一種新鮮肉蓯蓉經生物催化轉化生產毛蕊花糖苷的方法

2023-07-25 23:05:06 1

專利名稱：一種新鮮肉蓯蓉經生物催化轉化生產毛蕊花糖苷的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用新鮮肉蓯蓉經生物催化轉化生產毛蕊花糖苷單體化合物的方法。
背景技術：
肉蓯蓉(HerbaCistanches)是多年寄生草本植物，為著名的補益中藥，具有益精氣、補腎助陽和延緩 衰老等功效。現代分析表明，肉蓯蓉的主要活性成分為苯乙醇苷類、苯甲醇苷類、環烯醚萜苷類、木 脂素苷類、低聚糖類衍生物、D-甘露醇和甜菜鹼等。苯乙醇苷類(Phenylethanoid Glycosides, Ph Gs) 包括松果菊苷(Echinacoside)、毛蕊花糖苷(Acteoside)等活性物質，通過腸內菌代謝研究發現，苯 乙醇苷主要成分松果菊苷在胃腸道中運動過程需經大腸內微生物酶催化轉化為毛森花糖苷的代謝通 道，是導致口服後生物利用度與療效存在顯著差異的主要因素。毛蕊花糖苷單體化合物具有小分子和 低極性的特徵，在藥物吸收中展示良好的吸收率和特殊的藥理活性。

發明內容
本發明的目的是提供一種以新鮮肉蓯蓉為原料，通過系統工藝處理和工業固定化酶反應器進行催 化轉化生產毛蕊花糖苷單體化合物的方法。
本發明的方法是，利用新鮮肉蓯蓉為原料，通過細胞破碎、漿液提取工藝及高溫滅酶工藝處理， 將滅酶後的肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，通過p-葡萄糖苷酶工業酶製劑固定化酶作為生物催化 劑，催化水解底物中松果菊苷使葡萄糖基配體末端斷裂、定向轉化為高活性的毛蕊花糖苷單體化合物， 再通過分離提純工藝，及濃縮、乾燥工藝，收穫毛蕊花糖苷單體化合物；催化反應過程溫度為38°C 60°C， pH為4.0 5.8，時間為4h 8h，催化反應過程反應物中的|3-葡萄糖苷酶活力為2U/g 1000U/g; 通過調整分離提純工藝條件，收穫的毛蕊花糖苷單體化合物純度百分比含量可達50% 90%。
本發明方法的具體步驟包括
1、 挑選新鮮肉蓯蓉肉質莖，置於水洗槽中用冷水或工業純淨水漂洗；撈起後，置於通常工業破碎
碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨水或經預冷的工業純淨水洗滌碎裂細胞成為肉灰
蓉破碎細胞漿狀物；然後採用通常工業壓濾機壓濾或工業離心機分離，獲取肉蓯蓉細胞漿液；可再將 濾渣經一次至數次(一般為1 3次)分別加入工業純淨水或經預冷的工業純淨水， 一次至數次經通常 工業破碎碾磨機進一步碾磨成漿狀物，還可同時採用通常工業超聲波提取裝置對破碎細胞進行提取， 再經工業壓濾機壓濾或工業離心機分離進一步獲取肉蓯蓉細胞槳液；將破碎碾磨和分離工藝過程肉歡 蓉破碎細胞漿狀物及細胞漿液控制在2(TC以下(一般為4 20'C)低溫環境；
2、 通過通常工業加熱裝置將步驟1得到的肉蓯蓉細胞槳液進行高溫滅酶，或進行工業超高溫瞬時 滅酶；將滅酶後的肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常固定化酶工業生產中的吸附法固定方式獲得的(3-葡萄糖苷酶工業酶製劑固定化酶作為生物催化劑，經通常工業固定化酶反應器進行間斷式 或連續式催化反應，催化水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蔬 花糖苷單體化合物；催化反應過程溫度為38。C 6(TC，最佳溫度為42。C 48。C; pH為4.0 5.8,最佳 pH為4.5 5.3;.時間為4h 8h，最佳時間為5h 6h，催化反應過程反應物中的p-葡萄糖苷酶活力為 2U/g 1000U/g，最佳酶活力為25U/g 150U/g;經測定，催化反應過程反應物中的松果菊苷轉化為毛 蕊花糖苷單體化合物的轉化率達78% 95%
3、 將經步驟2反應後的反應液，採用通常工業超濾膜分離，選擇性篩分及截留除去多糖、蛋白質 等大分子雜質以及微粒和亞微粒等雜質；再採用通常工業納濾膜分離，選擇性篩分及截留除去胺基酸、 D-甘露醇、甜菜鹼等小分子雜質；還可再採用通常工業大孔樹脂吸附分離工藝，或/和採用通常工業層 析柱分離純化工藝，或/和採用通常模擬移動床色譜分離系統工藝或通常多功能色譜分離工藝進一步分 離純化；通過調整以上分離提純工藝條件，可獲得不同純度的毛蕊花糖苷單體化合物提取液；
