RB基因的外顯子18-23(6個片段)進行多重PCR之後得到的PCR產物。顯然，基本上沒有得到所需長度的產物，後者與使用相同多重PCR反應產物，但此次是以長-PCR產物作為模板的泳道7-12形成對照。以不同的循環進行長-PCR，顯然僅需要5-10個循環即可為成功的多重PCR產生足夠的模板。
泳道13至19含有以長-PCR產物作為模板，將不同量的起始物質，即不同量的總基因組DNA用於長-PCR反應得到的多重短-PCR產物。令人感興趣的是5ng總基因組DNA即足以得到所有產物。由於臨床材料有時不能獲得足夠的量(如乳腺癌針活檢)，這一結果就很重要，表示很少量的DNA也可以進行成功的試驗。
最後，圖6的泳道20-24含有與6套長-PCR相對應的5個多重PCR的產物(長-PCR組1和6合併；也見圖3和下文將討論的表2)。進一步調整PCR條件和/或引物會得到此基因更小數目的多重套。實際上，沒有理由在僅單個PCR反應中不能擴增完整的RB基因編碼區。在第二個PCR之後，將片段進行一輪完全的變性/復性循環以促進異源雙鏈的形成。表2列出了對RB而言的TDGS引物對；外顯子數目列於表格最左邊，長PCR引物密碼是針對6個外顯子組(0至24-27)，短PCR引物是針對單個27個外顯子的。
PCR過後，使片段混合物在變性梯度凝膠中進行2-D電泳(圖1)，使用自動化儀器會大大簡化這一步驟。這裡所用的儀器可允許10塊凝膠同時跑，而不需人工於預(即切下泳道並將之上樣於第二塊凝膠)，使用手工操作的儀器進行涉及實驗條件最優化的所有實驗。2-D電泳後，將凝膠從玻璃板之間取下，用溴化乙錠或任何其他染料染色。
表2用於RB TDGS的引物對RB長-PCR外顯子引物5』-3』 大小0-2 TGTCAGGCCTGCCTGACAGACTTCTATTCAGCA 4.5kbATGTTAGCAGAGGTAAATTTCCTCTGGGTAATGG3-6 GCAGTCATTTCCCAACACCTCCCCTCTGT 9kbAAGCCAAGCAGAGAATGAGGGAGGAGTACATTAC7-11 TCAGCAGTTTCTCCCTCCAAGTCAGAGAGGC10kbGAGACCAGAAGGAGCAAGATCAGGTAGTAG12-17ACCATTCCCCCTACTCTCCATGGTCCATG 12.4kbCTCACAGGAAAAATACACAGTATCCTGTTTGTGTGGC18-23CCAGCCTTGCATTCTGGGGATGAAGC14kbAGTCGTAAATAGATTTTCTTCACCCCGCCCCRB短-PCR外顯子引物5』-3』 大小 Tm(％UF) 多重套2[GC1]TTGATTTATAAGTATATGCCA229bp30 ECAAAACGTTTTAAGAAAATCC3[GC1]CCAGTGTGTGAATTATTTAA 239bp27 ACCTTTTATGGCAGAGGCTTATA4[GC1]GAATTGAAATATCTATGATT 270bp 24 AATCAGAGTGTAACCCTAATA5[GC1]TACTATGACTTCTAAATTACG157bp 27 AGTGAAAAATAACATTCTGTG6TGGAAAACTTTCTTTCAGTG 237bp 17 A[GC1]GAATTTAGTCCAAAGGAATGC7[GC1]CCTGCGATTTTCTCTCATAC 257bp 26 BGCAACTGCTGAATGAGAAAG8GTTCTTATCTAATTTACCACT 229bp 27 B[GC1]TTTTAAAGAAATCATGAAGTT9[GC1]AGTCAAGAGATTAGATTTTG 227bp 20 BATCCTCCCTCCACAGTC10 [GC1]GACATGTAAAGGATAATTGT 222bp 21 BGCAAATCAATCAAATATACC11 AGTATGTGAATGACTTCACT 174bp 21 B[GC1]TATAATATAATTAAAAGTAGG12 CTCCCTTCATTGCTTAACAC 211bp 24 C[GC1]TTTCTTTGCCAAGATATTAC13 [GC1]GATTACACAGTATCCTCGAC 224bp 34 CGCAGTACCACGAATTACAATG14 [GC1]GTGATTTTCTAAAATAGCAGG179bp 35 CACCGCGCCCGGCTGAAAT17 [GC1]TTCTTTGTCTGATAATAAC 380bp 26 CCTCTCACTAACAATAATTTGTT18 [GC1]GACTTTTAAATTGCCACTGT 393bp 33 DATTCCCTACAGTTTCTTTAT19 [GC1]CAACTTGAAATGAAGAC248bp 34 DCGTCCCGCTGCTCTTGAAAATAATCATC20 [GC1]AAAATGACTAATTTTTCTTATTCCC227bp 44 DAGGAGAGAAGGTGAAGTGC21 [GC2]CATTCTGACTACTTTTACATC201bp 28 DCGGGCTTACTATGGAAAATTAC22 [GC3]CTTTTTACTGTTCTTCC 194bp 33DCCAATCAAAGGATACTTTTG23 [GC1]TCTAATGTAATGGGTCCACC 281bp 38DCCCTACTTCCCTAAAGAGAAAAC24 CGGAATGATGTATTTATGCTCA 195bp 22E[GC1]TTCTTTTATACTTACAATGC25 [GC1]ATGATTTAAAGTAAAGAATTCT 245bp 38ECATCTCAGCTACTGGAAAAC26 [GC1]TCCATTTATAAATACACATG 161bp 32EATTTCGTTTACACAAGGTG27 [GC1]TACCCAGTACCATCAATGC191bp 43ETCCAGAGGTGTACACAGTGGC夾GC1CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCC(30聚體)GC2CGCCCCGCGCCGCCGCCCCGCCCCCGCCCGTCCCGCCC(38聚體)GC3CGCCCCGCCGCGCCCCGCGCGCCCGGTCCCCGCGC(35聚體)記錄並評價(通過肉眼和圖象分析)所得模式中突變的存在。在所用條件下，即GC-加強和異源雙鏈化，雜合突變形成4個點2個同源雙鏈變體和2個異源雙鏈變體(圖7中闡明的)，後者並不總能被分離。由於突變也可在純合狀態下發生，因而在PCR之前有必要將每種樣品與對照樣品混合以確信異源雙鏈分子會存在。
下文提供了詳細的方法，其中本發明的實施方案得以實施和使用以在DNA診斷檢測中精確而有效地製備和檢查基因片段。針對舉例性或模型基因(即前文討論過的腫瘤抑制基因RB)的這一描述不構成對本發明的特殊限制。將相同的方法用於其他基因和/或在同一個試管中混合更多的PCR片段屬於本領域技術人員的範圍，它被認為屬於本發明的保護範圍。
A.RB兩步PCRTDGS試驗的設計序列的獲得從資料庫(即Genbank)中獲取RB基因的序列，靶區域(即外顯子，剪接位點，調節區)是確定的。
用於多重長-PCR的引物的選擇以用最可能少數目的仍可通過長-PCR擴增的片段覆蓋整個靶區域的方式定位長-PCR的引物對。選擇長-PCR引物還應使多重長-PCR有最高的特異性，最適的退火溫度和最低限度的自身互補作用，例如通過使用引物設計軟體而選擇。考慮到引物充足的定位空間，設計多重長-PCR相對容易。
用於多重短-PCR的引物的選擇 以下述標準為基礎選擇短-PCR的引物對。
a.所需的靶序列應被100至600bp的擴增子覆蓋b.擴增子應具有最理想的解鏈行為，即由一個最低解鏈區外加與引物之一結合的GC-夾組成c.在2-D凝膠中擴增子最理想的分布d.類似的反應動力學如果用於總基因組DNA，上述標準b經常與標準的引物設計標準相衝突。實際上，經證實本發明對於設計和完成作為檢測RB基因中突變的快速、精確和實用的工具的TDGS而言是必需的，也是足夠的。
以不同多重反應中引物的行為為基礎，憑經驗選擇多重組，根據長-PCR制定RB的多重組，即以一個長-PCR片段為模板的所有短-PCR作為一個多重組一起擴增。實際上將兩個長-PCR組聯合作為一個多重組，所有短-PCR片段也可一起擴增。如上文所解釋，表2列出了長和短PCR所用的引物對，片段大小，退火溫度，解鏈溫度和5個不同的多重組。
B.PCR反應和異源雙鏈化可從多種來源得到引物(去保護並去鹽的)。我們的引物得自Gibco BRL。為了長期貯存，例如應在-20℃下將引物以在超純水中的100μM貯存溶液保存，短期使用的話，在-20℃下將引物作為超純化水中的12.5μM溶液保存。
在帶有加熱蓋的Gene E熱循環儀(Techne，Cambridge，UK)的熱孔(thermowell)試管(Costar，Cambridge，MA.)中進行PCR反應，不必在樣品上覆蓋油。使用LAPCR試劑盒(TaKaRa)，在100μl體積中以5-500ng基因組DNA作為模板，每種引物為0.2μM進行多重長PCR反應(6個片段)，根據廠商的說明進行PCR反應，條件如下所示。首先，94℃，1分鐘一個循環，接著98℃，20秒/68℃，12分鐘30個循環(每次循環漸增10秒)，最後72℃，12分鐘一個循環。PCR產物貯存於-20℃下供進一步使用。
