治療和抑制纖維化疾病和瘢痕疙瘩的方法

2023-07-11 02:34:31 2

專利名稱：治療和抑制纖維化疾病和瘢痕疙瘩的方法
治療和抑制纖維化疾病和瘢痕疙瘩的方法
相關申請
本發明申請要求於2006年7月12日提交的美國臨時專利申請第60/830,279號 和2006年10月2日提交的美國臨時專利申請第60/849,041號的優先權，兩文均以 引用的方式全部併入本文。
政府資助聲明
本研究至少有部分工作是由NIH批准的K25HL074968和NIH STTR批准的6 R42 HL071309-03資助。美國政府對本發明持有確定的權利。
背景技術：
疤痕疙瘩和增殖性瘢痕是一類纖維增生性的異常癒合的疾病，其特徵是由於細 胞外基質的過度產生、沉積和收縮而引起過度瘢痕化，從而導致功能性和美容性缺 陷(Leask和Abraham, 2004)。目前對於這類病症尚無有效治療手l爻。

發明內容
在第一方面，本發明提供了治療和/或抑制纖維化疾病的方法，該方法包括向有 需要的個體給予有效劑量的治療和/或抑制纖維化疾病的多肽，所述多肽包含根據通 式I的序列
X1-A(X2)APLP-X3 (SEQ ID NO: 302和SEQ ID NO: 316)
其中XI是位於序列SEQ ID NO: 298胺基酸殘基1和14之間的熱休克蛋白20 序列的0-14位胺基酸；
X2選自由S、 T、 Y、 D、 E、羥賴氨酸、羥脯氨酸、磷酸絲氨酸類似物和磷酸 酪氨酸類似物組成的組；以及
X3選自由下列組成的組(a)序列SEQ ID NO: 298的胺基酸殘基21至160 的0-140位胺基酸；和(b)含Z1-Z2-Z3類型序列的0、 1、 2或3位胺基酸，其中 Zl選自由G和D組成的組；Z2選自由L和K組成的組；以及 Z3選自由S、 T和K組成的組。
第二方面，本發明提供了治療和/或抑制瘢痕的方法，該瘢痕選自由疤痕疙瘩和 增殖性瘢痕組成的組，其方法包括向有需要的個體給予有效劑量的治療和/或抑制選 自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕組成的瘢痕的多肽，所述多肽包含才艮據通式I的序列的 多肽
X1-A(X2)APLP國X3 (SEQ ID NO: 302和SEQ ID NO: 316)
其中XI是位於序列SEQ ID NO: 298胺基酸殘基1和14之間的熱休克蛋白20 的0-14位胺基酸；
X2選自由S、 T、 Y、 D、 E、羥賴氨酸、幾脯氨酸、磷酸絲氨酸類似物和磷酸 酪氨酸類似物組成的組；以及
X3選自由下列組成的組(a)序列SEQ ID NO: 298的胺基酸殘基21至160 的0-140位胺基酸；和(b)含Z1-Z2-Z3類型序列的0、 1、 2或3位胺基酸，其中 Zl選自由G和D組成的糹且；
在本發明第一和/或第二方面的各種實施方式中，有需要的個體是亞洲人或非洲 人的後代，和/或有需要個體的靶組織中所含的一個或多個生物標誌物的水平有所升 高，此生物標誌物選自由TGFpl表達物；TGFp2表達物;CTGF表達物；磷酸化絲切 蛋白；磷酸化HSP27;和a平滑肌肌動蛋白表達物組成的組。
具體實施例方式
本文主要採用單字母表示胺基酸。本領域的技術人員所熟知的這種單字母表示 法規則如下
A是丙氨酸；C是半胱氨酸；D是門冬氨酸；E是穀氨酸；F是苯丙氨酸；G是 甘氨酸；H是組氨酸；I是異亮氨酸；K是賴氨酸；L是亮氨酸；M是蛋氨酸；N是 天冬醯胺；P是脯氨酸；Q是穀氨醯胺；R是精氨酸；S是絲氨酸；T是蘇氨酸；V 是纈氨酸；W是色氨酸；以及Y是酪氨酸。
本文所使用的單數形式"一 (a) ，， 、 "一 (an)"和"這(the)，，包括複數意 義，除非上下文清楚另有所指。例如，表示一個(a)"多肽"意指一種或多種多肽。
本公開內容指出本發明方法中所使用的多肽可降低轉化生長因子pi(TGF-(31)誘 導的結締組織生長因子(CTGF)的表達，以及減少相關膠原的合成。該作用還伴隨有細胞形態學的改變(星形形態和應力纖維斷裂)。由於肌動蛋白細胞骨架在CTGF 表達時應保持完整，因此這表明本發明多肽改變細胞骨架動力學的能力對於降低疤
痕疙瘩成纖維細胞中的CTGF水平具有重要意義。由於CTGF在纖維化反應的發展
和維持中發揮著關鍵作用，因此本發明的方法在治療疤痕疙瘩和大部分纖維化疾病
中具有廣闊的應用前景。
因此， 一方面，本發明提供了治療和/或抑制纖維化疾病和/或選自由疤痕疙瘩和
增殖性瘢痕組成的組的瘢痕的方法，該方法包括向有需要的個體給予有效劑量的治
療和/或抑制纖維化疾病和/或選自由^痕疙癟和增殖性瘢痕組成的瘢痕的多肽，所述
多肽包含根據通式I序列的序列
X1-A(X2)APLP-X3 (SEQ ID NO: 302和SEQ ID NO: 316)
其中XI是位於序列SEQ ID NO: 298胺基酸殘基1和14之間的熱休克蛋白20
的0-14位胺基酸；
X2選自由S、 T、 Y、 D、 E、羥賴氨酸、幾脯氨酸、磷酸絲氨酸類似物和磷酸 酪氨酸類似物組成的組；以及
X3選自由下列組成的組(a)序列SEQ ID NO: 298的胺基酸殘基21至160的 0-140位胺基酸；和(b)含Z1-Z2-Z3類型序列的0、 1、 2或3位胺基酸，其中Zl 選自由G和D組成的組；
Z2選自由L和K組成的組；以及
Z3選自由S、 T和K組成的組。
在一種優選實施方式中，XI是WLRR ( SEQ ID NO : 1); Z1是G; Z2是L; Z3是K。在該實施方式中，所優選的是具有通式的多肽包括或由具有SEQIDNO : 300的胺基酸序列(WLRRApSAPLPGLK)組成，其中"pS"表示磷酸化絲氨酸殘基。 在另一種優選實施方式中，本發明方法採用的多肽包括或由依照下式的胺基酸序列 組成
Bl-WLRRApSAPLPGLK-B2 ( SEQ ID No : 317 ),其中Bl和B2至少有一個選 自由YARAAARQARA (SEQ ID NO : 281 )和YGRKKRRQRRR ( SEQ ID NO : 299 )
組成的組。
在一種實施例中，"有需要的個體"是指已遭受或將遭受(例如接受外科手術) 創傷而可能導致選自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕組成的組的瘢痕和/或纖維化疾病形 成的個體，或者已經出現選自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕組成的組的瘢痕和/或纖維化疾病形成的個體。本文所述的"創傷"是泛指皮膚和皮下組織的損傷。這類創傷包 括但不限於撕裂傷、燒傷、刺傷、壓瘡、褥瘡、口瘡、外傷、咬傷；瘻、潰瘍、感
染引發的損傷、牙周創傷、牙槽創傷、口腔燒灼症候群、剖腹產傷口、外科傷口、 切傷、燒傷後攣縮以及整容手術操作引起的創傷。
本文所述的"疤痕疙瘩"是指在癒合的皮膚損傷部位因組織過度生長而產生的 瘢痕。疤痕疙瘩通常伴隨嚴重瘙癢、銳痛和紋理改變。在嚴重的病例中，它可影響 皮膚活動。本文所述的"增殖性瘢痕"是指生長不超過原始創傷邊界的突出性瘢痕， 可隨時間而逐漸減小。
本文所述的短語"減少選自由^痕疙癟和增殖性瘢痕組成的組的瘢痕形成"是 指在疤痕疙瘩或增殖性瘢痕形成中的任何形式的減少，可為患者帶來治療性的或美 容性的益處。與未採用本發明方法治療的^痕疙瘩或增殖性瘢痕相比，可通過例如 減小疤痕疙瘩或增殖性瘢痕的大小和/或深度，或者縮小已存在的疤痕疙瘩或增殖性 瘢痕的大小獲得這種治療性的或美容性益處。
通過提供減少選自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕組成的組的瘢痕形成的方法，本發 明可用於臨床治療各種類型的創傷以減少疤痕疙瘩和增殖性瘢痕形成，既用於減少 初始的總痕疙疼和增殖性瘢痕形成，也可用於對既有疤痕疙瘩或增殖性瘢痕的治療
性處理(即在疤痕疙瘩或增殖性瘢痕形成後將其切除，採用本發明化合物進行處 理，使疤痕疙瘩或增殖性瘢痕癒合更加緩慢)。
在一種優選實施方式中，需要治療或抑制選自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕組成的 組的瘢痕的個體是有色個體，包括但不限於亞洲人或非洲人的後裔，他們易出現疤 痕疙瘩和增殖性瘢痕，因此可受益於本發明方法用於限制疤痕疙瘩或增殖性瘢痕發 展的預防性治療，以及用於處理疤痕疙瘩或增殖性瘢痕。
在其他不同的優選實施方式中，需要治療或抑制纖維化疾病的個體是正在遭受 一種或多種與TGF卩誘導CTGF表達物相關的纖維化疾病或對後者具有高患病風險 的個體，包括但不限於組織纖維化(包括但不限於特發性肺纖維化、肝纖維化、腎 纖維化、腹膜後纖維化、嚢性纖維化、血管纖維化和心臟組織纖維化)；糖尿病性腎 病變、腎小球硬化症和IgA腎病(引起腎功能衰竭並需要透析和再次移植)；糖尿病 視網膜病和黃斑變性(眼部纖維化疾病並可導致失明)；肝硬化和膽道閉鎖(導致肝 纖維化和衰竭)；充血性心力衰竭；肺纖維化；硬皮病；腹腔粘連和間質性纖維化。
