Dna構建體以及其用途的製作方法

2023-07-11 13:49:56 1

專利名稱：Dna構建體以及其用途的製作方法
技術領域：
本發明是關於一種能表達穀氨醯-tRNA合成酶(Glutamyl-tRNAsynthetase)的DNA建構體。此外，本發明是關於使用該DNA建構體生產轉基因植物以及轉基因植物組織的方法。
背景技術：
葉綠素(Chlorophyll)是吸收陽光並且利用其能量將二氧化碳和水合成碳水化合物的物質。此過程便是公知的光合作用，並且其是維持所有植物生命的基礎。由於動物以及人類通過食用植物而獲得食物供給，因此光合作用也可說是我們生命的來源。通過經由光合作用的過程，植物可生產大量的必需元素，如葡萄糖、蔗糖、果糖以及纖維素。進一步，我們的皮膚以及消化系統可通過攝取含有葉綠素的食物而得到改善。
對於人類的研究發現，補充葉綠酸(Chlorophyllin)，一種葉綠素的衍生物，可將由黃麴黴毒素(Aflatoxin)所引起的DNA損傷降低至55％。研究也發現葉綠素具有抗發炎、抗氧化以及創傷復原的特性，進一步，其也可保護細胞，使細胞不會暴露於致癌物質、突變劑以及輻射線之下。
在地球上，有一半的人口以稻米為主食。在部分非洲以及亞洲的地區，許多窮人通過稻米獲得日常生活中所需要的大部分熱量。隨著世界人口的增加，未來30年的稻米產量必須增加至少70％才足夠。若稻米中的養分能增加，人們可能僅需食用稻米就可以變得更健康。通過基因工程增加稻米中養分的一個成功範例，便是公知的「黃金米」。1999年瑞士以及德國科學家宣布研發了一種基因工程改良的稻米，用以生產β-胡蘿蔔素，而人體可將β-胡蘿蔔素轉化成維生素A。該新品種稻米很快地被宣告為針對維生素A缺乏症(Vitamin A deficiency，VAD)的一種奇蹟似的對策。在發展中國家中，維生素A缺乏症已經造成數百萬人民的困擾，特別是小孩以及孕婦。並且，嚴重的VAD可能造成患者部分或全盲；較輕微的VAD則會減弱免疫系統，增加受到感染，如麻疹以及瘧疾的危險。患有VAD的女性似乎更容易在生產期間或生產後死亡。每年，估計約有35萬名學齡前兒童因為患VAD而失明，並且VAD也造成超過百萬人死亡。因此，「黃金米」的研發對於拯救患VAD的患者來說是非常重要的。
馬鈴薯是世界上第四重要的糧食作物，並且是最重要的蔬菜。在美國，幾乎每個州皆種植馬鈴薯作為經濟作物。此外，美國馬鈴薯的年產量已經超過1千8百萬噸，而全世界的馬鈴薯年產量則約有3億噸。馬鈴薯的普及主要是因為其用途廣泛以及營養價值。馬鈴薯可以被使用，以新鮮的、冷凍的或是乾燥的方式，或者可被加工成馬鈴薯粉、澱粉或酒精。其具有多種碳水化合物，並且富含鈣、菸鹼酸以及維生素C。進一步，雖然洋芋片以及薯條已經在許多報導中表示含有大量的有毒物質，丙烯醯胺，但是這些馬鈴薯的食品加工產品仍然非常受到歡迎。
鑑於葉綠素對人體健康的價值以及稻米、馬鈴薯等作物的普及，若能研發可持續表達高含量葉綠素的稻米以及馬鈴薯等作物是有其需求。此外，不喜歡吃蔬菜的兒童也可通過食用這些作物而獲得葉綠素的補充。

發明內容
因此，本發明提供生產轉基因植物以及轉基因植物組織的方法，並且該轉基因植物以及植物組織中含有持續表達的高含量葉綠素。特別地，本發明提供通過特定的DNA建構體生產轉基因植物以及轉基因植物組織的方法。
本發明目的之一是提供一種DNA建構體，其包含一種可操作性地與核苷酸序列連接的特定啟動子，其中該核苷酸序列編碼包含選自SEQ IDNO2(細胞質型穀氨醯-tRNA合成酶)、SEQ ID NO4(胞器型穀氨醯-tRNA合成酶)及其組合的胺基酸序列。
本發明的另一目的是提供一種植物細胞，該植物細胞包含一DNA建構體，其中該DNA建構體包含一種可操作性地與核苷酸序列連接的特定啟動子，其中該核苷酸序列編碼包含選自SEQ ID NO2(細胞質型穀氨醯-tRNA合成酶)、SEQ ID NO4(胞器型穀氨醯-tRNA合成酶)及其組合的胺基酸序列。
本發明的再一目的是提供一種轉基因植物組織，該轉基因植物組織包含一DNA建構體，其中該DNA建構體包含一種可操作性地與核苷酸序列連接的特定啟動子，其中該核苷酸序列編碼包含選自SEQ ID NO2(細胞質型穀氨醯-tRNA合成酶)、SEQ ID NO4(胞器型穀氨醯-tRNA合成酶)及其組合的胺基酸序列。
此外，本發明的另一個目的是提供一種生產轉基因植物的方法。該方法包括用DNA建構體轉化植物細胞，該DNA建構體包含一種可操作性地與核苷酸序列連接的特定啟動子，其中該核苷酸序列編碼包含選自SEQ ID NO2(細胞質型穀氨醯-tRNA合成酶)、SEQ ID NO4(胞器型穀氨醯-tRNA合成酶)及其組合的胺基酸序列；以及從該轉化的植物細胞產生完整的植物。
另外，本發明的另一個目的同樣是提供一種生產轉基因植物的方法。該方法包括用DNA建構體轉化植物組織，該DNA建構體包含一種可操作性地與核苷酸序列連接的特定啟動子，其中該核苷酸序列編碼包含選自SEQ I D NO2(細胞質型穀氨醯-tRNA合成酶)、SEQ ID NO4(胞器型穀氨醯-tRNA合成酶)及其組合的胺基酸序列；以及從該轉化的植物組織產生完整的植物。
關於本發明的優點與精神可以通過以下的發明詳述及附圖得到進一步的了解。
四

圖1A-圖1C是表示根據本發明的用於生產轉基因水稻的DNA建構體。
圖2A-圖2C是表示根據本發明的用於生成轉基因馬鈴薯的DNA建構體。
五、實施方式以下將詳述本發明的優選具體實施例以及實際應用案例，用以充分說明本發明的特徵、精神及優點。
本發明提供一種特定的DNA建構體，其包含一特定的啟動子以及一或多個特定基因。此外，該(多個)特定基因可幫助增加植物中的葉綠素含量。
首先，氨醯-tRNA合成酶(Aminoacyl-tRNA synthetase，ARS)在蛋白質合成反應中扮演著重要的角色，其通過催化胺基酸附加到同源tRNA以促進蛋白質合成。氨醯-tRNA合成的特性配合適當的tRNAs以及胺基酸致使基因信息能準確傳播。植物中的蛋白質合成是在細胞質、粒線體以及葉綠體中進行，並且在上述各分區中，蛋白質合成不需要由各別細胞核基因所編碼的全部獨特氨醯-tRNA合成酶的參與。一般而言，植物的氨醯-tRNA合成酶可根據其基質被分為兩個族群細胞質型酶，其能最有效地氨醯化(Aminoacylate)植物或酵母菌的細胞質tRNAs；以及胞器型酶，其能氨醯化胞器或大腸桿菌(Escherichia coli)的tRNAs。
