來自放線菌的殺蟲發酵液的製作方法

2023-07-11 20:49:01

專利名稱：來自放線菌的殺蟲發酵液的製作方法
來自放線菌的殺蟲發酵液與相關申請的交叉引用本申請要求2009年11月6日遞交的美國系列號61/258，716和2009年11月9日遞交的美國系列號61/259，549的權益，每一個的內容都在此通過引用而併入。關於對在聯邦資助的研究或發展之下作出的發明的權利的聲明不適用
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背景技術：
昆蟲僅在美國就引起超過二百二十億美元的作物損失。許多廣泛使用的殺蟲劑是較舊的神經毒性化合物，並且對於新的、更安全的化學品存在大量需求。美國專利號6，682，925中描述的菌株NRRL No. 30232是專利化的鮮黃鏈黴菌(Streptomycesgalbus)菌株,其產生一組緊密相關的大環內酯稱作都奈黴素(dunaimycins),所述都奈黴素顯示出殺蟲活性，特別是抗鱗翅目(毛毛蟲)的殺蟲活性。都奈黴素是由放線菌產生的24元大環內酯，其首先在二十世紀90年代早期被Abbott Laboratories的研究組報導。Abbott的研究者闡明了各種都奈黴素品種Al，Cl，C2, D2，D2S，D3和D4S的結構；研究了其抗微生物活性和免疫抑制活性；並且描述了產生性生物體的分類,兩種澱粉酶產色鏈黴菌(Streptomyces diastatochromogenes)的菌株。Karwowski, T. P.,等人 Tournalof Antibiotics Dec. 1991，p.1312-1317 ；Hochlowski, T.E. Tournal of Antibiotics,Dec. 1991, pp. 1318-1330 ；和 Burres, N. S.,等人，Tournal of Antibiotics, Dec. 1991,PP. 1331-1341。幾篇更晚的公開描述了特定都奈黴素的殺蟲或殺蟎活性。雖然文獻描述了特定都奈黴素的純化並闡明了其結構和活性，缺乏關於各種都奈黴素之間的相互作用、以及比較各種都奈黴素的殺蟲活性的公開。此外，雖然需要在克/升的範圍內產生含有都奈黴素的發酵液以產生商業上可行的殺蟲產品，都奈黴素相關的公開描述的都奈黴素的產生在毫克/升的水平。背景文獻沒有公開用於增加都奈黴素生產的方法，也沒有領會擴大規模的相應挑戰。在通過篩選抗生素抗性突變體的文庫和優化發酵條件來進行實驗，以增加鮮黃鏈黴菌NRRL No. 30232的都奈黴素生產中，申請人將都奈黴素生產增加到了之前未報導過的水平，即至少2. 5克都奈黴素/升發酵液(濃縮前)。然而，令人驚訝地，申請人發現都奈黴素生產的增加與殺蟲活性的增加並不必然是成比例的。申請人更詳細地分析了各種都奈黴素之間的相互作用並確定了有殺蟲活性的具體都奈黴素品種，而其它的都奈黴素品種沒有活性或者對殺蟲活性有拮抗性。發明概述因此，本發明涉及含有放線菌培養物的組合物，其具有殺蟲活性都奈黴素與無殺蟲活性都奈黴素之間的優化的比率。在一個實施方案中，此類培養物含有克/升水平的都