4、 將步驟3獲得的毛蕊花糖苷單體化合物提取液，通過通常工業真空濃縮工藝或工業薄膜蒸發濃 縮工藝，獲得固形物含量為30% 50%的濃縮物；再通過工業噴霧乾燥工藝，或通常的其它工業乾燥 方法，獲得毛蕊花糖苷單體化合物的粉狀物或乾燥物。收穫的毛蕊花糖苷單體化合物純度百分比含量 可達50% 90%。
本發明方法涉及的新鮮肉蓯蓉原料，可以是新收穫(未經冷藏或冷凍保鮮)的新鮮肉歡蓉肉質莖，
或者是置於工業冷藏庫保鮮的新鮮肉蓯蓉肉質莖，或置於工業冷凍庫冷藏的新鮮肉灰蓉肉質莖；或者 是上述新鮮肉蓯蓉肉質莖的切片或碎料。
本發明所述的肉蓯蓉是符合《中華人民共和國藥典》2005年版收載的列當科植物肉歡蓉C/sto恥/2e (ie鮮"co/a Y.C.Ma或管花肉灰蓉C7加"c/ze勵w/ora (Schrenk) Wight。
本發明方法涉及的採用工業冷藏庫保鮮的庫溫一般為rc i3匸，最佳的冷藏庫保鮮庫溫為4'C
l(TC;採用工業冷凍庫冷藏的庫溫一般為-52i: -l(rC，最佳的冷凍庫冷藏的庫溫為-36'C -18。C;採 用的置於水槽中的冷水水溫為rC 20'C，最佳的冷水水溫為4'C 1(TC;每次加入工業純淨水或經預 冷的工業純淨水的添加量為肉蓯蓉破碎細胞或濾渣的100% 400% (重量比)，最佳添加量為200%
300% (重量比)；經預冷的工業純淨水水溫為rc 2o'c,最佳水溫為4。C 10'C。
本發明方法涉及的工業生產中的吸附法固定方式獲得固定化酶，通常是將(3-葡萄糖苷酶工業酶制
劑酶液與吸附劑接觸，再經洗滌除去不吸附的酶液便可以製得固定化酶；包括物理吸附法、離子吸附 法；吸附劑包括微孔玻璃、羥基磷灰石、賽珞玢、大孔型合成樹脂、特種陶瓷、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、AmberliteIRA-93、 IRA-410、 IRA-900、 Dowex-50、 Amberlite CG-50、 IRC-50、 IR-120，
可選用通常國外及國內商品。
本發明方法涉及的(3-葡萄糖苷酶工業酶製劑，包括p-葡萄糖苷酶及富含(3-葡萄糖苷酶的纖維素酶、 植物提取複合酶、植物水解複合酶。
本發明方法涉及的高溫滅酶的溫度一般為75'C 10(TC，時間一般為3min 0min;超高溫瞬時滅 酶的溫度一般為135'C 141。C。本發明方法涉及的工業固定化酶反應器可以是通常工業攪拌罐式反應器、固定化床反應器或流化 床反應器。
本發明方法涉及的超濾膜的相對分子質量為1000 4500，最佳的相對分子質量為1500 3500;納 濾膜相對分子質量為200 300，最佳的相對分子質量為250 280;超濾膜選用CA或CTA、 PAN、 PS、 PSA、 PES、 PVDF、 PEK、 SPS的系列膜型號；納濾膜選用4040-UHT-ESNA或8540-UHY-ESNA、 ESNA-FREE650、 ESNA-FREE1700、 NTR7450HG、 NTR729HG、 NF-CA膜、NF-CA巻式元件及中空 纖維件的系列膜型號；大孔吸附樹脂選用XAD、 Diaion、 SP、 Posapak及Chromosorb及非離子型高分 子吸附劑AB-8、 CHA-III、 CAD-40、 DlOl、 D301、 D296、 D396R、 D4006、 D4020、 D3520、 DA201、 DM301、 D130、 GDX104、 HPDIOO、 HPD450、 HPD500、 HPD600、 HPD8、 H107、 JD-KW、 LD601、 LD605、 ME-1、 ME-2、 ME-3、 NKA-2、 NKA-9、 R-A、 S8、 SIP、 WLD及X-5型系列型號；模擬移動 床色譜分離系統及多功能色譜分離系統，可以選用MB、 MD、 ME、 MF製備型色譜分離層析儀、SMBC 實驗型、SMBC中試型、XZ12E-4L型、XZ20Z-2L型及SMBC工業化連續製備色譜型的色譜分離系統。 本發明方法涉及的超濾膜、納濾膜、大孔吸附樹脂、非離子型高分子吸附劑、工業層析柱、移動床色 譜分離系統、多功能色譜分離系統，可選用通常國外及國內商品。
本發明方法涉及的工業真空濃縮工藝或工業薄膜蒸發濃縮工藝的溫度一般為42'C 8(TC，最佳溫 度為45'C 65'C;採用的工業噴霧乾燥工藝的乾燥塔進風溫度一般為125°C 285°C，最佳進風溫度為 135。C 185。C。