除了在蛋白質合成中扮演著重要的角色外，穀氨醯-tRNA合成酶，一種氨醯化-tRNA合成酶，也是與葉綠素合成有關的第一個酶。針對高等植物的相關研究已經報導，當胞器型穀氨醯-tRNA合成酶以及絲氨醯-tRNA合成酶(Seryl-tRNA synthetase)被去活性時，將導致葉綠體以及粒線體的發展停滯(Kim，Y.K.，et al.J.Biol.Chem.28037098-37106 (2005))。此外，胞器型穀氨醯-tRNA合成酶以及絲氨醯-tRNA合成酶的去活性也導致葉綠素的含量減少。根據這些研究，顯而易見地，穀氨醯-tRNA合成酶在葉綠素含量以及葉綠體的分化中扮演著重要的角色。
因此，本發明欲將該細胞質型穀氨醯-tRNA合成酵素和/或該胞器型穀氨醯-tRNA合成酶轉移到植物以及植物組織，如水稻種子、小麥種子、大麥種子、玉米種子以及馬鈴薯塊莖等。
在本發明的一個優選的具體實施例中，提供一種DNA建構體。該DNA建構體包含第一特定的啟動子，其可操作性地與核苷酸序列連接，其中該核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO2的胺基酸序列(細胞質型穀氨醯-tRNA合成酶)和/或SEQ ID NO4的胺基酸序列(胞器型穀氨醯-tRNA合成酶)。
在本發明的一個具體實施例中，該DNA建構體進一步包含第二特定的啟動子，如CaMV35S啟動子。此外，在該實施例中，該DNA建構體也包含一種標記基因，如編碼磷酸甘露糖異構酶(Phosphomannoseisomerase，PMI)的基因，可操作性地連接到該第二特定啟動子上。因此，該第二特定的啟動子可驅動該標記基因的表達。
參見圖1A至圖1C，圖1A至圖1C是表示根據本發明的供稻米轉殖用的DNA建構體。在一具體的實施例中，第一特定的啟動子是谷蛋白(glutelin)1啟動子。此外，如圖1A所示，DNA建構體也包含SEQ IDNO1的核苷酸序列，其中核苷酸序列編碼細胞質型穀氨醯-tRNA合成酶，並且核苷酸序列由第一特定的啟動子驅動。DNA建構體也包含CaMV35S啟動子，以及由CaMV35S啟動子驅動的標記基因。
如圖1B所示，在一具體的實施例中，第一特定的啟動子同樣是谷蛋白1啟動子。並且，DNA建構體包含SEQ ID NO3的核苷酸序列，其編碼該胞器型穀氨醯-tRNA合成酶，並且核苷酸序列由第一特定的啟動子驅動。該DNA建構體同樣包含CaMV35S啟動，以及由CaMV35S啟動子驅動的標記基因。
進一步地，如圖1C所示，在一具體的實施例中，DNA建構體可同時包含SEQ ID NO1的核苷酸序列以及SEQ ID NO3的核苷酸序列。在本發明的另一具體實施例中，第一特定的啟動子可以是I型B33patatin啟動子(圖2A至圖2C)。可利用圖2A至圖2C所示的DNA建構體轉化馬鈴薯。應當注意的是，第一特定的啟動子以及第二特定的啟動子不限於上述的啟動子，可以視情況需要而選擇其它適當的啟動子。
在本發明的另一個優選的具體實施例中，提供包含上述DNA建構體的植物細胞。進一步低，該植物細胞可以來自水稻、小麥、大麥、黑麥(Rye)、花生、穀物(Corn)、玉米(Maize)、馬鈴薯、甘薯、甜菜、蘿蔔、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、胡蘿蔔、南瓜、小胡瓜(Zucchini)、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、覆盆子(Raspberry)、菠蘿、大豆、蕃茄、高梁以及甘蔗等植物。
在本發明的另一優選的具體實施例中，提供包含上述DNA建構體的轉基因植物組織。在實際應用中，該植物組織可以是果實、莖、根、種子以及塊莖等植物組織，如水稻種子、大麥種子、玉米種子以及馬鈴薯塊莖。
此外，在本發明的一個優選的具體實施例中，提供生產轉基因植物的方法，該方法包括二個主要步驟首先，用DNA建構體轉化植物細胞，該DNA建構體包含一種可操作性地與核苷酸序列連接的特定啟動子，其中該核苷酸序列編碼包含選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4及其組合的胺基酸序列；接著從該轉化的植物細胞產生完整的植物。
在一個具體的實施例中，該方法可進一步包括從該完整植物或繁殖的完整植物中收穫植物組織，如，果實、莖、根、種子以及塊莖的步驟。在實際應用中，該植物可以是，但不限於水稻、小麥、大麥、黑麥、花生、穀物、玉米、馬鈴薯、甘薯、甜菜、蘿蔔、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、胡蘿蔔、南瓜、小胡瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、覆盆子、菠蘿、大豆、蕃茄、高梁以及甘蔗等。
此外，在本發明的另一個優選的具體實施例中同樣提供一種生產轉基因植物的方法，該方法包括下列步驟首先，用DNA建構體轉化植物組織，該DNA建構體包含一種可操作性地與核苷酸序列連接的特定啟動子，其中該核苷酸序列編碼包含選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4及其組合的胺基酸序列；接著從該轉化的植物細胞產生完整的植物。
在實際應用中，該植物同樣可以是，但不限於水稻、小麥、大麥、黑麥、花生、穀物、玉米、馬鈴薯、甘薯、甜菜、蘿蔔、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、胡蘿蔔、南瓜、小胡瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、覆盆子、菠蘿、大豆、蕃茄、高梁以及甘蔗。並且，在實際應用中，該植物組織可以是，但不限於果實、莖、根、種子以及塊莖，如水稻種子、大麥種子、小麥種子以及馬鈴薯塊莖。