奈黴素。本發明還涉及用於產生富含殺蟲活性都奈黴素的發酵液的方法，其中通過在優化的培養基中培養能夠產生活性和無活性都奈黴素兩者的放線菌直到產生至少約I克總都奈黴素/I升發酵液。在一個實施方案中，所述優化的培養基含有C N比按重量為至少10 I的碳源和氮源。可基於總體發酵培養基混合物中C和N的質量通過已知的方法來計算C N的重量比。因此，多種組分可向每個C和N部分添加不同的量，但是混合物中的總體比率將具有所示的比率。本發明還涵蓋用於產生含有都奈黴素的發酵產品的方法，其中使用上述方法和標準的純化技術來獲得純的或半純的、富含 殺蟲活性都奈黴素的發酵產品。本發明的另一方面是就殺蟲活性而篩選放線菌的方法，其是通過測量過量產生都奈黴素的放線菌文庫所產生的活性和無活性都奈黴素的量。在此方法的一個實施方案中，在篩選步驟之前進行這樣的步驟其中從過量產生都奈黴素的親本菌株產生過量產生都奈黴素的放線菌的突變體文庫。


圖I提供了本文所描述的都奈黴素的一般結構，其中包括被鑑別為Al，Cl，C2,C2S, D2, D2S, D3, D3S 和 D4S 的那些。圖2提供了用於本文所述的都奈黴素的編號方案。圖3提供了利福平抗性突變體vs.野生型的階段I篩選測定的生物活性結果。圖4提供了利福平抗性突變體vs.野生型的階段3篩選測定的生物活性結果，含有LD50數據。圖5提供了對於利福平抗性突變體階段3篩選的Al比率的HPLC測定結果。圖6提供了本文所指的都奈黴素的具體結構。圖7提供了圖表，其中顯示了以野生型進行的AQ6047的典型批次方法的大環內酯生產。圖8提供了圖表，其中顯示了以野生型進行的AQ6047的典型補料批次方法的大環
內酯生產。圖9提供了圖表，其中顯示了以突變體進行的AQ6047的典型補料批次方法的大環
內酯生產。圖10提供了圖表，其中顯示了補料批次發酵中M1064的都奈黴素生產和相應的生物活性。圖11提供了圖表，其中顯示了通過發酵優化對都奈黴素生產的改進。圖12提供了圖表，其中顯示了 RF 1694和RF 1696的發酵液以及Javelin(蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringensis)產物)、Spintor (基於多殺菌素的產品)和未處理的對照(UTC)抗甜菜夜蛾的生物活性。發明詳述本發明涉及殺蟲放線菌產生的發酵液以及相關發酵固體，其含有殺蟲活性與無殺蟲活性都奈黴素的優化比率。術語「發酵液」是指微生物發酵後產生的培養基，並且特別涵蓋微生物及其組成部分、未使用的原材料、以及所述微生物在發酵過程中所產生的代謝物。如本文中所使用的，術語「發酵固體」是指濃縮的和/或乾燥的發酵液。如本文中所使用的，術語「粗製提取物」是指發酵液的有機提取物，例如乙酸乙酯提取物。如本文中所使用的，術語「半純化的」是指從發酵液分離的代謝物，其為約50%至約90%純。如本文中所使用的，術語「純化的」是指從發酵液分離的代謝物，其為約91%至約100%純。發酵液中的放線菌產生有殺蟲活性和無殺蟲活性的都奈黴素，並且可以是鏈黴菌屬(Streptomyces)的菌株。數種之前鑑別的鏈黴菌屬的菌株產生多種都奈黴素。此類菌株包括鮮黃鏈黴菌NRRL No. 30232 (在美國專利號6，682，925中描述)和澱粉酶產色鏈黴菌菌株 AB1691Q-321 和 AB1711J-452 (在 Karwowski, J. P.,等人,Tournal of AntibioticsDec. 1991, p. 1312中描述)。此外，可使用本文中所描述的和本領域中已知的技術就產生活性和無活性都奈黴素的能力容易地篩選鏈黴菌屬的菌株。產生都奈黴素的放線菌還可以是產生都奈黴素的親本菌株(例如分離的野生型菌株)的突變體。可通過本領域中已知的物理和化學方法來獲得突變體。