在本文公開的所有實施方式的其他不同優選實施方式中，需要治療和/或抑制纖
7維化疾病和/或選自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕組成的組的瘢痕的個體是那些具有一 種或多種下列生物標誌物水平升高的個體
轉化生長因子betal( "TGF卩1")表達物;
轉化生長因子beta2( "TGFp2")表達物；
結締組織生長因子("CTGF")表達物；
磷酸化絲切蛋白；
磷酸化HSP27;以及
a平滑肌肌動蛋白表達物。
正如以下的公開內容，本發明的多肽能抑制人疤痕疙瘩成纖維細胞中TGF卩1誘 導的CTGF表達、TGFpi誘導的a-SMA表達以及絲切蛋白和HSP27的磷酸化，它 們在纖維化疾病中均有所升高，由此表明具有這些生物標誌物水平升高的個體尤其 能得益於本發明的方法。本文所述的一種或多種生物標誌物"升高的"水平是指在 個體或處於相似境地的個體的相關靶組織中任何高於正常的情況。該靶組織是受纖 維化症狀影響的組織，包括但不限於血液、傷口滲出液和取自受纖維化影響組織的 活檢物，後者包括但不限於上述公開的組織(皮膚、腎、肺、肝、腹膜、血管、心 髒、視網膜等)。在其他各種實施方式中，有需要的個體是具有一種或多種所列舉的 生物標誌物水平高於正常水平5%、 10%、 15%、 20%、 25%、 50%、 75%、 100%或 更多的個體。測定一種或多種生物標誌物的水平可採用本領域內的常規技術對蛋白 質和/或基因表達進行檢測，包括但不限於以下公開內容。
這些一種或多種生物標誌物的"正常"水平可採用任何適當方法建立，包括但 不限於測定無纖維化症狀和/或疤痕疙瘩的個體或處於相似境地個體的正常水平，或 者採用任意其他適宜方法建立標準以作參考。
本文所述的"治療(treat或treating)"是指完成一項或多項以下內容(a)減 輕疾病的嚴重程度；(b)抑制或防止所治療疾病特徵性症狀的發展；(c)阻止所治 療疾病特徵性症狀惡化；(d)抑制或防止曾經患病的病人再次患病；以及(e)抑制 或防止曾經出現疾病症狀的病人再次出現症狀。
本文所述的"抑制(limit或limiting )，，是指抑制具有患病風險的個體發病。
在另一方面，本發明提供了監測本發明方法治療有效性的方法，包括按本文披 露的方法處理個體，接著測定一種或多種下列生物標誌物的水平
TGF(31表達物；化絲切蛋白； 磷酸化HSP27;以及 a平滑肌肌動蛋白表達物。
在這些實施方式中，優選在治療前測定一種或多種生物標誌物的水平以確立治 療前水平，接著在治療後測定生物標誌物水平。這種隨後的生物標誌物水平的檢測 時機可以是主治醫師認為可行的任意時間(即治療後每周一次；每周兩次；每幾周 一次等)。即使療效可由治療對個體症狀的效應而確立，但監測生物標誌物水平可提 供療效的其它信息因而有助於主治醫師制定後續治療方案。例如，如果治療方案尚 未對個體的症狀產生明顯改善作用，但是生物標誌物的水平顯示治療正在降低生物 標誌物水平，那麼醫師就可能決定繼續使用劑量和給藥頻率相同的治療方案。可選 自地，如果症狀或生物標誌物水平均未受治療影響，則主治醫師就可能決定增加藥 物劑量和/或給藥頻率，或者進行聯合治療(包括但不限於TGF-p抗體療法，和/或 設計為抑制a平滑肌肌動蛋白表達和/或HSP27和/或絲切蛋白去磷酸化的治療)。
重新提及通式，HSP20的胺基酸殘基15-21，形成了依照通式I( A(X2) APLP) (SEQ ID NO : 2)的多肽結構核心，其中HSP20的胺基酸殘基16可以被取代。HSP20 的全序列以SEQIDNO:298表示，如下所示
G7m i7e /Vo Pra )^/ G7w屍ra Ser 7>; 丄ew種Ala Ser Ala Pro Leu Pro Gly Leu Ser Ala Pro Gly Arg Leu Phe Asp Gin Arg Phe Gly Glu Gly Leu Leu Glu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Cys Pro Thr Thr Leu Ala Pro iyr Tyr Leu Arg Ala Pro Ser Val Ala Leu Pro Val Ala Gin Val Pro Thr Asp Pro Gly His Phe Ser Val Leu Leu Asp Val Lys His Phe Ser Pro Glu Glu lie Ala Val Lys Val Val Gly Glu His Val Glu Val His Ala Arg His Glu Glu Arg Pro Asp Glu His Gly Phe Val Ala Arg Glu Phe His Arg Arg iyr Arg Leu Pro Pro Gly Val Asp Pro Ala Ala Val Thr Ser Ala Leu Ser Pro Glu Gly Val Leu Ser lie Gin Ala Ala Pro Ala Ser Ala Gin Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ala Lys。
下劃線的胺基酸殘基表示胺基酸15-21。
XI是SEQ ID NO: 298胺基酸殘基1至14之間的SEQ ID NO: 298 0-14位氨基 酸(見上，以斜體字表示)。因此，如果XI是SEQ ID NO: 298胺基酸殘基1至14 之間的5位胺基酸，則XI將是鄰接胺基酸殘基15-21的5位胺基酸,例如SWLRR
9(SEQ ID NO: 303)。同樣地，當XI是SEQ ID NO: 298胺基酸殘基1至14之間的下列數量胺基酸，則其特性如下所示SEQ ID NO:298的1位胺基酸RSEQ ID NO:298的2位胺基酸RRSEQ ID NO:298的3位胺基酸LRR ( SEQ ID NO: 304)SEQ ID NO:298的4位胺基酸WLRR ( SEQ ID NO: 1)SEQ ID NO:298的6位胺基酸PSWLRR ( SEQ ID NO: 305)SEQ ID NO:298的7位胺基酸NPSWLRR (SEQ ID NO: 306)SEQ ID NO:298的8位胺基酸VNPSWLRR (SEQ ID NO: 307)SEQ ID NO:298的9位胺基酸PVNPSWLRR (SEQ ID NO: 308)SEQ ID NO:298的10位胺基酸VPVNPSWLRR (SEQ ID NO: 309)SEQ ID NO:298的11位胺基酸PVPVNPSWLRR (SEQ ID NO: 310)SEQ ID NO:298的12位胺基酸IPVPPVNPSWLRR (SEQ ID NO: 311)SEQ ID NO:298的13位胺基酸EIPWPVNPSWLRR (SEQ ID NO: 312)SEQ ID NO:298的14位胺基酸MEIPVPPVNPSWLRR (SEQ ID NO: 313)在另一種實施方式中，XI是具有WLRR序列(SEQ ID NO: l)的0、 1、 2、 3或4位胺基酸。
在另 一種實施方式中，X3是SEQ ID NO: 298胺基酸殘基21-160之間的0-140位胺基酸。根據該實施方式，X3可以是SEQ ID NO: 298胺基酸殘基21至160之間
的0、 1、2、3、 4、 5、6、7、 8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、 21、22、23、 24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、
38、 39、40、41、 42、43、44、 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、
56、 57、58、59、 60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、
74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 1 18、 1 19、 120、 120、 121、 122、123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 131、 132、 133、 134、 135、 136、 137、138、 139或140位胺基酸。