本發明方法涉及的其它工業乾燥的方法包括通常工業滾筒乾燥、或氣流乾燥、流化床乾燥、微波 真空乾燥、微波乾燥、真空乾燥或熱風循環乾燥，乾燥溫度一般為50 10(TC，最佳為58 80'C。
本發明方法生產的毛蕊花糖苷單體化合物的粉狀物或乾燥物，可直接用於醫藥原料，或作為化妝 品原料，也可作為原料或複方原料生產口服液、膠囊劑、片劑、顆粒劑、衝劑、丸劑或袋泡茶等功能 性保健食品。本發明方法的推廣實施，將使肉蓯蓉這一名貴的中藥更好地造福於人類的健康。
本發明方法中涉及的各種量的百分比(％),除了另有說明外，均為重量百分比。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
實施例一
1、 挑選置於庫溫為4'C的工業冷藏庫保鮮的新鮮肉灰蓉肉質莖，置於水洗槽中用冷水漂洗，冷水 水溫為18'C，撈起後，置於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨水洗滌破碎 細胞成為肉蓯蓉破碎細胞漿狀物，水的加入量為破碎細胞重量的300%;然後採用工業壓濾機壓濾，獲 取肉蓯蓉細胞漿液；經檢測，破碎碾磨和分離工藝過程肉蓯蓉破碎細胞漿狀物及細胞漿液溫度為2(TC;
2、 通過工業微波加熱裝置將肉蓯蓉細胞漿液進行高溫滅酶，溫度為100'C，時間為3min;將滅酶 後的肉雙蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的物理吸附法羥基磷灰石作為吸附劑的
6固定方式，獲得|3-葡萄糖苷酶固定化酶作為生物催化劑，經通常固定化床反應器進^連續式催化反應， 催化水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷單體化合物； 催化反應過程溫度為46'C, pH為4.9，每批次催化反應時間為5.5h,連續進行催化反應10批次；催化 反應過程反應物中的(3-葡萄糖苷酶活力為10U/g;經檢測，底物中松果菊苷轉化為毛蕊花糖苷單體化 合物的轉化率達94%;
3、 將上述催化反應後的反應液採用相對分子質量為4000的超濾膜分離，再採用相對分子質量為 250的納濾膜進行納濾，然後採用AB-8型的工業大孔吸附樹脂進行吸附分離，並經工業層析柱分離純 化工藝分離提純，再採用XZ12E-4L型多功能色譜分離系統進一步分離提純，獲得較高純度的毛蕊花 糖苷單體化合物提取液；
4、 將上述提取液通過工業真空濃縮工藝，溫度為6(TC,獲得固形物含量為42%的濃縮物；進一 步通過工業真空乾燥工藝，乾燥溫度為58'C，獲得毛蕊花糖苷單體化合物的乾燥物；經分析測定，所 收穫的乾燥物中(以乾物質計)，毛蕊花糖苷單體化合物純度百分比含量為87.5%。
實施例二
1、 挑選置於庫溫為io'c的工業冷藏庫保鮮的新鮮肉蓯蓉肉質莖，置於水洗槽中用冷水漂洗，冷水
水溫為4'C，撈起後，置於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入經預冷至水溫為4'C的 工業純淨水洗滌破碎細胞成為肉灰蓉破碎細胞漿狀物，水的加入量為破碎細胞重量的200%;然後採用 T.業離心機分離，獲取肉蓯蓉細胞漿液；並再將濾渣加入工業純淨水，水的加入量為濾渣重量的200 %,經通常工業破碎碾磨機進一步碾磨成漿狀物，並採用超聲波提取裝置對破碎細胞進行提取，再經 丄業離心機分離進一步獲取肉歡蓉細胞漿液；經檢測，破碎碾磨和分離工藝過程肉蓯蓉破碎細胞漿狀 物及細胞漿液溫度為18'C;
2、 通過工業加熱裝置將肉蓯蓉細胞槳液進行高溫滅酶，溫度為10(TC,時間為5min;將滅酶後的 肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的物理吸附法賽珞玢作為吸附劑的固定方式， 獲得P-葡萄糖苷酶固定化酶作為生物催化劑，經通常工業固定化反應器進行連續式催化反應，催化水 解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷單體化合物；催化反 應過程溫度為45'C， pH為4.5，每批次催化反應時間為6.0h，連續進行催化反應12批次，催化反應過 程反應物中的P-葡萄糖苷酶活力為29U/g;經檢測，底物中松果菊苷轉化為毛蕊花糖苷單體化合物的 轉化率達95%;
