B因子、補體旁路的抑制及與此相關的方法

2023-08-08 19:50:36

專利名稱：B因子、補體旁路的抑制及與此相關的方法
技術領域：
本發明一般涉及補體旁路的新型抑制劑，特別涉及新型抗B因子抗體。本發明一般還涉及該抑制劑降低或預防氣道高反應性和氣道炎症、由此治療該病症起作用的疾病的用途。
背景技術：
補體激活主要通過三種途徑所謂的經典途徑、凝集素途徑和旁路途徑。參與旁路途徑激活的關鍵蛋白是B因子(fB)和D因子(fD)。這些蛋白共同起作用，以啟動和/或放大C3的激活，這然後引起許多炎性事件的啟動。第三種蛋白備解素可穩定C3和B因子的複合物，但是它不是旁路途徑起作用所必需的。B因子還有助於溶解免疫複合物，並被報導起B細胞生長因子的作用並能激活單核細胞(Takahashi，1980；Hall，1982；Peters，1988)。已培育出B因子缺失的小鼠(fB-/-小鼠)，並且在這些小鼠中，針對依賴T細胞的抗原的IgG1抗體應答和對內毒素休克的敏感性似乎是正常的(Matsumoto，1997)。
補體旁路通常由細菌、寄生蟲、病毒或真菌所啟動，但也有報導說IgA Ab和某些Ig L鏈可激活該途徑。當循環B因子與激活的C3(C3b或C3H2O)相結合時，旁路途徑激活被啟動。然後該複合物被循環D因子剪切產生具有酶學活性的片段C3Bb。C3Bb剪切C3形成C3b，這驅動炎症，同時還進一步放大激活過程，形成正反饋環。需要兩種組分(B因子和D因子)才能激活旁路途徑。
最近的研究表明補體旁路在幾種動物疾病模型的發病機理中起著重要的作用。I/R後腎臟內的補體激活基本僅受旁路途徑的介導(Thurman)，同時旁路途徑在關節炎的進展中起著關鍵作用。尤其令人吃驚的是，已表明缺失旁路途徑的小鼠在狼瘡腎炎MRL/Ipr模型中不會患腎炎(Watanabe)，並且不會引起抗磷脂介導的胎兒丟失(Girardi)，該模式通常被認為受到經典補體途徑介導。
已開發出幾種在不同激活期抑制補體系統的抑制劑(Holers)，但是在本發明前旁路途徑的特定抑制劑尚未廣泛報導。2001年7月4日公開的PCT公布文本WO 01/47963描述了來自外寄生水蛭的多肽，它在體外抑制補體激活的旁路途徑，並且它對通過經典途徑的補體激活基本沒有影響。已表明這些肽結合D因子，但是，未說明這些多肽在體內應用。能在體內特異性抑制旁路途徑的試劑與現有的補體聯級反應的抑制劑相比在理論上具有幾方面優點。首先，就基本由旁路途徑介導的模型而言，如腎I/R和抗磷脂介導的胎兒丟失，這種抑制劑應該與廣譜補體抑制劑一樣有效，還應該具有較少的免疫抑制副作用。儘管報導只有一例先天性B因子缺失的人類患者(Densen)，對基因打靶的B因子缺失小鼠(fB-/-)的研究尚未發現該因子具有免疫調節作用(Densen；Matsumoto)。相反，先天缺失經典途徑組分的患者似乎具有更大的感染風險(最常見的是葡萄球菌和鏈球菌)。抑制經典途徑組分或C3(所有補體途徑所共有的)可能還與自身免疫有關(Figueroa)，這可能解釋了為什麼B因子缺失使得MRL/Ipr小鼠不會患腎小球腎炎，而缺失C3卻相反(Watanabe)。因此，旁路途徑的抑制可能具有更好的耐受性，並且在某些情況下它較經典途徑的補體抑制更為有效。
過敏性哮喘是一種常見的氣道炎症和氣道高反應性(AHR)相關症候群(Busse)。患過敏性哮喘的患者暴露於吸入的過敏原後導致AHR和氣道炎症增強，研究表明來自補體C3、C4和C5蛋白家族的具有生物活性的片段水平提高，特別是在支氣管肺泡灌洗(BAL)液中的C3a(Humbles)和C5a(Krug)的水平提高。這表明這些患者在暴露於過敏原後通過過敏原誘導機制的補體途徑的激活出現在肺部。動物模型進一步提供了補體在過敏性氣道疾病進展中的作用。C3或C3a受體缺失的動物似乎不會出現由過敏原誘導的氣道疾病(Humbles，Drouin；Bautsch；Walters)。
推測在暴露於過敏原後誘導補體激活有幾種可能性。例如，過敏原-IgG免疫複合物可激發經典途徑的激活，並且某些抗原可通過旁路途徑直接激活C3(Kohl)。另外，肥大細胞或肺巨噬細胞釋放的中性類胰蛋白酶可直接剪切(蛋白水解)C3或C5(Schwartz；Mulligan)。補體激活的三種途徑(經典途徑、旁路途徑和凝集素途徑)會合於中心補體組分C3。因此，C3激活的抑制可防止其被剪切形成活性C3片段，還大大減少了C5的下遊激活以及來源於C5的活性片段的釋放(Sahu)。最近的研究表明在被敏化動物暴露於過敏原時通過使用C3轉變酶抑制劑抑制補體激活(由此抑制全部三種激活途徑)，減弱了晚期氣道反應(Abe)並減慢了AHR和氣道炎症的進展(Taube)。2004年3月18日公布的PCT公布文本WO 2004/022096描述了補體旁路的抑制，優選通過所有途徑共有的C5-C9的末端補體組分，最優選通過C5a的抑制。
目前，治療涉及AHR的炎症疾病(如中度到重度哮喘以及慢性阻塞性肺部疾病)的治療方法主要包括糖皮質激素和其它消炎藥的使用。但是，這些藥劑可能具有嚴重的副作用，包括但不限於提高了對感染的易感性、肝臟毒性、藥物引起的肺部疾病以及骨髓抑制。因此，這些藥劑在治療氣道高反應性相關肺部疾病的臨床使用上具有局限性。消炎藥和症狀緩解藥劑的使用是個嚴重的問題，這是由於它們的副作用，或者它們不能侵襲炎性反應的根本原因。一直都需要治療炎症的毒性更小並且更為有效的藥劑。因此，需要使用具有較少的副作用、毒性小並且對過敏性氣道疾病如哮喘和AHR病症的根本原因更特異的試劑的方法。

發明內容
本發明的一個實施方案涉及分離抗體或其抗原結合片段，它選擇性結合B因子的第三短同源重複序列(short consensus repeat，SCR)結構域，其中所述抗體阻止了C3bBb複合物的形成。一方面，抗體或其抗原結合片段結合B因子，並防止或抑制D因子剪切B因子。另一方面，抗體或抗原結合片段結合人B因子的第三短同源重複序列(SCR)結構域。另一方面，抗體或抗原結合片段結合選自下列B因子的第三SCR結構域的表位(a)包括至少一部分人B因子(SEQ IDNO2)的B因子的表位，包括從約Tyr139位到約Ser185位，或其在非人類B因子序列中的等效位置；(b)包括至少一部分人B因子(SEQ ID NO2)的B因子的表位，包括從約Try139位到約Ser141位，或其在非人類B因子序列中的等效位置；(c)包括至少一部分人B因子(SEQ ID NO2)的B因子的表位，包括從約Glu182位到約Ser185位，或其在非人類B因子序列的等效位置；或者(d)包括至少一部分人B因子(SEQ ID NO2)的B因子的表位，包括任何一個或多個下列位置或其在非人類B因子序列中的等效位置Tyr139，Cys140，Ser141，Glu182，Gly184或Ser185。另一方面，抗體或其抗原結合片段選擇性結合B因子(SEQ ID NO2)的第三SCR結構域的表位，該表位包括一個或多個下列胺基酸位置或其在非人類B因子序列中的等效位置Ala137，Tyr139，Ser141，Glu182，Ser185，Thr189，Glu190和Ser192。另一方面，抗體或其抗原結合片段選擇性結合B因子(SEQ ID NO2)的第三SCR結構域的表位，該表位包括下列胺基酸位置或其在非人類B因子序列的等效位置Ala137，Tyr139，Ser141，Glu182，Ser185，Thr189，Glu190和Ser192。另一方面，抗體或其抗原結合片段選擇性結合B因子(SEQ ID NO2)的第三SCR結構域的表位，該表位由下列胺基酸位置或其在非人類B因子序列的等效位置組成Ala137，Tyr139，Ser141，Glu182，Ser185，Thr189，Glu190和Ser192。該抗體或抗原結合片段可結合B因子的第三SCR結構域的一部分的三維結構中的非線性表位，其中該部分被定義為至少為SEQ ID NO2的胺基酸位置Ala137-Ser192，或其在非人類B因子序列中的等效位置。另一方面，抗體或其抗原結合片段選擇性結合多種哺乳動物物種(如人類和選自除人類外的靈長類、小鼠、大鼠、豬、馬和兔的動物)的B因子。抗體或抗原結合片段可為非補體激活同種型或亞類，可為單克隆抗體、人源化抗體、雙特異性抗體或單價抗體。抗原結合片段可包括Fab片段。在一個優選的實施方案中，抗體為單克隆抗體1379(由ATCC生產，保藏號PTA-6230)。
本發明的另一個實施方案涉及選擇性結合多種哺乳動物物種的B因子的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體阻止了C3bBb複合物的形成。一方面，抗體或其抗原結合片段選擇性結合人和選自除人外的靈長類、小鼠、大鼠、豬、馬和兔的動物的B因子。一方面，抗體為非補體激活同種型或亞類。另一方面，抗體為單克隆抗體。另一方面，抗原結合片段為Fab片段。
本發明的另一實施方案涉及抗原結合多肽，它選擇性結合B因子的第三短同源重複序列(SCR)結構域，其中所述抗原結合多肽阻止了C3bBb複合物的形成，或者涉及選擇性結合多種哺乳動物物種的B因子的抗原結合多肽，其中該抗原結合多肽阻止了C3bBb複合物的形成。
本發明的另一實施方案涉及選擇性結合B因子的分離抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其片段競爭性抑制單克隆抗體1379(由ATCC生產，保藏號PTA-6230)對人B因子的特異性結合，並且其中，當抗體或其抗原結合片段結合人B因子時，單克隆抗體1379抑制補體旁路的能力被抑制。一方面，抗體或其抗原結合片段競爭性抑制單克隆抗體1379結合人B因子，此時通過抗體-抗體競爭性分析在人B因子存在時檢測比較結合特異性。
本發明的另一實施方案涉及選擇性結合人B因子的分離抗體或其片段，其中所述分離抗體或其片段競爭性抑制二抗或其抗原結合片段特異性結合人B因子，並且其中所述二抗或其抗原結合片段結合人B因子的第三SCR結構域。
本發明還包括包含任何上述抗體、抗原結合片段或抗原結合多肽的組合物。
本發明的另一實施方案涉及降低或預防動物的氣道高反應性(AHR)或氣道炎症的方法。該方法包括下述步驟將上述抗體或其抗原結合片段給予患有炎症相關氣道高反應性或氣道炎症或有患該病風險的動物。一方面，通過下述途徑給予抗體或抗原結合片段口服、鼻部、局部、吸入、氣管內、經皮、直腸或非腸道途徑。另一方面，將抗體或抗原結合片段以有效顯著降低動物的氣道高反應性的量(與給予抗體或抗原結合片段前相比)給予動物。另一方面，將抗體或抗原結合片段以有效顯著降低動物的氣道高反應性的量(與許多有炎症的動物的氣道高反應性的水平相比，其中沒有給予所述抗體或抗原結合片段)給予動物。一方面，抗體或抗原結合片段的給予降低了動物對乙醯甲基膽鹼或組胺的反應性。另一方面，抗體或抗原結合片段與可藥用的選自下列的載體一起給予可分散乾粉、無水乙醇、小膠囊、脂質體、霧化噴霧劑和可注射賦形劑。另一方面，抗體或抗原結合片段可在選自下列的載體或裝置中給予無水乙醇、乾粉吸入系統、超聲吸入系統、壓力計量吸入器和計量溶液裝置。另一方面，抗體或抗原結合片段與選自下列的試劑一起給予所述哺乳動物皮質類固醇、β-激動劑(長效或短效)、白三烯調節物、抗組胺、磷酸二酯酶抑制劑、色甘酸鈉、奈多羅米(Nedocromil)、茶鹼、細胞因子拮抗劑、細胞因子受體拮抗劑、抗IgE和T細胞功能的抑制劑。另一方面，氣道高反應性或氣道炎症與選自下列的疾病相關哮喘、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、過敏性支氣管肺曲菌病、過敏性肺炎、嗜酸粒細胞性肺炎、肺氣腫、支氣管炎、過敏性支氣管炎、支氣管擴張、囊性纖維化病、結核病、過敏性肺炎、職業性哮喘、結節病、反應性氣道病症候群、間質性肺病、嗜酸細胞增多症候群、鼻炎、鼻竇炎、運動誘發哮喘、汙染誘發哮喘(pollution-induced asthma)、咳嗽變異性哮喘、肺寄生蟲病、呼吸道合胞體病毒(RSV)感染、副流感病毒(PIV)感染、鼻病毒(RV)感染和腺病毒感染。一方面，氣道高反應性與過敏性炎症相關。在一個優選的實施方案中，本發明的方法可在哺乳動物中實施，更優選在人中實施。


圖1為示出構建B因子-Ig融合蛋白的示意圖。
圖2A為示出3μg抗B因子加入含10μl血清的反應體系時，在酵母聚糖分析中抗B因子完全抑制補體旁路的線圖。
圖2B為示出6μg抗B因子抗體加入10μl人血清時，在兔紅細胞裂解分析中該抗B因子完全抑制了補體旁路的線圖。
圖3為示出將抗B因子給予小鼠抑制補體旁路的線圖。
圖4A為氣道阻力(RL)的線圖，該圖示出過敏原敏化和攻擊的fB+/+小鼠與僅被攻擊的fB+/+小鼠相比其對乙醯甲基膽鹼的反應性增強，但是fB-/-小鼠對乙醯甲基膽鹼的反應性顯著降低。
圖4B為動態順應性(Cdyn)的線圖，該圖示出過敏原敏化和攻擊的fB+/+小鼠與僅被攻擊的fB+/+小鼠相比其對乙醯甲基膽鹼的反應性增強，但是fB-/-小鼠對乙醯甲基膽鹼的反應性顯著降低。
圖5為表徵氣道敏化和攻擊後的fB-/-小鼠的BAL液和肺部組織的柱狀圖。
圖6A為氣道阻力(RL)的線圖，該圖示出豚草敏化和攻擊的fB-/-小鼠對乙醯甲基膽鹼的反應性降低，但是fB+/+小鼠對乙醯甲基膽鹼的反應性較強。
圖6B為動態順應性(Cdyn)的線圖，該圖示出豚草敏化和攻擊的fB-/-小鼠對乙醯甲基膽鹼的反應性降低，但是fB+/+小鼠對乙醯甲基膽鹼的反應性較強。
圖6C為表徵BAL液和肺部組織的柱狀圖，該圖示出豚草敏化和攻擊的fB-/-小鼠的BAL液中的氣道炎症與fB+/+小鼠相比有所降低。
圖7A為線圖，該圖示出在每次攻擊前用B因子處理的被敏化和攻擊的fB-/-小鼠對乙醯甲基膽鹼的反應性降低，這與用PBS處理的被敏化和攻擊的fB-/-小鼠相似，但是與被敏化和攻擊的fB+/+小鼠相比顯著降低。
圖7B為示出B因子的給予在fB-/-小鼠中重構出現AHR和氣道炎症的能力的柱狀圖。
圖8A為氣道阻力(RL)的線圖，該圖示出全身和噴霧給予B因子中和抗體抑制了被敏化和攻擊的小鼠中AHR的進展。
圖8B為動態順應性(Cdyn)的線圖，該圖示出全身和噴霧給予B因子中和抗體抑制了被敏化和攻擊的小鼠中AHR的進展。
圖8C為表徵BAL液和肺部組織的柱狀圖，該圖示出用抗B因子全身或噴霧處理降低了BAL液中的嗜酸性粒細胞的數量，支氣管周炎症、支氣管周嗜酸性粒細胞的數量以及氣道上皮中的粘液陽性細胞的數量。
圖9為線圖，該圖示出被敏化和攻擊的C4-/-小鼠(實心菱形，n＝10)對吸入的MCh表現出與被敏化和攻擊的C4+/+小鼠(實心方塊，n＝10)相似的反應性，並且與僅被攻擊的C4-/-小鼠(空心菱形，n＝10)和僅被攻擊的C4+/+小鼠(空心方塊，n＝10)相比反應性顯著增強(*與被敏化和攻擊的fB-/-小鼠、被攻擊的fB+/+小鼠和被攻擊的fB-/-小鼠相比，p＜0.05；#與被攻擊的fB+/+小鼠和被攻擊的fB-/-小鼠相比，p＜0.05； 與被攻擊的C4+/+小鼠和被攻擊的C4-/-小鼠相比，p＜0.05)。
圖10為線圖，該圖示出被敏化和攻擊的C4-/-小鼠(實心框，n＝8)與僅被攻擊的C4-/-小鼠(空心框，n＝8)相比其對吸入的MCh的氣道阻力增強，該圖還示出用抗B因子單克隆抗體全身處理被敏化和攻擊的C4-/-小鼠降低了其對MCh的氣道反應性(實心圓圈，n＝8)。
圖11為示意圖，該圖示出在人B因子表面上的mAb1379的表位圖模型。
圖12為示意圖，該圖示出mAB1379(一個Fab片段)結合B因子的模型化複合物，並且Fab的抗原結合端被做為覆蓋全部繪出的表位區域的模型。
圖13為柱狀圖，該圖示出用1379預處理的小鼠與野生型對照相比在再灌注24小時後血清尿素氮升高的水平較低。
具體實施例方式
本發明的一個實施方案涉及提供選擇性阻斷補體旁路的新型B因子抗體，並涉及該抗體抑制在需要該抑制、該抑制是有用的或被期待有用的任何病症或疾病中的補體旁路的用途。具體而言，考慮到特異性針對補體旁路的抑制劑在用於治療多種疾病的方法中的較好的潛在的治療效果，本發明人開發了幾種針對B因子的新型抑制型單克隆抗體。已經鑑定了幾種抗體，並且其中一種抗體已被非常詳細地鑑定。該抗體在廣泛接受的過敏性炎症和哮喘模型以及在腎臟缺血-再灌注損傷模型(通常應用到缺血-再灌注損傷)中在體外和體內進行了檢驗。為生產該抗體，用融合蛋白注射基因打靶的B因子缺失小鼠(fB-/-)，該融合蛋白由與免疫球蛋白相連的B因子的第二和第三短同源重複序列(SCR)結構域組成。就對B因子的免疫應答篩選小鼠，並將來自其中一隻注射小鼠的脾細胞融合到骨髓瘤細胞。所得到的其中一種雜交瘤細胞-稱為1379-生產在體外和體內抑制補體旁路激活的IgG1抗體，儘管本發明人已生產和鑑定了具有抑制補體旁路能力的多種單克隆抗體(參見表4)。1379抗體(在本文中也被稱為mAb1379)抑制來自多種動物物種的血清中的旁路途徑激活，這些動物包括小鼠、大鼠、人、狒狒、獼猴、短尾猴(cyno monkey)、豬、兔和馬。來自該抗體的Fab片段也可完全抑制旁路途徑。發明人還表明該抗體可完全抑制人血清對紅細胞的裂解，由此確定該試劑完全阻斷補體旁路激活的能力。表位圖用於說明該抗體結合B因子的第三短同源重複序列(SCR)結構域，並且該抗體阻止了C3bBb複合物的形成。關於由該抗體識別的表位的詳細描述參見下文。因此，本發明的一個實施方案涉及補體旁路的選擇性抑制劑，特別涉及那些新型B因子抗體，它們具有較寬的物種反應性，證明了在體外和體內的有效性，並且是用於多種病症和疾病中任一種中高度有效的治療工具，這些疾病中對補體旁路的選擇性抑制是有用的、必要的和/或優選的(如與氣道高反應性和氣道炎症相關的病症(參見下文)、缺血-再灌注損傷等等)。這些抗體還可被人源化或進行其他加工以降低來自免疫系統的潛在副作用，由此成為一種有價值的新型治療藥劑。
本發明的發明人所生產的抗體識別幾種哺乳動物(包括人)所共有的B因子上的位點，在這幾種哺乳動物中進行了臨床前的原理驗證實驗，因此使得在人類疾病模型中的發現易於轉變成為人類治療。在本發明之前，發明人並不知曉針對B因子的任何其它如本發明的抗體那樣表現出對該蛋白具有較寬物種抑制性的抗體。因此，本發明還鑑定了B因子上獨特的位點，針對該位點可開發新型抑制劑。補體旁路中作為特定治療靶物質的B因子和其它蛋白的鑑定提供了合理的治療方法以及可治療氣道的炎性疾病和其它疾病的主要化合物。選擇性阻斷旁路途徑具有一些優點。例如，C4-/-小鼠(缺少經典途徑、旁路途徑和凝集素補體途徑所共有的C4補體組分)而不是fB-/-(B因子缺失)小鼠似乎對實驗細菌感染更為敏感，這表明通過不破壞經典途徑，旁路途徑的抑制劑對嚴重感染具有較低風險。經典途徑的阻斷還可引起自身免疫，並且先天性經典途徑組分缺失的病人被感染和發生自身免疫的風險增加。選擇性抑制旁路途徑使得不能形成結合C3a受體和結合補體受體1-4和C5a的來源於C3的配體。由於在激活過程中形成的B因子的Ba或Bb激活產物的受體表徵不明確，阻斷旁路途徑的影響事實上可能更直接。
本發明的另一實施方案涉及本發明人的不尋常的發現，該發現表明通過旁路途徑激活補體聯級反應在氣道高反應性和氣道炎症的進展中是至關重要的，並且實際上是必要和充分的。更具體而言，本發明人在本文中公開了旁路途徑而非經典補體途徑的抑制預防氣道高反應性並降低氣道炎症的發現。發明人使用B因子缺失的小鼠(即通過基因敲除技術)並通過使用單克隆抗體抑制B因子(通過全身或氣霧劑送遞)來證實該發現。因此，發明人在本文中公開了通過該手段或其它手段(如通過缺失或抑制D因子或備解素)選擇性抑制補體旁路，以抑制氣道高反應性和氣道炎症。本發明人表明B因子是誘導實驗性哮喘所必需的。重要的是，B因子在該模型的攻擊期(或效應期)是不可或缺的，並且將選擇性結合B因子的單克隆抗體吸入肺或通過全身給予阻斷了與過敏性炎性疾病相關的氣道高反應性(AHR)和氣道炎症的進展，如在實驗哮喘模型中所示例。另外，本發明人發現該抑制作用通過抑制補體旁路特別獲得，這是由於其它結果表明在該模型系統中，C4基因敲除(C4-/-)小鼠會患AHR，而B因子基因敲除(fB-/-)小鼠不會患AHR。因此，本發明人發現抑制補體旁路(通過任何手段)是抑制AHR和氣道炎症以及由此治療或預防與此相關的病症和疾病所必要和充分的。另外，發明人表明抑制經典補體途徑不是抑制AHR或氣道炎症所必需的，因此，如上所述，遵循本發明的教導，可避免與抑制經典補體途徑相關的不受歡迎的結果。
B因子抗體因此，本發明的第一個實施方案涉及選擇性抑制補體旁路的抗體或其抗原結合片段，特別涉及B因子抗體。同樣，具有相同特異性的抗原結合多肽也特別優選用於本發明。一方面，抗體以補體旁路的蛋白被抑制或阻止與另一種蛋白結合的方式(通常情況即天然或生理條件下這兩種蛋白相互作用)選擇性結合該補體旁路的蛋白。另一方面，抗體以蛋白被抑制或阻止激活另一種蛋白的方式(通常情況下兩者相互作用)選擇性結合該蛋白，即使該蛋白可能至少部分結合其它蛋白。用於選擇性抑制補體旁路的特別優選的抗體及其抗原結合片段包括本文所描述的B因子抗體，特別是本文所詳細描述的mAb1379抗體。
本文詳細描述和舉例說明了根據本發明選擇性結合B因子和抑制補體旁路的抗體(及其抗原結合片段)。在一個實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合在動物物種中(特別是哺乳動物物種中)保守的該蛋白(如B因子)的保守結合表面或表位(即該抗體與兩種或多種不同哺乳動物物種的蛋白發生交叉反應)。具體而言，本發明包括結合來自至少兩種、優選幾種不同哺乳動物物種的B因子的抗體，這些哺乳動物包括但不限於人、除人外的靈長類、小鼠、大鼠、豬、馬和兔。優選地，本發明包括結合B因子的抗體，該B因子來自人和至少另一種動物物種，優選至少另一種哺乳動物物種，包括但不限於除人外的靈長類、小鼠、大鼠、豬、馬和兔。在一個實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合B因子的第三同源重複序列(SCR)。在一個實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合阻止D因子剪切B因子的B因子的區域。在一個實施方案中，抗體為單克隆抗體。在一個實施方案中，抗體為本文所稱的1379的抗體(即由相同編號的雜交瘤細胞系生產的抗體，ATCC保藏號PTA-6230)或其抗原結合片段。
本文所述雜交瘤細胞1379(或mAb1379)於2004年9月21日保藏於美國典型培養物保藏中心(ATCC，位於10801University Blvd，Manassas，VA 20110-2209)，該保藏中心符合國際承認的用於專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約的條款，並且該雜交瘤細胞已獲得ATCC保藏號PTA-6230。
根據本發明，蛋白、蛋白的一部分(如片段、一部分、結構域等)或蛋白的區域或表位的最小尺寸其大小足以起到作為抗體形成的表位或保守結合表面或作為體外分析的靶物質。在一個實施方案中，本發明的蛋白至少長約4、5、6、7或8個胺基酸(如在分析中適合作為抗體表位或作為可檢測肽)或至少長約25個胺基酸、或至少長約50個胺基酸、或至少長約100個胺基酸、或至少長約150個胺基酸等任何介於4個胺基酸到最高達蛋白或其部分的全長或更長之間的全部整數的長度(如8、9、10、......25、26......500、501......)。
本領域熟知編碼人B因子和其它補體蛋白的基因和編碼區的核苷酸序列以及這些蛋白的胺基酸序列。例如，編碼人B因子和其它補體蛋白的基因在NCBI資料庫中的編號為No.NG_000013。B因子的編碼序列在NCBI資料庫中的編號為No.NM_001710，B因子前蛋白原的胺基酸序列在NCBI資料庫中的編號為No.NP_001701或P00751。NCBI資料庫編號為No.P00751的胺基酸序列是人前蛋白原B因子序列，在本文中表示為SEQ ID NO1。本領域還熟知來自其它動物物種的序列。通過比較，在小鼠B因子序列中(例如參見NCBI資料庫編號No.P04186，在本文中表示為SEQ ID NO6)，第三SCR結構域位於該761胺基酸前蛋白的160-217位，並且成熟的鼠類B因子蛋白跨越SEQ ID NO6的23-761位。
表示為SEQ ID NO1的人B因子前蛋白為具有跨越胺基酸1-25位的信號肽的764個胺基酸的蛋白。B因子的成熟鏈對應SEQ ID NO1的26-764位，在本文中表示為SEQ ID NO2。人B因子的三個SCR區域在本文中表示為SEQ ID NO3(SCR1，也為Sushi 1，跨越SEQID NO1的從約35位到約100位，或跨越SEQ ID NO2的從約5位到約75位)、SEQ ID NO4(SCR2，也為Sushi 2，跨越SEQ IDNO1的從約101位到約160位，或跨越SEQ ID NO2的從約76位到約135位)以及SEQ ID NO5(SCR3，也為Sushi 3，跨越SEQID NO1的從約163位到約220位，或跨越SEQ ID NO2的從約138位到約195位)。
基於使用Hourcade所描述的片段(參見Hourcade，1995，J.Biol.Chem.)對本發明的示例性抗體進行的表位作圖(參見實施例)，在一個優選的實施方案中，本發明的抗B因子抗體優選結合在部分第三SCR結構域中的或含有部分第三SCR結構域的表位或保守結合表面，更優選結合包括至少一部分包含成熟B因子蛋白(SEQ ID NO2)從約Try139位到約Ser185位的序列的人B因子的表位，結合包括至少一部分包含成熟B因子蛋白(SEQ ID NO2)從約Try139位到約Ser141位的序列的人B因子的表位，結合包括至少一部分包含成熟B因子蛋白(SEQ ID NO2)從約Glu182位到約Ser185位的序列的人B因子的表位，結合包括至少一部分包含任何一個或多個下列位置或非人類B因子序列的等效位置的人B因子(SEQ ID NO2)的B因子的表位Try139，Cys140，Ser141，Glu182，Gly184或Ser185，或結合包括至少一部分除人外的動物物種的等效位置的B因子的表位。本領域的技術人員能容易地將人B因子的序列與來自其它動物物種的B因子的序列進行比對，檢測SCR區的位置以及對應上述胺基酸位置的第三SCR區的特定部分。例如，使用Tatusova和Madden描述的BLAST2序列(Tatusova and Madden，(1999)，「Blast 2 sequences-a newtool for comparing protein and nucleotide sequences」，FEMS Microbiollett.174247-250，通過援引全文納入本文中)將兩個特定序列彼此進行比對。
以本發明的示例性抗體的另一個表位模型以及圖譜為基礎，在另一優選的實施方案中，本發明的抗B因子抗體優選結合B因子的部分第三SCR結構域中的或含有B因子的部分第三SCR結構域的表位(保守結合表面)，該部分包括SEQ ID NO2的至少一個或多個下列胺基酸位置或者其在非人類B因子序列中的等效位置A137，Y139，S141，E182，S185，T189，E190和S192。本發明的一方面，表位位於B因子的部分第三SCR結構域中或含有B因子的部分第三SCR結構域，該部分包括全部或基本全部(至少五個、六個或七個)SEQ IDNO2的下列胺基酸位置或者其在非人類B因子序列中的等效位置Ala137，Tyr139，Ser141，Glu182，Ser185，Thr189、Glu190和Ser192。另一方面，本發明的抗B因子抗體識別的表位位於B因子的部分第三SCR結構域中或含有B因子的部分第三SCR結構域，該部分由SEQ IDNO2的下列胺基酸位置或其在非人類B因子序列中的等效位置組成Ala137，Tyr139，Ser141，Glu182，Ser185，Thr189，Glu190和Ser192。
在一個實施方案中，本發明的B因子抗體識別的表位還可更為具體地定義為位於B因子的第三SCR結構域的一部分的三維結構中的非線性表位。包含表位的部分為SEQ ID NO2的幾乎全部(如至少約90％)的胺基酸位置Ala137-Ser192或者非人類B因子序列的等效位置所確定的B因子三維結構，前提是該序列在構象上被排列成天然全長B因子序列出現的構象。B因子的三維結構的模型闡明了mAb1379的表位，例如可參見圖11和12。本文所使用的蛋白的「三維結構」或「三級結構」指蛋白組分在三維中的排列。該術語為本領域的技術人員所熟知。本文所使用的術語「模型」指蛋白、多肽或肽的三維結構的在有形介質中的代表。例如，模型可為三維結構在電子文件中、計算機屏幕上、紙件(即在二維介質)上的表示和/或表示為球棍圖。
根據本發明，給定蛋白或肽或其它分子的「表位」一般被定義為與抗體有關的大分子的一部分或其上的位點，抗體或其抗原結合片段將結合該部分或位點，並且針對該部分或位點可產生抗體。術語表位可與給定蛋白或抗原的術語「抗原決定簇」 「抗體結合位點」或「保守結合表面」互換使用。更具體而言，表位可被定義為參與抗體結合的胺基酸殘基，還可被定義為三維空間的構象(如構象表位或保守結合表面)。表位可包含於小至約4-6個胺基酸殘基的肽中，或可包含於蛋白的較大片段中，並且在指表位的三維結構、特別是指抗體結合表位時，表位無需由連續胺基酸殘基構成。抗體結合表位通常為構象表位，而不是順序表位(即線性表位)，換句話說，即抗體與之結合的、蛋白或多肽表面上三維排列的胺基酸殘基所確定的表位。如上所述，構象表位不由胺基酸殘基的連續序列構成，但是取而代之的是，該殘基可能在一級蛋白序列中被廣泛分隔，通過蛋白摺疊形成三維天然構象，該殘基一起形成結合表面。mAb1379所識別的表位為構象表位，而非線性表位。
使用已知方法，本領域的技術人員可鑑定和/或組裝構象表位和/或順序表位，這些方法包括突變分析(如定向誘變)、預防蛋白水解性降解法(蛋白足印法)、使用如合成肽和肽掃描、BIACORE或ELISA的模擬表位分析、抗體競爭圖譜、組合肽文庫篩選、基質輔助雷射解析-電離飛行時間(MALDI-TOF)質譜術或三維模型(如使用任何適合的軟體程序，包括但不限於MOLSCRIPT 2.0(Avatar Software AB，Heleneborgsgatan 21C，SE-11731 Stockholm，Sweden)、圖形顯示程序O(Jones et.al.，Acta Crystallography，vol.A47，p.110，1991)、圖形顯示程序GRASP或圖形顯示程序INSIGHT)。例如，可使用分子置換或其它技術以及相關蛋白已知的三維結構以模擬B因子的三維結構，並可推測結合該結構的抗體的構象表位。事實上，可使用這些技術中的一種或這些技術的組合，以確定抗體結合表位。圖11和12闡明了結合模擬表位分析和突變分析的信息，使用三維模型鑑定本發明的B因子抗體的表位。
本文中所使用的術語「選擇性結合」指一種蛋白與另一種蛋白(如抗體、抗體片段或結合抗原的結合配偶體)的特異性結合，其中通過任何標準方法(如免疫分析)測得的結合水平在統計學上顯著高於分析的本底對照。例如，在進行免疫分析時，對照一般包括僅含有抗體或抗原結合片段(即無抗原)的反應孔/管，其中在無抗原時抗體或其抗原結合片段的反應(如非特異結合到孔內)的量被認為是本底。可通過本領域的各種標準方法檢測結合，這些方法包括但不限於蛋白質印跡、免疫印跡、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、免疫沉澱、表面等離子共振技術、化學發光法、螢光偏振法、磷光法、免疫組織化學分析、基質輔助雷射解析-電離飛行時間(MALDI-TOF)質譜術、顯微細胞術、微陣列、顯微術、螢光激活的細胞分選(FACS)法和流式細胞術。
本發明的一個實施方案包括抗體或其抗原結合片段，它為B因子結合抗B因子抗體(如單克隆抗體1379)的競爭性抑制劑。根據本發明，B因子結合本發明的抗B因子抗體的競爭性抑制劑為在與本發明的已知抗B因子抗體(如mAb1379)的相同表位或相似表位結合B因子的抑制劑(如另一種抗體或抗原結合片段或多肽)，因此已知抗B因子抗體與B因子的結合被抑制。競爭性抑制劑可以與抗B因子抗體相比更大的親和力結合靶物質(如B因子)。可以本文所描述的與抗B因子抗體1379相似的方式(如抑制補體旁路、抑制動物的氣道高反應性、抑制動物的氣道炎症、抑制動物的再灌注缺血損傷等等)使用競爭性抑制劑。例如，本發明的一個實施方案涉及特異性結合B因子的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段競爭性抑制mAb1379特異性結合B因子，並且其中當該抗體或其片段結合B因子時，補體旁路被抑制，或者，mAb1379抑制補體旁路的能力被抑制。另一實施方案涉及特異性結合B因子的分離抗體或其片段，其中該分離抗體或其片段競爭性抑制二抗或其片段特異性結合B因子，並且其中該二抗或其片段結合B因子的第三SCR結構域。
可使用本領域的標準方法(如競爭性ELISA或其它結合分析)進行競爭性分析。例如，通過抑制B因子與已知的標記的抗B因子抗體(如mAb1379)的結合的能力可檢測競爭性抑制劑並對其進行定量。人B因子存在時的抗體-抗體競爭性分析在例如實施例3中描述。實施例3和表4中描述了B因子結合抗B因子1379的競爭性抑制劑。
根據本發明，抗體的特徵在於它們包含免疫球蛋白結構域，因此它們是蛋白的免疫球蛋白蛋白大家族的成員。一般而言，抗體分子包括兩種類型的鏈。其中一種鏈指重鏈或H鏈，另一種鏈指輕鏈或L鏈。兩種鏈以等摩爾比存在，並且每個抗體分子一般具有兩條H鏈和兩條L鏈。兩條H鏈通過二硫鍵連接在一起，每條H鏈和每條L鏈通過二硫鍵連接在一起。只有兩種類型的L鏈，為lambda(λ)鏈和kappa(κ)鏈。相反，有五種被稱為同種型的主要H鏈。這五類包括免疫球蛋白M(IgM或μ)、免疫球蛋白D(IgD或δ)、免疫球蛋白G(IgG或λ)、免疫球蛋白A(IgA或α)以及免疫球蛋白E(IgE或ε)。這些同種型之間的區別性特徵通過免疫球蛋白的恆定區確定並在下文中詳細討論。人免疫球蛋白分子包括九種同種型IgM、IgD、IgE、IgG的四種亞類(包括IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)和IgG4(γ4))和IgA的兩種亞類(包括IgA1(α1)和IgA2(α2))。人的IgG亞類3和IgM為最有效的補體激活劑(經典補體系統)，而IgG亞類1和亞類2(程度較低)為經典補體系統的中低度的激活劑。IgG4亞類並不激活補體系統(經典途徑或旁路途徑)。已知激活補體旁路系統的唯一的人免疫球蛋白同種型為IgA。在小鼠中，IgG亞類為IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。鼠類IgG1並不激活補體，而IgG2a、IgG2b和IgG3是補體激活劑。
免疫球蛋白分子的每條H鏈或L鏈包括兩個區域，稱為L鏈可變區(VL區)和L鏈恆定區(CL區)，以及H鏈可變區(VH區)和H鏈恆定區(CH區)。完整的CH區包括三個亞區(CH1、CH2、CH3)和一個鉸鏈區。總的來說，一條H鏈和一條L鏈可形成具有免疫球蛋白可變區的免疫球蛋白分子的臂。完整的免疫球蛋白分子包括兩個相連的(如二硫鍵連接的)臂。因此，整個免疫球蛋白的每個臂包括VH+L區和CH+L區。本文所使用的術語「可變區」或「V區」指VH+L區(也稱為Fv片段)、VL區或VH區。另外在本文中使用的術語「恆定區」或「C區」指CH+L區、CL區或CH區。
用蛋白酶對免疫球蛋白進行限制性消化可產生兩種片段。抗原結合片段指Fab、Fab』、或F(ab』)2片段。缺乏結合抗原的能力的片段指Fc片段。Fab片段包括含有與VH區和部分CH區(CH1區)相匹配的L鏈(VL+CL區)的免疫球蛋白的一個臂。Fab′片段對應具有與CH1區附著的部分鉸鏈區的Fab片段。F(ab』)2片段對應通常在鉸鏈區通過二硫鍵通常彼此共價連接的兩個Fab』片段。
CH區確定了免疫球蛋白的同種型，並根據不同的同種型賦予不同的功能特徵。例如，μ恆定區使IgM分子的五聚體能夠形成，α恆定區使二聚體能夠形成。
免疫球蛋白分子的抗原特異性通過可變區或V區的胺基酸序列賦予。因此，不同免疫球蛋白分子的V區根據其抗原特異性可顯著不同。V區的某些部分較其它部分更為保守，被稱為骨架區(FW區)。相反，V區的某些部分高度可變，被稱為高變區。VL和VH區在免疫球蛋白分子內配對時，每個區域的高變區聯合組成形成抗原結合位點的高變環(hypervariable loop)。因此，高變環決定了免疫球蛋白的特異性，被稱為互補決定區(CDR)，這是因為其表面與抗原是互補的。
V區的其它可變性通過編碼免疫球蛋白V區的基因區段的組合可變性賦予。免疫球蛋白基因包括多種系基因區段，該區段在體內重排形成編碼免疫球蛋白分子的重排免疫球蛋白基因。L鏈V基因區段和J基因區段(連接區段)編碼VL區。H鏈V基因區段、D基因區段(多變區段)和J基因區段(連接區段)編碼VH區。
L鏈和H鏈V基因區段均含有具有基本胺基酸序列可變性的三個區域。該區域分別指L鏈CDR1、CDR2和CDR3以及H鏈CDR1、CDR2和CDR3。L鏈CDR1的長度可在不同VL區顯著變化。例如，CDR1的長度可在約7個胺基酸到約17個胺基酸之間變化。相反，L鏈CDR2和CDR3的長度一般在不同VL區沒有變化。H鏈CDR3的長度可在不同VH區顯著變化。例如，CDR3的長度可在約1個胺基酸到約20個胺基酸之間變化。每個H鏈和L鏈CDR區的側翼區為FW區。
免疫球蛋白分子的其它功能方面包括免疫球蛋白分子的配價、免疫球蛋白分子的親和力以及免疫球蛋白分子的親合力。本文所使用的親和力指在免疫球蛋白分子單個位點上的免疫球蛋白分子結合抗原的強度(如單價Fab片段結合單價抗原)。親和力不同於親合力，後者指免疫球蛋白結合抗原的強度的總和。免疫球蛋白結合親和力的測量可通過使用本領域的標準技術，如競爭性結合技術、平衡透析法或BIAcore法。本文所使用的配價指每個免疫球蛋白分子的不同抗原結合位點數(即每個抗原結合片段的抗體分子上抗原結合位點數)。例如，單價免疫球蛋白分子同時只能結合一個抗原，而二價免疫球蛋白分子可同時結合兩個或多個抗原等。選擇性結合補體旁路的蛋白的單價和二價抗體均包含於本文中。
在一個實施方案中，抗體為雙特異性抗體或多特異性抗體。如二價(或多價)抗體結合抗原那樣，雙特異性(或多特異性)抗體能結合兩個(或多個)抗原，但在這種情況下，抗原為不同的抗原(即抗體表現出雙特異性或更多的特異性)。例如，選擇性結合本發明的補體旁路中的蛋白的抗體(如本文中所描述的抗B因子抗體)可被構建成雙特異性抗體，其中第二抗原結合特異性針對所需靶物質。因此，本發明所包含的一種雙特異性抗體包括具有如下組成的抗體(a)結合補體旁路中的蛋白(如B因子)第一部分(如第一抗原結合部分)；和(b)結合細胞表達的細胞表面分子的第二部分。在該實施方案中，第二部分可結合任何細胞表面分子。一種優選的細胞表面分子為受體或配體，因此該抗體靶向特定的細胞或組織類型和/或給予抗體的動物體內的特定位點。在一個實施方案中，第二抗原結合特異性針對補體受體。一種特別優選的補體受體包括但不限於II型補體受體(CR2)。選擇性結合CR2並因此能用於本發明的該實施方案中的抗體在例如美國專利No.6,820,011中描述。
在一個實施方案中，本發明的抗體包括人源化抗體。人源化抗體是這樣一種分子，其抗原結合位點來自除人外的物種的免疫球蛋白，該分子的剩餘的免疫球蛋白來源的部分來源於人免疫球蛋白。抗原結合位點可包括融合到人恆定區的完整可變區或僅包括嫁接到可變區中合適的人骨架區上的互補決定區(CDR)。人源化抗體可通過例如模擬抗體可變區並通過使用遺傳工程技術(如CDR嫁接)生產抗體來生產(參見下文)。已發現對多種生產人源化抗體的技術的描述，例如參見Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-55；Whittle et al.(1 987)Prot.Eng.1499-505；Co et al.(1990)J.Immunool.1481149-1154；Co et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 882869-2873；Carter et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.894285-4289；Routledge et al.(1991)Eur.J.Immunol.212717-2725和PCT專利公布文本WO 91/09967、WO91/09968和WO 92/113831。
本發明的分離抗體可包括含該抗體的血清或不同程度純化的抗體。本發明的全部抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體。或者，本發明可使用下述抗體全部抗體的功能等價物，如一個或多個抗體結構域被截短或缺失的抗原結合片段(如Fv、Fab、Fab』或F(ab)2片段)以及遺傳工程抗體或其抗原結合片段，包括單鏈抗體、人源化抗體(如上所述)、結合多於一個表位的抗體(如雙特異性抗體)或可結合一個或多個不同抗原的抗體(如雙特異性抗體或多特異性抗體)。
本發明的遺傳工程抗體包括通過標準重組DNA技術生產的抗體，這些技術涉及編碼抗體可變區和/或恆定區的DNA的操控和再表達。具體的實例包括嵌合抗體(抗體的VH區和/或VL區與餘下抗體部分來自不同來源)以及CDR嫁接抗體(及其抗原結合片段)，其中至少一個CDR序列並且任選地至少一個可變區骨架胺基酸來自於一種來源並且餘下可變區和恆定區部分(合適時)來自於不同來源。嵌合抗體和CDR嫁接抗體的構建在例如歐洲專利申請EP-A0194276、EP-A0239400、EP-A0451216和EP-A0460617中描述。
在一個實施方案中，根據本發明生產嵌合抗體，該抗體包含結合補體旁路的蛋白(如B因子)的抗體可變區，以及與該區融合的、作為第二靶向部分的蛋白。例如，靶向部分可包括與靶向的細胞或組織相關，或與動物內的特定系統相關的蛋白。例如，靶向部分可為一部分補體受體。用於本發明這方面的一種優選的補體受體包括II型補體受體(CR2)。在融合蛋白或嵌合蛋白中使用CR2及其部分(如作為送遞系統)在美國專利No.6,820,011中詳細描述。
一般而言，在抗體的生產中，將抗原(針對該抗原可產生所需抗體)暴露給合適的實驗動物，例如但不限於兔、綿羊、倉鼠、豚鼠、小鼠、大鼠或雞。一般而言，通過將有效量的抗原注射給動物來免疫動物。抗原的有效量指誘導動物產生抗體所需要的量。然後，動物的免疫系統能在預定的一段時間內起反應。免疫過程可反覆進行直到發現免疫系統產生針對抗原的抗體。為獲得特異性針對抗原的多克隆抗體，收集含有所需抗體的動物的血清(就雞而言，抗體可從雞蛋中收集)。該血清可作為試劑使用。多克隆抗體可通過例如用硫酸銨處理從血清(或雞蛋)中純化。
單克隆抗體可根據Kohler和Milstein的方法(Nature 256495-497，1975)生產。例如，從免疫動物的脾臟(或任何合適的組織)收集B淋巴細胞，然後與骨髓瘤細胞融合，以獲得能在合適的培養基中連續生長的雜交瘤細胞群。生產所需抗體的雜交瘤細胞可通過檢測雜交瘤細胞生產的抗體結合所需抗原的能力進行篩選。