例如，如果X3是SEQ ID NO: 298胺基酸殘基21至160之間的5位胺基酸，則X3為鄰接胺基酸殘基達15-21的5位胺基酸，如GLSAP (SEQ IN No: 314)。本領域的技術人員根據本文所提供的教導將會明悉其他可能的X3序列。
在另一種實施方式中，X3是具有Z1-Z2-Z3類型序列的0、 1、 2或3位胺基酸，其中Zl選自由G和D組成的組；
Z2選自由L和K組成的組；以及Z3選自由S、 T和K組成的組。
例如，如果X3是含Zl-Z2-Z3類型序列的2位胺基酸，則X3可以是GL、 GK、DL和DK。本領域的技術人員根據本文所提供的教導將會明悉該實施方式中其他可能的X3序列。
根據通式I的多肽的不同實施方式，X2是S、 T、 Y、 D、 E、磷酸絲氨酸類似物或磷酸酪氨酸類似物。優選X2為S、 T或Y;更優選X2為S或T,最優選X2為S。在這些X2為S、 T或Y的實施方式中，更優選X2是磷酸化的。當X2為D或E時，這些胺基酸殘基具有負電荷能夠模擬磷酸化狀態。當X2被磷酸化，是磷酸絲氨酸或磷酸酪氨酸類似物或者是其它一種磷酸化胺基酸殘基類似物(例如D或E殘基)時，通式I多肽在本發明方法中表現出最佳功效。磷酸絲氨酸類似物的實例包括但不限於硫代絲氨酸、含取代磷酸基團氧原子的亞甲基的胺基酸類似物、4-膦醯基(二氟甲基)苯丙氨酸，以及L-2-氨基-4.(膦醯基)-4,4-二氟丁酸。其他磷酸絲氨酸類似物可由本領域的技術人員製備。磷酸酪氨酸類似物的實例包括但不限於膦醯基甲基苯丙氨酸、二氟膦醯基甲基苯丙氨酸、氟-O-丙二醯酪氨酸和O-丙二醯酪氨酸。
因此，根據這些各種實施方式，適用於本發明方法的依照通式I的多肽代表性的實例包括 f旦不限於包括以下序列或由以下序列組成(ASAPLP) (SEQ ID NO:3);(ATAPLP) (SEQ ID NO:4); (RASAPLP) (SEQ ID NO:5); (RATAPLP) (SEQ IDNO:6); (AYAPLP) (SEQ ID NO:7); (RAYAPLP) (SEQ ID NO:8); (RRASAPLP) (SEQID NO:9); (LRRASAPLP) (SEQ ID NO:10); (WLRRASAPLP); (SEQ ID NO:ll)(RRATAPLP) (SEQ ID NO:12); (LRRATAPLP) (SEQ ID NO:13); (WLRRATAPLP)(SEQ ID NO:14); (RRAYAPLP) (SEQ ID NO:15); (LRRAYAPLP) (SEQ ID NO:16);(WLRRAYAPLP) (SEQ ID NO: 17); (RRASAPLPG) (SEQ ID NO: 18); (RRASAPLPD)(SEQ ID NO: 19); (RRASAPLPGL) (SEQ ID NO:20); (RRASAPLPGK) (SEQ IDNO:21); (RRASAPLPDL) (SEQ ID NO:22); (RRASAPLPDK) (SEQ ID NO:23);(RRASAPLPGLS) (SEQ ID NO:24) ; (RRASAPLPGLT) (SEQ ID NO:25);
11(RRASAPLPGKS) (SEQ ID NO:26)(RRASAPLPDLS) (SEQ ID NO:28)(RRASAPLPDKS) (SEQ ID NO:30)(LRRASAPLPG) (SEQ ID NO:32)(LRRASAPLPGL) (SEQ ID NO:34)(LRRASAPLPDL) (SEQ ID NO:36)(LRRASAPLPGLS) (SEQ ID NO:38)(LRRASAPLPGKS) (SEQ ID NO:40)(LRRASAPLPDLS) (SEQ ID NO:42)(LRRASAPLPDKS) (SEQ ID NO:44)(WLRRASAPLPG) (SEQ ID NO:46)(WLRRASAPLPGL) (SEQ ID NO:48)(WLRRASAPLPDL) (SEQ ID NO:50)(WLRRASAPLPGLS) (SEQ ID NO:52)(WLRRASAPLPGKS) (SEQ ID NO:54)(WLRRASAPLPDLS) (SEQ ID NO:56)(WLRRASAPLPDKS) (SEQ ID NO:58)
(RRASAPLPGKT) (SEQ ID NO:27)RRASAPLPDLT) (SEQ ID NO:29)(RRASAPLPDKT) (SEQ ID NO:31)(LRRASAPLPD) (SEQ ID NO:33)(LRRASAPLPGK) (SEQ ID NO:35)(LRRASAPLPDK) (SEQ ID NO:37)(LRRASAPLPGLT) (SEQ ID NO:39)(LRRASAPLPGKT) (SEQ ID NO:41)(LRRASAPLPDLT) (SEQ ID NO:43)(LRRASAPLPDKT) (SEQ ID NO:45)(WLRRASAPLPD) (SEQ ID NO:47)(WLRRASAPLPGK) (SEQ ID NO:49)(WLRRASAPLPDK) (SEQ ID NO:51)(WLRRASAPLPGLT) (SEQ ID NO:53)(WLRRASAPLPGKT) (SEQ ID NO:55)(WLRRASAPLPDLT) (SEQ ID NO:57)(WLRRASAPLPDKT) (SEQ ID NO:59)
(RRATAPLPG) (SEQ ID NO:60); (RRATAPLPD) (SEQ ID NO:61); (RRATAPLPGL)(SEQ ID NO:62); (RRATAPLPGK) (SEQ ID NO:63); (RRATAPLPDL) (SEQ IDNO:64); (RRATAPLPDK) (SEQ ID NO:65); (RRATAPLPGLS) (SEQ ID NO:66);
(RRATAPLPGLT)(SEQIDNO:67);(RRATAPLPGKS)(SEQIDNO:68)
(RRATAPLPGKT)(SEQIDNO:69);(RRATAPLPDLS)(SEQIDNO:70)
(RRATAPLPDLT)(SEQIDNO:71);(RRATAPLPDKS)(SEQIDNO:72)
(RRATAPLPDKT)(SEQIDNO:73);(LRRATAPLPG)(SEQIDNO:74)
(LRRATAPLPD) (SEQ IDNO:75);(LRRATAPLPGL)(SEQIDNO:76)
(LRRATAPLPGK)(SEQIDNO:77);(LRRATAPLPDL)(SEQIDNO:78)
(LRRATAPLPDK)(SEQIDNO:79);(LRRATAPLPGLS)(SEQIDNO:80)
(LRRATAPLPGLT)(SEQIDNO:81);(LRRATAPLPGKS)(SEQIDNO:82)
(LRRATAPLPGKT〕(SEQIDNO:83);(LRRATAPLPDLS)(SEQIDNO:84)
(LRRATAPLPDLT)(SEQIDNO:85);(LRRATAPLPDKS)(SEQIDNO:86)(LRRATAPLPDKT) (SEQ ID NO:87); (WLRRATAPLPG) (SEQ ID NO:88); (WLRRATAPLPD) (SEQ ID NO:89); (WLRRATAPLPGL) (SEQ ID NO:90); (WLRRATAPLPGK) (SEQ ID NO:91); (WLRRATAPLPDL) (SEQ ID NO:92); (WLRRATAPLPDK) (SEQ ID NO:93); (WLRRATAPLPGLS) (SEQ ID NO:94); (WLRRATAPLPGLT) (SEQ ID NO:95); (WLRRATAPLPGKS) (SEQ ID NO:96); 10 (WLRRATAPLPGKT) (SEQ ID NO:97); (WLRRATAPLPDLS) (SEQ ID NO:98); (WLRRATAPLPDLT) (SEQ ID NO:99); (WLRRATAPLPDKS) (SEQ ID NO:100); (WLRRATAPLPDKT) (SEQ ID NO: 101); (RRAYAPLPG) (SEQ ID NO: 102); (RRAYAPLPD) (SEQ ID NO:103) ; (RRAYAPLPGL) (SEQ ID NO:104); (RRAYAPLPGK) (SEQ ID NO: 105); (RRAYAPLPDL) (SEQ ID NO: 106); 15 (RRAYAPLPDIQ (SEQ ID NO: 107) ; (RRAYAPLPGLS) (SEQ ID NO:108); (RRAYAPLPGLT) (SEQ ID NO: 109); (RRAYAPLPGKS) (SEQ ID NO: 110); (RRAYAPLPGKT) (SEQ ID NO:lll); (RRAYAPLPDLS) (SEQ ID NO: 112); (RRAYAPLPDLT) (SEQ ID NO:113); (RRAYAPLPDKS) (SEQ ID NO:114); (RRAYAPLPDKT) (SEQ ID NO: 115) ; (LRRAYAPLPG) (SEQ ID NO: 116); (LRRAYAPLPD) (SEQ ID NO: 117) ; (LRRAYAPLPGL) (SEQ ID NO: 118); (LRRAYAPLPGK) (SEQ ID NO:119); (LRRAYAPLPDL) (SEQ ID NO:120); (LRRAYAPLPDK) (SEQ ID NO: 121); (LRRAYAPLPGLS) (SEQ ID NO: 122); (LRRAYAPLPGLT) (SEQ ID NO: 123); (LRRAYAPLPGKS) (SEQ ID NO: 124); (LRRAYAPLPGKT) (SEQ ID NO: 125); (LRRAYAPLPDLS) (SEQ ID NO: 126); (LRRAYAPLPDLT) (SEQ ID NO: 127); (LRRAYAPLPDKS) (SEQ ID NO: 128); (LRRAYAPLPDKT) (SEQ ID NO: 129); (WLRRAYAPLPG) (SEQ ID NO: 130); (WLRRAYAPLPD) (SEQ ID NO:131); (WLRRAYAPLPGL) (SEQ ID NO:132); (WLRRAYAPLPGK) (SEQ ID NO:133); (WLRRAYAPLPDL) (SEQ ID NO:134); (WLRRAYAPLPDK) (SEQ ID NO:135); (WLRRAYAPLPGLS) (SEQ ID 30 NO:136); (WLRRAYAPLPGLT) (SEQ ID NO: 137); (WLRRAYAPLPGKS) (SEQ ID NO: 138); (WLRRAYAPLPGKT) (SEQ ID NO:139); (WLRRAYAPLPDLS) (SEQ ID NO:140); (WLRRAYAPLPDLT) (SEQ ID NO:141);
(WLRRAYAPLPDKS) (SEQ ID NO: 142); 和(WLRRAYAPLPDKT) (SEQ ID NO:143);《FA7W)RRASAPLP) (SEQ ID NO:144); ((F/Y/W)LRRASAPLP) (SEQ ID200NO: 145); ((FA7W)WLRRASAPLP); (SEQ ID NO:146);((FA7W)RRATAPLP) (SEQ ID NO:147); ((FA7W)LRRATAPLP) (SEQ ID NO:148); ((F/Y/W)WLRRATAPLP) (SEQ ID NO: 149); ((F/Y/W)RRAYAPLP) (SEQ ID NO:150); ((FA7W)LRRAYAPLP) (SEQIDNO: 151) ;((FA7W)WLRRAYAPLP)(SEQIDNO: 152); ((FA7W)RRASAPLPG) (SEQ ID NO: 153);
((F/Y/W)RRASAPLPD) (SEQ ID NO:154); ((F/Y/W)RRASAPLPGL) (SEQ ID NO: 155); ((F/Y/W)RRASAPLPGK) (SEQ ID NO: 156); ((F/Y/W)RRASAPLPDL) (SEQIDNO: 157) ;((FA7W)RRASAPLPDK)(SEQIDNO: 158); ((F/Y/W)RRASAPLPGLS) (SEQ ID NO:159); ((F/Y/W)RRASAPLPGLT) (SEQ ID NO:160); ((F/Y/W)RRASAPLPGKS); (SEQ ID NO:161); ((F/Y/W)RRASAPLPGKT) (SEQID NO:162) ;((F/Y/W)RRASAPLPDLS)(SEQIDNO: 163); ((FA7W)RRASAPLPDLT) (SEQ ID NO:164); ((F/Y/W)RRASAPLPDKS) (SEQ ID NO:165); ((F/Y/W)RRASAPLPDKT) (SEQ ID NO:166); ((F/Y/W)LRRASAPLPG) (SEQ ID NO:167) ; ((F/Y/W)LRRASAPLPD) (SEQ ID NO:168) ; ((F/Y/W)) LRRASAPLPGL) (SEQ ID NO:169); ((FA7W)LRRASAPLPGK) (SEQ ID NO:170); ((FA7W)LRRASAPLPDL) (SEQ ID NO: 171); ((F/Y/W)LRRASAPLPDK) (SEQ ID NO:172); ((F/Y/W)LRRASAPLPGLS) (SEQ ID NO:173); ((F/Y/W)LRRASAPLPGLT) (SEQ ID NO:174) ; ((F/Y/W)LRRASAPLPGKS) (SEQ 20 ID NO:175); ((FA7W)LRRASAPLPGKT) (SEQ ID NO: 176); ((F/Y/W)LRRASAPLPDLS) (SEQ ID NO:177); ((FA7W)LRRASAPLPDLT) (SEQ ID NO:178); ((FA7W)LRRASAPLPDKS) (SEQ ID NO: 179) ;((FA7W)LRRASAPLPDKT) (SEQ ID NO: 180); ((FA7W)WLRRASAPLPG) (SEQ ID NO: 181); ((FA7W)WLRRASAPLPD) (SEQ ID NO: 182) ; ((F/Y/W)WLRRASAPLPGL) (SEQ ID NO: 183) ; ((F/Y/W)WLRRASAPLPGK) (SEQ ID NO: 184); ((F/Y/W)WLRRASAPLPDL) (SEQ ID NO:185) ; ((FA7W)WLRRASAPLPDK) (SEQ ID NO:186); ((F/Y/W)WLRRASAPLPGLS) (SEQ ID NO: 187); ((FA7W)WLRRASAPLPGLT) (SEQ IDNO:188) ; ((F/Y/W)WLRRASAPLPGKS)(SEQIDNO:189); ((F/Y/W)WLRRASAPLPGKT) (SEQ ID NO:l卯)；((F/Y/W)WLRRASAPLPDLS) (SEQ ID NO:191) ;((FA7W)WLRRASAPLPDLT) (SEQ ID NO:192); ((F/Y/W)WLRRASAPLPDKS) (SEQ ID NO: 193); ((F/Y/W)WLRRASAPLPDKT)
14(SEQ ID NO:194); ((FA7W)RRATAPLPG) (SEQ ID NO:195); ((F/Y/W)RRATAPLPD) (SEQIDNO:闊；((FA7W)RRATAPLPGL)(SEQIDNO:197); ((F/Y/W)RRATAPLPGK) (SEQ ID NO: 198); ((F/Y/W)RRATAPLPDL) (SEQ ID NO:199);
((F/Y/W)RRATAPLPDK) (SEQ ID NO:200); ((FA7W)RRATAPLPGLS) (SEQ ID NO:201); ((FA7W)RRATAPLPGLT) (SEQ ID NO:202);
((FA7W)RRATAPLPGKS) (SEQ ID NO:203); ((FA7W)RRATAPLPGKT) (SEQ ID NO:204);《FA7W)RRATAPLPDLS) (SEQ ID NO:205);
((FA7W)RRATAPLPDLT) (SEQ ID NO:206); ((FA7W)RRATAPLPDKS) (SEQ ID NO:207); ((FA7W)RRATAPLPDKT) (SEQ ID NO:208);
((F/Y/W)LRRATAPLPG) (SEQ ID NO:209); ((F/Y/W)LRRATAPLPD) (SEQ ID NO:210); ((FA7W)LRRATAPLPGL) (SEQ ID NO:211);
((F/Y/W)LRRATAPLPGK) (SEQ ID NO:212); ((FA7W)LRRATAPLPDL) (SEQ ID NO:213); ((FA7W)LRRATAPLPDK) (SEQ ID NO:214);