在一個具體的實施例中，該方法可進一步包括從該完整植物或繁殖的完整植物中收穫一特定的植物組織，如，果實、莖、根、種子以及塊莖的步驟。
關於上述的方法將在以下幾個實施例中進行更詳細的闡述。應當注意的是，在實施例1中描述DNA建構體的構建；在實施例2中描述水稻的轉基因；在實施例3中描述馬鈴薯的轉基因。
具體實施例實施例1DNA建構體的構建分別自擬南芥(Arabidopsis thaliana)中分離出2760bp的DNA片段(SEQ ID NO1)，該片段編碼細胞質型穀氨醯-tRNA合成酶(SEQ ID NO2)；以及2055bp的DNA片段(SEQ ID NO3)，該片段編碼胞器型穀氨醯-tRNA合成酶(SEQ ID NO4)。(SEQ ID NO1-4的具體序列見序列表)擬南芥GluRS(穀氨醯-tRNA合成酶)基因選擇GluRS是合成葉綠素的第一個基因，擬南芥有細胞質型和胞器型兩種形式，利用擬南芥mRNA反轉錄的cDNA當模板(反轉錄的具體過程為在微量離心管中，加入阿拉伯芥total RNA 1μg、500μg/ml oligo(dT)1μl、10mM dNTPmix 1μl，用水補到12μl，65℃處理5分鐘，然後冰入冰塊中。再加入5μl緩衝液、2μl 0.1M DTT、1μl RNase inhibitor及1μl(200U)反轉錄酵素，42℃處理50分鐘，即得到阿拉伯芥cDNA)，利用AtGluRScF(5』-gctctagaatggatgggatgaagct t-3』(含XbaI切位))與AtGluRScR(5』-tcccccgggtgagttagcggctcttcc-3』(含SmaI切位))、或AtGluRSoF(5』-gctctagaatggcgagccttgtctac-3』(含XbaI切位))與AtGluRSoR(5』-tcccccgggtcaggttgatactgtggc-3』(含SmaI切位))做引物，以PCR方式複製擬南芥GluRS基因，細胞質型GluRS全長2160bp(具體序列見序列表)，胞器型GluRS全長1713bp(具體序列見序列表)。(兩個PCR反應的具體反應條件為利用上述的cDNA當模板，利用AtGluRScF與AtGluRScR或AtGluRSoF與AtGluRSoR當引子，35次PCR循環中，72℃反應時間2分10秒或1分45秒，其他PCR條件同下列質粒構建項目1所述，即得阿拉伯芥GluRS基因。)質粒構建1.pCambia1390-PMI以XhoI將pCambia1390載體(可以是市售)上的潮黴素抗性基因切除，換上PMI基因(基因的來源為抽取大腸桿菌genomic DNA，利用PMI5』390引子5』-ccatggtcatgcaaaaactcattaac-3』(含NcoI切位)與PMI3』1574引子5'-taagctcttacagcttgttg-3』，以PCR方式複製大腸桿菌PMI基因全共1176bp，以TA cloning插入pPICT-1質體，定序確定序列無錯誤。PCR條件如下在薄壁微量離心管中，加入最濃度dNTP 0.2mM、Mg2+2mM、正反引子各0.2μM、Taq DNApolymerase 1U、1倍PCR反應緩衝液、大腸桿菌genomic DNA當模版，用 菌水補至總體積50μl，整個管子先94℃處理5分鐘，再做94℃ 30秒、52℃ 30秒、72℃ 70秒共35次循環，最後72℃ 8分鐘結束，跑0.8％ agarose電泳確定大小無誤。利用限制酵素酶XhoI將PMI基因片段從pPICT-1質體中切出，然後接入pCambia1390中的XhoI site，以取代原先該位置上的抗生素基因)。
2.pBluescript II SK(pBS)中的基因盒將大小約0.3kb NOS終止子以BamHI/EcoRI從pPZPY122載體中切下，接入pBS中；將水稻glutelin 1基因啟動子從TA cloning pPICT-1質體以NotI/XbaI切下，接入pBS中；擬南芥GluRS基因從TA cloning pPICT-1質體以XbaI/SmaI切下，接入pBS中，此質粒即分含有GluRS啟動子、基因與終止子。3.以NotI/ApaI切下pBS質粒整個基因盒，用Klenow酶補平；用SmaI切pCambia1390-PMI，兩者進行連接反應，即可得到可將擬南芥細胞質型與胞器型GluRS基因大量表達的轉基因質粒。
4.以NotI/ApaI切下pBS質粒含有整個細胞質型GluRS基因盒，用Klenow酶補平；用PmlI切已接入胞器型GluRS的pCambia1390-PMI質粒，兩者進行連接反應，即可得到可同時表達擬南芥細胞質型與胞器型GluRS的轉基因質粒。
請參閱圖1以及圖2，以了解於此所建立的DNA建構體的部分實例。這些DNA建構體包含上述的DNA片段中的至少一DNA片段。這些DNA建構體並且進一步包含至少一第一特定啟動子，如glutelin 1啟動子以及class I B33 patatin啟動子，以及一第二特定啟動子，如CaMV35S啟動子。並且，這些DNA建構體可包含一標記基因，如一磷酸甘露糖異構酶基因。此外，這些DNA建構體以農桿菌(Agrobacterium)為媒介分別傳遞進入稻米或馬鈴薯的基因組，分別如實施例2以及實施例3所描述。
實施例2轉基因水稻發芽將約50粒臺農67號的水稻種子(市售產品)，以30％的漂白溶液(次氯酸鈉)消毒7分鐘，用滅菌水洗滌後，將經過消毒的水稻種子散布於MS培養基(MS+維生素為基礎培養基；30g/L的蔗糖；0.7％的洋菜；pH 5.8)上。在黑暗中使上述的水稻種子在30℃生長約3-5天。
癒合組織的誘導將發芽的水稻種子轉移至CIM培養基(N6+維生素為基礎培養基；0.3g/L酪蛋白胺基酸(Casamino acid)；2.8g/L raline；2mg/L 2，4-D；100mg/L肌醇；30g/L蔗糖；0.7％洋菜；pH 5.7)，進行癒合組織的誘導，接著在30℃持續光照培養，每隔2周進行傳代培養(Subculture)。