例如，可通過用化學品(例如N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍)處理來獲得突變體菌株。可不有意使用誘變劑而獲得自發突變體，通過例如經典方法，例如在親本對其敏感的某些抗生素的存在下培養所述親本菌株並就改進的生物學活性或者-在本申請中-與親本相比都奈黴素的過量生產來測試任何抗性突變體。也可通過產生生產都奈黴素的菌株的原生質融合而獲得突變 體，其中使用 Keiser, T.,等人 Practical Streptomyces Genetics, 2000,pp. 57-58 中所描述的技術。產生的都奈黴素多於親本菌株的突變體在本文中稱作「過量產生都奈黴素的菌株」。在一些實施方案中，與親本菌株相比，此類過量產生都奈黴素的菌株產生約2至約20倍更多的都奈黴素。在一個實施方案中，此類突變體是鮮黃鏈黴菌M1064。這種突變體是通過篩選抗生素抗性的、過量產生都奈黴素的鮮黃鏈黴菌NRRLNo. 30232突變體而獲得的，如實施例I中所詳細描述的。根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約及其下的實施細則(布達佩斯條約)，將M1064於2009年11月5日保藏在USDA的農業研究機構保藏中心(位於 1815N. University Street Peoria, 111. 61604U. S. A) (NRRL)，並且保藏編號為 No. NRRL50334。此菌株是在下述條件下被保藏的確保在此申請的未決過程中可獲得對培養物的接觸。然而，應理解此保藏物的可獲得性不構成通過政府行為損害專利權而實施本發明的許可。都奈黴素的一般性結構和各種都奈黴素顯示在圖I中。如本文中所使用的，術語「活性都奈黴素」是指有殺蟲活性的那些都奈黴素種類。在一個實施方案中，經純化的活性都奈黴素種類在少於約IOOOppm的濃度時至少對於一些昆蟲是有殺蟲活性的；在另一個實施方案中，以少於約500ppm的濃度；在另外的實施方案中，以少於約200ppm的濃度。活性都奈黴素包括D3S，C2S，D2，D2S，D4S和C2。如本文中所使用的，術語「無活性都奈黴素」是指無殺蟲活性的那些都奈黴素種類。經純化的無活性都奈黴素種類不顯示對於一些或全部昆蟲的殺蟲活性，並且在直至約IOOOppm時是無活性的。無活性的都奈黴素包括Al和Cl。在一個實施方案中，殺蟲活性是通過抗鱗翅目的活性確定的。在另一個實施方案中，如下區分有活性和無活性的都奈黴素以200ppm或更少的LD50，每一種顯示出抗甜菜夜蛾的殺蟲活性的能力。在一些實施方案中，活性都奈黴素在位置C18-C19處具有插烯烯醇醚或半縮醛或乙縮醛部分，如025，025，02，025和02所具有的。都奈黴中的碳編號素顯示在圖2中。在這種實施方案中，無活性的都奈黴素缺少這些部分而在位置C19處具有酮，如Al和Cl所具有的。無意被任何特定的理論所束縛，申請人相信需要插烯烯醇醚或半縮醛或乙縮醛部分的存在用於生物學活性，而圖2中所顯示的位置R2處的氨基糖部分存在與否對於活性不是必需的但是其增加分子的水溶性。另外一個考慮是，活性都奈黴素能動地(即作為活化劑)結合昆蟲中特定的蛋白靶標，而無活性的都奈黴素競爭性地抑制活性種類的結合，但是它們自己在這些蛋白靶標上僅顯示出弱的效果。在一個實施方案中，發酵液包括至少約O. 5g總都奈黴素/升。在另一個實施方案中，其包括至少約I克總都奈黴素/升。