((FA7W)LRRATAPLPGLS) (SEQ ID NO:215); ((F/Y/W)LRRATAPLPGLT) (SEQ ID NO:216); ((F/Y/W)LRRATAPLPGKS) (SEQ ID NO:217); ((F/Y/W)LRRATAPLPGKT) (SEQID NO:218) ;((F/Y/W)LRRATAPLPDLS)(SEQ ID NO:219); ((F/Y/W)LRRATAPLPDLT) (SEQ ID NO:220); ((F/Y/W)LRRATAPLPDKS) (SEQ ID NO:221); ((FA7W)LRRATAPLPDKT) (SEQ ID NO:222); ((FA7W)WLRRATAPLPG) (SEQIDNO:223) ;C(FA7W)WLRRATAPLPD)(SEQ ID NO:224); ((F/Y/W)WLRRATAPLPGL) (SEQ ID NO:225); ((F/Y/W)WLRRATAPLPG K) (SEQ IDNO:226) ;20((FA7W)WLRRATAPLPDL)(SEQIDNO:227); ((FA7W)WLRRATAPLPDK) (SEQ ID NO:228); ((FA7W)WLRRATAPLPGLS) (SEQ ID NO:229) ; ((FA7W)WLRRATAPLPGLT) (SEQ IDNO:230); ((FA7W)WLRRATAPLPGKS) (SEQ ID NO:231); ((FA7W)WLRRATAPLPGKT) (SEQ IDNO:232) ; ((FA7W)WLRRATAPLPDLS) (SEQ IDNO:233); ((FA7W)WLRRATAPLPDLT) (SEQ ID NO:234); ((F/Y/W)WLRRATAPLPDKS) (SEQ ID NO:235); ((F/Y/W)WLRRATAPLPDKT) (SEQ ID NO:236); ((FA7W)RRAYAPLPG) (SEQIDNO:237) ; ((F/Y/W)RRAYAPLPD)(SEQIDNO:238); ((FA7W)RRAYAPLPGL) (SEQ ID NO:239); ((F/Y/W)RRAYAPLPGK) (SEQ ID
15NO:240); ((F/Y/W)RRAYAPLPDL) (SEQ ID NO:241); ((F/Y/W)RRAYAPLPDK) (SEQ ID NO:242); ((F/Y/W)RRAYAPLPGLS) (SEQ ID NO:243); ((F/Y/W)RRAYAPLPGLT) (SEQIDNO:244) ;((F/Y/W)RRAYAPLPGKS)(SEQID NO:245); ((F/Y/W)RRAYAPLPGKT) (SEQ ID NO:246); ((F/Y/W)RRAYAPLPDLS) (SEQ ID NO:247); ((FA7W)RRAYAPLPDLT) (SEQ ID NO:248); ((F/Y/W)RRAYAPLPDKS) (SEQID NO:249) ;((F/Y/W)RRAYAPLPDKT)(SEQID NO:250); ((F/Y/'W)LRRAYAPLPG) (SEQ ID NO:251); ((FA7W)LRRAYAPLPD) (SEQ ID NO:252); ((FA7W)LRRAYAPLPGL) (SEQ ID NO:253); ((F/Y/W)LRRAYAPLPGK) (SEQIDNO:254) ;((FA7W)LRRAYAPLPDL)(SEQID NO:255); ((F/Y/W)LRRAYAPLPDK) (SEQ 5 IDNO:256) ; ((FA7W)LRRAYAPLPGLS) (SEQIDNO:257) ; ((F/Y/W)LRRAYAPLPGLT) (SEQ ID NO:258); ((FA7W)LRRAYAPLPGKS) (SEQ ID NO:259); ((F/Y/W)LRRAYAPLPGKT) (SEQ ID NO:260); ((F/Y/W)LRRAYAPLPDLS) (SEQ ID NO:261); ((FA7W)LRRAYAPLPDLT) (SEQ ID NO:262) ;((F/Y/W)LRRAYAPLPDKS) (SEQ ID NO:263); ((F/Y/W)LRRAYAPLPDKT) (SEQ ID NO:264); ((F/Y/W)WLRRAYAPLPG) (SEQ ID NO:265); ((F/Y/W)WLRRAYAPLPD) (SEQ ID NO:266); ((FA7W)WLRRAYAPLPGL) (SEQ ID NO:267) ;((F/Y/W)WLRRAYAPLPGK) (SEQ ID NO:268); ((FA7W)WLRRAYAPLPDL) (SEQ ID NO:269); ((F/Y/W)WLRRAYAPLPDK) (SEQ IDNO:270) ; ((FA7W)WLRRAYAPLPGLS)(SEQIDNO:271); ((F/Y/W)WLRRAYAPLPGLT) (SEQ ID NO:272); ((FA7W)WLRRAYAPLPGKS) (SEQ IDNO:273) ; ((FA7W)WLRRAYAPLPGKT)(SEQIDNO:274); ((FA7W)WLRRAYAPLPDLS) (SEQ ID NO:275); C(FA7W)WLRRAYAPLPDLT) (SEQ IDNO:276) ;((FA7W)WLRRAYAPLPDKS)(SEQIDNO:277); 和 ((FA7W)WLRRAYAPLPDKT) (SEQ ID NO:278)，其中(FA7W)是指選自F、 Y和W 的胺基酸殘基。本領域的技術人員根據本文所提供的教導將會明悉歸屬於通式I範 圍內的其他特定多肽。
用於本發明方法中的通式I多肽可以多拷貝形式存在以提供更高功效。例如， 多肽可以l、 2、 3、 4或5個拷貝存在。在另一種實施方式中，包含通式I序列的多 肽包括來自X1-A(X2)APLP-X3 (SEQ ID NO: 302和SEQ ID NO: 316)區域的不同序 列的組合。在該實施方式中，例如，多肽可由1個拷貝的SEQ ID NO :9和1個拷貝的SEQ ID NO: 143組成。在另 一個不同的實施例中，多肽可由2個拷貝的SEQ ID NO: 200和3個拷貝的SEQ ID NO: 62組成。根據本發明的教導，本領域的技術人員將會 明悉有許多可能的這類組合。
在一個優選實施方式中，依照通式I的多肽還包括一個或多個轉導域。本文所 述"轉導域"是指能夠跨細胞膜轉運多肽的胺基酸序列。這些結構域可與其他多肽 結合而帶動相連多肽^E爭細胞膜移動。在某些情況下轉導分子不需要與活性多肽共價 結合。在一個優選實施方式中，轉導結構域通過肽鍵與多肽的其它部位結合。這種 轉導域的實施例包括但不限於(R) 4—9 (SEQ ID NO: 279); GRKKRRQRRRPPQ (SEQ IDNO:280); YARAAARQARA
(SEQ ID NO:281); DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE (SEQ ID 10 NO:282) ;GWTLNSAGYLLGLINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:283) PLSSIFSRIGDP (SEQ ID NO:284); AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO:285); AAVLLPVLLAAP (SEQ ID NO:286); VTVLALGALAGVGVG (SEQ ID NO:287); GALFLGWLGAAGSTMGAWSQP (SEQ ID NO :288)
GWTLNSAGYLLGLINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:289) KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO:290); KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID 隱291) ; KAFAKLAARLYRKAGC (SEQ ID NO:292); KAFAKLAARLYRAAGC (SEQ ID NO:293); AAFAKLAARLYRKAGC (SEQ ID NO:294); KAFAALAARLYRKAGC (SEQ ID NO:295); KAFAKLAAQLYRKAGC (SEQ ID NO:296) ， GGGGYGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:297)和YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:299)。