感染1周後，用含有上述DNA建構體的農桿菌GV3101(指的是圖1A、1B與1C的DNA建構體)懸浮液感染傳代培養的癒合組織細胞。將農桿菌懸浮液用AAM培養液稀釋至OD600nm＝0.6-0.8，並將該農桿菌懸浮液傾注至含有癒合組織細胞的培養皿，培養15分鐘。其中AAM培養溶的配方為CaCl2·2H2O 440mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、KH2PO4170mg/L、Fe-EDTA 37.5mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O 0.02mg/L；維生素(鹽酸胸腺嘧啶1mg/L、鹽酸吡哆醇1mg/L、菸鹼酸10mg/L)；胺基酸(甘氨酸75mg/L、L-穀氨醯胺877mg/L、L-天門冬氨酸266mg/L、L-精氨酸228mg/L)；蔗糖68.5g/L、酪蛋白胺基酸500mg/L、葡萄糖36g/L、乙醯丁香酮(Acetosyringone)100μM；pH 5.2)。
共培養將接種的癒合組織細胞取出並以吸水紙移除過剩的農桿菌，接著將癒合組織細胞在2N6I-AS培養基(N6+維生素為基礎的培養基；酪蛋白胺基酸1g/L；2，4-D 2mg/L；菜豆醣100mg/L；乙醯丁香酮100M；30g/L的蔗糖；葡萄糖10g/L；洋菜0.7％；pH 5.2)上，在28℃在黑暗中培養3天。
篩選在共培養後，用AA2培養液洗滌癒合組織細胞30分鐘，重複該洗滌步驟2次，並且移除過剩的培養溶液，其中AA2培養液的配方為CaCl2·2H2O 440mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、KH2PO4170mg/L、Fe-EDTA37.5mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl2·6H2O0.02mg/L；維生素(鹽酸胸腺嘧啶1mg/L、鹽酸吡哆醇1mg/L、菸鹼酸10mg/L)；胺基酸(甘氨酸75mg/L、L-穀氨醯胺877mg/L、L-天門冬氨酸266mg/L、L-精氨酸228mg/L；蔗糖30g/L、2，4-D 2mg/L；pH 5.7)。接著將癒合組織細胞轉移到篩選培養基2N6I-CH(N6+維生素為基礎的培養基；酪蛋白胺基酸1g/L；2，4-D 2mg/L；菜豆醣100mg/L；蔗糖30g/L；0.7％洋菜；pH 5.2)上，在30℃持續光照的環境下進行篩選。
再生將小於3mm的新生癒合組織轉移至篩選培養基RM中，在26.5℃持續光照條件下繼續培養，其中RM培養基的配方是KH2PO4400mg/L；KNO32830mg/L；(NH4)2SO4463mg/L；MgSO4·7H2O 185mg/L；CaCl2·2H2O 166mg/L；FeSO4·7H2O 27.85mg/L；Na-EDTA 37.25mg/L；ZnSO4·7H2O 1.8mg/L；MnSO4·4H2O 2.5mg/L；H3BO31.6mg/L；KI 0.83mg/L；N6維生素(商品化的化學製劑，包含甘氨酸、煙酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素)；NAA 0.5mg/L；細胞分裂素5mg/L；蔗糖30g/L；葡萄糖5g/L；菜豆醣100mg/L；0.7％洋菜；pH 5.7)。
生根誘導將3-5釐米的幼芽轉移至篩選培養基MS+2，4-D，進一步培養至10-15釐米，並將其轉移至土壤中，使其進一步生長。
實施例3轉基因馬鈴薯幼苗消毒將馬鈴薯塊根以30％的漂白溶液(次氯酸鈉)消毒，並且以滅菌水洗滌後，將其在MS培養基中培養，使其發芽。
預培養使用消毒後幼苗的幼葉進行預培養。將幼葉剪成5mm寬度的片段，將帶有幼葉上表面的片段轉移至HH培養基(MS+維生素為基礎的培養基；3％蔗糖；NAA 10mg/L；玉米素核苷10mg/L；0.7％洋菜；pH 5.6-5.8)中進行預培養，接著在20-22℃，光照周期為16小時光照/8小時黑暗，光強度為60μE/m2s下培養。
感染用COD培養液(MS+維生素為基礎的培養基；3％的蔗糖；200μM的乙醯丁香酮)將含有上述DNA建構體的農桿菌細胞懸浮液稀釋至OD600nm＝0.6-0.8，將稀釋後的農桿菌細胞懸浮液與上述預培養幼葉片段共同培養10分鐘。
共培養將感染後帶有幼葉上表面的片段轉移至LSR1培養基(含有乙醯丁香酮200μM；MS+維生素為基礎之培養基；3％蔗糖；NAA 0.2mg/L；玉米素核苷2mg/L；GA30.02mg/L；0.7％洋菜；pH 5.6-5.8)中，在20-22℃，光照周期為16小時光照/8小時黑暗，光強度為60μE/m2s的條件下共同培養。
癒合組織誘導將上述共同培養的幼葉片段轉移至LSR1T篩選培養基(LSR1培養基+200mg/L Timentin)，在20-22℃，光照周期為16小時光照/8小時黑暗，光強度為100μE/m2s的條件下培養。
再生誘導將帶有包含上述DNA建構體的癒合組織的幼葉片段轉移至LSR2培養基(MS+維生素為基礎的培養基；3％蔗糖；玉米素核苷2mg/L；GA30.02mg/L；0.7％洋菜；pH 5.6-5.8)上，供外殖體誘導，每2周更換新鮮培養基。當外殖體生長到1-2釐米時，將外殖體轉移至CM培養基(MS+維生素為基礎的培養基；2％蔗糖；0.7％洋菜；pH 5.6-5.8)，該培養基也可包含乙烯基抑制劑(1mg/L硫代硫酸銀)，以抑制過度發芽。
生根誘導將幼芽轉移至RT培養基(MS+維生素為基礎的培養基；2.5％蔗糖；0.2mg/L吲哚乙酸；0.7％洋菜；pH 5.6-5.8)上，進行生根誘導。
以上優選具體實施例的詳述，是希望能更加清楚描述本發明的特徵與精神，而並非用上述所公開的優選具體實施例來對本發明的範圍加以限制。相反地，其目的是希望能在本發明所申請的權利要求的範疇內涵蓋各種改變及具相等性的安排。
初步實驗結果水稻與馬鈴薯的轉植正在進行中，第一期計獲得10個水稻轉植品系與15個馬鈴薯轉植品系，經PCR分析發現有6水稻轉植品系具有轉植基因的表現，而馬鈴薯則有10個轉植品系具有轉植基因的表現。