生產本發明的抗體的優選的方法包括(a)給予動物有效量的蛋白或肽(如B因子蛋白或含其結構域的肽)以生產抗體，並(b)回收抗體。在另一種方法中，本發明的抗體通過重組生產。例如，一旦獲得表達本發明的抗體的細胞系，如雜交瘤細胞，那麼能從其中克隆cDNA並能鑑定編碼所需抗體的可變區基因，包括編碼CDR的序列。因此，本發明的抗體或抗原結合片段可通過製備一種或多種可複製的表達載體並將其轉化/轉染合適的宿主細胞獲得，並在該宿主細胞中生產抗體，其中所述的表達載體至少含有編碼抗體重鏈或輕鏈的可變區的DNA序列，並任選地含有編碼所需重鏈和/或輕鏈的餘下部分的其他DNA序列。合適的表達宿主包括細菌(如大腸桿菌菌株)、真菌(特別是酵母菌，如畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)或克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的成員)和哺乳動物細胞系，如非生產型骨髓瘤細胞系，如小鼠NSO系或CHO細胞。為獲得有效的轉錄和翻譯，每個載體中的DNA序列應該包括合適的調控序列，特別是有效連接到可變區序列上的啟動子和前導序列。通過該途徑生產抗體的具體方法普遍熟悉並常規使用。例如，基礎分子生物學方法為Maniatis等人所描述(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，1989)；可根據Sanger等人的描述(PNAS74，5463，(1977))和Amersham International plc測序手冊進行DNA測序，並可根據Kramer等人的方法(Nucl.Acids Res.12，9441，(1984))和AnglianBiotechnology Ltd.的手冊可進行定向誘變。另外，有很多包括專利說明書在內的出版物詳細描述了適合通過操控DNA、構建表達載體和轉化合適的細胞來製備抗體的技術，例如如Mountain A和Adair，JR在《生物技術和遺傳工程綜述》(Biotechnology and GeneticEngineering Reviews)(ed.Tombs，M P，10，Chapter 1，1992，Intercept，Andover，UK)和在前面提到的歐洲專利申請中總結的那樣。
其它採用例如噬菌體展示技術(參見例如US5969108、US5565332、US5871907、US5858657)的方法或者所選的US5627052中的淋巴細胞抗體方法也可用於生產本發明的抗體和/或抗原片段，這對技術人員而言是非常顯而易見。
因此，本發明的另一方面一般涉及用於選擇性抑制動物的補體旁路的組合物和方法，該動物患有補體旁路激活起作用的病症或疾病或有患該病風險(如補體旁路的激活有助於病症或疾病的進展，加重了該病症或疾病的至少一個症狀，或者引起病症或疾病)。該方法包括使用本發明的新型B因子抗體(上文已詳細描述)。該病症或疾病包括但不限於與氣道高反應性(包括炎症相關氣道高反應性)、缺血-再灌注損傷以及胎兒丟失相關的病症。下面將詳細描述含該抗體及其抗原結合片段以及模擬本文所描述的B因子抗體的特異性的抗原結合多肽的組合物和製劑，以及給予方法和劑量的討論。
預防或抑制氣道高反應性和氣道炎症的方法基於本發明人的補體旁路是抑制氣道高反應性和氣道炎症所必要的和充分的這一發現，本發明的另一實施方案涉及抑制患有炎症相關氣道高反應性或氣道炎症或者有患該病風險的動物的氣道高反應性和/或氣道炎症的方法。該方法包括選擇性抑制患有氣道高反應性或有患該病風險的動物的補體旁路的步驟，所述氣道高反應性包括炎症相關氣道高反應性(即氣道高反應性的出現是由於炎症或者炎性過程，或者與氣道中的炎症同時出現或先於炎症出現)。
下文中的討論對治療或預防動物的氣道高反應性和/或氣道炎症或與此相關的病症或疾病方面進行了詳細說明。但是，應該理解的是對抑制劑、給藥途徑、劑量、治療指示劑、對製劑的描述等等的一般性討論可應用到本文所描述的發明的任何實施方案中(即針對與氣道高反應性和氣道炎症相關的那些疾病或病症以外的其它病症或疾病)。例如，下文所描述的發明的許多概括方面可應用到補體旁路的特定抑制，以治療其它的病症，如缺血-再灌注損傷。
根據本發明，抑制動物的補體旁路指抑制作為補體旁路的一部分的至少一種蛋白的表達和/或生物活性。該蛋白包括但不限於B因子、D因子或備解素。「選擇性」抑制補體旁路意味著本發明的方法優先地或唯一地抑制補體旁路，但是不抑制或至少不顯著抑制補體激活的其它途徑(包括經典補體途徑或凝集素途徑)。例如，本發明的新型B因子抗體及其抗原結合片段為選擇性抑制補體旁路的試劑的一個實例。該定義應用到本文所描述的其它方法中，其中補體旁路被選擇性抑制。
本發明的補體旁路的抑制可通過直接影響補體旁路的蛋白表達(轉錄或翻譯)或生物活性完成，或通過直接影響蛋白結合補體旁路的蛋白或影響蛋白以其他方式幫助激活旁路途徑中的補體的能力完成。更具體而言，在一個實施方案中，蛋白的表達指蛋白的轉錄或蛋白的翻譯。因此，本發明的方法可抑制天然表達該蛋白的動物中蛋白的轉錄和/或翻譯(如通過給予抑制蛋白表達的試劑以及對動物進行遺傳修飾以減少蛋白表達)。在另一實施方案中，補體旁路的抑制在本文中被定義為該途徑活性的任何可測量的(可檢測的)降低(即減少、下調、抑制)，例如通過補體旁路的蛋白表達和/或生物活性的可測量的降低。
根據本發明，「氣道高反應性」或「AHR」指氣道的異常，它使得氣道對能引起氣流受限的刺激非常易於變窄和/或過度變窄。AHR可為呼吸系統的功能性改變，這是由於氣道中的炎症(即炎症相關AHR)或由於氣道重建(如通過膠原沉積)。氣流受限是指氣道的不可逆的或可逆的變窄。氣流受限或氣道高反應性可由下述現象引起膠原沉積、支氣管痙攣、氣道平滑肌肥大、氣道平滑肌收縮、粘液分泌、細胞沉積、上皮的破壞、上皮穿透性的改變、平滑肌功能或敏感性的改變、肺實質的異常以及氣道內和周圍的浸潤性疾病。儘管AHR是與炎症不同的症狀，但是這些誘因中還是有許多與炎症相關(即AHR為上文所描述的特定病症或症狀，它可(但不總是)與氣道的前期炎症或並發炎症相關)。通過暴露於激發劑或刺激物(在本文中也稱為AHR激發刺激物)，AHR可在具有與上述誘因相關的病症的患者內激發。該刺激物包括但不限於過敏原、乙醯甲基膽鹼、組胺、白三烯、鹽水、通氣增強、運動、二氧化硫、腺苷、心得安(propranolol)、冷空氣、抗原、緩激肽、乙醯膽鹼、前列腺素、臭氧、環境空氣汙染物及其混合物。本發明涉及與具有炎症的任何呼吸病症相關的氣道高反應性，特別涉及過敏原誘導的氣道高反應性。
氣道高反應性通常與過敏性炎症和/或病毒誘導的炎症相關。與過敏性炎症相關的氣道高反應性可出現在患有包括但不限於慢性阻塞性氣道疾病的病症或有患該病風險的病人中。該病症包括但不限於哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、過敏性支氣管肺麴黴病、過敏性肺炎、嗜酸粒細胞性肺炎、肺氣腫、支氣管炎、過敏性支氣管炎、支氣管擴張、囊性纖維化病、結核病、過敏性肺炎、職業性哮喘、結節病、反應性氣道病症候群、間質性肺病、嗜酸細胞增多症候群、鼻炎、鼻竇炎、運動誘發哮喘、汙染誘發哮喘和肺寄生蟲病。與病毒誘導的炎症相關的氣道高反應性出現在被病毒感染或有被感染風險的患者內，這些病毒包括但不限於呼吸道合胞體病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、鼻病毒(RV)和腺病毒。使用本發明的方法和試劑治療的其它疾病或病症包括涉及疾病(如全身性自身免疫疾病)引起的炎症和/或氣道高反應性的任何肺部病症或肺部併發症。例如，使用本發明可治療全身性紅斑狼瘡中的肺部併發症。
炎症的特徵一般在於炎性介質(如細胞因子或趨化因子)的釋放，該炎性介質將參與炎症的細胞募集至組織中。氣道炎症為出現在動物氣道(肺組織、呼吸細胞和組織)中的炎症。與過敏性炎症相關的病症或疾病是這樣一種病症或疾病，即在動物中誘發針對敏化劑(如過敏原)的一類免疫應答(如Th2型免疫應答)可導致炎性介質的釋放，炎性介質募集參與炎症的細胞，它的存在可導致組織損害，並且有時會引起死亡。如上所述，AHR通常與氣道炎症相關(與氣道炎症同時出現，或者可能由氣道炎症引起)。應該注意的是AHR的症狀或病症有時可不依賴炎症症狀治療，反之亦然(如對AHR的治療可能對炎症有影響，也可能沒有-它們是獨立的病症)。
AHR可通過負荷試驗(stress test)檢測，該試驗包括檢測動物對激發劑(即刺激物)應答的呼吸系統功能。AHR可以呼吸功能相對基線的改變對激發劑的劑量所作的曲線圖的形式測量(該檢測的方法以及所使用的哺乳動物模型在下文的實施例中描述)。呼吸功能(以及AHR的生物特徵)可通過下述方式檢測，例如肺活量測定法、體積描記法、峰值氣流量、症狀得分、體徵(即呼吸速率)、哮嗚、運動耐受、救援藥劑(即支氣管擴張藥)的使用、咳嗽和血液氣體。人的肺活量測定法與激發劑如乙醯甲基膽鹼或組胺一起測量呼吸功能的改變。通過要求人深呼吸並將氣體最長時間、最大力、最快速地吹入測量氣流和體積的計量器中對人的肺活量進行測量。已知第一秒呼出的空氣體積為用力呼氣量(FEV1)，呼出氣體的總體積為用力肺活量(FVC)。可獲得人的正常預計FEV1和FVC，並根據體重、身高、性別和種族對其進行標準化。未患病個體的FEV1和FVC為特定人的正常預計值的至少約80％，並且FEV1/FVC的比率為至少約80％。分別在吸入激發劑前(即表示患者的靜息狀態)後(即表示患者較高的肺阻力狀態)測定該數值。所得到的曲線的位置表明氣道對激發劑的敏感性。
激發劑的劑量或濃度的增加對肺功能的影響通過測量用激發劑攻擊的動物在第一秒的用力呼氣量(FEV1)以及FEV1比用力肺活量(FEV1/FVC比率)檢測。引起人的FEV1下降20％的激發劑(即乙醯甲基膽鹼或組胺)的劑量或濃度(PC20FEV1)為AHR的程度的指標。使用本領域的技術人員所熟知的方法可檢測FEV1和FVC值。
通過測量跨肺壓(氣道開放和身體體積描記器之間的壓力差)可檢測肺部功能量度氣道阻力(RL)、動態順應性(CL)和高反應性。體積為身體體積描記器中所計算的壓力變化，氣流為體積信號的數字差異。使用本領域技術人員所熟知的方法(如通過使用運動平衡的遞歸最小二乘方方案)獲得阻力(RL)和順應性(CL)。應該注意的是測量除人外的哺乳動物(如小鼠)中的氣道阻力(RL)值可用於診斷氣流阻塞(airflow obstruction)，這同測量人的FEV1和/或FEV1/FVC比率相似。
可使用多種激發劑測量AHR值。合適的激發劑包括直接和間接刺激物，並通常為體內激發AHR的激發劑。本文所使用的短語「激發劑」可與短語「AHR激發刺激物」互換使用。優選的激發劑或刺激物包括例如過敏原、乙醯甲基膽鹼、組胺、有機刺激物、刺激性氣體和化學藥品、白三烯、鹽水、通氣增強、運動、二氧化硫、腺苷、心得安、冷空氣、抗原、緩激肽、乙醯膽鹼、前列腺素、臭氧、環境空氣汙染物及其混合物。優選地，對AHR的試驗性誘導而言，乙醯甲基膽鹼(Mch)用作激發劑。用於濃度-反應曲線中的Mch的優選濃度介於約0.001到約100毫克每毫升(mg/ml)之間。用於濃度-反應曲線中的Mch的更優選濃度介於約0.01到約50mg/ml之間。用於濃度-反應曲線中的Mch的更優選濃度介於約0.02到約25mg/ml之間。當Mch用作激發劑時，AHR的程度被定義為引起動物的FEV1下降20％所需要的Mch的激發濃度(PC20乙醯甲基膽鹼FEV1)。例如，在人中，並使用並領域的標準方法，一個正常人的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1一般大於8mg/ml Mch。因此，在人中，AHR被定義為PC20乙醯甲基膽鹼FEV1小於8mg/ml Mch。
根據本發明，呼吸功能可通過各種靜態試驗評估，該試驗包括檢測在不存在激發劑時動物的呼吸系統功能。靜態試驗的實例包括例如肺活量測定法、體積描記法、峰值氣流量、症狀得分、體徵(即呼吸速率)、哮鳴、運動耐受、救援藥劑(即支氣管擴張藥)的使用、血液氣體和咳嗽。通過測量下述指標可在靜態試驗中進行評估肺部功能，例如總肺活量(TLC)、胸腔氣體容量(TgV)、肺功能殘氣量(FRC)、殘氣量(RV)和肺體積的電導率(SGL)，肺一氧化碳彌散量(DLCO)、動脈血液氣體，包括用於氣體交換的pH、PO2和PCO2。FEV1和FEV1/FVC均可用於檢測氣流受限。若在人中使用肺活量測定法，個人的FEV1可與FEV1的預計值相比較。FEV1預計值可通過以動物的年齡、性別、體重、身高和種族為基礎的標準正常圖獲得。正常動物的FEV1一般為動物的預計FEV1的至少約80％。氣流受限引起FEV1或FVC小於預計值的80％。另一種檢測氣流受限的方法以FEV1與FVC的比率(FEV1/FVC)為基礎。未患疾病的個體被定義為其FEV1/FVC的比率至少約為80％。氣流阻塞引起FEV1/FVC的比率下降到小於預計值的80％。因此，具有氣流受限的動物被定義為其FEV1/FVC小於約80％。
本文所使用的降低氣道高反應性指氣道高反應性中的任何可測量的降低和/或氣道高反應性出現在患者中的出現率或頻率的任何降低。AHR的降低可通過使用任何上述技術或任何其他本領域所熟知的適合的方法進行測量。優選地，氣道高反應性或可能的氣道高反應性被降低，最佳被降低到動物不再忍受由氣道高反應性引起或與之相關的不舒適和/或功能改變。預防氣道高反應性指在本文所述的氣道高反應性的生物學特徵可在患者內被明顯檢測或測量前預防或中止氣道高反應性的誘導。一旦一個或多個氣道高反應性的生物學特徵可被明顯檢測或測量，急性起病的氣道高反應性被認為已經出現。
在一個實施方案中，本發明的方法減少了動物的乙醯甲基膽鹼的反應性。優選地，本發明的方法引起動物的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1值提高，因此在使用本發明的方法前(此時動物用乙醯甲基膽鹼的第一濃度激發)所獲得的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1值與在使用本發明的方法後(此時動物用二倍於乙醯甲基膽鹼的第一濃度激發)所獲得的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1值相同。優選地，本發明的方法引起動物的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1值提高，因此，在使用本發明的方法前(此時動物用約0.01mg/ml到約8mg/ml的乙醯甲基膽鹼激發)所獲得的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1值與在使用本發明的方法後(此時動物用約0.02mg/ml到約16mg/ml的乙醯甲基膽鹼激發)所獲得的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1值相同。
在另一實施方案中，本發明的方法將動物的FEV1提高了動物預計FEV1的至少約5％，更優選提高了約6％到約100％，更優選提高了約7％到約100％，更優選提高了約8％到約100％。在另一實施方案中，本發明的方法將動物的FEV1提高了至少約5％，優選至少約10％，更優選至少約25％，更優選至少約50％，更優選至少約75％。
在另一實施方案中，本發明的方法引起動物的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1相對於正常動物的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1提高了約兩倍濃度。正常動物指已知未患有異常AHR或對其不敏感的動物。患者或待測動物指疑似患有異常AHR或對其敏感的動物。
因此，患氣道高反應性的動物為其氣道高反應性例如可通過使用上述用於測量氣道高反應性的其中一種方法被測量或檢測的動物，其中如上所述，氣道高反應性一般通過暴露於AHR激發刺激物被誘導。同樣，患有過敏原誘導的氣道高反應性的動物為其氣道高反應性例如可通過使用上述用於測量氣道高反應性的其中一種方法被測量或檢測的動物，其中，氣道高反應性可通過暴露給過敏原誘導。為了通過AHR激發刺激物如過敏原誘導，氣道高反應性可通過暴露於刺激物明顯地直接或間接引發(如由後者引起，為後者的症狀、指標，或者與後者同時出現的事件)。AHR的症狀或生物學特徵包括但不限於改變了的呼吸功能(參見上文詳述))的指標、呼吸速率的改變、哮嗚、降低了的運動耐受、咳嗽和改變了的血液氣體。任何一個或多個這些症狀的檢測或測量是急性AHR發作的指標。
就過敏原而言，氣道高反應性由先前敏化動物的過敏原明顯、直接或間接引發。對過敏原敏化指之前一次或多次暴露給過敏原，由此出現針對該過敏原的免疫應答。與過敏反應相關的應答(如組胺釋放、鼻炎、水腫、血管舒張、支氣管壓縮(bronchial constriction)或氣道高反應性、氣道炎症)一般在新個體第一次暴露給過敏原時不出現，但是一旦產生了針對過敏原的細胞免疫應答和體液免疫應答，個體就對該過敏原「敏化」。然後，當敏化個體再次暴露於相同過敏原(如過敏原攻擊)時，就會出現過敏反應。一旦個體對過敏原敏化，過敏反應會隨著接下來的每次暴露給過敏原而變嚴重，因為每次再暴露不僅產生了過敏症狀，還進一步提高了針對過敏原所產生的的抗體的水平以及針對過敏原的T細胞應答的水平。
一般而言，與針對抗原(即過敏原)的過敏反應相關的病症其特徵至少部分在於肺部組織的炎症。這些病症或疾病在上文中已描述。應該注意的是儘管本發明的效果可能涉及過敏炎症的抑制，但是本發明的本實施方案特別針對AHR的治療，因此不需要引起AHR如過敏炎症的相關病症或誘因能得以顯著降低或「治癒」。本發明的方法甚至在動物的肺部的炎性反應完全確立後可完全有效地降低AHR。有患氣道高反應性風險的動物為已暴露於足以引發AHR的AHR激發刺激物或有暴露於該刺激物風險，但尚未表現出氣道高反應性的可測量或檢測的特徵或症狀(已在前文中描述的那些症狀)的動物。有患過敏原誘導的氣道高反應性風險的動物為先由過敏原敏化並且已暴露於足以引發AHR的過敏原的量(即過敏原的引發量或攻擊量)或有暴露於其中的風險，但尚未表現出氣道高反應性的可檢測或測量的特徵或症狀的動物。有患氣道高反應性風險的動物還包括被認為易患該病症或疾病或對其敏感的動物。
本發明的方法還可抑制或降低動物的氣道炎症。炎症，特別是嗜酸性炎症，是包括哮喘在內的多種呼吸疾病的標誌。通過使用幾個參數可評估氣道炎症，這幾個參數包括但不限於肺內炎性細胞的累積(如嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、淋巴細胞)、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的多種細胞因子(如IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13和IFN-γ)的水平改變和/或肺內粘液生成的變化。實施例中示出了多種這些參數的測量方法。
本發明的試劑和製劑可給予任何動物患者，優選給予人。根據本發明，試劑或製劑的給予可用於抑制AHR、氣道炎症或治療與這些病症相關的疾病。本發明的方法的適合的候選患者包括但不限於患有該病症或疾病或有患該病風險(如易於患該病)的患者。儘管本發明的效果可能涉及對患者的顯著治療益處，但是如上所述，本發明主要涉及AHR和/或氣道炎症的治療，因此不需要引起AHR或氣道炎症的病症或誘因，或與這些病症相關的疾病被顯著降低或「治癒」。這個概念也普遍應用於補體旁路起作用的其它病症或疾病中。
因此，治療益處不一定是治癒特定疾病或病症(包括本文所描述的任何疾病或病症)，而是優選包括最通常包括下述的結果緩解疾病或病症、消除疾病或病症、減少與疾病或病症相關的症狀、預防或緩解由於原發性疾病或病症的出現而引起的繼發性疾病或病症和/或預防疾病或病症。本文所使用的短語「免於感染疾病」指減少疾病症狀、減少疾病的出現率和/或降低疾病的嚴重程度。保護患者可指本發明的組合物給予患者時它阻止疾病出現和/或治癒或減輕疾病症狀、徵兆或原因的能力。因此，使患者免於感染疾病包括預防疾病的發生(預防性治療)和治療患病的患者(治療性治療)。有益效果很容易由本領域的技術人員和/或經過專門訓練的治療患者的臨床醫生所評估。術語「疾病」指哺乳動物從正常健康的任何偏離，包括疾病症狀存在時的狀態，以及偏離(如感染、基因突變、遺傳缺失等)已出現但症狀尚未得到證實的病症。
因此，本發明的方法包括多種試劑(即調控化合物)的用途，這些試劑通過直接對補體旁路的蛋白起作用選擇性抑制補體旁路的一種或多種蛋白的表達和/或生物學活性，由此降低動物的氣道高反應性和/或氣道炎症。用於本發明的試劑包括例如蛋白、核酸分子、抗體和為推理性藥物設計的產物的化合物(即藥物)。這些試劑在本文中一般指抑制劑。根據本發明，抑制劑為任何抑制(直接抑制或競爭性抑制)蛋白(如補體旁路的蛋白)的表達和/或生物學活性的試劑，包括對B因子、D因子或備解素起作用的試劑。在本發明的一個實施方案中，補體旁路或補體旁路的蛋白的抑制在本文中被定義為任何可測量的(可檢測的)補體旁路的蛋白的生物學活性的降低(即減少、下調、抑制)。蛋白的生物學活性或生物學作用指天然存在形式的蛋白體內(即蛋白的天然生理環境)或體外(即在實驗室條件下)檢測或觀察所展現或執行的任何功能。例如，B因子的生物學活性包括但不限於結合激活的C3，溶解免疫複合物、B細胞生長因子活性和單核細胞激活。根據本發明，蛋白的生物學活性通過直接阻止或抑制(降低、減少)蛋白結合和/或激活另一種蛋白(如C3)的能力可被抑制，由此抑制該結合所引起的下遊事件。優選地，補體旁路的生物學活性通過給予抑制該途徑中的至少一種蛋白的試劑被抑制，該試劑包括但不限於以蛋白結合和/或激活另一種蛋白的能力被抑制或阻止的方式結合該途徑中至少一種蛋白或與該途徑中的蛋白競爭的試劑。這種試劑包括但不限於蛋白的拮抗劑、抗體(包括其抗原結合片段)、其它抗原結合多肽以及小分子(如合成化合物或藥物)。
用於本發明的一種試劑為補體旁路的拮抗劑，包括該途徑中的蛋白的拮抗劑。根據本發明，「拮抗劑」指抑制(如拮抗、降低、減少、阻斷、逆轉或改變)指定蛋白的作用的任何化合物。更具體而言，拮抗劑能以相對於指定蛋白的活性的方式起作用，因此該指定蛋白的生物學活性以拮抗(如對抗、逆轉、相反於)指定蛋白的天然作用的方式被降低或阻斷。拮抗劑可包括但不限於抗體或其抗原結合片段、蛋白、肽、核酸(包括核酶和反義鏈)或提供拮抗效果的藥物/化合物/肽設計或選擇的產物。例如，本發明包括天然蛋白、B因子、D因子或備解素的任何拮抗劑，包括抗體拮抗劑、蛋白/肽拮抗劑、核酸拮抗劑或小分子拮抗劑(如小分子抑制劑)。