在另一種實施方式中，多肽包括以下分子式的多肽或由具有以下分子式的多肽 組成
B1-X1-A(X2)APLP-X3-B2 (SEQ ID NO: 318和SEQ ID NO: 319)
其中XI、 X2和X3如上所述，Bl和B2分別不包括或包括上述轉導域。 在一個優選實施方式中，Bl和B2之一或二者均包括具有YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 299)和/或YARAAARQARA (SEQ ID NO:281)序列的胺基酸或由其組 成。在一個最為優選的實施方式中，依照本文所披露通式的多肽包括多肽 YGRKKRRQRRRWLRRApSAPLPGLK(SEQIDNO:301) 或
L其中"pS"
17表示磷酸化絲氨酸殘基。
在本發明方法的另一種實施方式中，多肽包括具有以下分子式的多肽或由具有 以下分子式的多肽組成
J2-X1-A(X2)APLP-X3-J3 (SEQ ID NO: 320和SEQ ID NO: 321)
其中XI 、 X2和X3如上所述，J2和J3分別不包括或包括上述轉導域。 本發明方法所使用的多肽還可被衍生化以提供更長的半衰期，例如通過與聚乙 二醇結合。本發明多肽可包括L-胺基酸、D-胺基酸(在體內具有L-胺基酸特異性蛋 白酶抗性)、D-和L-胺基酸混合物以及各種"帶標籤的"胺基酸(例如P-曱基氨基 酸、Ca-甲基胺基酸和Na-曱基胺基酸等)以附加特定性質。合成胺基酸包括替代賴 氨酸的鳥氨酸和替代亮氨酸或異亮氨酸的正亮氨酸。
此外，多肽可含有類肽鍵(如酯鍵)而為其帶來新型特性。例如，摻入還原性 肽鍵製備肽，即RrCHrNH-Rz,其中R^和R2是胺基酸殘基或序列。還原性肽鍵可 作為二元肽亞基被引入。這種多肽能夠對抗蛋白酶活性，從而在體內具有更長的半 衰期。
術語"多肽"取用其最廣泛意義以指代胺基酸亞基序列、胺基酸類似物或類肽。 亞基通過肽鍵相連，儘管多肽還可包括不需以肽鍵與多肽結合的部分。例如，如上 所述，多肽還可能包括含有芳香環的非胺基酸分子。
本文所述多肽可以是化學合成的或重組表達的。重組表達可採用本領域的常規 方法獲得，主要涉及將導致多肽表達的核酸序列克隆進入表達載體，該載體用於轉 染或轉化宿主細胞使其提供細胞體系進行多肽表達。這種表達載體可以包括細菌或 病毒表達載體，宿主細胞可以是原核的或真核細胞。
本發明方法使用的多肽優選為化學合成。採用固相、液相或肽縮聚或它們的任 意組合等常用技術製備的合成多肽可包括天然的和非天然胺基酸。用於肽合成的氨 基酸可以是經常規固相操作的常規脫保護、中和、偶聯和洗滌步驟處理的標準Boc (Na-氨基被保護的Na-t-叔丁氧羥基)胺基酸樹脂，或者鹼不穩定的Na-氨基被保 護的9-藥曱氧羰基(Fmoc)胺基酸。Fmoc和Boc Na-氨基被保護的胺基酸均可從 Sigma、 Cambridge Research Biochemical或其他本領域技術人員熟悉的化學公司購 得。此外，多肽也可採用本領域技術人員熟悉的其他Na-保護性基團合成。
固相肽合成可採用本領域的技術人員熟知的技術進行，例如採用自動合成儀。
本文所述的一種或數種多肽的"有效劑量"是指足以提供預期治療益處的劑量。應用多肽的有效劑量通常在0.01 pg/kg體重-10 mg/kg體重的範圍之間，優選0.05 pg/kg-5mg/kg體重。然而劑量水平還基於多種因素，包括損傷類型、年齡、體重、 性別、個體的身體狀況、疾病嚴重程度、給藥途徑和所應用的特定化合物。因此， 給藥方案可能千差萬別，但醫師能夠根標準方法加以確定。
可對多肽進行常規的藥學操作，例如滅菌和/或包含常規輔料，如防腐劑、穩定 劑、溼潤劑、乳化劑、緩衝液等。
對於給藥方式，多肽通常與一種或多種適用指定給藥途徑的輔料組合。化合物 可與乳糖、蔗糖、澱粉粉末、鏈烷酸纖維素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸鎂、氧化鎂、 磷酸和硫酸的鈉鹽和鈣鹽、阿拉伯膠、明膠、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷、硫酸葡聚
糖、含肝素凝膠和/或聚乙烯醇混合，製成傳統給藥的片劑或膠嚢劑。可選地，本發 明化合物可溶於鹽水、水、聚乙烯醇、丙二醇、羧甲基纖維素膠體溶液、乙醇、玉 米油、花生油、棉籽油、芝麻油、西黃蓍膠和/或各種緩衝液。其他輔料和給藥方式 均是藥學領域所熟知的。載體或稀釋劑可包括延時材料，例如單獨的單硬脂酸甘油 酯或二硬脂酸甘油酯，單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯與蠟的混合物，或者本領 域所熟知的其他材料。
多肽或它的藥學組合物可以含有常規藥學可接受的載體、輔料和賦形劑的單位 劑量劑型通過任何適當的途徑給藥，包括經口、經胃腸道外、噴霧吸入、經直腸或 局部給藥。本文所用術語經胃腸道外包括皮下、靜脈內、動脈內、肌內、胸骨內、 腱內、推內、顱內、胸腔內注射技術或腹腔內給藥。給藥的優選實施方式根據治療 情況而定。在一個優選實施方式中，多肽或藥學組合物被置於傷口敷料或其他局部 用藥之上或之內。該傷口敷料可以是本領域內所使用的任何形式，包括但不限於薄 膜(如聚氨酯薄膜)、水膠體(結合於聚氨酯薄膜的親水性膠粒)、水凝膠(含水至 少60%的交聯聚合物)、泡沫劑(親水的或疏水的)、藻酸鉤(藻酸鈞纖維的非織造 複合物)、玻璃紙和生物聚合物，例如2003年10月9日公開的美國專利申請公開號 第20030190364號所述的生物聚合物。
多肽可製備為固體形式(包括顆粒、粉末或栓劑)或液體形式(如溶液、混懸 液或乳液)。本發明多肽可應用於多種溶液。根據本發明適合採用的溶液是無菌的、 能溶解一定數量多肽並對計劃用藥無害的溶液。
實施例1
19疤痕疙瘩和增殖性瘢痕是纖維化增生致異常癒合的疾病，其特徵是由於細胞外 基質的過度產生、沉積和收縮而引起過度瘢痕化，從而導致功能性和美容性缺陷
(Leask和Abraham, 2004)。目前對於這類病症尚無有效治療手l殳。
有三種哺乳動物亞型，分別是TGF-pl、 TGF-(32和TGF-(33。 TGF-p是具有多重功能 的分子，其作用取決於細胞環境和各同工型表達平衡狀態。TGF-pl被認為涉及啟動 纖維化的應答，而TGF-|33則可能具有抗纖維化功能(Leask和Abraham, 2004， Miller和Nanchahal, 2005)。
在成纖維細胞中TGF-p促進結締組織生長因子(CTGF)的表達。CTGF是富含 半胱氨酸的多肽，它作為TGF-(3下遊調節因子發揮作用，促進成纖維細胞增殖、細 胞外基質產生(包括膠原和纖維蛋白連接素)和肉芽組織形成(Duncan等人，1999, Leask和Abraham, 2004 )。組織損傷所釋放的其他化合物，例如凝血酶和內皮素也可 上調CTGF表達(Chambers等人，2000 , Shi-Wen等人，2004 , Rodriguez-Vita等人， 2005 )，提示細胞-基質-細胞因子相互作用的複雜網絡調節著創傷癒合過程的起始以 及病理性纖維化疾病(Duncan等人，1999)。由於CTGF在痣痕疙疼和增殖性瘢痕 中的過表達增強了 TGF-(3促纖維化的應答，因此CTGF被認為參與了瘢痕纖維化的 發病機制(Colwell等人，2004 )。因此，可以想像阻斷CTGF表達可能會通過防止結 締組織細胞增殖和基質沉積而減輕病理性瘢痕形成的纖維化增殖性應答。
除了細胞因子和蛋白酶，對細胞結構的調節也會影響CTGF表達。因此，破壞 微管、活化RhoA和穩定肌動蛋白纖維的藥物被證明促進CTGF在腎成纖維細胞中 的表達，而使肌動蛋白解聚的藥物(如紅海海綿素)則減少了 CTGF的表達(Ott 等人,2003 )。
最近有研究證明，P20肽( 一種熱休克蛋白20的磷酸肽類似物)與被稱作蛋白 質轉導域(PTD)的肽載體結合能穿透進入細胞並抑制由血清或溶血磷脂酸激發的 應力纖維形成(Dreiza等人，2004)。這個結果令我們猜測P20肽引起的細胞骨架斷 裂抑制了 CTGF合成，可能會抑制纖維化增生病症。為驗證該假設，我們研究了 PTD-P20肽處理是否會減少CTGF和膠原在TGF-p刺激的疤痕疙瘩成纖維細胞中的 表達。
方法
成纖維細胞培養:人疤痕疙瘩成纖維細胞置10 cn^培養臟中，於37。C和10% C02下在含10% FBS和青黴素與鏈黴素(1% )的DMEM中生長至細胞匯合達70%。實 驗前細胞在含0.5% FBS的DMEM中進行血清飢餓培養48h。開始測定時向培養皿 中加入新鮮培養液，細胞不經處理(對照)或用TGF-pl(劑量範圍0.6-5 ng/mL)、 p20磷酸肽(劑量範圍50-200 mM)、福斯高林(forskolin) (fsk， 10 )或snap (500 mM)處理24h。為驗證血清飢餓的影響，還將部分細胞生長於含10% FBS 培養液(高血清對照)進行實驗。
