一種新型導向溶栓劑，其製備方法及用途的製作方法

2023-07-11 10:49:26 4

專利名稱：一種新型導向溶栓劑，其製備方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，更確切地說涉及一種新型導向溶栓劑，還涉及其製備方法及應用。
背景技術：
隨著社會工業化程度的提高，生活節奏加快及飲食習慣的改變，心血管疾病已經成為當今世界上威脅人類最嚴重的疾病之一，其發病率和死亡率已超過腫瘤性疾病而躍居第一。其中血栓病引起的死亡率和致殘率極高，常見的血栓性疾病主要有急性心肌梗死、腦血栓和靜脈血栓等。血栓在血液循環系統中的非正常形成往往是導致此類疾病的直接原因。因此有效地清除堵塞血管的病理性血栓，疏通血管，恢復缺血組織正常的血液流通，實現對組織正常的營養、氧氣供應，成為治療的關鍵。目前的治療主要包括兩個方面手術治療及藥物治療。作為常規的治療手段，選用良好的溶栓藥物一直是治療方案的首選。
經過30多年的研究和實踐，溶栓製劑經歷了多次的更新換代，第一代溶栓製劑包括鏈激酶、尿激酶等，第二代溶栓製劑包括t-PA，scu-PA和葡激酶等。但這些溶栓製劑在臨床應用中都出現了一些明顯的問題，主要集中體現在對血栓的特異性差、臨床使用劑量大，並導致全身性出血等毒副作用。因而目前，國內外都在積極地開展第三代溶栓藥物的研製。第三代溶栓製劑研製的思路是通過基因工程技術，對天然的溶栓藥物進行結構改造，以提高溶栓劑的血栓特異性和延長溶栓劑的半衰期，從而減少溶栓劑的臨床使用劑量，減少其毒副作用。目前的研究主要集中在兩個方面，其一為改造t-PA或構建t-PA/scu-PA嵌合體，以期提高溶栓製劑對血栓特異性溶解能力。第二個方面則主要是利用血栓特異性抗體進行導向溶栓。目前，在導向溶栓製劑的研製中都是採用尿激酶或低分子量單鏈尿激酶作為溶栓劑，因而研究的焦點在於導向抗體。由於在血栓形成過程中，產生了一些新的抗原標誌，包括纖維蛋白，激活的血小板表面GPIIb/IIIa受體以及損傷血管內皮等，因而這些抗原標誌提供了導向抗體的結合靶位作用。
在國外，早在二十世紀九十年代初就開始了利用抗人纖維蛋白的抗體進行導向溶栓藥物的研製，在不同的動物(包括倉鼠和狒狒等)體內進行溶栓實驗表明，構建的抗體-尿激酶雜合體能夠降低溶栓劑的使用劑量10倍以上，而且能夠極大的延長溶栓劑在體內的半衰期。(Characterization of achimeric plasminogen activator consisting of a single-chain Fv fragment derivedfrom a fibrin fragment D-dimer-specific antibody and a truncated single-chainurokinase.J Biol Chem.1991 Oct 15；266(29)19717-24.)在1999年，德國漢堡大學的一個研究小組利用抗人纖維蛋白抗體和抗活化血小板抗體與尿激酶進行偶聯，製備了雙特異性的導向溶栓製劑，體外實驗表明，製備的雙特異性的導向溶栓製劑的纖溶活性提高約10倍(Abispecific antifibrin-antiplateleturokinase conjugate(BAAUC)induces enhanced clot lysis and inhibits plateletaggregation.Biochim Biophys Acta 2001 Apr 7；1546(2)399-405)。但是這些研究所用的導向抗體都為鼠抗體，而鼠抗體用於體內時因其較強的免疫原性而導致人抗鼠抗體反應(HAMA)，並降低了重複用藥的效果。因而近年來，國外大量的研究單位和製藥公司都在積極的研製免疫原性低的人源化(humanized)抗體或人抗體。截至到2002年，文獻報導的在美國進行臨床試驗的約100多種抗體中，其中絕大部分為人源化抗體和人源性抗體(其中有大約60％為人源化抗體)。因而在現階段，製備和採用免疫原性更低的人源化抗體或人源性抗體作為導向抗體研製導向溶栓藥物是大勢所趨。

發明內容
本發明提供了一種新型導向溶栓製劑，該溶栓製劑是一種雜合體，是將抗人纖維蛋白單鏈抗體與低分子量尿激酶(scu-PA-32k，殘基144-411)融合而成。本發明主要包括如下內容鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體(A11)-低分子量尿激酶(scu-PA-32k，殘基144-411)雜合體，它具有序列表中序列1所示的胺基酸序列，或序列表中序列1的一個或幾個胺基酸經過取代，缺失或增加後衍生的，具有與原序列相同功能的胺基酸序列。