在本發明的一個優選的實施方案中，用於抑制補體旁路的試劑為抗體或其抗原結合片段。同樣，抗原結合多肽也特別優選用於本發明中。一方面，抗體選擇性結合補體旁路的蛋白，以使該蛋白與另一種蛋白的結合(通常情況下，即天然條件下或生理條件下它們發生相互作用)被抑制或阻止。另一方面，抗體選擇性結合該蛋白，以抑制或阻止該蛋白激活另一種蛋白(通常情況下相互作用，即便該蛋白與其它蛋白部分結合)。用於選擇性抑制補體途徑中的特別優選的抗體及其抗原結合片段已在上文中詳細描述(如本文所描述的B因子抗體，特別是本文詳細描述的mAb1379抗體)。
優選地，用於本發明的抗體或其抗原結合片段結合選自B因子、D因子或備解素中的蛋白。最優選地，本發明包括結合B因子的抗體或其抗原結合片段。本發明的選擇性結合B因子並抑制補體旁路的抗體(及其抗原結合片段)在本文中詳細描述並舉例說明。在一個實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合在動物物種、特別是在哺乳動物物種中保守的該蛋白的保守結合表面或表位(即該抗體與來自兩種或多種不同哺乳動物物種的該蛋白交叉反應)。具體而言，本發明包括結合來自至少兩種、優選幾種不同哺乳動物物種(包括但不限於人、除人外的靈長類、小鼠、大鼠、豬、馬和兔)中的補體旁路的蛋白的抗體。
本發明還涉及設計來選擇性結合併中和或抑制本發明的蛋白的非抗體多肽，有時指抗原結合配偶體或者抗原結合多肽。具有前述配體特異性的該多肽的設計的實例已由Beste等人給出(Proc.Natl.Acad.Sci.961898-1903，1999)，通過援引全文納入本文。
除了抗體、其抗原結合片段以及抗原結合多肽外，本發明還包括抑制補體旁路的蛋白的其它試劑。這些試劑包括例如推理性藥物設計的產物的化合物、天然產物以及具有部分明確的調控性質的化合物。調控試劑包括指定蛋白的拮抗劑，可為以蛋白為基礎的化合物、以碳水化合物為基礎的化合物、以脂質為基礎的化合物、以核酸為基礎的化合物、天然的有機化合物、合成的衍生有機化合物、抗體或其片段。在一個實施方案中，本發明的該調控試劑包括藥劑，這些藥劑包括調節補體旁路的一種或多種蛋白的產生和/或功能的肽、寡核苷酸、碳水化合物和/或合成有機分子。該試劑可從例如分子多樣性方法(可快速構建較大的具有化學多樣性的分子文庫的相關方法的組合)、天然化合物或合成化合物的文庫中獲得，特別是從化學文庫或組合文庫(即序列或大小不同但是具有相同的結構單元的化合物文庫)中獲得，或通過推理性藥物設計獲得。參見例如Maulik et al.，1997，MolecularBiotechnologyTherapeutic Applications and Strategies，Wiley-Liss，Inc.，通過援引全文納入本文。
在分子多樣性方法中，使用生物學方法、酶學方法和/或化學方法，從例如肽、寡核苷酸、碳水化合物和/或合成有機分子中合成較大的化合物文庫。在進行分子多樣性方法中的關鍵參數包括亞基多樣性、分子大小和文庫多樣性。篩選該文庫的總的目的在於利用連續使用組合選擇以獲得針對所需靶物質的高親和力配體，然後通過隨機設計方法或定向設計方法將主要分子最優化。分子多樣性的方法已由Maulik等人(上文)詳細描述。
在推理性藥物設計方法中，調控化合物的三維結構可通過例如核磁共振(NMR)或X射線晶體學分析。然後通過例如計算機模型，使用該三維結構預測諸如可能的調控劑的可能的化合物的結構。被預測的化合物的結構可用於將例如通過分子多樣性方法得到的主要化合物最優化。另外，被預測的化合物結構可通過例如化學合成、重組DNA技術或通過從天然來源(如植物、動物、細菌和真菌)分離模擬表位生產。
Maulik等人(1997，上文)公開了其它以結構為基礎的藥物設計的各種方法。Maulik等人公開了例如定向設計的方法(其中使用者指導形成來自恰當選擇的片段的片段文庫的新型分子的進程)、隨機設計(其中使用者使用遺傳算法或其它算法隨機突變片段及其組合，同時使用選擇標準以評估候選配體的適配度(fitness))以及以篩網為基礎的方法(其中使用者計算了三維受體結構和小的片段探針之間的互作用能，然後將有利的探針位點連接在一起)。
可用作抑制補體旁路的蛋白的試劑的分離核酸分子為反義核酸分子、核酶或siRNA。本文所使用的反義核酸分子被定義為通過在嚴格條件下與編碼蛋白的基因雜交以減少蛋白表達的分離核酸分子。該核酸分子與編碼蛋白的基因非常相似，該分子能在高度嚴格條件下與編碼天然蛋白的基因或RNA的編碼鏈或互補鏈RNA雜交。RNA幹擾(RNAi)是一種方法，藉此，雙鏈RNA以及哺乳動物系統中的短幹擾RNA(siRNA)被用於抑制或沉默互補基因的表達。靶細胞中的siRNA已被解鏈，並且與RNA誘導的沉默複合物(RISC)相關，RISC隨後被指導進入與siRNA互補的mRNA序列，藉此RISC剪切了mRNA。核酶為通過結合靶RNA部分起作用並通過在特定剪切位點剪切磷酸二酯骨架使其失活的RNA區段。
基因包括調控基因編碼蛋白的生產的調控區(例如但不限於轉錄、翻譯或翻譯後調控區)以及編碼區自身。編碼補體旁路的多種蛋白(包括B因子、D因子或備解素)的基因已被鑑定並為本領域所熟知。分離核酸分子為已從其天然環境中取出(即受到人為操控)的核酸分子，可包括DNA、RNA或者DNA或RNA的衍生物。因此，「分離」並不反映核酸分子被純化的程度。本發明的分離核酸分子可從天然來源分離或使用重組DNA技術(如聚合酶鏈反應(PCR)擴增、克隆)或化學合成生產。
本文所使用的雜交條件指核酸分子用於鑑定相似核酸分子的標準雜交條件。例如，Sambrook等人(Sambrook et al.Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press，1989)已經公開了這種標準雜交條件。Sambrook等人的該出版物(如前)通過援引全文納入本文(具體參見9.31-9.62頁)。另外，例如Meinkoth等人(Meinkoth et al.，1984，Anal.Biochem.138，267-284)還公開了計算合適的雜交和洗滌條件的公式以獲得不同程度的核苷酸錯配的雜交。Meinkoth等人的該出版物(如前)通過援引全文納入本文。
缺血-再灌注損傷本發明的另一實施方案涉及本發明人的使用例如本文所描述的抗B因子抗體或其抗原結合片段抑制B因子並抑制缺血-再灌注損傷這一發現。該發現在腎臟缺血-再灌注損傷模型中證實。因此，本發明的方法和組合物在與缺血-再灌注損傷以及本發明的一方面——腎臟缺血-再灌注損傷相關的病症中也具有治療效用。使用該方法可預防或減少的其它類型的缺血-再灌注損傷，包括但不限於心臟缺血-再灌注損傷、中樞神經系統缺血-再灌注、四肢或手指(腳趾)的缺血-再灌注損傷、內臟如肺、肝或小腸的缺血-再灌注或者任何移植器官或組織的缺血-再灌注損傷。
本發明的方法包括下列步驟選擇性抑制患有缺血-再灌注或有患該病風險的動物內的補體旁路。優選地，由於缺血-再灌注而引起的至少一個損傷的症狀或類型被預防或抑制。缺血-再灌注損傷可提高細胞和組織所產生的各種可能有害的化合物的產生或氧化，該過程可引起細胞和組織的氧化損傷或死亡。例如，腎臟缺血-再灌注損傷可引起腎臟的組織學損傷，包括以急性腎小管壞死(acute tubularnecrosis)為特徵的腎小管損害和變化。所引起的腎臟功能障礙使得通常由腎臟所分泌的諸如血清尿素氮(SUN)的含氮廢物的累積。缺血-再灌注還可引起諸如肺的遠端器官的損傷。本方法優選利用上文詳細描述的本發明的新型B因子抗體，在將它給予患有缺血-再灌注或有患該病風險的動物時，它預防、降低或抑制至少一個由於缺血-再灌注引起的損傷症狀。本文所描述的本發明的任何B因子抗體、其抗原結合片段或具有相似結合特異性的抗原結合多肽可用於本發明的該實施方案中。本文提供了在本發明的各種方法中關於優選劑量、給藥途徑、包含該抗體及有關試劑的組合物和製劑的描述並且它們被納入該實施方案中。
應該注意的是，本發明的該實施方案特別涉及缺血-再灌注損傷的治療，因此，不需要引起缺血-再灌注損傷的相關病症或誘因被顯著降低或「治癒」。本發明的方法可完全有效預防或降低與缺血-再灌注相關的損害或損傷，或者改善或減輕該損傷的至少一個症狀。因此，給予本文所描述的試劑或製劑可用於預防或抑制缺血-再灌注損傷，儘管不需要完全預防該損傷，但是優選患者能從該試劑或製劑的使用中獲得至少一種治療效用。
與本發明的實施方案相關的製劑、組合物和方法本發明的另一實施方案還包括含有補體旁路抑制劑，特別是上文所描述的補體旁路選擇性抑制劑的製劑或組合物。該製劑或組合物可用於本文所描述的任何方法中並且與本文所描述的任何試劑(如本文所描述的新型B因子抗體)使用。在一個實施方案中，該組合物可用於降低或預防動物的氣道高反應性。在另一實施方案中，該組合物可用於降低或預防動物的缺血-再灌注損傷。在另一實施方案中，該組合物通過選擇性抑制補體旁路用於治療或預防病症或疾病。該製劑包括(a)上文所描述的補體旁路的抑制劑；(b)可藥用的載體。
在一個實施方案中，該製劑或組合物可包括一種或多種其它試劑，如適用於降低患有氣道高反應性、特別是患有炎症相關氣道高反應性或有患該病風險的動物的炎症的消炎藥。消炎藥可為任何適用於降低患有與氣道高反應性相關的炎症病症的患者的炎症的消炎藥，包括但不限於皮質類固醇(口服、吸入和注射)、β-激動劑(長效或短效)、白三烯調節物(抑制劑或受體拮抗劑)、細胞因子或細胞因子受體拮抗劑、抗IgE、磷酸二酯酶抑制劑、色甘酸鈉、萘多羅米(nedocrimal)、茶鹼和T細胞功能抑制劑。用於本製劑的特別優選的消炎藥包括皮質類固醇、白三烯調節物和細胞因子或細胞因子受體拮抗劑。
在另一實施方案中，該製劑或組合物可包括一種或多種其它試劑，如適用於預防或降低動物的缺血-再灌注損傷的其它試劑。該試劑包括但不限於消炎藥或氧化和自由基損害的抑制劑。
在另一實施方案中，該製劑或組合物可包括一種或多種其它試劑，如適用於治療與補體旁路激活相關的另一種疾病或病症的其它試劑。
根據本發明，「可藥用載體」包括適用於將製劑或組合物給予體內的合適位點的可藥用賦形劑和/或可藥用的送遞載體。體內的合適位點優選補體旁路可被抑制的任何位點。在一個優選的實施方案中，當患者患有氣道高反應性和/或氣道炎症或有患該病風險時，體內的合適位點優選在肺組織或氣道內。體內的其它優選位點包括位於與補體旁路相關的病症的發病中心的其它組織或器官。在另一優選的實施方案中，體內的合適位點為缺血-再灌注損傷出現的任何位點，如在心臟或肺系統、中樞神經系統、四肢或手指(腳趾)、內臟(如肺、肝或小腸)內或在任何移植器官或組織內。優選的可藥用載體為能以下述方式保持用於本發明製劑的試劑一旦試劑到達患者的靶位點，試劑便能作用於其靶物質(如為補體旁路的組分的蛋白)，優選對患者產生治療效用。
本發明的合適的賦形劑包括運輸或輔助運輸、但不特異性使組合物靶向細胞或組織(在本文中也指非靶向載體)的賦形劑或製劑(formulary)。可藥用的賦形劑的實例包括但不限於水、磷酸鹽緩衝的鹽水、Ringer溶液、葡萄糖溶液、含血清溶液、Hank溶液、其它在生理學上平衡的水性溶液、油類、酯類和乙二醇。水性載體可含被要求接近受試者的生理條件的合適的輔助物質，例如通過提高化學穩定性和等張性。合適的輔助物質包括例如乙酸鈉、氯化納、乳酸鈉、氯化鉀、氯化鈣和其它用於生產磷酸鹽緩衝液、Tris緩衝液和碳酸氫鹽緩衝液的物質。輔助物質還可包括防腐劑，如硫柳汞、間甲酚或鄰甲酚、福馬林和苯甲醇(benzol alcohol)。可通過常規方法和/或低壓凍幹法對本發明的製劑進行滅菌。
一種可藥用的載體包括能將本發明的組合物緩慢釋放到動物的控釋製劑。本文所使用的控釋製劑包括在控釋載體中的本發明的試劑。合適的控釋載體包括但不限於生物相容的聚合物、其它聚合基質、膠囊、微膠囊、微粒、推注製劑、滲透泵、分散裝置、脂質體、脂質球(liposphere)和經皮送遞系統。其它合適的載體包括可結合延長待送遞試劑的半衰期的試劑或納入該試劑中。該載體可包括任何合適的蛋白載體，甚至包括在體內送遞時延長蛋白的半衰期的融合區段。前文描述了合適的送遞載體，它們包括但不限於脂質體、病毒載體或包括核酶在內的其它送遞載體。天然的含脂質的送遞載體包括細胞和細胞膜。人工的含脂質的送遞載體包括脂質體和微團。如上所述，可修飾本發明的送遞載體以靶向患者的特定位點，由此靶向和利用該位點的抑制劑。合適的修飾包括操控送遞載體的脂質部分的化學製劑和/或在載體中導入能特異性靶向送遞載體至優選位點(例如一種優選的細胞類型)的靶向試劑。其它合適的送遞載體包括金顆粒、聚-L-賴氨酸/DNA-分子綴合物以及人工染色體。
在一個實施方案中，用於本方法的試劑以適用於肺部送遞或鼻部送遞、特別是適用於氣霧劑送遞(在本文中還指氣霧製劑)的製劑給予。這種送遞途徑特別適用於預防或抑制患者的AHR和/或氣道炎症的方法中，但也可用於需要將其送遞到肺或氣道中的其他病症中。另外，這些製劑特別適用於送遞抗體。該製劑一般包括載體，優選可藥用載體。本發明的特別適用於氣霧劑送遞的載體包括但不限於無水乙醇、可分散乾粉、小型膠囊(如微膠囊或微粒)、脂質體、可注射賦形劑和噴霧劑。已描述了用於送遞蛋白和肽的無水乙醇，例如參見Choi et al.，2001，PNAS USA 98(20)11103-11107。詳細描述了適用於氣霧送遞試劑的可分散乾粉，例如參見美國專利No.6,165,463，通過援引全文納入本文(還可參見來自Inhale Therapeutic Systems，Inc.，nowNektar和Quadrant Technology的產品)。用於噴霧劑的合適脂質體包括任何脂質體，特別包括本發明的方法中由氣霧劑送遞的足夠小的任何脂質體。微膠囊和微粒為本領域所熟知。例如，AlliancePharmaceutical Corporation具有稱為PulmoSphere的顆粒工程技術，這通過專有的噴霧-乾燥方法製備，並被設計為中空多孔的。Ventolin的產品由懸浮於以CFC為基礎的推進劑的混合物中的微粉化沙丁胺醇(游離鹼)顆粒組成。Proventil HFA含有微粉化硫酸舒喘靈(albuterolsulfate)和少量乙醇共溶劑以溶解穩定的油酸表面活性劑。將藥物納入脂質體就氣霧劑送遞而言具有幾個優點。因為脂質體相對不可溶，所以某些藥物在肺中的保留時間可被延長，提高了藥效。脂質體主要通過吞噬細胞攝入，這使得脂質體特別適用於某些藥物的送遞。噴霧製劑在實施例中描述。送遞氣霧製劑的裝置包括但不限於壓力計量吸入器(MDI)、乾粉吸入器(DPI)、計量溶液裝置(metered solutiondevice，MSI)和超聲吸入器，並包括霧化器和吸入器的裝置。多種試劑可用於通過該裝置送遞的製劑中，作為特別用於蛋白送遞的懸液助劑和增溶劑(如低聚乳酸(oligolactic acid)、醯基-醯胺酸(acyl-amideacid)和單功能化(mono-functionalized)的M-PEGS，參見Mckenzieand Oliver；2000；Formulating Therapeutic Proteins and Peptides inPressurized Metered Dosed Inhalers For Pulmonary Delivery；3MHealth Care Ltd.，Morley Street，Loughborough，Leicesteshire LE111EP，UK)。
能靶向的可藥用載體在本文中指「靶向送遞載體」。本發明的靶向送遞載體能送遞包括抑制劑在內的製劑到患者的靶位點。「靶位點」指需要送遞治療製劑的患者內的位點。例如，靶位點可為由本發明的抗體或通過使用脂質體、病毒載體或其它送遞載體(包括核酶)直接注射或送遞所靶向的任何細胞或組織。可修飾本發明的送遞載體或抗體以靶向動物的特定位點，由此在該位點靶向和利用特定化合物、抗體、蛋白或核酸分子。合適的修飾包括操控送遞載體的脂質部分的化學製劑和/或在載體中導入能特異性靶向送遞載體至優選位點(例如一種優選的細胞或組織類型)的化合物。具體而言，靶向指通過載體內的化合物與細胞表面的分子相互作用使得送遞載體結合到特定細胞。合適的靶向化合物包括能選擇性(即特異性)結合在特定位點的另一種分子的配體。該配體的實例包括抗體、抗原、受體和受體配體。特別有用的實例包括與補體途徑相關的任何配體(如CR2、C3、C3d、C3dg、iC3b、C3b)或與待處理動物的細胞類型、組織類型或位點相關的任何配體。操控送遞載體的脂質部分的化學製劑可調節送遞載體的胞外或胞內靶向性。例如，可將一種化學物質加到脂質體的脂質製劑上，以改變該脂質體的脂質雙層的電荷，這樣脂質體與具有特定電荷特徵的特定細胞相融合。
一種用於各種給藥途徑和試劑的送遞載體為脂質體。脂質體能在動物內在足夠長的時間內保持穩定以將本發明中描述的核酸分子、甚至是蛋白或抗體送遞到動物的優選位點。根據本發明的脂質體包括能將本發明中描述的核酸分子送遞到動物的特定或選定位點上的脂質化合物。本發明的脂質體包括能與靶細胞的質膜相融合以將核酸分子送遞到細胞內的脂質組合物。用於本發明的合適的脂質體包括任何脂質體。本發明的優選的脂質體包括通常用於例如為本領域的技術人員所熟知的基因送遞方法中的脂質體。更優選的脂質體包括具有聚陽離子脂質組合物的脂質體和/或具有與聚乙二醇綴合的膽固醇骨架的脂質體。使用在本領域標準化的方法可聯合脂質體與本發明的核酸分子或抑制劑。
另一種送遞載體包括病毒載體。病毒載體包括用於本發明的方法中的分離核酸分子，其中核酸分子包裝到病毒外殼中，這允許DNA進入到細胞中。可使用多種病毒載體，包括但不限於以α病毒、痘病毒、腺病毒、皰疹病毒、慢病毒、腺病毒伴隨病毒和逆轉錄病毒為基礎的病毒載體。
根據本發明，本領域的技術人員可決定可接受的方案，以給予試劑、組合物或製劑，包括給予途徑以及給予動物的試劑的有效量。本發明的試劑可在體內或體外給予。合適的體內給予途徑可包括但不限於口服、鼻部、吸入、局部、氣管內、經皮、直腸和腸胃外途徑。優選的腸胃外途徑可包括但不限於皮下、真皮內、靜脈內、肌內和腹膜內途徑。優選的局部途徑包括通過氣霧劑吸入(即噴灑)或局部表面給予到動物的皮膚。優選地，試劑通過鼻部、吸入、氣管內、局部或全身途徑(如腹膜內、靜脈內途徑)給藥。體外指在患者的外部進行部分給藥步驟。優選的給予抗體的途徑包括腸胃外途徑和氣霧劑/鼻部/吸入途徑。
可使用本領域標準化的方法進行靜脈內、腹膜內和肌內給藥。使用本領域標準化的方法進行氣霧劑(吸入)送遞(參見例如Stribling etal.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 18911277-11281，1992，通過援引全文納入本文中)。適用於氣霧劑送遞的載體已在上文中描述。用於遞送氣霧製劑的裝置包括但不限於壓力計量吸入器(MDI)、乾粉吸入器(DPI)和計量溶液裝置(MSI)，並包括霧化器和吸入器的裝置。口部送遞可通過將本發明的治療組合物與能對抗動物的消化道內的消化酶降解的載體聯合進行。該載體的實例包括塑料膠囊或片劑，如那些本領域所熟知的塑料膠囊或片劑。直接注射技術特別適用於將重組核酸分子給予通過手術可接近的細胞或組織，特別是給予到身體的表面上或表面附近的細胞或組織。將組合物局部給予到靶細胞區域指將組合物注射到距靶細胞或組織的幾釐米處，優選距其幾毫米處。
已表明本文所公開的各種給藥方法以及送遞載體可將核酸分子有效送遞到靶細胞或組織，由此核酸分子轉染細胞並得以表達。在許多研究中，異源基因的成功送遞和表達在優選的細胞類型中和/或使用本發明的優選的送遞載體和給藥途徑實現。例如，使用脂質體送遞，1998年1月6日授權給Dow等人的美國專利No.5,705,151示出了在陽離子脂質體送遞載體中成功地體內靜脈送遞編碼超級抗原的核酸分子以及編碼細胞因子的核酸分子，藉此編碼蛋白在動物的組織中、尤其是肺組織中表達。Liu等人(1997)示出靜脈送遞含有基因的含膽固醇的陽離子脂質體可優選靶向肺組織並有效調節體內基因的轉移和表達。通過給予編碼核酸序列的病毒載體可完成多種核酸序列的送遞。
優選的用於本文所描述的任何方法中的試劑(包括蛋白、小分子和抗體)的單次劑量含介於約0.01微克×千克-1到約10毫克×千克-1動物體重。更為優選的試劑的單次劑量包含介於約1微克×千克-1到約10毫克×千克-1動物體重。更為優選的試劑的單次劑量包含介於約5微克×千克-1到約7毫克×千克-1動物體重。更為優選的試劑的單次劑量包含介於約10微克×千克-1到約5毫克×千克-1動物體重。若試劑通過氣霧劑送遞，特別優選的試劑的單次劑量包含介於約0.1毫克×千克-1到約5毫克×千克-1動物體重。若試劑通過腸胃外送遞，另一特別優選的試劑的單次劑量包含介於約0.1微克×千克-1到約10微克×千克-1的動物體重。
在一個實施方案中，本發明的合適的核酸脂質體複合物的單次劑量為約0.1μg到約100μg/kg給予複合物的患者體重。在另一實施方案中，合適的單次劑量為約1μg到約10μg/kg體重。在另一實施方案中，合適的核酸脂質複合物的單次劑量為至少約0.1μg核酸，更為優選至少約1μg核酸，更優選至少約10μg核酸，更優選至少約50μg核酸，更優選至少約100μg核酸。
在一個實施方案中，用於本文所描述的任何方法中的本發明的試劑的合適劑量為與未給予該試劑相比較有效抑制本文所描述的補體旁路的至少一種蛋白(如B因子、D因子或備解素)的表達或活性的劑量。上文已經描述了檢測蛋白的表達或生物學活性的方法。在另一實施方案中，本發明的試劑的合適劑量為可顯著抑制本發明的補體旁路的劑量。使用本領域所熟知的技術/分析可檢測補體激活及其抑制。例如，可在實施例中所描述的酵母聚糖A顆粒上進行C3沉積體外分析。還可測驗該試劑抑制人血清裂解未敏化紅細胞的能力。以這些分析為基礎，由體外結果外推得到體內劑量在本領域的技術人員能力範圍內。
本領域熟知在人中使用常規方法進行氣霧劑送遞，即使是使用吸入器，一般只有約10％的送遞溶液進入到氣道深處。若氣霧化送遞是通過直接吸入，便可假定劑量為通過噴霧方法所給予劑量的約10％。最後，使用類比法(allometric scaling)，本領域的技術人員易於將小鼠用劑量轉化為人用劑量。實質上，小鼠到人的劑量轉化是以化合物的清除率和小鼠的身體表面為基礎的。mg/kg的轉化取「未觀察到不良作用水平」(NOEL)值的1/12以獲得人用劑量的濃度。該計算假設小鼠和人之間的清除是相同的，對抗體而言人們認為事實確實如此。