在另一個實施方案中，其包括至少3克總都奈黴素/升培養液。在另外的實施方案中，其包括至少7克總都奈黴素/升培養液。在另一個實施方案中，發酵液包括約I克至約7克總都奈黴素/升培養液。在一個實施方案中，活性與無活性都奈黴素的優化的比率為至少約I : I。在另一個實施方案中，活性與無活性都奈黴素的優化的比率為至少約2 I。可基於都奈黴素的摩爾比或重量比來計算所述比率。例如，都奈黴素Al和Cl不具有糖組分，而都奈黴素D2S和D3S具有連接的糖。含有糖的都奈黴素比沒有糖的那些重約10% (按重量)並且不明顯地影響活性與無活性都奈黴素的總體比率。
本發明的組合物包括上文所描述的發酵液，其可被原樣使用、經乾燥使用和/或經濃縮使用。可用一種或多種載體配製所述發酵液或發酵固體。視最終應用的需要，可在配製前通過加熱、化學或輻射手段處理所述發酵液以滅活微生物。載體是加入發酵液中以改善回收、效力、或物理特性和/或有助於包裝和施用的惰性製劑成分。可單獨地或組合加入此類載體。在一些實施方案中，所述載體是抗結塊劑、抗氧化劑、填充劑和/或保護劑。有用的載體的實例包括多糖(澱粉，麥芽糊精，甲基纖維素，蛋白質例如乳清蛋白，肽，膠)，糖(乳糖，海藻糖，蔗糖)，脂質(卵磷脂，植物油，礦物油)，鹽(氯化鈉，碳酸鈣，檸檬酸鈉)，和矽酸鹽類(粘土，無定形矽，煅制二氧化矽/沉澱的二氧化矽，矽酸鹽)。在一些實施方案中，在濃縮發酵液之後和在乾燥過程之中和/或之後加入所述載體。在一個實施方案中，所述組合物包括發酵固體，其被配製為可溼性粉劑或水可分散的顆粒，其中發酵固體以約1%至約90% (按重量)的濃度存在。在另一個實施方案中，所述組合物可以被配製為可乳化的濃縮物，其中將經濃縮的發酵液溶解在惰性載體中，所述載體為水易混合的溶劑或水不混溶的有機溶劑與乳化劑的混合物。濃縮的發酵液以約10%至約90%的濃度存在。在另一個實施方案中，所述組合物可被配製為水性懸浮液，其中濃縮的發酵液或發酵固體以約0.1%至約50% (按重量)範圍內的濃度被分散在水性媒介中。某些方法可用於製備具有活性與無活性都奈黴素的優化比率的發酵液。在本發明的一個方面中，上述發酵液是通過在合適的培養基中培養產生都奈黴素的放線菌而產生的，所述培養基經優化以增加活性都奈黴素的產生和使無活性都奈黴素的產生最小化。可通過調節氮源與碳源之間的比率，從而使得培養基中可獲得的氮多於碳，以獲得合適的培養基。在一個實施方案中，碳與氮的比率為約I : I至約200 I。在另一實施方案中，所述比率為約10 I至約30 I。在另一個實施方案中，所述比率為約20 I。如上文的概述中所述的，所示的比率是源中C和N的相對重量。在一個實施方案中，進行了批次方法，其中在分批(batching)過程中(開始發酵之前)設置所述比率並且在發酵過程中不對其進行調節。在另一個實施方案中，監測C和N源的消耗並且在所述方法中向發酵培養基中進行添加。也可採用選擇特定的碳和氮源來優化活性與無活性都奈黴素的比率。合適的碳源包括單糖、二糖和多糖，例如葡萄糖、果糖、鹿糖、糖蜜、麥芽糊精和澱粉，以及源自植物的月旨肪酸和油(例如豆油和棉籽油)。合適的氮源可以是源自微生物、動物和植物的蛋白質和胺基酸或者含有蛋白質的物質。在一個實施方案中，氮源來自源自大豆的產品，例如豆面，大豆消化液，大豆水解產物和大豆磨粒(grit)。在另一個實施方案中，氮源包括源自棉籽的產品例如 PROFLO (Traders Protein, Lubbock, Texas)和 martone (Marcor DevelopmentCorporation, Carlstadt, NJ),玉米眾粉,麥芽提取物以及馬鈴薯提取物。