編碼上述雜合體胺基酸序列的DNA序列，其中之一如序列表中序列2所示。
上述雜合體的製備方法包括如下步驟1、A11-scuPA32k融合基因的構建和克隆鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體(A11)為本發明的發明人利用噬菌體表面呈現技術篩選到的一株對人纖維蛋白特異的鼠抗體。利用PCR等方法，構建出A11-scuPA32k融合基因，該融合基因的DNA序列之一如序列表中序列2所示。然後利用常規的分子克隆技術將該融合基因克隆至原核表達載體pET15，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，建立表達A11-scuPA32k融合基因的工程菌株。
2、A11-scuPA32k融合基因在大腸桿菌中的可溶性表達利用IPTG誘導，如上所述的工程菌株能夠表達重組A11-scuPA32k雜合體，而且胞內可溶組分中能夠檢測到明顯的尿激酶活性，表明重組蛋白至少部分以可溶蛋白形式存在於胞內。
3、重組A11-scuPA32k雜合體的純化利用兔抗尿激酶抗體，採用親和層析方法對表達的重組A11-scuPA32k雜合體進行純化，純化產物達到電泳純(圖1)。重組A11-scuPA32k雜合體具有序列表中序列1所示的胺基酸序列。
4、重組A11-scuPA32k雜合體的體外活性分析利用溶圈法分析純化後重組A11-scuPA32k雜合體的尿激酶的溶纖功能，利用體外血栓吸附實驗分析純化後重組A11-scuPA32k雜合體結合血栓的能力，結果表明製備的重組A11-scuPA32k雜合體保持了良好的雙功能(圖2，圖3)。
5、重組A11-scuPA32k雜合體的體內溶栓實驗在大鼠體內製備血栓模型，分析重組A11-scuPA32k雜合體的體內溶栓效果，結果表明得到相同體內溶栓效果時，重組鼠單鏈抗體-尿激酶融合蛋白的用量約為尿激酶用量的1/4(圖4，5，6，7)。
人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體(IIn)-低分子量尿激酶(scu-PA-32k，殘基144-411)雜合體，它具有序列表中序列5或7所示的胺基酸序列，或序列表中序列5或7的一個或幾個胺基酸經過取代，缺失或增加後衍生的，具有與原序列相同功能的胺基酸序列。
編碼上述雜合體胺基酸序列的DNA序列，其中編碼序列表中序列5所述胺基酸序列的DNA序列之一如序列表中序列6所示，編碼序列表中序列7所述胺基酸序列的DNA序列之一如序列表中序列8所示。
上述雜合體的製備方法包括如下步驟1、IIn-scu-PA-32k融合基因的構建和克隆在分子模建的基礎上，利用表面重塑的人源化方案對鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體進行了人源化改造。然後藉助於噬菌體表面呈現技術，採用CDR3突變和DNA shuffling等方法對人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體進行了體外親和力成熟，並篩選到如序列表中序列3所示的一株人源化單鏈抗體，該人源化單鏈抗體的親和力和特異性都較親本鼠抗體更好(圖8)。
利用PCR等其他分子生物學方法，構建出如序列表中序列6和8中所示的兩種IIn和scuPA32k的融合基因，兩種融合基因的主要差別在於IIn和scuPA32k的順序不同，一種為IIn-scuPA32k，另一種為scuPA32k-IIn。然後利用常規的分子克隆技術分別將該融合基因克隆至真核表達載體pMCE(圖9)，構建了兩種融合基因的真核表達載體pMCE-IIn-scuPA32k(圖10)和pMCE-scuPA32k-IIn(圖11)。
2、高效表達IIn和scuPA32k融合基因的CHO細胞株的建立利用invitrogen公司的脂質體lipofectinAMINE2000，分別將構建的兩種融合基因，即IIn-scuPA32k和scuPA32k-IIn的真核表達質粒轉染CHO/dhfr-細胞株。分別用G418篩選表達IIn-scuPA32k雜合體或scuPA32k-IIn雜合體的陽性克隆，然後利用MTX分別對陽性克隆進行加壓以擴增目的基因在基因組中拷貝數，並篩選和亞克隆高表達IIn-scuPA32k雜合體或scuPA32k-IIn雜合體的細胞株。表達該兩種雜合體細胞株的表達量都達到10μg/106細胞·24小時。