因此，優選的抗體的單次劑量包含介於約1ng×千克-1到約少於1mg×千克-1動物體重。更優選的抗體的單次劑量包含介於約20ng×千克-1到約600μg×千克-1動物體重。更為優選的抗體的單次劑量，特別是當抗體製劑在通過噴霧法送遞時，包含介於約20ng×千克-1到約600μg×千克-1動物體重，更優選地，介於約20ng×千克-1到約500μg×千克-1，更優選地，介於約20ng×千克-1到約400μg×千克-1，更優選地，介於約20 ng×千克-1到約300μg×千克-1，更優選地，介於約20ng×千克-1到約200μg×千克-1，更優選地，介於約20ng×千克-1到約100μg×千克-1，更優選地，介於約20ng×千克-1到約50μg×千克-1動物體重。
另一優選的抗體的單次劑量，特別是在抗體製劑通過噴霧法送遞時，包含介於約200ng×千克-1到約600μg×千克-1動物體重，更為優選地，介於約200ng×千克-1到約500μg×千克-1，更為優選地，介於約200ng×千克-1到約400μg×千克-1，更為優選地，介於約200ng×千克-1到約300μg×千克-1，更為優選地，介於約200ng×千克-1到約200μg×千克-1，更為優選地，介於約200ng×千克-1到約100μg×千克-1，更為優選地，介於約200ng×千克-1到約50μg×千克-1動物體重。
另一優選的抗體的單次劑量，特別是在抗體製劑從吸入器通過直接吸入法送遞時，包含介於約2ng×千克-1到約100μg×千克-1動物體重，更為優選地，介於約2ng×千克-1到約50μg×千克-1，更為優選地，介於約2ng×千克-1到約10μg×千克-1，更為優選地，介於約2ng×千克-1到約5μg×千克-1，更為優選地，介於約2ng×千克-1到約1μg×千克-1，更為優選地，介於約2ng×千克-1到約0.5μg×千克-1，更為優選地，介於約2ng×千克-1到約0.25μg×千克-1，更為優選地，介於約2ng×千克-1到約0.1μg×千克-1動物體重。
在另一實施方案中，抗體以少於約500μg抗體/毫升製劑的劑量給予，優選少於約250μg抗體/毫升製劑，更優選地，少於約100μg抗體/毫升製劑，更優選地，少於約50μg抗體/毫升製劑，更優選地，少於約40μg抗體/毫升製劑，更優選地，少於約30μg抗體/毫升製劑，更優選地，少於約20μg抗體/毫升製劑，更優選地，少於約10μg抗體/毫升製劑，更優選地，介於約5μg抗體到約10μg抗體/毫升製劑。
具體關於降低或預防氣道高反應性和/或氣道炎症或與此相關的病症或疾病的方法，合適的給予動物的抑制劑的單次劑量指在一段恰當時間內單次或多次給予時，能降低或預防動物的氣道高反應性和/或氣道炎症，或降低有待治療的疾病(如哮喘)的至少一種其它症狀的劑量。當患者患有AHR或有患該病風險時，合適的試劑的單次劑量包括將AHR的激發劑劑量增加為兩倍或改善動物的靜態呼吸功能的劑量。
根據本發明的方法，給予動物抑制AHR的試劑的有效量包含能降低氣道高反應性(AHR)或氣道炎症同時對動物沒有毒的量。對動物有毒的量包含任何可引起動物的結構或功能損害(即有毒)的量。
在一個實施方案中，AHR抑制劑使患有AHR或有患該病風險的動物免於感染AHR的有效性可通過雙倍量測量。例如，若動物的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1在給予試劑前為1mg/ml，而在給予試劑後為2mg/mlMch，那麼通過給予指定試劑使動物免於感染AHR的能力(即降低或預防)是顯著的。同樣，若動物的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1在給予試劑前為2mg/ml，而在給予試劑後為4mg/ml Mch，則試劑被認為是有效的。優選的試劑的有效量包括能將經該試劑處理的動物的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1向正常動物的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1方向增加至約兩倍濃度的量。如上所述，正常動物指已知未患異常AHR或對其不敏感的動物。待測動物指被懷疑患有異常AHR或對其敏感的動物。
在本發明的一個實施方案中，在患有AHR的動物中，給予動物的試劑的有效量為與給予試劑前相比顯著降低動物的AHR的量。在另一實施方案中，給予動物的試劑的有效量為與具有AHR相關炎症而並未給予該試劑的動物群體的氣道AHR的水平相比顯著降低動物的AHR的量。試劑優選能降低動物的AHR，甚至是在AHR的身體症狀發作後(即急性AHR發作後)給予試劑時。更優選地，試劑的有效量為將AHR的症狀降低到在患者中AHR不再能檢測到的量。在另一實施方案中，試劑的有效量是在患者暴露於諸如過敏原的AHR激發刺激物前給予試劑時，可預防或顯著抑制AHR發作的量，其中該暴露過程在無該試劑的情況下足以誘導AHR。
在另一實施方案中，本發明的方法的試劑的有效量包括引起動物的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1值提高的量，其中在給予該試劑前，動物用第一濃度的乙醯甲基膽鹼激發時所獲得的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1值與給予該試劑後，動物用雙倍量的第一濃度的乙醯甲基膽鹼激發時所獲得的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1值相同。試劑的優選的量包括引起動物的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1值提高的量，其中在給予該試劑之前所獲得的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1值介於約0.01mg/ml到約8mg/ml乙醯甲基膽鹼之間，這與在給予該試劑之後所獲得的PC20乙醯甲基膽鹼FEV1值相同，此時該值介於約0.02mg/ml到約16mg/ml乙醯甲基膽鹼之間。
如上所述，試劑保護患有AHR或對其敏感的動物的有效性可通過測量給予試劑前後FEV1的提高百分比和/或FEV1/FVC檢測。在一個實施方案中，試劑的有效量包括能降低動物的氣流受限以使動物的FEV1/FVC值至少為約80％的量。在另一實施方案中，試劑的有效量包括能降低動物的氣流受限以使動物的FEV1/FVC值至少提高約5％，或至少約100cc或PGFRG 10L/min的量。在另一實施方案中，試劑的有效量包括使動物的FEV1提高至少約5％、更優選提高約6％到約100％、更優選提高約7％到約100％、更優選提高約8％到約100％(或約200ml)動物的預計FEV1的量。在另一實施方案中，試劑的有效量包括將動物的FEV1至少提高約5％、優選至少提高約10％、更優選至少提高約25％、更優選至少提高約50％、更優選至少提高約75％的量。
本領域的技術人員能決定給予動物的試劑的劑量數取決於氣道高反應性的程度、以該AHR為症狀的基礎病症以及有待治療的患者個體的反應性。另外，臨床醫師能決定有效降低動物的AHR的送遞試劑的恰當時間。優選地，在患者暴露於能有效誘導AHR的AHR激發刺激物的量前48小時內送遞試劑，更優選在患者暴露於能有效誘導AHR的AHR激發刺激物的量前36小時內，更優選24小時內，更優選12小時內，更優選6小時、5小時、4小時、3小時、2小時或1小時內。在一個實施方案中，在患者或臨床醫師意識到患者已暴露於或將暴露於AHR激發刺激物、特別是已暴露於或將暴露于敏化患者的AHR激發刺激物(即過敏原)時(即立即)給予該試劑。在另一實施方案中，在初次發現出現AHR(即急性AHR發作)時就給予試劑，優選至少在AHR症狀出現2小時內、優選在出現AHR症狀至少1小時內，更優選至少30分鐘內，更優選至少10分鐘內，更優選至少5分鐘內。上文已詳細描述了AHR的症狀以及測量或檢測該症狀的方法。優選地，進行該給予，直到AHR降低的徵兆出現，然後根據需要進行，直到AHR的症狀消失。
具體關於抑制或預防缺血-再灌注損傷的方法，試劑的有效量，特別是給予動物的B因子抗體或其抗原結合片段(或抗原結合多肽)的有效量為與不給予該試劑相比，顯著抑制動物的組織學損害(包括氧化損害或細胞死亡)的量。就腎臟缺血-再灌注損傷而言，給予動物的試劑的有效量為與未給予該試劑相比顯著抑制血清尿素氮的升高或顯著降低動物腎臟組織的組織學損傷的量。合適的給予動物的抑制劑的單次劑量為在一段合適的時間內給予一次或多次時能降低或預防動物的缺血-再灌注損傷的至少一種症狀、損傷類型或所引起的損害的劑量。上文已經詳細描述了抗體的合適劑量，包括用於各種給藥途徑的合適劑量。一方面，給予動物的抑制缺血-再灌注損傷的試劑的有效量包括能抑制由缺血-再灌注損傷所引起的至少一種症狀或損害，同時對動物無毒的量。
本發明的任何方法可用於任何動物，特別是哺乳類(即哺乳動物)脊椎動物綱的任何動物，包括但不限於靈長類、嚙齒類、家畜和馴養寵物。優選的使用本發明的方法治療的哺乳動物為人類。
以下實施例出於示例性目的，並非意在限制本發明的範圍。
實施例實施例1下列實施例描述了補體旁路的新型抑制劑的生產。
本發明人已製造了生產結合小鼠B因子的小鼠單克隆抗體的幾種雜交瘤細胞。在本研究中，發明人著手鑑定這些抗體中的其中一種抑制補體旁路的能力。發明人還在抗磷脂介導的胎兒丟失模型中檢驗了該抗體。如前人所述(Girardi)，B因子缺失的小鼠在該模型中免於胎兒丟失，並且發明人假設旁路途徑的外源抑制劑在這種疾病模型中是有效的治療試劑。
方法B因子-Ig融合蛋白的構建和小鼠B因子的純化。構建了編碼連接小鼠IgG1同種型的鉸鏈區、CH2區和CH3區的B因子基因的兩個短同源重複序列(SCR)的質粒(圖1)。選擇這些SCR結構域是因為它們是這些研究中所使用的fB-/-小鼠的B因子基因的缺失區段的一部分。
小鼠B因子的純化。通過親和純化從正常小鼠血清中純化補體B因子。根據製造商的說明書，通過將山羊抗人備解素B因子(Diasorin，Stillwater，MN)結合到CNBr-Activated Separose(Amersham，Arlington Heights，IL)製備親和柱。通過心臟穿刺對C57/B6J小鼠進行採血，並將血液收集到含有50μl 500mM EDTA的注射器中，以防止旁路途徑激活。將血液在2000rpm離心15min，收集血漿。然後用緩衝液(含EACA 50 mM、EDTA 10 mM、苄脒2 mM的PBS，pH7.4)1∶1稀釋血漿，然後用0.22μm過濾器(GE Water Technologies)過濾。將血漿加入親和柱，然後用10倍柱體積的緩衝液衝洗該柱。用5 M LiCl2洗脫B因子並用PBS過夜透析。然後在10％Tris-Glycine凝膠上電泳並用考馬氏亮藍染色檢測B因子的純度(未給出數據)。
靶向補體B因子的抑制型單克隆抗體的開發。如前入所述(Matsumoto)完成小鼠B因子的靶向缺失。用胚胎幹細胞Sv129細胞株製備B因子缺失的小鼠，然後在F1群體增殖前與C57BL/6小鼠雜交。用弗氏不完全佐劑乳化的重組B因子-Ig融合蛋白125μg免疫B因子缺失的小鼠，然後進行四次加強免疫，每次間隔三周。通過使用小鼠B因子包被培養板的酶聯免疫吸附分析(ELISA)和補體旁路抑制的體外分析(參見下文)檢驗小鼠血清，以此篩選出現抗B因子的抑制型抗體的小鼠。在最後注射後一天，將被鑑定具有針對B因子的強免疫應答的小鼠的脾細胞與來自美國科羅拉多州大學單克隆抗體中心(University of Colorado Monoclonal Antibody Center)的骨髓瘤細胞系融合。通過有限稀釋法克隆候選雜交瘤細胞，鑑定能抑制旁路途徑活性的克隆。一種雜交瘤細胞A1379被用於這些實驗。用Protein-G Sepharose柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)從組織培養上清液中純化A1379。使用多粘菌素(Sigma)將LPS從純化的mAb中除去。根據製造商的說明書使用鱟試劑測定(Limulus AmebocyteLysate Assay，BioWhittaker，Inc.，Walkersville，MD)檢驗mAb的LPS水平是否低於1 EU/mg mAb。然後在10％Tris-Glycine凝膠上電泳並用考馬氏亮藍染色檢查mAb的純度。
抗B因子抗體水平的ELISA分析針對純化B因子用酶聯免疫吸附分析(ELISA)檢驗小鼠血清，以此篩選對免疫接種產生免疫應答的小鼠。用溶於包被緩衝液(15mMNa2CO3，35mM Na2HCO3)的純化B因子125 ng包被96孔ELISA板(Costar，Corning，NY)並在4℃過夜保存。然後用200μl PBS衝洗該板。通過用溶於PBS的5％BSA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)200μl孵育這些板，阻斷非特異性結合。將板用含0.1％Tween 20的PBS 200μl洗滌兩次，然後與稀釋血清孵育1小時。用含0.1％Tween20和0.1％BSA的PBS 1∶100稀釋樣本，然後將該樣本以1∶1進行系列稀釋七次。然後將板洗滌兩次並用50μl綴合山羊抗小鼠IgG的過氧化物酶(Cappel，Durham，NC)孵育。然後將板洗滌四次並與100μl ABTS(含有1∶1000的30％H2O2)(Sigma)一起孵育，並用微量培養板讀數器(Biorad，Richmond，CA)在405 nm讀取吸光值。
補體旁路抑制的分析。然後將具有可檢測滴度的抗B因子抗體的血清就其抑制旁路途徑的能力進行篩選。這通過使用在酵母聚糖A顆粒(Sigma)上進行C3沉積體外分析進行(Quigg)。將溶於10ml 0.15M NaCl中的50mg酵母聚糖顆粒煮沸60分鐘，然後用PBS洗滌兩次。通過將反應混合物中的1×107酵母聚糖顆粒與終濃度分別為10mM和5mM的EGTA和MgCl2混合分析血清。10微升未操控C57/B6小鼠的血清被作為補體源加入。用最高達70μl免疫小鼠的血清(以篩檢抑制型抗體的形成)或用每次反應用0.0625μg到8μg滴定的純化抗體進行抑制分析。用PBS將樣本稀釋為100μl終體積，並在37℃孵育30min。酵母聚糖顆粒用冷PBS、1％胎牛血清洗滌兩次，然後與FITC綴合的山羊抗小鼠C3(Capple，Durham，NC)冰上孵育1小時。將樣本再洗滌兩次，用0.5ml PBS、1％胎牛血清重懸，然後通過流式細胞術進行分析。使用下列公式計算抑制百分比 還使用酵母聚糖分析就1379克隆的Fab片段抑制旁路途徑的能力對其進行了檢驗。根據製造商的說明書，通過將純化抗體與木瓜蛋白酶-瓊脂糖(ICN Biomedicals，Aurora，OH)一起孵育形成Fab片段。然後通過將消化的抗體應用到G蛋白柱上除去Fc片段以及未消化的IgG。在流出液中收集Fab片段，然後用0.1M甘氨酸-鹽酸(pH2.8)依次洗脫Fc片段和未消化的IgG。在酵母聚糖反應中使用了1μg Fab。已發現在本分析中所使用的多克隆抗小鼠C3抗體與多種物種發生交叉反應。因此，本分析可用於檢驗1379克隆對這些物種的旁路途徑的抑制作用。如上所述對該抑制型抗體進行滴定。
作為另一個對1379克隆抑制補體旁路的能力的分析，發明人檢驗了該抗體抑制人血清裂解未敏化兔紅細胞的能力。將兔全血與緩衝液1∶1混合，該緩衝液由1升蒸餾水中含20.5g葡萄糖、8.0g(二水合)檸檬酸鈉、4.0g NaCl、0.55g檸檬酸構成。然後將5ml紅細胞溶液與含1.1％NaCl、0.0025％5，5二乙基巴比妥鈉(Na-5，5 diethylbarbiturate)、pH7.35、8mM EGTA、2mM MgCl2的溶液1∶9混合。將該混合物37℃孵育幾分鐘，然後在4℃1000×g離心10分鐘。將該紅細胞再洗滌三次，然後重懸於40ml相同溶液。將50μl上述懸浮液加入人血清(5到100μl)緩衝溶液中，使得終體積為150μl。無血清緩衝液中的紅細胞作為陰性對照，加入100μl蒸餾水中的紅細胞作為陽性對照(完全裂解)。將樣本在37℃孵育30分鐘，並偶爾振蕩以保持細胞懸浮。加入1.5ml冷PBS終止反應，然後將樣本在1000×g離心5分鐘。使用分光光度計(Biorad)在415nm讀取每個上清液的光密度值。發現10μl血清使得紅細胞完全裂解。然後使用10μl該血清和濃度增加的1379克隆(1μg到12μg/反應)進行相同反應。旁路途徑活性的抑制百分率使用下列公式測定 1379克隆的體內藥代動力學。先將小鼠採血，然後腹腔內注射(IP)或靜脈內注射(IV)1mg或2mg劑量的抗體1379克隆。選擇這些劑量是因為據估計它們與B因子等摩爾。血清中的B因子大約為～200μg/ml(或～2.2μM，若B因子為90kD的蛋白)。因為1379抗體為150kD且成年小鼠的血管內體積約為3ml，注射1 mg(6.7μMol)將產生～2.2μM的循環濃度。因為抗體是雙價的，該等摩爾注射有望更為有效地引起旁路途徑的完全抑制。在注射抑制劑後1、2、6、24、48和96小時將小鼠採血。然後將來自這些時間點的血清用於酵母聚糖分析以評估旁路途徑的活性。
結果針對B因子的Ba部分的抑制型單克隆抗體的形成。如在方法部分所描述那樣形成針對小鼠B因子的單克隆抗體。來自免疫小鼠的血清用於分析是否存在抗B因子抗體(未給出數據)。選擇一種稱為1379的克隆用於進一步表徵，這是由於發現該雜交瘤細胞可快速生長，該抗體為IgG1的亞類(非補體激活)並且發現其上清是補體旁路的有效抑制劑。將抗體純化後(未給出數據)，在兩個旁路途徑激活的體外分析中檢驗了該抗體(圖2A和2B)。在將3μg抑制劑加入含10μl血清的反應體系中時，使用酵母聚糖分析發現該抑制劑完全抑制了旁路途徑。在該濃度下抗B因子抗體和B因子幾乎等摩爾濃度(假設B因子為200μg/ml，分子量為90,000 kD，在10μl血清中為0.022nMol，3μg分子量為150,000 kD的抗體等於約0.02 nMol)。在兔紅細胞裂解分析中，反應中用6μg抗體/10μl人血清可獲得完全抑制。然後使用1379克隆的Fab片段檢驗旁路途徑的抑制。當使用過量摩爾的1379克隆的Fab時，通過該分析觀察到旁路途徑活性的完全抑制。
然後在酵母聚糖分析中檢驗了1379抑制來自於多個不同哺乳動物物種的血清的旁路途徑活性的能力。在所檢測的大部分物種中，1379抗體能完全抑制旁路途徑活性(表1)。抗體能完全抑制小鼠、大鼠、人以及幾種猴類的血清的旁路途徑活性。但是，未發現任何針對狗或豚鼠的抑制活性。
表1

1379抗體的藥代動力學。在單次注射抑制型抗體後在不同時間就旁路途徑的抑制檢驗小鼠。在IV注射1小時以及IP注射2小時內1mg抗體引起完全抑制(圖3)。接受1mg IP注射的小鼠在24小時時依然保留對旁路途徑的完全抑制，接受2mg注射的小鼠在注射後長達48小時時依然保留完全抑制。發明人還每隔一天通過腹膜內注射反覆注射2mg 1379抗體，持續14天，結果表明在最後一次注射後補體旁路的完全抑制至少維持了48小時(未給出數據)。這些數據清楚表明該小鼠mAb並不被識別為「外來的」並且支持其在體內長期使用。最後，使用抗體F(ab)片段的實驗表明旁路途徑的抑制與完整1379抗體一樣獲得幾乎等摩爾水平(未給出數據)。
1379結合BaSCR3區的表位。1379抗體結合一系列B因子突變體的能力已有描述(Hourcade，1995，J.Biol.Chem.)，以表徵mAb結合位點。實驗表明將某些丙氨酸置換引入人B因子的SCR2和SCR3，而不是SCR1，使得1379抗體不能結合B因子。在所檢測的這25種不同突變體中，1379基本上不結合B17和B23突變體，並保留少於20％其與B18突變體的結合能力。這些都是SCR3突變。更具體而言，突變體B17用His-Cys-Pro置換139-Tyr-140-Cys-141-Ser，該位置與表示為SEQ ID NO2的成熟人B因子相關；突變體B23用Gly-Asn-Gly-Val置換182-Glu-183-Gly-184-Gly-185-Ser，該位置也與表示為SEQ ID NO2的成熟人B因子相關。因此，1379抗體結合到B因子的第三SCR結構域。
結論本發明人製備了針對小鼠B因子的新型單克隆抗體，被稱為1379克隆。該抗體是補體旁路的特異性抑制劑，它在體外和體內完全抑制該途徑。單次腹膜內注射1 mg引起旁路途徑的完全抑制長達48小時，多次注射延長了對該途徑的抑制。
使用體外分析表明1379完全抑制了多種物種的血清的旁路途徑活性，這些物種包括小鼠、大鼠、猴和人。使用對抗體與一系列B因子突變體的結合親和力分析，測得抗原位點在B因子的SCR3結構域(fB-/-小鼠缺失區域的一部分)。B因子蛋白的該區域與D因子剪切位點毗鄰。1379的Fab片段抑制旁路途徑活性的能力表明其不僅僅是由1379引起可防止被剪切的空間位阻，而且該特異性結合位點還是D因子介導的蛋白剪切的關鍵位置。1379針對如此眾多不同物種的血清的有效性說明該位點在高等哺乳動物中高度保守。
已經開發了幾種其它可溶性補體抑制劑並對其進行了鑑定(Quigg；Weisman；Heller；Granger；Pratt)，但是相信本文所描述的抑制劑是在大範圍動物物種中選擇性抑制旁路途徑的第一個抑制劑。通過選擇性抑制旁路途徑，1379與在C3轉化酶水平起作用的抑制劑相比較具有幾個優點。通過不破壞經典途徑，該抑制劑可能具有較少的免疫抑制效應。另外，經典途徑的阻斷實際上可誘導自身免疫。旁路途徑的選擇性阻斷改善了狼瘡腎炎小鼠模型的症狀(Watanabe)，而C3缺失卻不能改善其症狀。旁路途徑具體涉及多種疾病模型(Thurman；Watanabe；Girardi)，表明了特異性旁路途徑抑制劑的治療潛能。