序列表160NUMBER OF SEQ ID NOS4210SEQ ID NO 1211LENGTH2760212TYPEDNA213ORGANISMArabidopsis thaliana400SEQUENCE1agggttctgt ttctcgtctc tctctcaaac ccacattgca caatccattt ctcgtttctc 60tgatttagat ccaaagatgg atgggatgaa gctttcgttc ccaccggaaa gtccaccact120ttcagtcatc gttgctcttt ctctctcagc ttctccggtg acgattgatt cttccgccgc180tgcaacaacc gtcccttctt ttgtcttctc cgacgggagg aaattgaatg gagccaccgt240tcttcttcgc tatgttggtc gatcagcgaa aaagcttcct gatttctatg gcaacaatgc300ttttgattct tctcagattg atgagtgggt agattacgca tctgtcttct cttctggttc360agagtttgag aatgcttgtg gtcgtgttga taagtatctc gagagtagca cgtttcttgt420tggccattct ctttccattg ctgatgtcgc tatttggtca gctcttgctg gaactggtca480aagatgggaa agtttgagga aatctaaaaa gtatcagagt cttgttagat ggttcaattc540gatattagac gagtacagtg aggtgcttaa caaggttcta gcaacttatg ttaagaaagg600atcagggaag cctgttgctg cacctaagtc taaagatagc caacaagctg tgaaaggaga660tggtcaggat aaaggtaagc ctgaagtgga cttgccggaa gcggagattg gaaaggttaa720actccggttt gctccagagc caagtggtta tcttcacata ggacatgcta aggctgcgtt780gctgaacaag tatttcgctg agcgttacca aggggaagtg attgtgcgtt ttgatgatac840taaccctgct aaagaaagca atgagtttgt ggataatctt gtgaaggata ttgggacctt900ggggatcaag tatgagaaag tgacatacac ttcggactat tttcctgaat tgatggatat960ggcggaaaaa ctgatgcgtg agggtaaggc atatgttgat gacacaccga gggagcagat1020gcagaaagag aggatggatg ggattgattc gaaatgtagg aatcatagcg tcgaggagaa1080
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210SEQ ID NO 2211LENGTH719212TYPEPRT213ORGANISMArabidopsis thaliana400SEQUENCE2Met Asp Gly Met Lys Leu Ser Phe Pro Pro Glu Ser Pro Pro Leu Ser1510 15Val Ile Val Ala Leu Ser Leu Ser Ala Ser Pro Val Thr Ile Asp Ser20 25 30Ser Ala Ala Ala Thr Thr Val Pro Ser Phe Val Phe Ser Asp Gly Arg35 40 45Lys Leu Asn Gly Ala Thr Val Leu Leu Arg Tyr Val Gly Arg Ser Ala50 55 60Lys Lys Leu Pro Asp Phe Tyr Gly Asn Asn Ala Phe Asp Ser Ser Gln65 70 75 80Ile Asp Glu Trp Val Asp Tyr Ala Ser Val Phe Ser Ser Gly Ser Glu85 90 95Phe Glu Asn Ala Cys Gly Arg Val Asp Lys Tyr Leu Glu Ser Ser Thr100 105 110Phe Leu Val Gly His Ser Leu Ser Ile Ala Asp Val Ala Ile Trp Ser115 120 125Ala Leu Ala Gly Thr Gly Gln Arg Trp Glu Ser Leu Arg Lys Ser Lys130 135 140Lys Tyr Gln Ser Leu Val Arg Trp Phe Asr Ser Ile Leu Asp Glu Tyr145 150 155 160Ser Glu Val Leu Asn Lys Val Leu Ala Thr Tyr Val Lys Lys Gly Ser165 170 175