3、 將上述催化反應後的反應液採用相對分子質量為300的納濾膜進行納濾，然後採用XAD型的 工業大孔吸附樹脂進行吸附分離，並經工業層析柱分離純化工藝提純，再採用XZ20Z-ZL型多功能色 譜分離系統進一步分離提純，獲得較高純度的毛蕊花糖苷單體化合物提取液；
4、 將上述提取液通過工業薄膜蒸發濃縮工藝，溫度為55°C,獲得固形物含量為45%的濃縮物； 進一步通過工業滾筒乾燥工藝，乾燥溫度為55'C，獲得毛蕊花糖苷單體化合物的乾燥物；經分析測定， 所收穫的乾燥物中(以乾物質計)，毛蕊花糖苷單體化合物純度百分比含量為89.9%。實施例三
1、 挑選置於庫溫為-52'C的工業冷凍庫冷藏的新鮮肉蓯蓉肉質莖，置於水洗槽中用工業純淨水漂 洗，撈起後，置於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨水洗滌破碎細胞成為 肉蓯蓉破碎細胞漿狀物，水的加入量為破碎細胞重量的400%;然後採用工業壓濾機壓濾，獲取肉灰蓉 細胞槳液；經檢測，破碎碾磨和分離工藝過程肉蓯蓉破碎細胞漿狀物及細胞漿液溫度為18°C;
2、 通過工業加熱裝置將肉蓯蓉細胞漿液進行高溫滅酶，溫度為95'C，時間為10min;將滅酶後的 肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的物理吸附法大孔型合成樹脂作為吸附劑的 固定方式，獲得(3-葡萄糖苷酶固定化酶作為生物催化劑，經通常工業流化床反應器進行連續式催化反 應，催化水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷單體化合 物；催化反應過程溫度為42'C， pH為4.9，每批次催化反應時間為5h，連續進行催化反應8批次，經 檢測，催化反應過程反應物中的p-葡萄糖苷酶酶活力為2U/g;經檢測，底物中松果菊苷轉化為毛蘊花 糖苷單體化合物的轉化率達81.2%;
3、 將上述催化反應後的反應液採用相對分子質量為4500的超濾膜分離，再採用相對分子質量為 250的納濾膜進行納濾，然後採用NKA-2型的工業大孔吸附樹脂進行吸附分離，並經工業層析柱分離 純化工藝進一步分離提純，獲得較高純度的毛蕊花糖苷單體化合物提取液；
4、 將上述提取液通過工業真空濃縮工藝，溫度為60°C，獲得固形物含量為41%的濃縮物；進一 步通過工業噴霧千燥工藝，乾燥塔進風溫度為185'C,獲得毛蕊花糖苷單體化合物的粉狀物；經分析測 定，所收穫的粉狀物中(以乾物質計)，毛蕊花糖苷單體化合物純度百分比含量為76.3%。
實施例四
1、 挑選置於庫溫為13'C的工業冷藏庫保鮮的新鮮肉蓯蓉肉質莖，置於水洗槽中用冷水漂洗，冷水 水溫為13°C，撈起後，置於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入經預冷至水溫為2'C 的I業純淨水洗滌破碎細胞成為肉歡蓉破碎細胞漿狀物，水的加入量為破碎細胞重量的100%;然後採 用丁業壓濾機壓濾分離，獲取肉蓯蓉細胞漿液；並將濾渣經2次分別加入工業純淨水，水的加入量為 濾渣重量的300%，再經通常工業破碎碾磨機進一步碾磨成漿狀物，再經工業壓濾機壓濾分離進一步獲 取肉蓯蓉細胞漿液；經檢測，破碎碾磨和分離工藝過程肉蓯蓉破碎細胞漿狀物及細胞漿液溫度為18°C;
2、 將上述獲得獲得的肉蓯蓉細胞漿液進行工業超高溫瞬時滅酶，溫度為138'C;將滅酶後的肉歡 蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的離子吸附法DEAE-葡聚糖凝膠作為吸附劑的固 定方式，獲得p-葡萄糖苷酶固定化酶作為生物催化劑，經通常工業攪拌罐式反應器進行連續式催化反 應，催化水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷單體化合 物；催化反應過程溫度為47'C， pH為5.0,每批次催化反應時間為5.0h，連續進行催化反應16批次， 催化反應過程反應物中的(3-葡萄糖苷酶活力為3.5U/g;經檢測，底物中松果菊苷轉化為毛蕊花糖苷單 體化合物的轉化率達88.1%;
3、 將上述催化反應後的反應液採用相對分子質量為1000的超濾膜分離，再採用相對分子質量為 300的納濾膜進行納濾，然後採用CAD-40型的工業大孔吸附樹脂進行吸附分離，並經工業層析柱分離