參考文獻1.Thurman et al.，2003，JImmunol1701517-15232.Watanabe et al.，2000，JImmunol 164786-7943.Girardi et al.，2003，JClin Invest 1121644-16544.Holers，V.M.2003，Clin Immunol 107140-1515.Densen et al.，l996，Mol Immunol 3368(Abstract 270)6.Matsumoto et al.，1997，Proc Natl Acad Sci USA948720-87257.Figueroa and Densen，1991，Clin Microbiol Rev 4359-3958.Quigg et al.，1998，J Immunol1604553-45609.Weisman et al.，1990，Science 249146-15110.Heller et al.，1999，J Immunol163985-99411.Granger et al.，2003，Circulation 1081184-119012.Pratt et al.，2003，Am JPathol 1631457-1465實施例2下述實施例表明通過旁路途徑的補體激活在氣道高反應性和炎症的進展中很關鍵，還進一步表明對旁路途徑的補體激活的抑制抑制了氣道高反應性。
考慮到在暴露於過敏原前抑制補體激活的有效性，本發明人還檢測了補體激活途徑。在本研究中本發明人報導通過旁路途徑的補體級聯反應的激活在氣道高反應性和氣道炎症的進展中很關鍵。
方法動物從Jackson實驗室(Bar Harbor，ME)獲得8到12周齡的雌性C57BL/6小鼠。如前所述，首先將B因子雜合缺失的小鼠(fB+/-)與C57BL/6品系雜交，然後再在F1代互交，然後互交形成fB-/-品系。然後將這些小鼠與C57BL/6小鼠回交7代。使用同類系的fB+/+同窩小鼠作為對照小鼠。C4缺失小鼠((C4水)，與C57BL/6小鼠回交17代)保留在動物實驗室。在本研究中所使用的全部實驗動物的飲食不含卵清蛋白(OVA)，並遵循國家猶太醫療和研究中心的實驗動物管理與使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee ofthe national jewish medical and research center)批准的協議。
實驗方案在第1天和14天通過腹膜內注射(i.p.)20μg懸浮於2.25mg氫氧化鋁(Alum Imuject；Pierce，Rockford，IL)的OVA(V級，SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)或豚草(Ambrosia artemisiifolia，GreerLaboratories，Lenoir，NC)敏化小鼠，然後在第27、28和29天使用噴霧OVA或豚草(1％，溶於PBS)、超聲噴霧器(De Vibiss HealthCare，Somerset，PA)通過氣道攻擊，每天20分鐘。
為重構fB，在每次氣道攻擊未敏化和敏化fB-/-小鼠前1個小時通過用於鼻部給予10μg、1μg或0.1μg純化fB(50μL，溶於PBS)。作為對照，給予PBS。
在不同的實驗中，在每次OVA攻擊前2小時，將針對fB的抗體(抗fB)通過i.p.注射(2mg/次處理/小鼠)或通過噴霧法給予敏化小鼠。就噴霧法而言，將4隻小鼠放入有機玻璃盒中，並使用超聲噴霧器(DeVilbiss Health Care)將0.5mg抗fB(溶於5ml PBS)噴霧。作為對照，相同劑量和體積的大鼠IgG在相同時間點通過i.p.注射或噴霧。在第31天，評估AHR並在同一天將動物處死，收集BAL液、血液和肺組織。
B因子的純化為重構B-/-小鼠的旁路途徑活性，通過親和純化法從正常小鼠血清純化小鼠補體B因子。根據製造商的說明書，通過將山羊抗人備解素B因子(Diasorin，Stillwater，MN)結合到CNBr-Activated Separose(Amersham，Arlington Heights，IL)製備親和柱。通過心臟穿刺對C57/B6J小鼠進行採血，並將血液收集到含有50μl 500mM EDTA的注射器中，以防止旁路途徑激活。將血液在2000rpm離心15分鐘，然後收集血漿。然後將血漿用緩衝液(含EACA 50 mM、EDTA 10 mM、苄脒2 mM的PBS，pH7.4)1∶1稀釋，並用0.22μm過濾器(GE WaterTechnologies)過濾。將血漿加入親和柱，並用10倍柱體積的緩衝液衝洗。用5 M LiCl2洗脫B因子並用PBS透析過夜。在10％Tris-Glycine凝膠上電泳並用考馬氏亮藍染色檢測B因子的純度。通過鱟試劑測定(BioWhittaker，Inc.，Walkersville，MD)測定LPS的濃度，發現該濃度低於1 EU/mg純化B因子。
抗B因子抗體的形成抗小鼠B因子單克隆抗體可如實施例1所述生產。簡而言之，用重組融合蛋白免疫B因子缺失的小鼠，該重組融合蛋白是由B因子基因的第二和第三短同源重複序列(SCR)結構域以及免疫球蛋白形成。選擇SCR結構域是由於它們為fB-/-小鼠B因子基因缺失區段的一部分。然後用該蛋白免疫fB-/-小鼠，並加強免疫四次，每次間隔三周。在最後一次注射後一天，將脾細胞與從美國克羅拉多大學單克隆抗體中心獲得的骨髓瘤細胞融合。然後鑑定和表徵分泌抗B因子單克隆抗體(mAb)的克隆。一種雜交瘤細胞A1379被用於這些實驗。用Protein-G Sepharose柱(Pharacia，Uppsala，Sweden)從組織培養上清液中純化A1379。使用多粘菌素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)將LPS從純化的mAb中去除。根據製造商的說明書，使用鱟試劑測定(BioWhittaker，Inc.，Walkersville，MD)來確定mAb的LPS水平是否低於1 EU/mg mAb。然後在10％Tris-Glycine凝膠上電泳並用考馬氏亮藍染色檢測mAb的純度。
氣道功能的檢測氣道反應性通過給予濃度逐漸增加(6.25、12.5、25、50和100mg/ml)的氣霧化乙醯甲基膽鹼(MCh)10秒(每分鐘呼吸60次，潮氣量為500μl)攻擊後氣道功能的變化來評估。麻醉小鼠(戊巴比妥鈉，i.p.，70到90mg/kg)、氣管切開小鼠(18G插管)通過機械通氣(每分鐘呼吸160次，潮氣量為150μl、呼氣末正壓為2-4cm H2O)並評估了肺功能(Takeda，1997)。通過將氣流、體積和壓力代入運動公式連續計算(Labview，NationalInstruments，TX)氣道阻力(RL)。取RL的最大值，並表示為PBS氣霧劑獲得的相對基線的變化百分率。在各自的缺失小鼠或對照小鼠之間基線RL值沒有顯著差異。
支氣管肺泡灌洗和細胞因子的測量評估完氣道功能後，通過氣管導管用Hank平衡鹽溶液(1×1ml，37℃)灌洗肺。使用細胞計數器(Coulter Counter；Coulter Co.，Hialeah，FL)獲得BAL細胞數。將細胞離心製劑進行差異細胞計數並計算每種細胞類型的百分比和絕對數。通過ELISA評估BAL液中的細胞因子水平(Tompkinson)。根據製造商的指示進行IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12(全部購自PharMingen，San Diego，CA)和IL-13(RDSystems，Minneapolis，MN)ELISA。
根據製造商的指示(Cedarlane Laboratories，Hornby，Ontario，Canada)，在第一次或第二次過敏原攻擊後24小時和在第三次和最後一次攻擊後24小時和48小時，通過ELISA測量未敏化小鼠和敏化小鼠BAL液中的C3a desArg的水平。
組織學和免疫組織化學研究獲得BAL液後，用2ml 10％福馬林通過氣管使肺膨脹，然後用相同溶液通過浸漬法固定。組織切片用蘇木精和伊紅、高碘酸西夫劑(PAS)染色，並用兔抗小鼠MBP抗體(由J.J.Lee，Mayo Clinic，Scottsdale，AZ提供)對含嗜酸性主要鹼性蛋白(MBP)的細胞進行免疫組織化學檢測。通過盲目方式檢查了切片並且通過使用NIHScionImage軟體(1.62版，由美國國立衛生研究所開發，在網際網路上可得)分別對支氣管周組織的嗜酸性粒細胞和杯形細胞進行分析。
總IhE和OVA特異抗體的測量如前人所述(Tompkinson)，通過ELISA測量了總IgE和OVA特異IgE和IgG1的血清水平。樣本的OVA特異抗體滴度與內部收集的標準品相關，它們被人為指定為500 ELISA單位(EU)。通過與已知小鼠IgE標準品(553481，PharMingen)比較計算總IgE的水平。
統計分析方差分析(ANOVA)被用來檢測所有組次之間的差異水平。通過Tukey-Kramer可靠的顯著差異(HSD)進行對全部組次的比較。顯著性的概率值被設為0.05。全部測量值被表示為平均值±平均值的標準誤(SEM)。
結果通過旁路途徑的補體激活在過敏原攻擊敏化小鼠後AHR的進展中很重要為評估旁路途徑在AHR和氣道炎症的進展過程中的作用，OVA敏化和未敏化fB-/-小鼠和配對對照小鼠(fB+/+)用1％OVA氣霧劑連續攻擊三天。被敏化和攻擊fB+/+小鼠與僅被攻擊的fB+/+小鼠相比其對MCh的反應性增加(圖4)。相反，被敏化和攻擊fB-/-小鼠與被敏化和攻擊fB+/+小鼠相比其在整個劑量-反應性曲線中表現出對MCh顯著降低的反應性(P＜0.01)，因此表明在被敏化和攻擊後顯然不能出現AHR。
通過旁路途徑的補體激活在過敏原攻擊敏化小鼠後氣道炎症的進展中很重要氣道炎症是過敏性氣道疾病的特徵性特徵。為評估氣道炎症，在最後一次氣道攻擊後48小時獲得了BAL液和肺組織。被敏化和攻擊fB+/+小鼠與僅被攻擊的小鼠相比其BAL液中的總細胞計數增加，特別是嗜酸性粒細胞的數量增加，其中僅被攻擊的小鼠在其BAL液中沒有嗜酸性粒細胞(圖5)。被敏化和攻擊fB-/-小鼠與被敏化和攻擊fB+/+小鼠相比BAL液中的總細胞計數以及嗜酸性粒細胞數量顯著降低(p＜0.01)，但是仍然顯著高於僅被攻擊的對照組(p＜0.01)。同樣，fB-/-小鼠與豚草敏化和攻擊的對照組相比在用豚草敏化和攻擊後BAL液中的嗜酸性粒細胞數量也降低了(圖5)。
過敏原敏化和氣道攻擊與僅被攻擊相比可引起支氣管周炎症的增加，特別是嗜酸性粒細胞滲入的增加(圖3)。但是被敏化和攻擊fB-/-小鼠與被敏化和攻擊對照小鼠相比支氣管周炎症顯著降低(表2)。為定量肺中的嗜酸性粒細胞滲入量，組織切片用抗主要鹼性蛋白染色(未給出數據)。在僅被攻擊的小鼠中，在支氣管周組織中僅發現少量嗜酸性粒細胞。敏化和隨後的過敏原攻擊的fB+/+小鼠使得其支氣管周嗜酸性粒細胞數量顯著增加(表2)。相反，被敏化和攻擊fB-/-小鼠其支氣管周僅有少量嗜酸性粒細胞滲入(表2)。
過敏性氣道疾病的另一特點在於氣道上皮細胞杯形細胞增生。肺用高碘酸-西夫劑染色，以鑑定氣道上皮中的含有粘液的細胞。被敏化和攻擊小鼠的大量細胞通過染色發現為粘液陽性(表2)，相反，僅被攻擊的小鼠中未檢測到PAS陽性細胞(表2)。被敏化和攻擊fB-/-小鼠其氣道上皮中含有粘液的細胞顯著低於被敏化和攻擊野生型小鼠(p＜0.001)。
通過旁路途徑的補體激活影響BAL液中的細胞因子的產生T細胞產生的Th2細胞因子在誘導過敏性氣道炎症和AHR中起著重要的作用。為評估過敏原攻擊後細胞因子應答，在最後一次OVA攻擊後48小時評估了BAL液中IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13和IFN-γ的濃度。與僅被攻擊的對照組相比，被敏化和攻擊的野生型小鼠其IL-4、IL-5和IL-13顯著提高(p＜0.05)，而IL-10、IL-12和IFN-γ顯著降低(p＜0.05)(未給出數據)。fB-/-小鼠的BAL液中的TH2細胞因子水平(IL-4、IL-5和IL-13)有所降低(未給出數據)。
fB缺失並不影響抗原特異抗體的血清水平最後一次氣道攻擊後48小時測量總IgE和OVA特異IgE和IgG1的血清水平。與僅被攻擊的對照組小鼠相比，被敏化和攻擊的fB+/+小鼠其總IgE和OVA特異IgE和IgG1的水平有所提高(表3)。同樣，fB-/-小鼠其總IgE和OVA特異IgE和IgG1的水平也有所提高，這與被敏化和攻擊的fB+/+小鼠在統計學上沒有差異，表明在這些小鼠中對被過敏原敏化和攻擊的體液應答保持完好。
表2.杯形細胞增生和支氣管周嗜酸性粒細胞炎症的定量

如在方法部分所述，敏化和攻擊小鼠。在最後一次攻擊後48小時估算了杯形細胞(PAS陽性細胞)以及支氣管周嗜酸性粒細胞(抗主要鹼性蛋白(MBP)陽性細胞)的數量。表示為平均值±SEM；fβ-/-B因子缺乏小鼠；fβ+/+同類系野生型對照小鼠；C4-/-補體因子4缺乏小鼠；C4+/+同類系野生型對照小鼠；對照Ab被敏化和攻擊的C57BL/6小鼠用對照Ab通過i.p.進行處理；抗-fβ，i.p.被敏化和攻擊的C57BL/6小鼠通過i.p用抗fβ抗體處理；抗fβneb被敏化和攻擊的C57BL/6小鼠通過吸入用抗fβ抗體處理；BM(基膜)。*p＜0.05，與僅被攻擊的fβ+/+、被攻擊的fβ-/-、被敏化和攻擊的抗fβi.p.以及被敏化和攻擊的抗fβ neb相比較。#p＜0.05與僅被攻擊的fβ+/+相比較。
表3血清免疫球蛋白水平

如在方法部分所述，敏化和攻擊小鼠。在最後一次攻擊後48小時估算了免疫球蛋白的血清水平。表示為平均值±SEM；fβ-/-B因子缺乏小鼠；fβ+/+同類系野生型對照小鼠；對照Ab被敏化和攻擊的C57BL/6小鼠用對照Ab通過i.p.進行處理；抗-fβ，i.p.被敏化和攻擊的C57BL/6小鼠通過i.p.用抗fβ抗體處理；抗fβ neb被敏化和攻擊的C57BL/6小鼠通過吸入用抗fβ抗體處理；EU/ml(Elisa單位/ml)。*p＜0.05，與僅被攻擊的fβ+/+和被攻擊的fβ-/-相比較。
該模型中經典途徑的激活對過敏性氣道疾病的進展並不重要為進一步確定對被敏化和攻擊的小鼠的肺中過敏反應的進展很關鍵的補體途徑，發明人使用缺失補體組分4(C4-/-，它在經典途徑和凝集素途徑的激活中是必須的)的小鼠與fB-/-小鼠相比較。
為評估補體途徑的激活，估算了BAL液中的C3a desArg水平。僅被攻擊的小鼠C3a desArg水平較低(未給出數據)。相反，在第一次、第二次以及第三次攻擊後，被敏化小鼠BAL液中C3a desArg水平有所增加，並且在最後一次攻擊後48小時達最高值(未給出數據)。有趣的是，被敏化和攻擊C4-/-小鼠與被敏化和攻擊野生型小鼠的C3a水平相當，這與被敏化和攻擊fB-/-小鼠相反fB-/-小鼠與其各自的被敏化和攻擊的野生型小鼠相比C3a desArg水平降低(未給出數據)。這些數據表明在敏化小鼠暴露於過敏原後，出現了通過旁路途徑的補體激活。
C4-/-小鼠(出現與被敏化和攻擊C4+/+小鼠相當的AHR水平(圖9)。同樣，與被敏化和攻擊對照小鼠(n＝10；分別為175±53；35±12；115±32×103細胞)相比，C4-/-小鼠支氣管肺泡灌洗(BAL)液中的總細胞計數(平均值±SEM，n＝10；163±35×103細胞)或淋巴細胞數量(28±9×103細胞)和嗜酸性粒細胞(98±23×103細胞)數量沒有降低(未給出數據)。與各自的被敏化和攻擊WT小鼠相比，進一步被敏化和攻擊C4-/-小鼠其支氣管周嗜酸性粒細胞數量和杯形細胞數量提高水平相當(表2)。這些發現表明該模型中的經典途徑的激活對過敏性氣道疾病的進展而言並不重要。
在fB缺失小鼠中不出現AHR和氣道炎症並不是OVA特異的為評估在過敏原敏化和攻擊後不出現氣道高反應性是否是由於對OVA無特異應答，用豚草敏化和攻擊fB-/-小鼠以及野生型小鼠。豚草敏化和攻擊的fB-/-小鼠對MCh的反應性降低，而fB+/+對MCh反應強烈(圖6A和6B)。同樣，與fB+/+相比，豚草敏化和攻擊的fB-/-小鼠BAL液中氣道炎症降低(圖6C)。
給予B因子重構fB-/-小鼠出現AHR和氣道炎症的能力為在肺中重構B因子，在每次氣道攻擊前，fB-/-接受單次鼻部使用10μg、1μg或0.1μg純化B因子(圖7)或PBS。在每次攻擊前用0.1μgB因子處理的被敏化和攻擊fB-/-小鼠其對MCh反應性下降，這與用PBS處理的被敏化和攻擊fB-/-小鼠相似，但是與被敏化和攻擊fB+/+小鼠相比顯著降低(圖7A)。與用PBS或0.1μg純化B因子處理的被敏化和攻擊fB-/-小鼠相比，用1μg純化B因子處理的被敏化和攻擊小鼠其氣道反應性有所增強，但是在統計學上沒有差異(圖7A)。相反，與被敏化和攻擊fB+/+小鼠相同，在每次氣道攻擊前用10μg純化B因子處理被敏化和攻擊fB-/-小鼠其對MCh的反應性增強。
與在被敏化和攻擊fB+/+小鼠中所觀察到的細胞數相同，在每次氣道攻擊前用10μg純化B因子處理被敏化和攻擊fB-/-小鼠，也提高了氣道炎症，特別是提高了BAL液中的嗜酸性粒細胞數，但是用0.1μg或1μg純化B因子處理不能提高BAL液中的嗜酸性粒細胞的數量(圖7B)。若在每次氣道攻擊前將B因子給予未敏化受體，未觀察到AHR或氣道炎症反應，這表明需要敏化階段以對攻擊做出反應，同時還表明在fB-/-小鼠中敏化階段是完整的。fB-/-小鼠的這些數據直接表明旁路途徑的B因子對於過敏性氣道疾病的進展而言是關鍵的。
用fB中和抗體處理抑制被敏化和攻擊小鼠的AHR的出現為評估在被敏化和攻擊的無基因缺失的小鼠中通過旁路途徑的補體激活的作用，按照方法部分所述將C57BL/6敏化。將實施例1中所描述的1379抗B因子抗體通過噴霧法全身或局部給予，這已被表明它是給予其它補體抑制劑的有效途徑。正常小鼠，在被敏化後攻擊階段用抗B因子通過全身或局部(噴霧法)處理後，其AHR顯著降低(圖8A和8B)，同時氣道中的氣道炎症和嗜酸性粒細胞增多被抑制(圖8C)。另外，在這些抗fB處理的小鼠中組織炎症、支氣管周嗜酸性粒細胞數量(表2)以及杯形細胞數量(表2)降低。另外，fB抗體處理的小鼠的BAL液中IL-4、IL-5和IL-13水平顯著降低(未給出數據)。同樣，用抗B因子處理被敏化和攻擊C4-/-小鼠降低了其氣道反應性以及氣道炎症(圖10)。這些結果與使用補體抑制劑的研究相一致在經典途徑和旁路途徑之間沒有區別，但是阻斷了晚期氣道反應性以及AHR的進展。
參考文獻
1.Busse et al.，2001，N Engl J Med344350-622.Lee et al.，2001，J Allergy Clin Immunol 107945-573.Henson P.，2000，Nat Immunol 1190-24.Humbles et al.，2000，Nature 406998-10015.Krug et al.，2001，Am J Respir Crit Care Med 1641841-36.Drouin et al.，2001，J Immunol 1662025-327.Karp et al.，2000，Nat Immunol 1221-68.Drouin et al.，2002，J Immunol 1695926-59339.Bautsch et al.，2000，J Immunol 1655401-510.Walters et al.，2002，Am JRespir Cell MolBiol27413-811.Kalli et al.，1994，Springer Semin Immunopathol15417-3112.Weisman et al.，1990，Science249146-5113.Wong and Fearon，1985，J Immunol 1344048-5614.Li et al.，1993，J Immunol 1514295-30515.Kim et al.，1995，J Exp Med 181151-916.Quigg et al.，1998，J Immunol 1604553-6017.Holers et al.，2002，J Exp Med 195211-2018.Rehrig et al.，2001，J Immunol 1675921-719.Rah et al.，2003，J Allerg Clin Immunol 111A91620.Takeda et al.，1997，J Exp Med 186449-5421.Tomkinson et al.，2001，Am J Respir Crit Care Med 163721-3022.Taube et al.，2002，J Immunol 1696482-923.Oshiba et al.，1996，J Clin Invest 971398-40824.Oshiba et al.，1997，J Immunol 1594056-6325.Hamelmann et al.，1999，Am J Respir Cell Mol Biol 21480-926.Kohl，2001，Mol Immunol 38175-8727.Schwartz et al.，1983，J Immunol 1301891-528.Mulligan et al.，1996，J Clin Invest 98503-1229.Czermak et al.，1999，Nat Med5788-9230.Holers，2000，Immunopharmacology 49125-3131.Drouin et al.，2001，J Immunol1674141-532.Carroll，1998，Annu.Rev.Immunol.16545-6833.Fischer et al.，1996，J Immunol 157549-5634.Wittmann et al.，1999，J Immunol 1626763-935.Braun et al.，2000，J Immunol 1643009-1736.Abe et al.，2001，J Immunol 1674651-6037.Hamelmann et al.，1999，Am J Respir Crit Care Med 160934-4138.Hamelmann et al.，1997，Am J Respir Crit Care Med 155819-2539.Corry et al.，1996，J Exp Med 183109-1740.Wills-Karp et al.，1998，Science 2822258-6141.Grunig et al.，1998，Science 2822261-3