Gly Lys Pro Val Ala Ala Pro Lys Ser Lys Asp Ser Gln Gln Ala Val180 185 190Lys Gly Asp Gly Gln Asp Lys Gly Lys Pro Glu Val Asp Leu Pro Glu195 200 205Ala Glu Ile Gly Lys Val Lys Leu Arg Phe Ala Pro Glu Pro Ser Gly210 215 220Tyr Leu His Ile Gly His Ala Lys Ala Ala Leu Leu Asn Lys Tyr Phe225 230 235 240Ala Glu Arg Tyr Gln Gly Glu Val Ile Val Arg Phe Asp Asp Thr Asn245 250 255Pro Ala Lys Glu Ser Asn Glu Phe Val Asp Asn Leu Val Lys Asp Ile260 265 270Gly Thr Leu Gly Ile Lys Tyr Glu Lys Val Thr Tyr Thr Ser Asp Tyr275 280 285Phe Pro Glu Leu Met Asp Met Ala Glu Lys Leu Met Arg Glu Gly Lys290 295 300Ala Tyr Val Asp Asp Thr Pro Arg Glu Gln Met Gln Lys Glu Arg Met305 310 315 320Asp Gly Ile Asp Ser Lys Cys Arg Asn His Ser Val Glu Glu Asn Leu325 330 335Lys Leu Trp Lys Glu Met Ile Ala Gly Ser Glu Arg Gly Leu Gln Cys340 345 350Cys Val Arg Gly Lys Phe Asn Met Gln Asp Pro Asn Lys Ala Met Arg355 360 365Asp Pro Val Tyr Tyr Arg Cys Asn Pro Met Ser His His Arg Ile Gly370 375 380Asp Lys Tyr Lys Ile Tyr Pro Thr Tyr Asp Phe Ala Cys Pro Phe Val385 390 395 400
Asp Ser Leu Glu Gly Ile Thr His Ala Leu Arg Ser Ser Glu Tyr His405 410 415Asp Arg Asn Ala Gln Tyr Phe Lys Val Leu Glu Asp Met Gly Leu Arg420 425 430Gln Val Gln Leu Tyr Glu Phe Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Thr Leu435 440 445Leu Ser Lys Arg Lys Leu Leu Trp Phe Val Gln Thr Gly Leu Val Asp450 455 460Gly Trp Asp Asp Pro Arg Phe Pro Thr Val Gln Gly Ile Val Arg Arg465 470 475 480Gly Leu Lys Ile Glu Ala Leu Ile Gln Phe Ile Leu Glu Gln Gly Ala485 490 495Ser Lys Asn Leu Asn Leu Met Glu Trp Asp Lys Leu Trp Ser Ile Asn500 505 510Lys Arg Ile Ile Asp Pro Val Cys Pro Arg His Thr Ala Val Val Ala515 520 525Glu Arg Arg Val Leu Phe Thr Leu Thr Asp Gly Pro Asp Glu Pro Phe530 535 540Val Arg Met Ile Pro Lys His Lys Lys Phe Glu Gly Ala Gly Glu Lys545 550 555 560Ala Thr Thr Phe Thr Lys Ser Ile Trp Leu Glu Glu Ala Asp Ala Ser565 570 575Ala Ile Ser Val Gly Glu Glu Val Thr Leu Met Asp Trp Gly Asn Ala580 585 590Ile Val Lys Glu Ile Thr Lys Asp Glu Glu Gly Arg Val Thr Ala Leu595 600 605Ser Gly Val Leu Asn Leu Gln Gly Ser Val Lys Thr Thr Lys Leu Lys610 615 620
Leu Thr Trp Leu Pro Asp Thr Asn Glu Leu Val Asn Leu Thr Leu Thr625 630 635 640Glu Phe Asp Tyr Leu Ile Thr Lys Lys Lys Leu Glu Asp Asp Asp Glu645 650 655Val Ala Asp Phe Val Asn Pro Asn Thr Lys Lys Glu Thr Leu Ala Leu660 665 670Gly Asp Ser Asn Met Arg Asn Leu Lys Cys Gly Asp Val Ile Gln Leu675 680 685Glu Arg Lys Gly Tyr Phe Arg Cys Asp Val Pro Phe Val Lys Ser Ser690 695 700Lys Pro Ile Val Leu Phe Ser Ile Pro Asp Gly Arg Ala Ala Lys705 710 715210SEQ ID NO 3211LENGTH2055212TYPEDNA213ORGANISMArabidopsis thaliaha400SEQUENCE3agttatgagg ctttaatcga atttgttgct ttgctttgcg actttcatct ttccgattaa 60tcaaatcctt ttatcctctg aaaaatctca actttcgaag aaaacgaaaa tggcgagcct120tgtctacggg acgccgtggc ttagggttag atctttaccg gagcttgctc cagcttttct180cagacggcgt caatcttctt tattttactg ttctcggcga agcttcgcgg tggttgcgtg240ttccactcca gtcaacaatg gtgggtctgt cagagttcgt ttcgcgcctt ctcctactgg300taatctccat gtaggtggag caaggactgc tcttttcaac tacttgttcg cgaggtctaa360aggagggaaa tttgtgctga gaattgaaga tacagatttg gagagatcaa cacgtgaatc420tgaagcagct gttcttcagg atctctcatg gcttggtctt gattgggatg aaggtcctgg480ggttagtgga gactttggtc cttatcggca atctgaaaga aatgctttgt ataaacaata540tgcagagaag cttttagagt caggtcatgt ctatcgatgc ttttgctcaa gtgaggaact600