8純化工藝進一步分離提純，獲得較高純度的毛蕊花糖苷單體化合物提取液；
4、將上述提取液通過工業薄膜蒸發濃縮工藝，溫度為60°C，獲得固形物含量為48%的濃縮物； 進一步通過工業滾筒乾燥工藝，乾燥溫度為55'C，獲得毛蕊花糖苷單體化合物的乾燥物；經分析測定， 所收穫的乾燥物中(以乾物質計)，毛蕊花糖苷單體化合物純度百分比含量為87.6%。
實施例五
1 、挑選置於庫溫為-18'C的工業冷凍庫冷藏的新鮮肉蓯蓉肉質莖，置於水洗槽中用工業純淨水漂 洗，撈起後，置於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨水洗滌破碎細胞成為 肉蓯蓉破碎細胞漿狀物，水的加入量為破碎細胞重量的250%;然後採用工業壓濾機壓濾，獲取肉蓯蓉 細胞漿液；經檢測，破碎碾磨和分離工藝過程肉蓯蓉破碎細胞漿狀物及細胞漿液溫度為15°C;
2、 通過工業加熱裝置將肉蓯蓉細胞漿液進行高溫滅酶，溫度為85'C，時間為10min;將滅酶後的 肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的離子吸附法IRC-50作為吸附劑的固定方式， 獲得卩-葡萄糖苷酶固定化酶作為生物催化劑，經通常工業攪拌罐式反應器進行連續式催化反應，催化 水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷單體化合物；催化 反應過程溫度為45'C, pH為4.1，每批次催化反應時間為6h,連續進行催化反應4批次，催化反應過 程反應物中的(3-葡萄糖苷酶活力為70U/g;經檢測，底物中松果菊苷轉化為毛森花糖苷單體化合物的 轉化率達93.3%;
3、 將上述催化反應後的反應液採用相對分子質量為3500的超濾膜分離，再採用相對分子質量為 250的納濾膜進行納濾，然後採用DM301型的工業大孔吸附樹脂進行吸附分離，並經工業層析柱分離 純化[:藝進一步分離提純，獲得較高純度的毛蕊花糖苷單體化合物提取液；
4、 將上述提取液通過工業真空濃縮工藝，溫度為56°C，獲得固形物含量為30%的濃縮物；進一 步通過工業真空乾燥工藝，乾燥溫度為56'C,獲得毛蕊花糖苷單體化合物的乾燥物；經分析測定，所 收穫的乾燥物中(以乾物質計)，毛蕊花糖苷單體化合物純度百分比含量為87.2%。
實施例六
1、 挑選置於庫溫為l(TC的工業冷藏庫保鮮的新鮮肉蓯蓉肉質莖，置於水洗槽中用冷水漂洗，冷水 水溫為8'C，撈起後，置於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入經預冷至水溫為l(TC 的工業純淨水洗滌破碎細胞成為肉蓯蓉破碎細胞漿狀物，水的加入量為破碎細胞重量的200%;然後採 用工業壓濾機壓濾，獲取肉蓯蓉細胞漿液；並將濾渣再加入經預冷至水溫為l(TC的工業純淨水，水的 加入量為濾渣重量的100%,經通常工業破碎碾磨機進一步碾磨成漿狀物，再經工業壓濾機壓濾分離進 一步獲取肉蓯蓉細胞漿液；經檢測，破碎碾磨和分離工藝過程肉蓯蓉破碎細胞漿狀物及細胞漿液溫度 為12°C;
2、 通過工業加熱裝置將肉蓯蓉細胞漿液進行高溫滅酶，溫度為100'C，時間為4min;將滅酶後的 肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的離子吸附法IRC-120作為吸附劑的固定方 式，獲得植物水解複合酶固定化酶作為生物催化劑，經通常工業攪拌罐式反應器進行間斷式催化反應，催化水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷單體化合物； 催化反應過程溫度為48'C， pH為4.9，催化反應時間為6h，催化反應過程反應物中的p-葡萄糖苷酶活 力為100U/g;經檢測，底物中松果菊苷轉化為毛蕊花糖苷單體化合物的轉化率達84.2%;
3、 將上述催化反應後的反應液採用相對分子質量為4000的中空纖維超濾膜分離，再採用相對分 子質量為200的納濾膜進行納濾，然後採用X-5型的工業大孔吸附樹脂進行吸附分離，並經工業層析 柱分離純化工藝進一步分離提純，獲得較高純度的毛蕊花糖苷單體化合物提取液；
4、 將上述提取液通過工業薄膜蒸發濃縮工藝，溫度為70°C，獲得固形物含量為38%的濃縮物； 進一步通過工業滾筒乾燥工藝，乾燥溫度為60'C，獲得毛蕊花糖苷單體化合物的乾燥物；經分析測定， 所收穫的乾燥物中(以乾物質計)，毛蕊花糖苷單體化合物純度百分比含量為76.2%。