在另一個實施方案中，氮源是源自動物的，例如源自酪蛋白的產品(脫脂乳，酪蛋白腖，酪蛋白水解產物，酪蛋白胺基酸)以及蛋白腖。在另一個實施方案中，氮源是源自微生物的，例如酵母提取物或全酵母。生物體生長發育所需的其它必要元素也應被包括在培養基中並且將是本領域技術人員所熟知的。可使用常規的監測碳和/或氮源的方法來進行對發酵培養基中C和N水平的監測。例如，可使用Beckman葡萄糖分析儀來監測葡萄糖水平，可使用酶促(轉化酶)法來監測蔗糖，而可在對發酵培養基等分試樣進行酸水解後通過色度還原糖法來分析更複雜的源(例如糖蜜和麥芽提取物)。可使用常規的大規模微生物培養方法來培養產生都奈黴素的放線菌，所述方法包括深層發酵，固態發酵，或液體表面培養。當在約20°C至約32°C的溫度下培養時，產生都奈黴素。在一個實施方案中，將發酵液的pH保持在約6至約8之間。在一個實施方案中，培養產生都奈黴素的放線菌，直至產生至少約I克都奈黴素/升發酵液；或者在另一個實施方案中，直至產生至少約2克都奈黴素/升；或者在另一個實施方案中，直至產生至少約3克都奈黴素/升；或者在另一個實施方案中，直至產生至少約I克-約7克都奈黴素/升。在發酵過程中可通過測試培養液的抽取物而追蹤都奈黴素的產生。用於追蹤產生的一種方法是通過高壓液相色譜(HPLC)分析抽取物。在一個實施方案中，上述用於生產具有活性與無活性都奈黴素的優化比率的殺蟲發酵液的方法包括進一步通過常規工業方法濃縮所述培養液的步驟，所述常規工業方法為例如離心，膜過濾，切線流過濾，深度過濾和蒸發。在一些實施方案中，清洗經濃縮的發酵液(例如通過膜透析或超濾方法)以去除殘餘發酵液。在另一個實施方案中，可通過加入或不加入載體而使用常規乾燥過程或方法來乾燥發酵液或培養液濃縮物，所述常規乾燥過程或方法為例如噴霧乾燥、冷凍乾燥、託盤乾燥、流動床乾燥或轉筒乾燥。可進一步加工所產生的發酵固體(例如通過研磨或粒化)以產生特定的粒度或物理形式。在本發明的另一個方面中，對通過上述方法產生的殺蟲發酵液進行化學處理，以修飾無活性的都奈黴素，從而使得它們不能就生物學相關的結合位點或靶標幹擾活性都奈黴素或與其競爭，或者從而使得它們被轉化為活性都奈黴素。在一個實施方案中，可從混合物中去除所選擇的都奈黴素。例如，可通過使所有都奈黴素的全部混合物通過含有懸垂氨 基官能團(例如伯胺、肟，氨基脲或肼)的樹脂而實現去除都奈黴素Al和Cl。存在於Al和Cl中的C19-酮基將優先與所述懸垂氨基反應而可通過用適當的溶劑簡單清洗而從柱子中去除其餘的都奈黴素。可通過使都奈黴素混合物通過陽離子交換樹脂而去除含有例如糖胺糖部分的都奈黴素。糖胺糖上存在的氨基將幫助具有糖的活性都奈黴素分子保留在柱子上，並允許無活性的都奈黴素通過。然後，可用鹼性緩衝液將活性糖胺糖都奈黴素從樹脂上洗脫掉。在另一個實施方案中，可通過遺傳操作放線菌菌株以特異性地敲除無活性都奈黴素的表達(通過經典遺傳學或通過分子手段)而減少混合物中的無活性都奈黴素。在本發明的另一個方面中，使通過上述方法產生的殺蟲發酵液經受標準的純化技術，以將活性都奈黴素與無活性都奈黴素分離，並獲得半純化或純化的都奈黴素。本發明還涵蓋用於就優先產生活性都奈黴素的能力篩選放線菌的方法。在一個實 施方案中，目的放線菌所產生的活性都奈黴素與無活性都奈黴素的比率大於約I : I。在另一個實施方案中，不產生無活性都奈黴素。