42.Kopf et al.，2002，Nat Med 8373-843.Werfel et al.，2000，J Immunol 1656599-60544.La Flamme et al.，2003，J Immunol 170470-47645.Takafuji et al.，1996，Allergy 51563-846.DiScipio et al.，1999，J Immunol 1621127-3647.Elsner et al.，1994，Blood 833324-3148.Elsner et al.，l994，Eur J Immunol 24518-22實施例3下面的實施例描述了對本發明人所生產的一系列抗B因子抗體的其它結合數據。分析用於檢驗小鼠B因子和人B因子對各種抗體的結合和/或抑制。如所見到的那樣，mAB 1379可結合和抑制小鼠和人的B因子。相反，稱為624的mAb能結合小鼠和人B因子，但是不能抑制人旁路途徑。競爭ELISA用於進一步評估抗體。如所見到的那樣，抗體624、691和1231並不能阻斷1379的結合。因此這些抗體一定在不同的位點結合該蛋白，這解釋了為什麼它們在體外結合B因子而不抑制其功能。但是，抗體395、1322和1060是1379的競爭性抑制劑。
表4

實施例4下述實施例描述了mAb 1379在人B因子表面的表位圖。
對mAb 1379抗體作表位圖的第一個實驗表明B因子上的表位或抗體結合位點並不是線性的。當抗體附著在ELISA板上時，它與全長蛋白結合強烈。構建了長為10個胺基酸的肽以跨越已知出現結合的蛋白區域(SCR2-3)。當這些肽附著到ELISA板上時，抗體並不識別它們，表明這些線性序列中沒有一個被識別為表位。
將被mAb 1379識別的人B因子的預計保守結合表面或表位模型化。簡而言之，以解析的CR2-SCR1-2的三維結構為基礎構建人B因子的三級結構(Protein Data Bank(PDB)id 1GHQ)。將最終模型改進為最低能量狀態，並將約束因素固定在每個SCR的四個絕對保守的Cys殘基上。B因子SCR2-3與CR2 SCR1-2的序列的同一性為30％(最高)，與H因子SCR15-16的為25％，與CD46的為20％。圖11示出B因子結構的模型，並指出了對應mAb 1379表位(相對於SEQID NO2)的胺基酸位置。被認為形成mAb 1379抗體的構象表位的殘基為Ala137、Tyr139、Ser141、Glu182、Ser185、Thr189、Glu190和Ser192，但是該表位可能僅含有圖11中所示出的少量殘基、基本上全部殘基或較該圖中所示出的更多殘基。
現在該模型被用於預測之前所討論的來自Hourcade(Hourcade，1995，J。Biol.Chem)的B因子突變體的效果，該突變體最初用於表徵結合mAb 1379抗體的表位(參見實施例1)。下文示出來自這一系列的四種突變體，它們含有屬於圖11所示的mAb 1379表位模型的殘基。如下文所示，實施例1中所示出的降低mAb 1379的結合的B17和B23突變體具有預計朝向內部的特定置換(被表示為加粗和傾斜)，因此可能干擾結合mAb 1379的表位或保守結合表面的結構。儘管突變體B16/17含有結合mAb 1379的模型化表位中的殘基，但是它並不認為具有幹擾表位結構的突變，這可解釋為什麼在首次圖譜實驗中該突變體結合該抗體。同樣，儘管突變體B23/24也含有結合mAb 1379的模型化表位中的殘基，但是該突變體也結合在首次圖譜實驗中的抗體，形成抗體接觸位點的殘基可能不會被這些突變所幹擾。本實驗還闡明了本發明的抗體可結合B因子蛋白或其部分，具有保守突變或基本不幹擾該表位的突變。
B17Y139-C140-S141置換H PB23E182-G183-G184-S185置換G N V
Bl6/17G136-A137-G138置換 NSSB23/24S187-G188-T189-E190-P191-S192置換 D ET AV圖12為示意圖，該圖示出結合B因子的mAb1379(一個Fab片段)的模型化複合物，該Fab的抗原結合端被模型化以覆蓋所繪製的全部表位區域(如圖11所示)。
實施例5下述實施例表明補體旁路的抑制、特別是B因子的抑制抑制和預防動物免受腎臟缺血-再灌注損傷。
進行實驗以檢驗在缺血性急性腎功能衰竭模型中mAb1379在弱化損傷方面的有效性。在該模型中，通過將小鼠麻醉並將腎蒂夾24分鐘，誘導缺血性急性腎功能衰竭。小鼠腹膜內注射1mg mAb一小時後誘導損傷。該方法引起引起缺血性急性腎功能衰竭的逆轉形式，並且損傷峰一般在夾子拿離腎蒂並且血液回流到腎臟後24小時出現。然後通過測量諸如SUN和血清肌酸酐的含氮廢物的累積以及由腎臟病理學家評估腎臟的形態學損傷評估腎臟損傷。發明人進一步表明在腎臟再灌注後補體的旁路途徑很快被激活，還表明該激活有助於所引起的腎臟損傷。
免疫螢光法和蛋白質印跡分析檢測確認本文所描述的1379抗體在I/R後有效阻止了補體激活。如圖13所示，用1379預處理的小鼠與野生型對照組相比，在再灌注24小時後其血漿尿素氮(SUN)提高幅度較小(78±15mg/dL對119±15mg/dL，p＜0.05，每組n＝11)。在用1379處理的小鼠中也有更輕微的組織學損傷。以盲目形式由病理學家分級時，1379處理小鼠較對照小鼠其腎小管損害顯著降低(3.3±0.5對4.9±0.1，p＜0.01，每組n＝10)。因此，1379有效預防了在I/R後小鼠腎臟中的補體激活，1379預處理緩解了I/R後功能損傷和組織學損傷。
在另一個實驗中，通過與抗黴素一起培養使培養物中的腎小管上皮細胞化學缺氧兩個小時。然後將細胞暴露於新鮮小鼠血清(作為補體來源)，測量作為細胞死亡標記的乳酸脫氫酶(LDH)，並使用商業分析試劑盒(Promega，Madison，WI)在任意單位中表達。暴露於抗黴素和血清中的細胞較僅暴露於血清中的細胞其釋放的LDH顯著增加(100,140±3307(抗黴素+血清)對69,255±9754，p＜0.05；未給出數據)。但是，在與細胞一起培養前血清與mAb1379一起孵育時，LDH的釋放下降為76,471±7720(p＜0.01對用抗黴素+血清處理的細胞，未給出數據)。因此mAb1379保護了在體內或體外暴露於旁路途徑的組分中的含氧低的腎小管上皮細胞。
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儘管本發明的各個實施方案已被詳細描述，但顯而易見的是本領域的技術人員可對這些實施方案進行修改和改變。但是，應該清楚了解的是這些修改和改變在所附權利要求所限定的本發明的範圍內。
序列表110V.M.霍勒斯J.M.瑟曼C.陶布E.W.格爾範德G.S.吉爾克森120B因子、補體旁路的抑制及與此相關的方法1302848-6615060/543,5941512004-02-1015060/636,2391512004-12-14150US04/0150401512004-05-131606170PatentIn version 3.32101211764212PRT213人(Homo sapiens)4001Met Gly Ser Asn Leu Ser Pro Gln Leu Cys Leu Met Pro Phe Ile Leu1 5 10 15Gly Leu Leu Ser Gly Gly Val Thr Thr Thr Pro Trp Ser Leu Ala Arg20 25 30Pro Gln Gly Set Cys Ser Leu Glu Gly Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser35 40 45Phe Arg Leu Leu Gln Glu Gly Gln Ala Leu Glu Tyr Val Cys Pro Ser50 55 60Gly Phe Tyr Pro Tyr Pro Val Gln Thr Arg Thr Cys Arg Ser Thr Gly65 70 75 80Ser Trp Ser Thr Leu Lys Thr Gln Asp Gln Lys Thr Val Arg Lys Ala85 90 95Glu Cys Arg Ala Ile His Cys Pro Arg Pro His Asp Phe Glu Asn Gly100 105 110Glu Tyr Trp Pro Arg Ser Pro Tyr TyrAsn Val Ser Asp Glu Ile Ser115 120125Phe His Cys Tyr Asp Gly Tyr Thr Leu Arg Gly Ser Ala Asn Arg Thr130 135 140Cys Gln Val Asn Gly Arg Trp Ser Gly Gln Thr Ala Ile Cys Asp Asn145 150 155 160Gly Ala Gly Tyr Cys Ser Asn Pro Gly Ile Pro Ile Gly Thr Arg Lys165 170 175
Val Gly Ser Gln Tyr Arg Leu Glu Asp Ser Val Thr Tyr His Cys Ser180 185 190Arg Gly Leu Thr Leu Arg Gly Ser Gln Arg Arg Thr Cys Gln Glu Gly195 200 205Gly Ser Trp Ser Gly Thr Glu Pro Ser Cys Gln Asp Ser Phe Met Tyr210 2l5 220Asp Thr Pro Gln Glu Val Ala Glu Ala Phe Leu Ser Ser Leu Thr Glu225230 235 240Thr Ile Glu Gly Val Asp Ala Glu Asp Gly His Gly Pro Gly Glu Gln245 250 255Gln Lys Arg Lys Ile Val Leu Asp Pro Ser Gly Ser Met Asn Ile Tyr260 265 270Leu Val Leu Asp Gly Ser Asp Ser Ile Gly Ala Ser Asn Phe Thr Gly275 280 285Ala Lys Lys Cys Leu Val Asn Leu Ile Glu Lys Val Ala Ser Tyr Gly290 295 300Val Lys Pro Arg Tyr Gly Leu Val Thr Tyr Ala Thr Tyr Pro Lys Ile305 310 3l5 320Trp Val Lys Val Ser Glu Ala Asp Ser Ser Asn Ala Asp Trp Val Thr325 330 335Lys Gln Leu Asn Glu Ile Asn Tyr Glu Asp His Lys Leu Lys Ser Gly340 345 350Thr Asn Thr Lys Lys Ala Leu Gln Ala Val Tyr Ser Met Met Ser Trp355 360 365Pro Asp Asp Val Pro Pro Glu Gly Trp Asn Arg Thr Arg His Val Ile370 375 380Ile Leu Met Thr Asp Gly Leu His Asn Met Gly Gly Asp Pro Ile Thr385 390 395 400Val Ile Asp Glu Ile Arg Asp Leu Leu Tyr Ile Gly Lys Asp Arg Lys405 410 415Asn Pro Arg Glu Asp Tyr Leu Asp Val Tyr Val Phe Gly Val Gly Pro420 425 430Leu Val Asn Gln Val Asn Ile Asn Ala Leu Ala Ser Lys Lys Asp Asn435 440 445Glu Gln His Val Phe Lys Val Lys Asp Met Glu Asn Leu Glu Asp Val450 455 460Phe Tyr Gln Met Ile Asp Glu Ser Gln Ser Leu Ser Leu Cys Gly Met465 470 475 480
Val Trp Glu His Arg Lys Gly Thr Asp Tyr His Lys Gln Pro Trp Gln485 490 495Ala Lys Ile Ser Val Ile Arg Pro Ser Lys Gly His Glu Ser Cys Met500 505 510Gly Ala Val Val Ser Glu Tyr Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe515 520 525Thr Val Asp Asp Lys Glu His Ser Ile Lys Val Ser Val Gly Gly Glu530 535 540Lys Arg Asp Leu Glu Ile Glu Val Val Leu Phe His Pro Asn Tyr ASn545 550 555 560Ile Asn Gly Lys Lys Glu Ala Gly Ile Pro Glu Phe Tyr Asp Tyr Asp565 570 575Va1 Ala Leu Ile Lys Leu Lys ASn Lys Leu Lys Tyr Gly Gln Thr Ile580 585 590Arg Pro Ile Cys Leu Pro Cys Thr Glu Gly Thr Thr Arg Ala Leu Arg595 600 605Leu Pro Pro Thr Thr Thr Cys Gln Gln Gln Lys Glu Glu Leu Leu Pro610 615 620Ala Gln Asp Ile Lys Ala Leu Phe Val Ser Glu Glu Glu Lys Lys Leu625 630 635 640Thr Arg Lys Glu Val Tyr Ile Lys Asn Gly Asp Lys Lys Gly Ser Cys645 650 655Glu Arg Asp Ala Gln Tyr Ala Pro Gly Tyr Asp Lys Val Lys Asp Ile660 665 670Ser Glu Val Val Thr Pro Arg Phe Leu Cys Thr Gly Gly Val Ser Pro675 680 685Tyr Ala Asp Pro Asn Thr Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile690 695 700Val His Lys Arg Ser Arg Phe Ile Gln Val Gly Val Ile Ser Trp Gly705 710 715 720Val Val Asp Val Cys Lys ASn Gln Lys Arg Gln Lys Gln Val Pro Ala725 730 735His Ala Arg Asp Phe His Ile Asn Leu Phe Gln Val Leu Pro Trp Leu740 745 750Lys Glu Lys Leu Gln Asp Glu Asp Leu Gly Phe Leu755 7602102211739212PRT213人(Homo sapiens)
4002Thr Pro Trp Ser Leu Ala Arg Pro Gln Gly Ser Cys Ser Leu Glu Gly1 5 10 15Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Phe Arg Leu Leu Gln Glu Gly Gln Ala20 25 30Leu Glu Tyr Val Cys Pro Ser Gly Phe Tyr Pro Tyr Pro Val Gln Thr35 40 45Arg Thr Cys Arg Ser Thr Gly Ser Trp Ser Thr Leu Lys Thr Gln Asp50 55 60Gln Lys Thr Val Arg Lys Ala Glu Cys Arg Ala Ile His Cys Pro Arg65 70 75 80Pro His Asp Phe Glu Asn Gly Glu Tyr Trp Pro Arg Ser Pro Tyr Tyr85 90 95Asn Val Ser Asp Glu Ile Ser Phe His Cys Tyr Asp Gly Tyr Thr Leu100 105 110Arg Gly Ser Ala Asn Arg Thr Cys Gln Val Asn Gly Arg Trp Ser Gly115 120 125Gln Thr Ala Ile Cys Asp Asn Gly Ala Gly Tyr Cys Ser Asn Pro Gly130 135 140Ile Pro Ile Gly Thr Arg Lys Val Gly Ser Gln Tyr Arg Leu Glu Asp145 150 155 160Ser Val Thr Tyr His Cys Ser Arg Gly Leu Thr Leu Arg Gly Ser Gln165 170 175Arg Arg Thr Cys Gln Glu Gly Gly Ser Trp Ser Gly Thr Glu Pro Ser180 185 190Cys Gln Asp Ser Phe Met Tyr Asp Thr Pro Gln Glu Val Ala Glu Ala195 200 205Phe Leu Ser Ser Leu Thr Glu Thr Ile Glu Gly Val Asp Ala Glu Asp210 215 220Gly His Gly Pro Gly Glu Gln Gln Lys Arg Lys Ile Val Leu Asp Pro225 230 235 240Ser Gly Ser Met Asn Ile Tyr Leu Val Leu Asp Gly Ser Asp Ser Ile245 250 255Gly Ala Ser Asn Phe Thr Gly Ala Lys Lys Cys Leu Val Asn Leu Ile260 265 270Glu Lys Val Ala Ser Tyr Gly Val Lys Pro Arg Tyr Gly Leu Val Thr275 280 285Tyr Ala Thr Tyr Pro Lys Ile Trp Val Lys Val Ser Glu Ala Asp Ser
290 295 300Ser Asn Ala Asp Trp Val Thr Lys Gln Leu Asn Glu Ile Asn Tyr Glu305 310 315 320Asp His Lys Leu Lys Ser Gly Thr Asn Thr Lys Lys Ala Leu Gln Ala325 330 335Val Tyr Ser Met Met Ser Trp Pro Asp Asp Val Pro Pro Glu Gly Trp340 345 350Asn Arg Thr Arg His Val Ile Ile Leu Met Thr Asp Gly Leu His Asn355 360 365Met Gly Gly Asp Pro Ile Thr Val Ile Asp Glu Ile Arg Asp Leu Leu370 375 380Tyr Ile Gly Lys Asp Arg Lys Asn Pro Arg Glu Asp Tyr Leu Asp Val385 390 395 400Tyr Val Phe Gly Val Gly Pro Leu Val Asn Gln Val Asn Ile Asn Ala405 410 415Leu Ala Ser Lys Lys Asp Asn Glu Gln His Val Phe Lys Val Lys Asp420 425 430Met Glu Asn Leu Glu Asp Val Phe Tyr Gln Met Ile Asp Glu Ser Gln435 440 445Ser Leu Ser Leu Cys Gly Met Val Trp Glu His Arg Lys Gly Thr Asp450 455 460Tyr His Lys Gln Pro Trp Gln Ala Lys Ile Ser Val Ile Arg Pro Ser465 470 475 480Lys Gly His Glu Ser Cys Met Gly Ala Val Val Ser Glu Tyr Phe Val485 490 495Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Thr Val Asp Asp Lys Glu His Ser Ile500 505 510Lys Val Ser Val Gly Gly Glu Lys Arg Asp Leu Glu Ile Glu Val Val515 520 525Leu Phe His Pro Asn Tyr Asn Ile Asn Gly Lys Lys Glu Ala Gly Ile530 535 540Pro Glu Phe Tyr Asp Tyr Asp Val Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys545 550 555560Leu Lys Tyr Gly Gln Thr Ile Arg Pro Ile Cys Leu Pro Cys Thr Glu565 570 575Gly Thr Thr Arg Ala Leu Arg Leu Pro Pro Thr Thr Thr Cys Gln Gln580 585 590Gln Lys Glu Glu Leu Leu Pro Ala Gln Asp Ile Lys Ala Leu Phe Val