3、重組IIn-scuPA32k和scuPA32k-IIn雜合體的體外活性分析利用溶圈法分析重組IIn-scuPA32k和scuPA32k-IIn雜合體的尿激酶的溶纖功能，利用ELISA分析表達的IIn-scuPA32k雜合體或scuPA32k-IIn雜合體對抗原D-Dimer的結合能力。結果表明CHO細胞表達的IIn-scuPA32k雜合體或scuPA32k-IIn雜合體都保持了良好的雙功能(圖12，表1)。
表1ELISA分析IIn-scupa32k和scupa32k-IIn雜合體的抗體活性樣品(n＝3)CHO/dhfr- IIn-scupa32kScupa32k-IInOD4920.04±0.010.87±0.15 0.76±0.10本發明的抗人纖維蛋白單鏈抗體與低分子量尿激酶的雜合體，為一種具有導向溶栓功能的新型溶栓製劑，可用於治療血栓性心腦血管疾病。
本發明的雜合體，具有單鏈抗體結合抗原D-dimer(DD)活性，其對血栓的結合能力強，得到相同體內溶栓效果時，重組鼠單鏈抗體-尿激酶融合蛋白的用量比尿激酶用量少的多，具有導向和溶栓雙功能，具有廣闊的臨床應用前景。


圖1為純化後重組A11-scupa32k的SDS-PAGE。其中A為純化後重組A11-scupa32k，B為低分子量蛋白標準圖2為溶圈法分析A11-scupa32k溶纖活性。其中
A為PBS標準B為純化後重組A11-scupa32kC為尿激酶標準(1IU)圖3為體外血栓吸附實驗分析A11-scupa32k的血栓結合能力。
圖4為近心端血管溫度變化(UK組)。
圖5為近心端血管溫度變化(Ab-UK組)。
圖6為血栓塊重量變化(UK組)。
圖7為血栓塊重量變化(Ab-UK組)。
圖8為人源化單鏈抗體與鼠單鏈抗體的相對親和力和特異性比較。
圖9為質粒pMCE結構示意圖。
圖10為質粒pMCE-IIn-scuPA32k結構示意圖。
圖11為質粒pMCE-scuPA32k-IIn結構示意圖。
圖12為溶圈法分析IIn-scupa32k和scupa32k-IIn雜合體的溶纖能力。
其中A為2IU尿激酶標準B為含IIn-scupa32k雜合體的細胞培養上清C為含scupa32k-IIn雜合體的細胞培養上清D為CHO/dhfr-細胞的培養上清(對照)具體實施方式
實施例一 鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體(A11)-低分子量尿激酶(scu-PA-32k，殘基144-411)融合基因的構建、表達、純化和體內外活性分析一、材料菌株E.coli BL21(DE3)購自novagen公司；質粒pET15b-HLSP2為本室構建，克隆有低分子量尿激酶基因(參見文獻生物工程學報，2000，16(4)514-516)，質粒pCANTAB5E-A11為本室構建，克隆有鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體(A11)基因(參見文獻生物技術通訊，1996，7(1)1-5)。
引物P1見序列表中序列9，P2見序列表中序列10。
化學試劑與酶類常用限制性內切酶、T4 DNA連接酶、pfu DNA聚合酶，dNTP等購自TAKARA公司和上海生工生物技術公司；抗原D-dimer(DD)，為人交聯纖維蛋白經纖溶酶原水解後產生的一個特異性降解片段，帶有交聯纖維蛋白的特異性抗原表位(Pizzo SV，Taylor LM Jr，Schwartz ML，et al.Subunit structure of fragment from fibrinogen and cross-linked fibrin.J Biol Chem.1973 Jul 10；248(13)4584-90.)；兔抗人尿激酶IgG為本室製備；其他常用生化試劑市購，為分析純。
實驗設備PCR儀(PE GeneAmp PCR system 2400)，超聲波破碎儀(ColePalmer CPX-600)，透射式紫外分析儀(LKB 2011 Macrovue)，高速冷凍離心機(Beckman J2-21)，臺式高速冷凍離心機(Sigma 3K 12)，低溫循環水浴槽(LKB 2219 Multiteivip II)，低溫冰箱(San Yo Medical freezer)，電子分析天平(Chyo JP-300 WP)，微型蛋白電泳儀(BioRAD Mini II)，721型分光光度計(上海，冷光牌)，恆溫空氣浴搖床(哈爾濱醫療器材廠)，恆溫水浴搖床(哈爾濱醫療器材廠)。