在本發明的另一個方面中，在篩選步驟之前產生過量產生都奈黴素的菌株文庫。例如，實施例I和2描述了產生突變體文庫以及使用色譜法來鑑別過量產生都奈黴素的那些。其它用於快速篩選過產生都奈黴素的突變體的方法包括產生色度報告菌株。本發明的組合物可用於控制昆蟲。因此，本發明的另一方面針對的是用於控制昆蟲的方法，其通過向昆蟲的部位施用有效量的本發明的組合物。如本文中所使用的，術語「控制(control) 」或「控制(controlling) 」是指殺死昆蟲或減少可存活昆蟲卵的數目。術語「部位」是指昆蟲在其中生活的環境或者它們的卵存在的地方，例如昆蟲可能食用或棲息的植物部分或植物周圍區域。「有效量」是引起被處理的昆蟲的可測量的減少所需的量。在一些實施方案中，獲得了超過約50%的控制，在其它實施方案中超過約60%;在其它實施方案中超過約70% ;在其它實施方案中超過約75% ;在其它實施方案中超過約80%。在一個實施方案中，使用了約IOOppm至約IOOOOppm的發酵固體/英畝的比率。在另一個實施方案中，應用了約I至約50g配製的發酵固體/英畝。在一個實施方案中，所述組合物用於控制鱗翅目，例如煙芽夜蛾(Heliothisvirescens),甜菜夜蛾(Spodoptera exigua),甘藍銀紋夜蛾(Trichoplusia ni)和小菜蛾(Plutella xylostella)。其它典型的鱗翅目包括埃及棉葉蟲,斜帶卷葉蟲,夜盜蟲,褐卷葉蟲，蘋果蠹蛾，草地貪夜蛾和棉鈴蟲。
實施例實施例I-突變體的產生QST6047 (Steptomyces galbus NRRL No. 30232)是鮮黃鏈黴菌的野生菌株，其產生一系列都奈黴素。QST6047產生的都奈黴素具有抗鱗翅目的殺蟲活性。為了增加都奈黴素生產和生物活性，通過抗生素抗性突變體篩選程序從野生菌株QST6047產生了過量產生都奈黴素的突變體M1064，在所述篩選程序中產生了對單獨的抗生素(慶大黴素，利福平，鏈黴素，巴龍黴素或妥布黴素)有抗性的突變體文庫。下面詳細描述了產生和篩選利福平抗性文庫，從其中最終選擇了過量產生都奈黴素的菌株用於進一步的開發。將來自S. galbus QST6047 的 SFM (甘露醇 20g/L，豆面 20g/L，瓊脂 20g/L)板培養物的孢子(懸浮在20%甘油中)在50°C水浴中熱激10分鐘。將100 μ I的孢子懸浮液塗板在補充了 5 μ Ι/ml利福平的GYM(葡萄糖4g/L，酵母提取物4g/L，麥芽提取物10g/L和瓊脂12g/L)上。塗布足夠的孢子懸浮液從而具有至少300個單菌落用於分離、純化和篩選。
將含有利福平抗性細菌的瓊脂塞用於接種含有31-3C培養基(Proflo 20g/L，麥芽提取物20g/L，KH2P04單鹼6g/L，K2HP04 二鹼4.8g/L)的培養管並在28°C下培養6天。然後將培養液系列稀釋並如下使用甜菜夜 蛾卵生物測定(BAW Egging Bioassay)就生物活性進行測試。將測試樣品分配在含有甜菜夜蛾(BAW)卵的96孔微量滴定板中。微量滴定板的每個孔含有膳食和大約已知數目的甜菜夜蛾卵。在最佳條件下孵育微量滴定板使卵孵出。七天後，計數仍然存活的蟲的數目並且給出中斷點評定。記錄相對於野生型中斷點的突變體中斷點。每個中斷點代表相對於野生型的2X活性增加。然後在搖瓶中培養任何顯示出超過野生型的生物活性的突變體。在所篩選的300種突變體中，20種顯示出增加的生物活性(圖3)。