Western blot分析實-驗結束後，細胞用PBS衝洗，再採用UDC緩衝液勻漿。 混合細胞裂解液，離心(6000 x g)20 min,上清用於CTGF和膠原表達檢測。樣品(20 嗎蛋白質)上樣15 %或10% SDS-PAGE膠，蛋白質被電泳轉移至Immobilon轉印 膜。為阻斷非特異性結合，將膜在l: 1 (v/v) Tris緩衝鹽溶液(TBS):封閉緩沖液 (Odyssey)中孵育，用抗CTGF ( Torrey Pines )和抗膠原(Cortex) —抗室溫著染 1 h， TBS洗滌3遍。接著將膜置於抗兔和抗小鼠二抗中孵育，用含吐溫的TBS洗滌。 蛋白-抗體複合物採用Odyssey直接紅外螢光顯像系統(Li-Cor, Lincoln , NE)顯影。
免疫細胞化學:人疤痕疙瘩成纖維細胞以2.5 x 105細胞/孔在帶蓋玻片的6孔板中 生長。細胞經血清飢餓24 h,再用刺激物處理。未處理細胞(對照)或用TGF-pl (1.2或2.5 ng/mL )和/或P20磷酸肽(50 )處理的細胞經4%多聚曱醛固定，用 0.1 % Triton X進行透化處理。接著用Alexa 350鬼筆環肽對細胞染色顯影肌動蛋白絲。 採用帶UV濾鏡和Zeiss軟體的Zeiss顯微鏡獲得螢光影像。
統計學分析所有數值結果均以從3-6個實驗所得的平均值士標準差表示。採用 Tukkey post-hoc檢驗後用ANOVA與實驗組比較。顯著性差異水平設定為< 0.05。
結果
TGF-pi與CTGF表達人悉痕疾癟成纖維細胞在含0.5 % FBS的DMEM培養 基中血清飢餓培養48小時，用不同劑量的TGF-pl處理24小時。CTGF表達的western blot密度測定結果參照GAPDH表達以校正上樣誤差。為比較各點將對照細胞的 CTGF表達設定為1。結果表明TGF-pl處理24 h呈劑量依賴性地增加人疤痕疾瘩成 纖維細胞中的CTGF表達(2.1-4.6倍)。
P20處理與CTGF表達人^痕疙瘩成纖維細胞在含0.5 % FBS的DMEM培養 基中血清々幾餓培養48小時，用劑量範圍在1.2-5 ng/mL的TGF-pl刺激24小時，並 同時用P20磷酸肽(50、 100或200 )處理24小時。Western blot條帶採用密度 測定法定量，CTGF表達參照GAPDH表達以校正上樣誤差。為比較各點將對照細胞的CTGF表達設定為1。結果顯示PTD-P20處理可顯著(P < 0 . 05)減少症痕疙瘩成 纖維細胞中TGF-(31誘導的CTGF表達。觀察到1.2和2.5 ng/mL TGF-pi的下降幅度 分別是53 %和29 % 。另 一方面，當採用5 ng/mL TGF-(31刺激細胞時，PTD-P20處 理即使在高劑量(100和200 )時也而沒有減少CTGF表達。
P20處理與膠原產生在觀察到PTD-P20處理減少了細胞經1.2和2.5ng/mL TGF- P 1刺激的CTGF表達之後，我們下一步研究了膠原合成是否也被減少。人疤 痕疙疼成纖維細胞在含0.5 %FBS的DMEM培養基中血清飢餓培養48小時，用劑 量範圍在1.2-2.5 ng/mL的TGF-(31刺激24小時，並同時用P20磷酸肽(50 ^M) 處理24小時。Western blot條帶採用密度測定法定量，膠原表達參照GAPDH表達 以校正上樣誤差。為比較各點將對照細胞的膠原表達設定為1。結果表明PTD-P20 處理減少膠原合成約48%。
採用升高cAMP和cGMP的化合物處理下一步我們評測了升高cAMP (Forskolin, FSK)或cGMP (SNAP)的化合物對痣痕疙癟成纖維細胞中CTGF表達的 影響。人疤痕疙瘩成纖維細胞在含0.5 %FBS的DMEM培養基中血清飢餓培養48 小時，用2.5 ng/mL劑量的TGF-pl刺激並同時用FSK( 10 pM )處理24小時。Western blot條帶採用密度測定法定量，CTGF表達參照GAPDH表達以校正上樣誤差。為 比較各點將對照細胞的CTGF表達設定為1。 TGF- p l( TGF- (3 1劑量為2.5 ng/mL ) 刺激的成纖維細胞經FSK處理其CTGF表達減少約50%。用FSK處理的未刺激成 纖維細胞與未處理細胞相比，其CTGF表達無差別。另一方面，SNAP處理沒有減 少TGF- P 1刺激細胞的CTGF表達。此外，用SNAP處理的未刺激成纖維細胞與 未處理(對照)細胞相比，其CTGF表達顯著增加(p < 0.05,增加2倍)。這些結 果與先前的報導一致(Duncan等人，1 999 ),表明對CTGF表達的抑制性作用對升 高cAMP藥物是具有選擇性的。而且，近期研究表明將痣痕疙瘩成纖維細胞經外源 性一氧化氮處理會劑量依賴性地增加膠原表達(Hsu等人,2006 )。
PTD-P20處理對細胞肌動蛋白細胞骨架的影響人痣痕疙瘩成纖維細胞在含0.5 %FBS的DMEM培養基中血清飢餓培養48小時，用TGF-卩1 ( 1.2或5 ng/mL )和 /或p20 ( 50 mM )刺激24小時。接著用鬼筆環肽對細胞染色以評價ptd-p20處理 對肌動蛋白細胞骨架的影響。PTD-P20處理導致未刺激細胞和經1.2 ng/mL TGF-Pl刺激細胞出現星形細胞形態以及肌動蛋白細胞骨架斷裂。當TGF-pl劑量為 2.5 ng/mL時該作用並不明顯。總結
迄今為止對疤痕疙瘩和其他纖維化疾病尚無有效治療手段。目前正處於研究階
^險的治療法絕大多數將目標鎖定在TGF- (3信號級聯通路中的細胞表面受體或酶。 本文所提供的方法因其提出了經我們團隊鑑定的激酶級聯下遊蛋白質的治療性應 用而具有創新性。本文提供的結果表明PTD-P20可降低TGF- P 1誘導的CTGF表 達(與FSK相當的水平)並減少相關膠原合成。PTD-P20的作用涉及細胞形態學 改變(星狀形態和應力纖維斷裂)。由於肌動蛋白細胞骨架在CTGF表達時應保持 完好，因此我們推斷PTD-P20改變細胞骨架動力學的能力對於降低疤痕疙瘩成纖 維細胞中的CTGF水平具有重要意義。因為CTGF在纖維化反應的發展和維持過程 中發揮關鍵作用，因此使用PTD-P20代表了一種治療疤痕疙瘩和其他纖維化疾病 的有潛力的策略。
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實施例2
成纖維細胞被普遍認為是纖維化、創傷癒合和組織修復過程中的關鍵細胞類 型。少部分觀點還將成纖維細胞轉化為成肌纖維細胞看作是細胞發揮上述功能的關 鍵甚至可能是必須事件(Powell等人，1999和Tomasek等人,2002 )。成肌纖維細胞 是平滑肌樣成纖維細胞，它表達a平滑肌肌動蛋白(a-SMA)並含有由肌動蛋白絲 和相關蛋白整合而成的顯著的應力纖維組成的收縮性結構(Tomasek等人，2002 )。 除了在維持組織穩態和修復中的正常作用而外，成肌纖維細胞的數量和功能發生改變與細胞外基質(ECM)沉積增多而致纖維化的疾病有關，例如涉及肺(肺纖維
化)、血管(內膜增生)、心臟(心臟纖維化)和皮膚(疤痕疙瘩)的疾病(Desmouliere 等人，2003, Desmouliere等人，2005， Hewitson等人，1995, Mitchell等人，1989, Zhang 等人，1994, Naugle等人，2006, Chipev等人，2000, Pepper等人，1997, Heusinger-Ribeiro等人,2001 )。因此抑制成纖維細胞至成肌纖維細胞的表型調變可 能為抑制由諸如TGF P 1和其他調節因子等刺激因子引發的纖維化提供一種方法。
最近有研究證明，P20肽( 一種熱休克蛋白20的磷酸肽類似物)與被稱作蛋白 質轉導域(PTD)的肽載體結合能穿透進入細胞並抑制由血清或溶血磷脂酸激發的 應力纖維形成(Dreiza等人，2004)。正如以上所討論的，該PTD-P20肽還能抑制 人疤痕疾瘩成纖維細胞中由TGF p 1誘導的CTGF表達。在這些實驗中，為進一步 檢測PTD-P20的抗纖維化活性，還測定了它對其他纖維化分子的作用ot-SMA和 肌動蛋白輔助蛋白絲切蛋白和HSP27。絲切蛋白在去磷酸化時被活化而使肌動蛋白 絲解聚，而HSP27則在磷酸化時被活化並與應力纖維形成相關。因此纖維化表型 會與絲切蛋白和HSP27的磷酸化增加有關。這些結果表明PTD-P20可抑制TGF P 1誘導的a-SMA表達和絲切蛋白和HSP27磷酸化。這類信息增加了對PTD-P20作 用機制的認識，並且鑑別出可能用於檢測PTD-P20活性或纖維化疾病狀態的有潛 力的生物標誌物。