二、方法與結果1、鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體(A11)-低分子量尿激酶(scu-PA-32k，殘基144-411)融合基因的構建以質粒pET15b-HLSP2為模板，以P1和P2為引物，用pfuDNA聚合酶擴增低分子量尿激酶基因(scuPA32k)，並在其5』端添加連接肽(G4S)3的編碼基因。電泳回收約870bp的PCR產物，用NotI和NdeI雙酶切處理；載體pCANTAB5E-A11用NcoI和NotI雙酶切處理，電泳回收約750bp的A11基因；載體pET15用NcoI和NdeI雙酶切處理，回收載體大片段。隨後進行三片段連接，構建原核表達質粒pET15b-A11-scuPA32k，轉化E.coliBL21(DE3)。挑取單克隆，首先提質粒進行酶切鑑定，取酶切鑑定正確者進行序列分析，結果表明序列完全正確。
2、A11-scuPA32k融合基因在大腸桿菌中的可溶性表達將鑑定正確的pET15b-A11-scuPA32k質粒轉化E.coliBL21(DE3)，同時以pET15b-A11質粒轉化E.coliBL21(DE3)作為對照。分別挑取單克隆，接種於3ml含200μg/ml氨苄青黴素(Amp)的LB培養基中，37℃，250rpm培養過夜。然後按1∶500轉接於500ml含200μg/ml氨苄青黴素(Amp)的LB培養基中，30℃，250rpm培養至OD600達到0.8，加入IPTG至終濃度為1mM誘導表達5小時，然後5000g，4℃，20min離心收菌，重懸於200mlPBS中，5000g，4℃，20min收菌，重懸於50ml PBS中，超聲破碎細菌。然後10000g，4℃，20min離心，取上清，用溶圈法分析上清中尿激酶活性，結果表明表達上清中能夠檢測到尿激酶活性。
3、重組A11-scuPA32k雜合體的純化首先用抗人尿激酶IgG與CNBr活化的Sepharose 4B偶聯，製備人尿激酶抗體親和柱；然後將如上製備的上清上抗體親和層析柱，隨後用0.2MHcl-Glycine(pH2.0)洗脫，收集洗脫液，進行SDS-PAGE電泳分析，結果表明純化產物達到電泳純(圖1)。
4、重組A11-scuPA32k雜合體的體外活性分析4.1溶圈法測定尿激酶的溶纖活性，詳見文獻(軍事醫學科學院院刊，1987；11101)，結果表明純化產物具有尿激酶的溶纖活性(圖2)。
4.2體外血栓結合實驗分析單鏈抗體活性4.2.1血栓的製備取新鮮人血漿5ml，加入2單位牛凝血酶原，迅速混勻，用注射器灌注入矽膠管內，置37℃溫育30分鐘，凝固後用刀片將矽膠管切成1cm小段，用注射器吹出矽膠管內血漿凝塊，即為體外製備的血栓柱。
4.2.2體外血栓結合實驗取乾淨試管，加入2ml經適當稀釋的純化樣品，然後加入上述製備的血栓柱兩條，放37℃水浴，每10分鐘取出50μl上清至乾淨離心管中，取出的樣品同樣置37℃水浴。80分鐘後結束實驗。
4.2.3用溶圈法檢測各時間點樣品中尿激酶活性殘留情況，以確定重組A11-scuPA32k雜合體與血栓結合能力。結果表明純化產物具有明顯的體外血栓結合能力(圖3)。
5、重組A11-scuPA32k雜合體的體內溶栓實驗5.1實驗動物實驗採用Wistar雌性大鼠，180～200g。
5.2血栓模型的建立動物用2％戊巴比妥鈉麻醉，取腹主靜脈，阻斷血管兩端，取出血管內血液，注入0.2ml人的血液，30min後即可。
5.3給藥方法及給藥劑量給藥方法採用尾靜脈給藥，給藥劑量為8、2、1、0.5萬單位/Kg。
5.4實驗分組實驗設正常對照組(注射生理鹽水)，2、8萬單位尿激酶(UK)給藥組和0.5、1、2、8萬單位A11-scuPA32k(Ab-UK)給藥組。對照組10隻動物，UK組90隻動物，AB-UK組180隻動物。
5.5觀察指標及療效評價A遠心端、近心端溫度變化。血栓形成後在血管遠心端和近心端分別測定給藥前血管溫度的正常值，給藥後每隔15min測定溫度一次，直至給藥後3小時，比較動物給藥前後及不同時間血管溫度變化情況。
B根據實驗分組，正常對照組動物，血栓形成後立即取出血管血塊，稱其重量，作為藥前值。給藥組分別在給藥後30、45、60、75、90、105、120、150、180min取出血栓，稱重，觀察比較不同藥物、給藥不同時間血栓大小變化情況。
結果表明得到相同體內溶栓效果時，重組鼠單鏈抗體-尿激酶融合蛋白的用量約為尿激酶用量的1/4(圖4，5，6，7)。