使用相同的Gene E熱循環儀，於50μl體積中，以2μl長-PCR產物，0.2-0.5μM每種引物，0.25mM dNTP，2.5-4.5mMMgCl2，3單位Taq聚合酶(Gibco BRL或Promega)進行短PCR反應。PCR條件如下述。94℃，2分鐘一個循環，然後94℃，40秒/41℃，40秒/69℃，2分鐘(每次循環漸增2秒)30個循環，最後72℃，10分鐘一個循環。
短PCR之後，通過一個完全的變性/復性循環使片段異源雙鏈化。即98℃，100分鐘/55℃，30分鐘/41℃，30分鐘。
PCR和異源雙鏈化之後，混合試管中的內含物，加入1/10體積的加樣緩衝液。根據溴化乙錠染色，通常有足夠跑幾次電泳的樣品，當總體積對狹線而言太大時，需用乙醇沉澱樣品(加入加樣緩衝液之前)並重新溶解到小體積中。
C.雙向電泳手工操作的和自動化的2-D電泳儀器均來自前述的Ingeny B.V.(Leiden，荷蘭)。對於手工操作的電泳而言，首先使用0.75mm厚的9％ PAA凝膠在45℃電泳5-6小時以按大小分離DNA片段的混合物，通過溴化乙錠染色10分鐘並用紫外線透照凝膠(凝膠置於玻璃板上以防止DNA片段被紫外光損壞)可用肉眼看到分離的模式。快速切下泳道中部(不包括邊緣)100-600bp的區域，加到1mm厚的含0-60％(RB)或30-90％(p53)脲/甲醯胺(UF)梯度的9％ PAA凝膠中。使用簡單的梯度形成儀(Gibco BRL)傾倒梯度，在60℃，200V下電泳7.5-11小時。電泳後用0.5μg/ml溴化乙錠染凝膠15-20分鐘並在水中脫色15分鐘，使用寶麗來照相機在紫外光照射下記錄電泳模式。
對於自動化的2-D電泳而言，根據廠商說明(Ingeny B.V.，Leiden，荷蘭)用自動化2-D電泳儀所附帶的凝膠澆鑄裝置一次傾倒10塊凝膠。凝聚之後，從凝膠澆鑄箱中取出凝膠(在玻璃板之間)並用溼吸水紙清潔，然後根據廠商說明置於儀器中，即置於兩個用矽氧烷封住邊緣的支持凝膠的盒中。含有加熱後45℃的緩衝液的儀器被置於電源開關關閉的l-D模式下。加入加樣緩衝液之後，將樣品(至多40μl)上樣於自動化2-D電泳儀中的凝膠的V-形孔中。使用帶有0-60％脲/甲醯胺梯度的9％丙烯醯胺，0.25％ TAE凝膠。第一向在45℃，180V下電泳4小時，第二向在60℃，200V下電泳7.5-11小時。電泳後用溴化乙錠將凝膠染色，與手工操作的儀器所描述的一樣，在紫外光照射下記錄電泳模式。
總之，儘管本發明描述的是後接雙向電泳分離的兩步(長和短)多重聚合酶鏈反應擴增，但它可與單向電泳或需要PCR-擴增之靶序列的檢測突變的其他方法聯合應用。
本領域技術人員會對本發明進行進一步修改，這種修改也被認為在本發明附加權利要求所限定的精神和範圍之內。
權利要求
1.一種分析來自DNA的預定基因外顯子的方法，包括，作為第一步和相對較長的多重聚合酶鏈反應，加入針對連續的基因外顯子組的引物對，接著在一共用試管中完成聚合酶鏈反應擴增；作為第二步和短的多重聚合酶鏈反應，進一步加入針對每種基因外顯子的引物對，在所述共用試管中完成聚合酶鏈反應擴增；電泳分離基因片段。
2.權利要求1所述的方法，其中沿一個方向以大小為基礎電泳分離基因片段。
3.權利要求2所述的方法，其中基因片段沿垂直方向和沿溫度或化學變性梯度進行進一步的鹼基對序列電泳分離以沿垂直方向將基因片段分布在各特定的序列位置處；將這些位置與正常基因片段的位置相比較以檢測基因突變。
4.權利要求3所述的方法，其中引物是用螢光染料標記的寡核苷酸引物。
5.權利要求3所述的方法，其中聚合酶鏈反應中所用的核苷酸構件是經螢光標記過的。
6.權利要求3所述的方法，其中電泳分離在變性梯度凝膠中完成。
7.權利要求6所述的方法，其中在凝膠中使用脲和甲醯胺梯度以分離片段。
8.權利要求6所述的方法，其中在凝膠中使用溫度梯度以分離片段。
9.權利要求3所述的方法，其中對於成視網膜細胞瘤基因而言，長-PCR基因外顯子組是外顯子1-2，3-6，7-11，12-17，18-23和24-27。
10.一種分析來自DNA的預定基因外顯子的方法，包括，作為第一步和相對較長的多重聚合酶鏈反應，加入針對連續的基因外顯子組的引物對，接著在一共用試管中完成聚合酶鏈反應擴增；作為第二步和短的多重聚合酶鏈反應，進一步加入針對每種基因外顯子的引物對，在所述共用試管中完成聚合酶鏈反應擴增。
全文摘要
檢測基因中突變的測定法,包括兩步多重聚合酶鏈反應擴增,然後以大小和鹼基對序列這兩者為基礎,優選進行片段的雙向電泳分離。
文檔編號G01N27/447GK1198188SQ96194610
公開日1998年11月4日 申請日期1996年6月3日 優先權日1995年6月6日
發明者揚·維吉, 李代宗 申請人:揚·維吉, 李代宗