方法
成纖維細胞培養:人疤痕疙瘩成纖維細胞置10 cr^培養亞中，於37。C和10% C02 下在含10% FBS和青黴素與鏈黴素(1% )的DMEM中生長至細胞匯合達70%。實 驗前細胞在含0.5% FBS的DMEM中進行血清飢餓培養48h。開始測定時，向培養 皿中加入新鮮培養液，細胞不經處理(對照)或用TGF-(31(劑量範圍0.6-5 ng/mL)、 P20磷酸肽(劑量範圍50-200 ^M)、福斯高林(FSK, 10 )或SNAP ( 500 ) 處理24h。為驗證血清飢餓的影響，還將部分細胞生長於含10% FBS培養液(高血 清對照)進行實驗。
Western blot分析實驗結束後，細胞用PBS衝洗，再採用UDC緩衝液勻漿。 混合細胞裂解液，離心(6000xg) 20 min,上清用於蛋白表達檢測。樣品(20嗎蛋 白質)上樣15 %或10% SDS-PAGE膠，蛋白質被電泳轉移至Immobilon轉印膜。為 阻斷非特異性結合，將膜在1: 1 (v/v )Tris緩衝鹽溶液(TBS ):封閉緩衝液(Odyssey ) 中孵育，用抗a平滑肌肌動蛋白表達、磷酸化HSP27和磷酸化絲切蛋白 一抗室溫著染l h, TBS洗滌3遍。接著將膜置於抗兔和抗小鼠二抗中孵育，用含吐溫的TBS 洗滌。蛋白-抗體複合物採用Odyssey直接紅外螢光顯像系統(Li-Cor， Lincoln, NE )顯影。
統計學分析所有數值結果均以從3-6個實驗所得的平均值土標準差表示。採用 Tukkey post-hoc檢驗後用ANOVA與實驗組比較。顯著性差異水平設定為p < 0.05。
結果
P20處理與a平滑肌肌動蛋白表達人悉痕疙瘩成纖維細胞在含0.5%FBS的 DMEM培養基中血清飢餓培養48小時，用含有或不含TGF-pi (2.5 ng/mL )的 PTD-P20 ( 50^M)處理24小時。採用Western blot密度測定法對a-SMA和P肌動 蛋白的表達水平進行定量並用GAPDH表達標準化以校正上樣誤差。為比較各點將 對照細胞的蛋白表達設定為1。結果顯示無論是否含有TGF(3 1， PTD-P20處理均顯 著(P〈 0.05 )減少了疤痕疙瘩成纖維細胞的a-SMA表達(

圖1 )。而另 一方面，PTD-P20 對I3肌動蛋白表達無影響，提示其活性a-SMA具有特異性，其是纖維化的關鍵標誌 物。
P20處理與HSP27和絲切蛋白磷酸化人痣痕疙瘩成纖維細胞在含0.5%FBS 的DMEM培養基中血清飢餓培養48小時，用含有或不含TGF-(31 (2.5 ng/mL)的 PTD-P20 (50pM)處理24小時。採用Western blot密度測定法對磷酸化絲切蛋白和 HSP27的表達水平進行定量並用GAPDH表達標準化以校正上樣誤差。為比較各點 將對照細胞的蛋白表達設定為1。結果表明PTD-P20處理顯著(P < 0.05 )減少了疤 痕疙瘩成纖維細胞中TGF P 1誘導的絲切蛋白和HSP27磷酸化增加。而絲切蛋白和 HSP27的總水平(磷酸化加非磷酸化)無變化。這些結果提示PTD-P20從影響肌動 蛋白細胞骨架的多個水平上抑制TGF P 1的纖維化反應。
總結
本文提供的結果的表明PTD-P20降低了 TGF p 1誘導的a-SMA表達並減少了 絲切蛋白和HSP27磷酸化。早期結果還顯示PTD-P20處理與細胞形態學改變相關 (星形形態和應力纖維斷裂)並可抑制CTGF表達。由於肌動蛋白細胞骨架的完整 性對於CTGF表達非常重要，因此這些結果提示PTD-P20通過改變細胞骨架動力 學而抑制纖維化反應。因為肌動蛋白細胞骨架在纖維化反應的發展和維持過程中發 揮關鍵:作用，因此使用PTD-P20代表了一種治療疤痕疙瘩和其他纖維化疾病的有潛力的策略。總而言之，這些結果也鑑別出了可以用於檢測PTD-P20活性或纖維
化疾病狀態的有潛力的生物標誌物(CTGF、 a-SMA、絲切蛋白和HSP27)。
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Zhang et al. (1994) Am J Pathol 145, 114-12權利要求
1. 一種治療和/或限制纖維化疾病的方法，該方法包括向有需要的個體給予有效劑量的治療和/或抑制纖維化疾病的的多肽，所述多肽包含根據通式I的序列X1-A(X2)APLP-X3其中X1是位於序列SEQ ID NO298胺基酸殘基1和14之間的熱休克蛋白20序列的0-14位胺基酸；X2選自由S、T、Y、D、E、羥賴氨酸、羥脯氨酸、磷酸絲氨酸類似物和磷酸酪氨酸類似物組成的組；以及X3選自由下列組成的組(a)序列SEQ ID NO298的胺基酸殘基21至160的0-140位胺基酸；和(b)含Z1-Z2-Z3類型序列的0、1、2或3位胺基酸，其中Z1選自由G和D組成的組；Z2選自由L和K組成的組；以及Z3選自由S、T和K組成的組。
2. —種治療和/或抑制瘢痕的方法，該瘢痕選自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕組成 的組，該方法包括向有需要的個體給予有效劑量的治療和/或抑制選自由疤痕疙瘩和 增殖性瘢痕組成的組的瘢痕的的多肽，所述多肽包含通式I的序列X1-A(X2)APLP隱X3其中XI是位於序列SEQ ID NO: 298胺基酸殘基1和14之間的熱休克蛋白20 的0-14位胺基酸；X2選自由S、 T、 Y、 D、 E、羥賴氨酸、羥脯氨酸、磷酸絲氨酸類似物和磷酸 酪氨酸類似物組成的組；以及X3選自由下列組成的組(a )SEQ ID NO: 298的胺基酸殘基21至160的0-140 位胺基酸；和(b)含Z1-Z2-Z3類型序列的0、 1、 2或3位胺基酸，其中Z1選自群 組包4舌G和D組成的組；Z2選自由L和K組成的組；以及Z3選自由S、 T和K組成的組。
3. 如權利要求1或2的方法，其中XI是WLRR ( SEQ ID NO : 1 )。
4. 如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中X3是GLK。
5. 如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中XI是位於序列SEQIDNO: 298胺基酸殘基1和14之間的熱休克蛋白20序列的0-14位胺基酸。
6. 如權利要求1-5中任一項所述的方法，其中多肽包括WLRRASAPLPGLK (SEQ ID NO : 300 ),其中S胺基酸殘基是磷酸化的。
7. 如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中多肽還包括共價結合的轉導域。
8. 如權利要求7的方法，其中轉導域包括選自由YARAAARQARA (SEQ ID NO : 281 )和YGRKKRRQRRR ( SEQ ID NO : 299 )組成的組的多肽。
9. 如*1利要求2-8中任一項所述的方法，其中該方法是用於限制選自由疤痕疙 瘩和肥厚性瘢痕組成的組的瘢痕，並且其中有需要的個體是亞洲人或非洲人的後裔。
10. 如權利要求3-8中任一項所述的方法，其中該方法是用於治療或限制纖維化 疾病，並且有需要的個體正在遭受一種或多種下列疾病或者對其具有高患病風險 糖尿病性腎病變、腎小球硬化症、IgA腎病、糖尿病視網膜病、黃斑變性、肝硬化、 膽道閉鎖、充血性心力衰竭、硬皮病和腹腔粘連。
11. 如權利要求1-10中任一項所述的方法，其中有需要個體的靶組織中一個或 多個下列生物標誌物的水平有所升高TGFpl表達物； TGF卩2表達物； CTGF表達物； 磷酸化絲切蛋白； 磷酸化HSP27;以及 a平滑肌肌動蛋白表達物。
12. 如權利要求1-10中任一項所述的方法，還包括通過測定啟用方法後靶組織 中 一個或多個下列生物標誌物的水平以監測本發明方法治療有效性的方法TGF|31表達物；TGF卩2表達物；CTGF表達物；磷酸化絲切蛋白；磷酸化HSP27;和a平滑肌肌動蛋白表達物。
全文摘要
本發明提供了治療和/或抑制纖維化疾病和/或治療或抑制選自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕組成的組的瘢痕的方法，該方法包括向有需要的個體給予有效劑量的治療和/或抑制選自由疤痕疙瘩和增殖性瘢痕組成的組的瘢痕的多肽，所述多肽包含HSP20相關多肽。
文檔編號A61K38/00GK101489572SQ200780026130
公開日2009年7月22日 申請日期2007年7月10日 優先權日2006年7月12日
發明者伊莉莎白·J·弗尼士, 帕米尼·科馬拉威拉斯, 查爾斯·羅伯特·弗林, 科林·M·布羅菲, 艾麗莎·帕尼什, 露茜安娜·比亞吉尼·洛佩斯 申請人:亞利桑那州董事會代表的亞利桑那州大學