實施例二 人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體(IIn)和低分子量尿激酶(scu-PA-32k，殘基144-411)融合基因的構建、表達及活性分析一、材料菌株E.coli XL1-blue為本室保存，CHO/dhfr-細胞株購自美國ATCC公司；質粒pcDNA3.1(+)購目invitrogen公司；質粒pSV2-dhfr，購自ATCC公司；質粒pIRESneo購自Clontech公司。質粒pET15b-IIn-UK為本室構建(參見文獻生物工程學報，2002，18(4)509-511)，該質粒克隆有人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體(IIn)基因及低分子量尿激酶(scuPA32k)突變基因，該基因的突變都為同義突變，不改變其編碼的胺基酸序列，詳見序列表中序列3，質粒pET15b-HLSP2克隆有低分子量尿激酶基因(參見文獻生物工程學報，2000，16(4)514-516)。引物P3見序列表中序列11，P4見序列表中序列12，P5見序列表中序列13，P6見序列表中序列14，P7見序列表中序列15，P8見序列表中序列16，P9見序列表中序列17，P10見序列表中序列18。
化學試劑與酶類常用限制性內切酶、T4 DNA連接酶、pfu DNA聚合酶，dNTP等購子自TAKARA公司和上海生工生物技術公司；抗原D-dimer(DD)，為人交聯纖維蛋白經纖溶酶原水解後產生的一個特異性降解片段，帶有交聯纖維蛋白的特異性抗原表位，為本室製備；羊抗兔IgG-HRP購自北京中山生物技術公司；其他常用生化試劑購自軍事醫學科學院條件處，為分析純。
實驗設備PCR儀(Perkin Elmer GeneAmp PCR system 2400)，超聲波破碎儀(Cole Palmer CPX-600)，透射式紫外分析儀(LKB 2011Macrovue)，高速冷凍離心機(Beckman J2-21)，臺式高速冷凍離心機(Sigma 3K 12)，低溫循環水浴槽(LKB 2219 Multiteivip II)，低溫冰箱(SanYo Medical freezer)，電子分析天平(Chyo JP-300 WP)，微型蛋白電泳儀(BioRAD Mini II)，臺式高速離心機(上海，TGL·16G型)，潔淨工作檯(北京半導體一廠)，721型分光光度計(上海，冷光牌)，恆溫空氣浴搖床(哈爾濱醫療器材廠)，恆溫水浴搖床(哈爾濱醫療器材廠)，二氧化碳培養箱(德國，Hereaus)二、方法與結果1、真核表達質粒pMCE的構建以質粒pSV2-dhfr為模板，以P9和P10為引物，擴增出DHFR基因，然後利用smaI+xbaI雙酶切分別處理載體pIRESneo和回收的PCR產物，將DHFR基因克隆至載體pIRESneo(替換neo基因)，構建質粒pIRESdhfr；然後利用EcoRV+xbaI雙酶切，分別處理載體pIRESdhfr和pcDNA3.1(+)，前者回收約1700bp的小片斷，後者回收約5400bp的載體大片斷，連接，構建載體pMCE(圖9)。轉化E.coli XL1-blue，挑取單克隆，提取質粒進行酶切鑑定和序列分析，結果表明序列完全正確。
2、融合基因IIn-scuPA32k的構建與克隆以質粒pET15b-IIn-UK為模板，首先以P4和P2(見實施例1)為引物，用pfuDNA聚合酶進行PCR反應，然後再以回收的PCR產物為模板，以P5和P2為引物，用pfuDNA聚合酶擴增出IIn-scuPA32k融合基因，並在融合基因的5』端添加一個抗體的信號肽的編碼基因。然後對PCR產物首先用NdeI切開，並用T4DNA聚合酶補平，熱滅活T4DNA聚合酶後，再用EcoRV處理；載體pMCE先用EcoRI，並用T4DNA聚合酶補平，熱滅活T4DNA聚合酶後，再用EcoRV處理，隨後將處理後的載體和PCR產物進行連接，構建真核表達質粒pMCE-IIn-scuPA32k(圖10)，轉化E.coli XL1-blue，挑取單克隆，提取質粒進行酶切鑑定和序列分析，結果表明序列完全正確。
3、融合基因scuPA32k-IIn的構建和克隆以質粒pET15b-HLSP2為模板，以P5和P6為引物，用pfuDNA聚合酶進行PCR反應，然後再以回收的PCR產物為模板，以P3和P6為引物，用pfuDNA聚合酶擴增出scuPA32k基因，並在scuPA32k基因的5』端添加一個抗體的信號肽的編碼基因，在3』端添加連接肽(G4S)3的編碼基因，隨後HindIII單酶切處理該PCR產物；以質粒pET15b-IIn-UK為模板，以P7和P8為引物，用pfuDNA聚合酶擴增出IIn基因，並用HindIII和NotI對該PCR產物進行雙酶切處理；載體pMCE用EcoRV和NotI雙酶切進行處理；隨後利用T4DNA連接酶對處理過的載體和兩種PCR產物進行三片段連接，構建表達質粒pMCE-scuPA32k-IIn(圖11)，轉化E.coli XL1-blue，挑取單克隆，提取質粒進行酶切鑑定和序列分析，結果表明序列完全正確。