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210SEQIDNO4211LENGTH570212TYPEPRT213ORGANISMArabidopsis thaliana400SEQUENCE4Met Ala Ser Leu Val Tyr Gly Thr Pro Trp Leu Arg Val Arg Ser Leu1510 15Pro Glu Leu Ala Pro Ala Phe Leu Arg Arg Arg Gln Ser Ser Leu Phe20 25 30Tyr Cys Ser Arg Arg Ser Phe Ala Val Val Ala Cys Ser Thr Pro Val3540 45Asn Asn Gly Gly Ser Val Arg Val Arg Phe Ala Pro Ser Pro Thr Gly50 55 60Asn Leu His Val Gly Gly Ala Arg Thr Ala Leu Phe Asn Tyr Leu Phe65 70 75 80Ala Arg Ser Lys Gly Gly Lys Phe Val Leu Arg Ile Glu Asp Thr Asp85 90 95Leu Glu Arg Ser Thr Arg Glu Ser Glu Ala Ala Val Leu Gln Asp Leu100 105 110Ser Trp Leu Gly Leu Asp Trp Asp Glu Gly Pro Gly Val Ser Gly Asp115 120 125Phe Gly Pro Tyr Arg Gln Ser Glu Arg Asn Ala Leu Tyr Lys Gln Tyr130 135 140Ala Glu Lys Leu Leu Glu Ser Gly His Val Tyr Arg Cys Phe Cys Ser145 150 155 160Ser Glu Glu Leu Val Lys Met Lys Glu Asn Ala Lys Leu Lys Gln Leu165 170 175
Pro Pro Val Tyr Thr Gly Lys Trp Ala Thr Ala Ser Asp Ala Glu Ile180 185 190Glu Gln Glu Leu Glu Lys Gly Thr Pro Phe Thr Tyr Arg Phe Arg Val195 200 205Pro Lys Glu Gly Ser Leu Lys Ile Asn Asp Leu Ile Arg Gly Glu Val210 215 220Cys Trp Asn Leu Asp Thr Leu Gly Asp Phe Val Val Met Arg Ser Asn225 230 235 240Gly Gln Pro Val Tyr Asn Phe Cys Val Thr Val Asp Asp Ala Thr Met245 250 255Ala Ile Ser His Val Ile Arg Ala Glu Glu His Leu Pro Asn Thr Leu260 265 270Arg Gln Ala Leu Ile Tyr Lys Ala Leu Lys Phe Pro Met Pro Gln Phe275 280 285Ala His Val Ser Leu Ile Leu Ala Pro Asp Arg Ser Lys Leu Ser Lys290 295 300Arg His Gly Ala Thr Ser Val Gly Gln Tyr Arg Glu Met Gly Tyr Leu305 310 315 320Pro Gln Gly Met Val Asn Tyr Leu Ala Leu Leu Gly Trp Gly Asp Gly325 330 335Thr Glu Asn Glu Phe Phe Thr Leu Glu Asp Leu Val Glu Lys Phe Ser340 345 350Ile Glu Arg Val Asn Lys Ser Gly Ala Ile Phe Asp Ser Thr Lys Leu355 360 365Arg Trp Met Asn Gly Gln His Leu Arg Ala Leu Pro Asn Glu Lys Leu370 375 380Thr Lys Leu Val Gly Glu Arg Trp Lys Ser Ala Gly Ile Leu Thr Glu385 390 395 400