在I-L三角瓶中培養所選的具有更高生物活性和在瓊脂板上的孢子生成能力的突變體並隨後擴大規模至含有31-3C培養基的20-L生物反應器。對於每種突變體測量生物活性(圖4)和都奈黴素產生(圖5)。令人驚訝地，雖然突變體產生了比野生型更高水平的都奈黴素，生物活性沒有成比例地增加。實施例2-鑑別各種都奈黴素生物活性的效力差異(HPLC鑑別和生物測定)從稱作M1064的突變體或野生型(鮮黃鏈黴菌QST6047)分離出各種都奈黴素用於活性分析。使用上文所描述的培養基，使M1064或野生型在2L搖瓶中生長。用IL乙酸乙酯將全培養液抽提兩次並在降低的壓力下濃縮合併的有機抽提物。將粗製提取物加載到在己烷中平衡的矽膠柱上，並用己烷和之後的己烷-乙酸乙酯分步溶劑梯度洗脫所述柱子。通過分析HPLC反相C8柱子和BAW卵生物測定確定含有都奈黴素的級分。使用製備性反相C8 柱[Zorbax Exclipse XDB-C8, 5 μ m ;9· 4x25cm,流速為 2. OmL/min，且在220nm處進行UV檢測。洗脫溶劑系統由水(IOmM NH4OAc)甲醇混合物組成]進一步分級活性級分，這產生了純的都奈黴素。使用UV和質譜證實了所有分離的都奈黴素。所鑑別的都奈黴素的結構顯示在圖6中。然後，如下就抗甜菜夜蛾卵的生物活性測試經分離、鑑別的都奈黴素。作為各種半純化的都奈黴素(單獨的或組合的)的15%含水乙醇溶液提供儲液。為了參照的目的，稱取Javelin WDG(蘇雲金芽孢桿菌克氏(Kurstaki)亞種；ThermoTrilogy Inc)並稀釋以提供IOOOppm的儲液(正化學標準)。將這些儲液轉移到深孔微量滴定板中將I. 4ml的每種儲液置於頂行的2ml孔中(A孔1-12)。然後,Packard Multiprobe II液體處理系統(PerkinElmer Inc.)運行稀釋程序，首先將700 μ I的DI H2O加入其餘的84個孔(B-H 1-12)中。然後，四個槍頭(tip)臂實行一系列的抽吸和分配步驟以混合樣品，然後將它們轉移到相鄰的孔中以給出含有700 μ I/孔的八種50%系列稀釋的樣品。然後，機器人使用轉移程序來將所有系列稀釋的樣品移液到經標記的96孔板中。將含有40 μ I每種稀釋液的等分試樣分配到微量滴定板上的6個孔中(所述微量滴定板含有約200 μ I的人工膳食/孔)。在每個96孔板上測試兩種樣品；樣品I以儲液濃度在孔Α1-6中；樣品2在孔Α7-12中。B行含有50%稀釋液系列或1/2Χ樣品I的溶液在B彳丁孔1_6中而樣品2在B彳丁孔7-12中。每組中的最後兩種樣品是化學標準和含有DI水的未處理的對照。在加壓氣流下使樣品在室溫快速乾燥，然後，使用重複移液在每個孔中放置5-10個瓊脂中的同步化的甜菜夜蛾卵。在加壓氣流下使卵瓊脂混合物乾燥並用多孔的聚脂薄膜覆蓋所述平板。將平板在28°C下、在16 8的光照黑暗循環中孵育。5-7天後，對每行中的活昆蟲數目制表。將死亡率記錄為死去的數目比所處理的數目，並表示為經對照校正的百分比死亡率。將數據從Excel
輸出到Polo PC(LeOra Software1987)中並使用自然響應和95%置信區間計算LC 10,50和90s。結果顯不在表I中。表I :純化的都奈黴素及組合的生物活性
權利要求
1.包含來自放線菌的殺蟲發酵液或發酵固體的組合物，其中所述發酵液或發酵固體包含活性都奈黴素與無活性都奈黴素的優化比率。
2.權利要求I的組合物，其中活性都奈黴素與無活性都奈黴素的優化比率是至少約1 1。