4、高效表達IIn和scuPA32k融合基因的CHO細胞株的建立分別用SspI對質粒pMCE-IIn-scuPA32k和pMCE-scuPA32k-IIn進行線形化，然後利用invitrogen公司的脂質體lipofectin AMINE2000分別轉染CHO/dhfr-細胞。隨後用400μg/ml的G418篩選，挑取至少20個陽性克隆，取表達上清用溶圈法進行尿激酶活性分析。然後選擇表達量較高的克隆用MTX進行逐步加壓，以擴增目的基因的拷貝數並提高目的蛋白的表達量。MTX濃度依次為2.5×10-8，5×10-8，1×10-7，每次MTX加壓後，都挑選至少20個單克隆分析表達量，然後挑選表達量較高的克隆進行下一步加壓。
5、重組IIn-scuPA32k和scuPA32k-IIn雜合體的體外活性分析5.1溶圈法測定尿激酶的溶纖活性，詳見文獻(軍事醫學科學院院刊，1987；11101)結果表明表達上清中具有明顯的尿激酶溶纖活性(圖12)。
5.2 ELISA分析單鏈抗體的活性抗原DD包被酶聯孔，隨後用1％BSA-1‰Tween20封閉；培養上清樣品中先加BSA至1％，加Tween20至1‰進行封閉，然後加封閉後的上清樣品至酶聯孔，37℃，1h；洗滌後加入兔抗尿激酶IgG，37℃，1h；洗滌後加入HRP-羊抗兔IgG抗體，37℃，1h；洗滌後加入OPD底物液顯色至適當強度，用2mol/L H2SO4終止反應並測定OD492。結果表明，表達上清產物具有單鏈抗體結合抗原DD活性(表1)。
序列表110中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所120一種新型導向溶栓劑，其製備方法及用途130
16018170PatentIn version 3.12101211530212PRT213
4001Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro1 5 10 15Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30Ser Tyr Pro Ile Glu Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu35 40 45Trp Ile Gly Asn Phe His Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu50 55 60Lys Phe Lys Gly Arg Ala Lys Leu Thr Val Glu Lys Ser Ser Ser Thr65 70 75 80Val Tyr Leu Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr85 90 95Tyr Cys Ala Ile Tyr Phe Gly Lys Pro Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Thr130 135 140Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala145 150 155 160Ser Ser Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser165 170 175Gly Ala Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser180 185 190Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser195 200 205Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys210 215 220Gln Leu Trp Asn Tyr Pro Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu225 230 235 240Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly245 250 255Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu260 265 270Arg Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn275 280 285Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val290 295 300Thr Tyr Val Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser305 310 315 320