實施例七
1、 挑選置於庫溫為4'C的工業冷藏庫保鮮的新鮮肉蓯蓉肉質莖，置於水洗槽中用冷水漂洗，冷水 水溫為15'C，撈起後，置於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨水洗滌破碎 細胞成為肉蓯蓉破碎細胞槳狀物，水的加入量為破碎細胞重量的100%;然後採用工業壓濾機壓濾，獲 取肉蓯蓉細胞漿液；經檢測，破碎碾磨和分離工藝過程肉蓯蓉破碎細胞漿狀物及細胞漿液溫度為19'C;
2、 通過工業微波加熱裝置將肉蓯蓉細胞漿液進行高溫滅酶，溫度為95'C,時間為4min;將滅酶 後的肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的物理吸附法羥基磷灰石作為吸附劑的 固定方式，獲得(3-葡萄糖苷酶固定化酶作為生物催化劑，經通常固定化床反應器進行連續式催化反應， 催化水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷單體化合物； 催化反應過程溫度為52'C， pH為4.8，每批次催化反應時間為7h，連續進行催化反應11批次，催化 反應過反應物中的(3-葡萄糖苷酶活力為900U/g;經檢測，底物中松果菊苷轉化為毛蕊花糖苷單體化合 物的轉化率達83.4%;
3、 將上述催化反應後的反應液採用相對分子質量為2000的超濾膜分離，再採用相對分子質量為 250的納濾膜進行納濾，並經工業層析柱分離純化工藝進一步分離提純；獲得較高純度的毛蕊花糖苷單 體化合物提取液；
4、 將上述提取液通過工業真空濃縮工藝，溫度為60'C，獲得固形物含量為40%的濃縮物；進一 步通過工業真空乾燥工藝，乾燥溫度為58'C，獲得毛蕊花糖苷單體化合物的乾燥物；經分析測定，所 收穫的乾燥物中(以乾物質計)，毛蕊花糖苷單體化合物純度百分比含量為65.4%。
實施例八
1、挑選置於庫溫為8'C的工業冷藏庫保鮮的新鮮肉蓯蓉肉質莖，置於水洗槽中用冷水漂洗，冷水 水溫為14°C，撈起後，置於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入經預冷至水溫為6'C 的工業純淨水洗滌破碎細胞成為肉蓯蓉破碎細胞漿狀物，水的加入量為破碎細胞重量的300%;然後採 用工業離心機分離，獲取肉蓯蓉細胞漿液；並再將濾渣分別經2次加入工業純淨水，經通常工業破碎 碾磨機進一步碾磨成漿狀物，再經工業離心機分離進一步獲取肉灰蓉細胞漿液；經檢測，破碎碾磨和分離工藝過程肉蓯蓉破碎細胞漿狀物及細胞漿液溫度為14°C;
2、 通過工業加熱裝置將肉蓯蓉細胞漿液進行高溫滅酶，溫度為10(TC，時間為3min;將滅酶後的 肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的離子吸附法DEAE-纖維素作為吸附劑的固 定方式，獲得纖維素酶固定化酶作為生物催化劑，經通常流化床反應器進行連續式催化反應，催化水 解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷單體化合物；催化反 應過程溫度為53'C， pH為5.2，每批次催化反應時間為8h,連續進行催化反應7批次，催化反應過程 反應物中的(3-葡萄糖苷酶活力為22U/g;經檢測，底物中松果菊苷轉化為毛蕊花糖苷單體化合物的轉 化率達69.3%;
3、 將上述催化反應後的反應液採用相對分子質量為4000的超濾膜分離，再採用相對分子質量為 300的納濾膜進行納濾，然後採用R-A型的工業大孔吸附樹脂進行吸附分離；獲得較高純度的毛蕊花 糖苷單體化合物提取液；
4、 將上述提取液通過工業薄膜蒸發濃縮工藝，溫度為6(TC，獲得固形物含量為40%的濃縮物； 進一步通過工業滾筒乾燥工藝，乾燥溫度為65'C,獲得毛蕊花糖苷單體化合物的乾燥物；經分析測定， 所收穫的乾燥物中(以乾物質計)，毛蕊花糖苷單體化合物純度百分比含量為52.2%。
實施例九
1 、挑選置於庫溫為-36'C的工業冷凍庫冷藏的新鮮肉蓯蓉肉質莖，置於水洗槽中用工業純淨水漂 洗，撈起後，置亍工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨水洗滌破碎細胞成為 肉蓯蓉破碎細胞漿狀物，水的加入量為破碎細胞重量的200%;然後採用工業壓濾機壓濾，獲取肉蓯蓉 細胞漿液；經檢測，破碎碾磨和分離工藝過程肉蓯蓉破碎細胞漿狀物及細胞漿液溫度為irC;