Ser Glu Gly Ser Phe Val Asn Glu Ala Val Glu Leu Leu Lys Asp Gly405 410 415Ile Glu Leu Val Thr Asp Ser Asp Lys Val Leu Leu Asn Leu Leu Ser420 425 430Tyr Pro Leu His Ala Thr Leu Ala Ser Pro Glu Ala Lys Pro Ala Val435 440 445Glu Asp Lys Leu His Glu Val Ala Ala Ser Leu Ile Ala Ala Tyr Asp450 455 460Ser Gly Glu Ile Pro Ser Ala Leu Glu Glu Gly Gln Gly Ala Trp Gln465 470 475 480Lys Trp Val Lys Ala Phe Gly Lys Ser Leu Lys Arg Lys Gly Lys Ser485 490 495Leu Phe Met Pro Leu Arg Val Leu Leu Thr Gly Lys Leu His Gly Pro500 505 510Glu Met Gly Thr Ser Ile Val Leu Ile Tyr Lys Ala Gly Ser Pro Gly515 520 525Ile Val Val Pro Gln Ala Gly Phe Val Ser Met Glu Glu Arg Phe Lys530 535 540Ile Leu Arg Glu Ile Asp Trp Glu Ala Leu Asn Lys Asp Glu Ser Val545 550 555 560Pro Leu Glu Ser Thr Ala Thr Val Ser Thr565 570
權利要求
1.一種DNA建構體，其包含一種可操作性地與核苷酸序列相連的第一特定啟動子，其中該核苷酸序列編碼選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4及其組合的胺基酸序列。
2.權利要求1所述的DNA建構體，進一步包含第二特定的啟動子。
3.權利要求2所述的DNA建構體，其中該第二特定的啟動子是CaMV35S啟動子。
4.權利要求3所述的DNA建構體，進一步包含一種標記基因，該標記基因是可操作性地與第二特定的啟動子相連。
5.權利要求4所述的DNA建構體，其中該標記基因編碼磷酸甘露糖異構酶。
6.如權利要求1所述的DNA建構體，其中第一特定的啟動子是谷蛋白1啟動子。
7.權利要求1所述的DNA建構體，其中第一特定的啟動子是I型B33patatin啟動子。
8.一種植物細胞，包含一DNA建構體，該DNA建構體包含一種可操作性與核苷酸序列相連的特定啟動子，其中該核苷酸序列編碼選自SEQ IDNO2、SEQ ID NO4及其組合的胺基酸序列。
9.權利要求8所述的植物細胞，其中該植物選自水稻、小麥、大麥、黑麥、花生、穀物、玉米、馬鈴薯、甘薯、甜菜、蘿蔔、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、胡蘿蔔、南瓜、小胡瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、覆盆子、菠蘿、大豆、蕃茄、高梁以及甘蔗。
10.權利要求9所述的植物細胞，其中該植物是水稻。
11.權利要求9所述的植物細胞，其中該植物是馬鈴薯。
12.一種轉基因植物組織，其包含一DNA建構體，該DNA建構體包含一種可操作性地與核苷酸序列相連的特定啟動子，其中該核苷酸序列編碼選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4及其組合的胺基酸序列。
13.權利要求12所述的轉基因植物組織，其中該植物組織選自果實、莖、根、種子以及塊莖。
14.權利要求13所述的轉基因植物組織，其中該植物組織是水稻種子或馬鈴薯塊莖。
15.一種生產轉基因植物的方法，包括下列步驟用DNA建構體轉化植物細胞，該DNA建構體包含可操作性地與核苷酸序列相連的特定的啟動子，其中該核苷酸序列編碼選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4及其組合的胺基酸序列；以及從該轉基因植物細胞中產生完整的植物。
16.權利要求15所述的方法，其中該植物選自水稻、小麥、大麥、黑麥、花生、穀物、玉米、馬鈴薯、甘薯、甜菜、蘿蔔、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、胡蘿蔔、南瓜、小胡瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、覆盆子、菠蘿、大豆、蕃茄、高梁以及甘蔗。
17.權利要求15所述的方法，進一步包括下列步驟從該完整植物或繁殖的完整植物中收穫植物組織。
18.權利要求17所述的方法，其中該植物組織選自果實、莖、根、種子以及塊莖。
19.一種生產轉基因植物的方法，包括下列步驟用DNA建構體轉化植物組織，該DNA建構體包含一種可操作性地與核苷酸序列相連的特定啟動子，其中該核苷酸序列編碼選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4及其組合的胺基酸序列；以及從該轉基因植物組織產生完整的植物。
20.權利要求19所述的方法，其中該植物選自水稻、小麥、大麥、黑麥、花生、穀物、玉米、馬鈴薯、甘薯、甜菜、蘿蔔、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、胡蘿蔔、南瓜、小胡瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、覆盆子、菠蘿、大豆、蕃茄、高梁以及甘蔗。
21.權利要求19所述的方法，進一步包括下列步驟自從該完整的植物或繁殖的完整植物中收穫特定的植物組織。
22.權利要求19或21所述的方法，其中該特定植物組織選自果實、莖、根、種子以及塊莖。
全文摘要
本發明公開了一種DNA構建體以及其用途，包含一種可操作性地與核苷酸序列相連的第一特定啟動子，其中該核苷酸序列編碼選自SEQ IDNO2、SEQ ID NO4及其組合的胺基酸序列。該轉基因植物以及植物組織中含有持續表達的高含量葉綠素。
文檔編號A01H5/00GK1884548SQ20061008731
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月7日 優先權日2006年6月7日
發明者謝旭亮, 文日升 申請人:謝旭亮, 文日升