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40018agtctagatt agtctttctt ctcgtagact tc 3權利要求
1.一種新型導向溶栓劑，為鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體與低分子量尿激酶的雜合體，其特徵在於具有序列表中序列1所示的胺基酸序列，或序列表中序列1的一個或幾個胺基酸經過取代，缺失或增加後衍生的，具有與原序列相同功能的胺基酸序列。
2.編碼權利要求1所述溶栓劑的融合基因，其特徵在於具有序列表中序列2所示的DNA序列。
3.製備權利要求1所述溶栓劑的方法，包括以下步驟(1)利用分子生物學方法構建鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體-低分子量尿激酶融合基因並克隆至原核表達載體，轉化大腸桿菌；(2)將(1)中的大腸桿菌培養和誘導表達；(3)重組鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體-低分子量尿激酶的分離純化；(4)重組鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體-低分子量尿激酶的體內外活性分析。
4.一種新型導向溶栓劑，其特徵在於人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體與低分子量尿激酶的雜合體，具有序列表中序列5或7所示的胺基酸序列，或序列表中序列5或7的一個或幾個胺基酸經過取代，缺失或增加後衍生的，具有與原序列相同功能的胺基酸序列。
5.編碼權利要求4所述溶栓劑的融合基因，其特徵在於具有如序列表中序列6或8所示的DNA序列。
6.根據權利要求4所述的溶栓劑，其特徵在於其中的人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體，具有如序列表中序列3所示的胺基酸序列。
7.根據權利要求4或6所述的溶栓劑，其特徵在於編碼人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體的融合基因具有如序列表中序列4所示的DNA序列。
8.製備權利要求4所述溶栓劑的方法，包括以下步驟(1)利用分子生物學方法構建兩種人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體與低分子量尿激酶融合基因的真核表達載體，轉染真核細胞；(2)細胞培養，篩選分別表達兩種人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體與低分子量尿激酶雜合體的陽性克隆，以及利用MTX加壓提高重組雜合體的表達量；(3)兩種重組人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體與低分子量尿激酶雜合體的體外活性分析。
9.根據權利要求8所述方法，其特徵在於真核表達載體為pMCE，真核細胞為CHO/dhfr-細胞，轉染方法為脂質體轉染，篩選試劑為G418。
10.權利要求1或4所述的溶栓劑在製備心腦血管疾病治療藥物中的用途。
11.根據權利要求10所述的用途，其中的心腦血管疾病為血栓性疾病。
全文摘要
本發明公開了一種新型導向溶栓製劑，還公開了其製備方法及用途。本發明第一部分為鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體－低分子量尿激酶雜合體，其製備方法包括表達載體構建，表達，純化，活性分析等步驟。第二部分為兩種人源化鼠抗人纖維蛋白單鏈抗體－低分子量尿激酶雜合體，其製備方法包括構建真核表達載體，建立細胞株，雜合體的雙功能分析等。本發明的雜合體具有導向溶栓功能，具有廣闊的臨床應用前景。
文檔編號A61P7/02GK1593655SQ0315678
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月12日 優先權日2003年9月12日
發明者俞煒源, 劉志剛, 黃君健, 林建波, 徐桂清 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所