2、 通過工業加熱裝置將肉蓯蓉細胞漿液進行高溫滅酶，溫度為10(TC,時間為8min;將滅酶後的 肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的離子吸附法DEAE-葡聚糖凝膠作為吸附劑 的固定方式，獲得p-葡萄糖苷酶固定化酶作為生物催化劑，經通常固定化床反應器進行連續式催化反 應，催化水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷單體化合 物；催化反應過程溫度為4(TC， pH為4.6,每批次催化反應時間為4.5h,連續進行催化反應13批次， 催化反應過程反應物中的(3-葡萄糖苷酶活力為21U/g;經檢測，底物中松果菊苷轉化為毛蕊花糖苷單 體化合物的轉化率達65.6%;
3、 將上述催化反應後的反應液採用相對分子質量為3500的超濾膜分離，再採用相對分子質量為 250的納濾膜進行納濾；獲得毛蕊花糖苷單體化合物提取液；
4、 將上述提取液通過工業真空濃縮工藝，溫度為60'C，獲得固形物含量為38°/。的濃縮物；進一 步通過工業噴霧乾燥工藝，乾燥塔進風溫度為1S5'C，獲得毛蕊花糖苷單體化合物的粉狀物；經分析測 定，所收穫的粉狀物中(以乾物質計)，毛蕊花糖苷單體化合物純度百分比含量為50%。
實施例十
1、挑選置於庫溫為13'C的工業冷藏庫保鮮的新鮮肉蓯蓉肉質莖，置於水洗槽中用冷水漂洗，冷水水溫為6'C，撈起後，置於工業破碎碾磨裝置中將肉蓯蓉肉質莖破碎碾磨，加入經預冷至水溫為4'C的 工業純淨水洗滌破碎細胞成為肉蓯蓉破碎細胞漿狀物，水的加入量為破碎細胞重量的100%;然後採用 ]::業離心機分離，獲取肉蓯蓉細胞漿液；並再將濾渣加入工業純淨水，水的加入量為濾渣重量的100 %,經通常工業破碎碾磨機進一步碾磨成漿狀物，再經工業離心機分離進一步獲取肉蓯蓉細胞漿液； 經檢測，破碎碾磨和分離工藝過程肉歡蓉破碎細胞漿狀物及細胞漿液溫度為18°C;
2、 將上述獲得的肉蓯蓉細胞槳液進行工業超高溫瞬時滅酶，溫度為138°C;將滅酶後的肉蓯蓉細 胞漿液作為催化反應底物，採用通常工業生產中的離子吸附法IR-120作為吸附劑的固定方式，獲得(3-葡萄糖苷酶固定化酶作為生物催化劑，經通常工業攪拌罐式反應器進行間斷式催化反應，催化水解去 掉底物松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛蕊花糖苷單體化合物；催化反應過 程溫度為60°C， pH為4.8，催化反應時間為4h,催化反應過程反應物中的(3-葡萄糖苷酶活力為500U/g; 經檢測，底物中松果菊苷轉化為毛蕊花糖苷單體化合物的轉化率達78%;
3、 將上述催化反應後的反應液採用相對分子質量為1500的超濾膜分離，再採用SP大孔樹脂吸附 分離提純，並經相對分子質量為300的納濾膜進行納濾，獲得較高純度的毛蕊花糖苷單體化合物提取 液；
4、 將上述提取液通過工業薄膜蒸發濃縮工藝，溫度為55°C，獲得固形物含量為42%的濃縮物； 進一步通過工業滾筒乾燥工藝，乾燥溫度為59'C，獲得毛蕊花糖苷單體化合物的乾燥物；經分析測定， 所收穫的乾燥物中(以乾物質計)，毛蕊花糖苷單體化合物純度百分比含量為50.2%。
1權利要求
1.一種利用新鮮肉蓯蓉原料經生物催化轉化生產毛蕊花糖苷單體化合物的方法，通過細胞破碎、漿液提取工藝及高溫滅酶或超高溫瞬時滅酶工藝處理，將滅酶後的肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，以β-葡萄糖苷酶工業酶製劑固定化酶作為生物催化劑，催化水解底物松果菊苷使葡萄糖基配體末端斷裂、定向轉化為高活性的毛蕊花糖苷單體化合物；再通過分離提純工藝，及濃縮、乾燥工藝，收穫毛蕊花糖苷單體化合物；催化反應過程溫度為38℃～60℃，pH為4.0～5.8，時間為4h～8h，催化反應過程反應物中的β-葡萄糖苷酶活力為2U/g～1000U/g。