3.權利要求2的組合物，其中活性都奈黴素和無活性都奈黴素的濃度為至少約lg/L發酵液。
4.權利要求2的組合物，其中活性都奈黴素和無活性都奈黴素的濃度為至少約3g/L發酵液。
5.權利要求2的組合物，其中活性都奈黴素和無活性都奈黴素的濃度為至少約7g/L發酵液。
6.權利要求2的組合物,其中所述放線菌是鏈黴菌屬(Streptomyces)的種的菌株,其能夠產生活性都奈黴素和無活性都奈黴素兩者。
7.權利要求6的組合物,其中所述鏈黴菌屬的種的菌株是鮮黃鏈黴菌(Streptomycesgalbus)。
8.權利要求6的組合物，其中所述鏈黴菌屬的種的菌株是鏈黴菌屬的種M1064。
9.權利要求I的組合物,其還包含載體。
10.權利要求I的組合物，其中所述活性都奈黴素在位置C18-C19處具有插烯烯醇醚或半縮醛或こ縮醛部分且所述無活性都奈黴素在位置C19處具有酮。
11.權利要求10的組合物，其中所述活性都奈黴素是C2，C2S，D2，D2S和D3S的ー種或多種且所述無活性都奈黴素是Al和Cl的ー種或多種。
12.用於產生富含殺蟲活性都奈黴素的發酵產品的方法，所述方法包括在含有碳源和氮源的培養基中培養產生活性都奈黴素和無活性都奈黴素的放線菌，直至產生至少約O. 5毫克的活性都奈黴素/升培養基，其中碳與氮源的比率為至少約10 I按重量。
13.權利要求12的方法，其中所述碳源選自來自植物或動物材料的單糖，ニ糖，多糖和複合糖。
14.權利要求12的方法，其中所述碳源選自蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、澱粉、麥芽糊精、糖蜜和麥芽提取物。
15.權利要求12的方法，其中所述氮源選自來自植物或動物的蛋白質和胺基酸，豆面，大豆消化液，蛋白腖，大豆水解產物，大豆磨粒，棉籽粉，玉米漿粉和馬鈴薯提取物。
16.權利要求12的方法，其中所述碳源是葡萄糖且所述氮源是豆面。
17.權利要求12的方法，其中所述碳源是葡萄糖且所述氮源是棉籽粉和豆面的組合。
18.權利要求12的方法，還包括篩選過量表達都奈黴素的放線菌文庫以產生活性都奈黴素和無活性都奈黴素的初始步驟。
19.權利要求12的方法，還包括從發酵液和生物質中純化活性都奈黴素。
20.權利要求12的方法，還包括濃縮發酵液和生物質。
21.權利要求20的方法，還包括乾燥發酵液和生物質。
22.權利要求12的方法，其中活性都奈黴素與無活性都奈黴素的比率為至少約I: I。
23.通過權利要求12-16中任ー項的方法產生的發酵產品。
24.就提高的殺蟲活性篩選放線菌的方法，所述方法包括產生過量產生都奈黴素的放線菌文庫，培養所述過量產生都奈黴素的放線菌，測量由所述過量產生都奈黴素的放線菌所產生的活性和無活性都奈黴素的量，以及選擇產生的活性都奈黴素多於無活性都奈黴素的、過量產生都奈黴素的放線菌。
25.權利要求24的方法,其中放線菌是鮮黃鏈黴菌(Streptomycesgalbus)。
26.權利要求24的方法,其中放線菌是鏈黴菌屬(Streptomyces)的種的菌株。
全文摘要
提供了用於製備殺蟲組合物的方法和組合物。
文檔編號A01N43/90GK102665419SQ201080049354
公開日2012年9月12日 申請日期2010年11月4日 優先權日2009年11月6日
發明者C·泰勒, J·希門尼斯, J·馬戈利斯, M·吉亞貝爾-戈雅, 朱宏 申請人:阿格拉奎斯特公司