2. 按照權利要求1所述的方法，其特徵是該方法的具體步驟包括(1) 挑選新鮮肉蓯蓉肉質莖，置於水洗槽中用冷水或工業純淨水漂洗；撈起後，置於通常工業破 碎碾磨裝置中將肉灰蓉肉質莖破碎碾磨，加入工業純淨水或經預冷的工業純淨水洗滌破碎細胞成為肉 蓯蓉破碎細胞漿狀物；然後採用通常工業壓濾機壓濾或工業離心機分離，獲取肉蓯蓉細胞漿液；將破 碎碾磨和分離工藝過程肉蓯蓉破碎細胞漿狀物控制在2(TC以下低溫環境；(2) 通過通常工業加熱裝置將步驟1得到的肉蓯蓉細胞漿液進行高溫滅酶或超高溫瞬時滅酶；將 滅酶後的肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，採用通常固定化酶工業生產中的吸附法固定方式，獲得 的(3-葡萄糖苷酶工業酶製劑固定化酶作為生物催化劑，經通常工業固定化酶反應器進行催化反應，催 化水解去掉底物松果菊苷葡萄糖基配體末端的一個葡萄糖基、定向轉化為毛藍花糖苷單體化合物；催 化反應過程溫度為38°C 60°C， pH為4.0 5.8，時間為4h 8h，催化反應過程反應物中的(3-葡萄糖 苷酶活力為2U/g 1000U/g;(3) 將經步驟2反應後的反應液，採用通常工業超濾膜分離，選擇性篩分及截留除去多糖、蛋白 質大分子雜質以及微粒和亞微粒雜質；再採用通常工業納濾膜分離，選擇性篩分及截留除去胺基酸、 D-甘露醇、甜菜鹼小分子雜質；獲得毛慈花糖苷單體化合物提取液；(4) 將步驟3獲得的毛蕊花糖苷單體化合物提取液，通過通常工業真空濃縮工藝或工業薄膜蒸發 濃縮工藝，獲得固形物含量為30% 50%的濃縮物；再通過工業噴霧乾燥工藝，或通常的其它工業幹 燥方法，獲得毛蕊花糖苷單體化合物的粉狀物或乾燥物。
3. 按照權利要求1或2所述的方法，其特徵是催化反應過程溫度為42'C 48'C; pH為4.5 5.3; 時間為為5h 6h，催化反應過程反應物中的p-葡萄糖苷酶活力為25U/g 150U/g。
4. 按照權利要求2所述的方法，其特徵是步驟(1)中再將濾渣經一次至數次加入工業純淨水或 經預冷的工業純淨水， 一次至數次經通常工業破碎碾磨機進一步碾磨成漿狀物，再經:工:業壓濾機壓濾 或工業離心機分離進一步獲取肉灰蓉細胞漿液。
5. 按照權利要求2所述的方法，其特徵是步驟(1)中所述的水洗槽中的冷水水溫為TC 2(TC。
6. 按照權利要求2或4所述的方法，其特徵是步驟(1)中所述的加入工業純淨水或經預冷的工 業純淨水的量每次為肉蓯蓉破碎細胞或濾渣重量的100% 400%，經預冷的工業純淨水水溫為1'C 2crc。
7. 按照權利要求1或2所述的方法，其特徵是所述的p-葡萄糖苷酶工業酶製劑，包括卩-葡萄糖苷 酶、纖維素酶、植物提取複合酶或/和植物水解複合酶。
8. 按照權利要求1或2所述的方法，其特徵是所述的高溫滅酶溫度為75'C 10(TC，時間為3min lOmin;超高溫瞬時滅酶溫度為135°C 141°C。
9. 按照權利要求2所述的方法，其特徵是步驟(2)中所述的超濾膜的相對分子質量為1000 4500， 納濾膜相對分子質量為200 300。
10. 按照權利要求2所述的方法，其特徵是步驟(3)中再採用通常工業大孔樹脂吸附分離工藝， 或/和採用通常工業層析柱分離純化工藝，或/和採用通常模擬移動床色譜分離系統工藝或通常多功能色 譜分離工藝進一步分離純化。
11. 按照權利要求2所述的方法，其特徵是步驟(4)中所述的工業真空濃縮工藝或工業薄膜蒸發 濃縮工藝的溫度為42。C 8(TC;工業噴霧乾燥工藝的乾燥塔進風溫度為125'C 285'C;其它工業乾燥 的方法的乾燥溫度為5(TC 10(TC。
全文摘要
本發明提出一種新鮮肉蓯蓉經生物催化轉化生產毛蕊花糖苷的方法。本發明方法利用新鮮肉蓯蓉為原料，通過細胞破碎、漿液提取等系統工藝及高溫滅酶工藝處理，將滅酶後的肉蓯蓉細胞漿液作為催化反應底物，通過β-葡萄糖苷酶工業酶製劑固定化酶作為生物催化劑，進行間斷式或連續式催化反應，催化水解底物中的松果菊苷使其葡萄糖基配體末端斷裂、定向轉化為高活性的毛蕊花糖苷單體化合物，再通過分離提純工藝及濃縮、乾燥工藝，收穫毛蕊花糖苷單體化合；通過調整分離提純工藝條件，收穫的毛蕊花糖苷單體化合物純度百分比含量可達50％～90％。毛蕊花糖苷單體化合物具有小分子和低極性的特徵，在藥物吸收中展示良好的吸收率和特殊的藥理活性。
文檔編號C12P19/00GK101629201SQ200910041649
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月4日 優先權日2009年8月4日
發明者昕 劉, 劉小卓, 勵 古, 青 季, 招淑燕, 卉 曹, 熊文婷, 田曉玲 申請人:中山大學;新疆學者醫藥有限公司;廣州綠色盈康生物工程有限公司