595 600 605Ser Glu Glu Glu Lys Lys Leu Thr Arg Lys Glu Val Tyr Ile Lys Asn610 615 620Gly Asp Lys Lys Gly Ser Cys Glu Arg Asp Ala Gln Tyr Ala Pro Gly625 630 635 640Tyr Asp Lys Val Lys Asp Ile Ser Glu Val Val Thr Pro Arg Phe Leu645 650 655Cys Thr Gly Gly Val Ser Pro Tyr Ala Asp Pro Asn Thr Cys Arg Gly660 665 670Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Val His Lys Arg Ser Arg Phe Ile Gln675 680 685Val Gly Val Ile Ser Trp Gly Val Val Asp Val Cys Lys Asn Gln Lys690 695 700Arg Gln Lys Gln Val Pro Ala His Ala Arg Asp Phe His Ile Asn Leu705 710 715 720Phe Gln Val Leu Pro Trp Leu Lys Glu Lys Leu Gln Asp Glu Asp Leu725 730 735Gly Phe Leu210321170212PRT213人(Homo sapiens)4003Ala Arg Pro Gln Gly Ser Cys Ser Leu Glu Gly Val Glu Ile Lys Gly1 5 10 15Gly Ser Phe Arg Leu Leu Gln Glu Gly Gln Ala Leu Glu Tyr Val Cys20 25 30Pro Ser Gly Phe Tyr Pro Tyr Pro Val Gln Thr Arg Thr Cys Arg Ser35 40 45Thr Gly Ser Trp Ser Thr Leu Lys Thr Gln Asp Gln Lys Thr Val Arg50 55 60Lys Ala Glu Cys Arg Ala65 70210421160212PRT213人(Homo sapiens)4004Ile His Cys Pro Arg Pro His Asp Phe Glu Asn Gly Glu Tyr Trp Pro1 5 10 15
Arg Ser Pro Tyr Tyr Asn Val Ser Asp Glu Ile Ser Phe His Cys Tyr20 25 30Asp Gly Tyr Thr Leu Arg Gly Ser Ala Asn Arg Thr Cys Gln Val Asn35 40 45Gly Arg Trp Ser Gly Gln Thr Ala Ile Cys Asp Asn50 55 60210521148212PRT213人(Homo sapiens)4005Gly Tyr Cys Ser Asn Pro Gly Ile Pro Ile Gly Thr Arg Lys Val Gly1 5 10 15Ser Gln Tyr Arg Leu Glu Asp Ser Val Thr Tyr His Cys Ser Arg Gly20 25 30Leu Thr Leu Arg Gly Ser Gln Arg Arg Thr Cys Gln Glu Gly Gly Ser35 40 452106211761212PRT213小鼠(Mus musculus)4006Met Glu Ser Pro Gln Leu Cys Leu Val Leu Leu Val Leu Gly Phe Ser1 5 10 15Ser Gly Gly Val Ser Ala Thr Pro Val Leu Glu Ala Arg Pro Gln Val20 25 30Ser Cys Ser Leu Glu Gly Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu35 40 45Leu Gln Gly Gly Gln Ala Leu Glu Tyr Leu Cys Pro Ser Gly Phe Tyr50 55 60Pro Tyr Pro Val Gln Thr Arg Thr Cys Arg Ser Thr Gly Ser Trp Ser65 70 75 80Asp Leu Gln Thr Arg Asp Gln Lys Ile Val Gln Lys Ala Glu Cys Arg85 90 95Ala Ile Arg Cys Pro Arg Pro Gln Asp Phe Glu Asn Gly Glu Phe Trp100 105 110Pro Arg Ser pro Phe Tyr Asn Leu Ser Asp Gln Ile Ser Phe Gln Cys115 120 125Tyr Asp Gly Tyr Val Leu Arg Gly Ser Ala Asn Arg Thr Cys Gln Glu130 135 140Asn Gly Arg Trp Asp Gly Gln Thr Ala Ile Cys Asp Asp Gly Ala Gly
145 150 155 160Tyr Cys Pro Asn Pro Gly Ile Pro Ile Gly Thr Arg Lys Val Gly Ser165 170 175Gln Tyr Arg Leu Glu Asp Ile Val Thr Tyr His Cys Ser Arg Gly Leu180 185 190Val Leu Arg Gly Ser Gln Lys Arg Lys Cys Gln Glu Gly Gly Ser Trp195 200 205Ser Gly Thr Glu Pro Ser Cys Gln Asp Ser Phe Met Tyr Asp Ser Pro210 215 220Gln Glu Val Ala Glu Ala Phe Leu Ser Ser Leu Thr Glu Thr Ile Glu225 230 235 240Gly Ala Asp Ala Glu Asp Gly His Ser Pro Gly Glu Gln Gln Lys Arg245 250 255Lys Ile Val Leu Asp Pro Ser Gly Ser Met Asn Ile Tyr Leu Val Leu260 265 270Asp Gly Ser Asp Ser Ile Gly Ser Ser Asn Phe Thr Gly Ala Lys Arg275 280 285Cys Leu Thr Asn Leu Ile Glu Lys Val Ala Ser Tyr Gly Val Arg Pro290 295 300Arg Tyr Gly Leu Leu Thr Tyr Ala Thr Val Pro Lys Val Leu Val Arg305 310 315 320Val Ser Asp Glu Arg Ser Ser Asp Ala Asp Trp Val Thr Glu Lys Leu325 330 335Asn Gln Ile Ser Tyr Glu Asp His Lys Leu Lys Ser Gly Thr Asn Thr340 345 350Lys Arg Ala Leu Gln Ala Val Tyr Ser Met Met Ser Trp Ala Gly Asp355 360 365Ala Pro Pro Glu Gly Trp Asn Arg Thr Arg His Val Ile Ile Ile Met370 375 380Thr Asp Gly Leu His Asn Met Gly Gly Asn Pro Val Thr Val Ile Gln385 390 395 400Asp Ile Arg Ala Leu Leu Asp Ile Gly Arg Asp Pro Lys Asn Pro Arg405 410 415Glu Asp Tyr Leu Asp Val Tyr Val Phe Gly Val Gly Pro Leu Val Asp420 425 430Ser Val Asn Ile Asn Ala Leu Ala Ser Lys Lys Asp Asn Glu His His435 440 445Val Phe Lys Val Lys Asp Met Glu Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Gln
450 455 460Met Ile Asp Glu Thr Lys Ser Leu Ser Leu Cys Gly Met Val Trp Glu465 470 475 480His Lys Lys Gly Asn Asp Tyr His Lys Gln Pro Trp Gln Ala Lys Ile485 490 495Ser Val Thr Arg Pro Leu Lys Gly His Glu Thr Cys Met Gly Ala Val500 505 510Val Ser Glu Tyr Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Met Val Asp515 520 525Asp Gln Lys His Ser Ile Lys Val Ser Val Gly Gly Gln Arg Arg Asp530 535 540Leu Glu Ile Glu Glu Val Leu Phe His Pro Lys Tyr Asn Ile Asn Gly545 550 555 560Lys Lys Ala Glu Gly Ile Pro Glu Phe Tyr Asp Tyr Asp Val Ala Leu565 570 575Val Lys Leu Lys Asn Lys Leu Lys Tyr Gly Gln Thr Leu Arg Pro Ile580 585 590Cys Leu Pro Cys Thr Glu Gly Thr Thr Arg Ala Leu Arg Leu Pro Gln595 600 605Thr Ala Thr Cys Lys Gln His Lys Glu Gln Leu Leu Pro Val Lys Asp610 615 620Val Lys Ala Leu Phe Val Ser Glu Gln Gly Lys Ser Leu Thr Arg Lys625 630 635 640Glu Val Tyr Ile Lys Asn Gly Asp Lys Lys Ala Ser Cys Glu Arg Asp645 650 655Ala Thr Lys Ala Gln Gly Tyr Glu Lys Val Lys Asp Ala Ser Glu Val660 665 670Val Thr Pro Arg Phe Leu Cys Thr Gly Gly Val Asp Pro Tyr Ala Asp675 680 685Pro Asn Thr Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Val His Lys690 695 700Arg Ser Arg Phe Ile Gln Val Gly Val Ile Ser Trp Gly Val Val Asp705 710 715 720Val Cys Arg Asp Gln Arg Arg Gln Gln Leu Val Pro Ser Tyr Ala Arg725 730 735Asp Phe His Ile Asn Leu Phe Gln Val Leu Pro Trp Leu Lys Asp Lys740 745 750Leu Lys Asp Glu Asp Leu Gly Phe Leu
755 760
權利要求
1.一種分離抗體或其抗原結合片段，它選擇性結合B因子的第三短同源重複序列(SCR)結構域，其中該抗體阻止C3bBb複合物的形成。
2.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合B因子並預防或抑制D因子剪切B因子。
3.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段結合人B因子的第三短同源重複序列(SCR)結構域。
4.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段選擇性結合選自下列的B因子的第三SCR結構域中的表位(a)包括至少一部分人B因子(SEQ ID NO2)的B因子的表位，包括從約Tyr139位到約Ser185位，或其在非人類B因子序列中的等效位置；(b)包括至少一部分人B因子(SEQ ID NO2)的B因子的表位，包括從約Try139位到約Ser141位，或其在非人類B因子序列中的等效位置；(c)包括至少一部分人B因子(SEQ ID NO2)的B因子的表位，包括從約Glu182位到約Ser185位，或其在非人類B因子序列中的等效位置；(d)包括至少一部分人B因子(SEQ ID NO2)的B因子的表位，包括任何一個或多個下列位置或其在非人類B因子序列中的等效位置Tyr139，Cys140，Ser141，Glu182，Gly184或Ser185。
5.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段選擇性結合多種哺乳動物物種的B因子。
6.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段選擇性結合人和選自下列動物的B因子除人類外的靈長類、小鼠、大鼠、豬、馬和兔。
7.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為非補體激活的同種型或亞類。
8.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為單克隆抗體。
9.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段為Fab片段。
10.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人源化抗體。
11.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為雙特異性抗體。
12.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為單價抗體。
13.權利要求1的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為單克隆抗體1379(由ATCC保藏號PTA-6230產生)。
14.一種分離抗體或其抗原結合片段，它選擇性結合來自多種哺乳動物物種的B因子，其中該抗體阻止了C3bBb複合物的形成。
15.權利要求14的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段選擇性結合人和選自下列動物的B因子除人類外的靈長類、小鼠、大鼠、豬、馬和兔。
16.權利要求14的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為非補體激活的同種型或亞類。
17.權利要求14的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為單克隆抗體。
18.權利要求14的分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段為Fab片段。
19.一種分離抗體或其抗原結合片段，它選擇性結合B因子，其中該抗體或其片段競爭性抑制單克隆抗體1379(由ATCC保藏號PTA-6230產生)與人B因子的特異性結合，並且其中，當該抗體或其抗原結合片段結合人B因子時，單克隆抗體1379抑制補體旁路的能力被抑制。
20.權利要求19的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段競爭性抑制單克隆抗體1379與人B因子的結合，通過抗體-抗體競爭性分析在人B因子存在時檢測比較結合特異性。
21.一種分離抗體或其片段，它選擇性結合人B因子，其中該分離抗體或其片段競爭性抑制二抗或其抗原結合片段與人B因子的特異性結合，並且其中該二抗或其抗原結合片段結合人B因子的第三SCR結構域。
22.一種組合物，包含權利要求1-21中任一項的分離抗體或其抗原結合片段。
23.一種抗原結合多肽，它選擇性結合B因子的第三短同源重複序列(SCR)結構域，其中該抗原結合多肽阻止了C3bBb複合物的形成。
24.一種抗原結合多肽，它選擇性結合多種哺乳動物物種的B因子，其中該抗原結合多肽阻止了C3bBb複合物的形成。
25.一種組合物，包含權利要求23或權利要求24的抗原結合多肽。
26.一種降低或預防動物的氣道高反應性(AHR)或氣道炎症的方法，包括將根據權利要求1到18中的任一項的抗體或其抗原結合片段給予患有炎症相關氣道高反應性或氣道炎症或有患該病風險的動物。
27.權利要求26的方法，其中該抗體或抗原結合片段以一定的量給予動物，與給予該抗體或抗原結合片段前相比，該量可有效顯著降低動物的氣道高反應性。
28.權利要求26的方法，其中該抗體或抗原結合片段以一定的量給予動物，與患有炎症並未給予該抗體或抗原結合片段的動物群體的氣道高反應性的水平相比，該量可有效顯著降低動物的氣道高反應性。
29.權利要求26的方法，其中該抗體或抗原結合片段的給予降低了動物對乙醯甲基膽鹼或對組胺的反應性。
30.權利要求26的方法，其中該抗體或抗原結合片段與選自下列的可藥用載體一起給予可分散乾粉、無水乙醇、小膠囊、脂質體、霧化噴霧劑和可注射賦形劑。
31.權利要求26的方法，其中該抗體或抗原結合片段在選自下列的載體或裝置中給予無水乙醇、乾粉吸入系統、超聲吸入系統、壓力計量吸入器和計量溶液裝置。
32.權利要求26的方法，其中所述抗體或抗原結合片段與選自下列的試劑一起給予所述哺乳動物皮質類固醇、β-激動劑(長效或短效)、白三烯調節物、抗組胺、磷酸二酯酶抑制劑、色甘酸鈉、奈多羅米、茶鹼、細胞因子拮抗劑、細胞因子受體拮抗劑、抗IgE和T細胞功能的抑制劑。
33.權利要求26的方法，其中所述氣道高反應性或氣道炎症與選自下列的疾病相關哮喘、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、過敏性支氣管肺曲菌病、過敏性肺炎、嗜酸粒細胞性肺炎、肺氣腫、支氣管炎、過敏性支氣管炎、支氣管擴張、囊性纖維化病、結核病、過敏性肺炎、職業性哮喘、結節病、反應性氣道病症候群、間質性肺病、嗜酸細胞增多症候群、鼻炎、鼻竇炎、運動誘發哮喘、汙染誘發哮喘、咳嗽變異性哮喘、肺寄生蟲病、呼吸道合胞體病毒(RSV)感染、副流感病毒(PIV)感染、鼻病毒(RV)感染和腺病毒感染。
34.權利要求26的方法，其中該氣道高反應性與過敏性炎症相關。
35.權利要求26的方法，其中該(AHR)或氣道炎症與哮喘相關。
36.權利要求26的方法，其中該(AHR)或氣道炎症與COPD相關。
37.一種降低或預防動物的氣道高反應性(AHR)或氣道炎症的方法，包括將選擇性抑制補體旁路的試劑給予患炎症相關氣道高反應性或氣道炎症或有患該病風險的動物。
38.一種降低或預防動物的缺血-再灌注損傷的方法，包括將根據權利要求1到18中任一項的抗體或其抗原結合片段給予患缺血-再灌注損傷或有患該病風險的動物。
39.權利要求38的方法，其中該缺血-再灌注損傷為腎臟缺血-再灌注損傷。
40.權利要求38的方法，其中該抗體或抗原結合片段以一定的量給予動物，與不給予該抗體或抗原結合片段相比，該量可有效顯著抑制動物的血清尿素氮的升高。
41.權利要求38的方法，其中該抗體或抗原結合片段以一定的量給予動物，與不給予抗體或抗原結合片段相比，該量可有效顯著降低對動物的腎臟組織的組織學損傷。
42.權利要求26或38的方法，其中該抗體或抗原結合片段通過選自下列的途徑給予口服、鼻部、局部、吸入、氣管內、經皮、直腸和腸胃外途徑。
43.一種降低或預防動物的氣道高反應性(AHR)或氣道炎症的方法，包括將根據權利要求23或權利要求24的抗原結合多肽給予患有炎症相關氣道高反應性或氣道炎症或有患該病風險的動物。
44.一種降低或預防動物的缺血-再灌注損傷的方法，包括將權利要求23或權利要求24的抗原結合多肽給予患有缺血-再灌注損傷或有患該病風險的動物。
45.權利要求26-44中任一項的方法，其中該動物為哺乳動物。
46.權利要求26-44中任一項的方法，其中該動物為人。
全文摘要
公開了補體旁路的新型抑制劑，特別公開了新型抗B因子抗體。還公開了該抑制劑通過選擇性抑制補體旁路降低或預防氣道高反應性和/或氣道炎症，由此治療該病症起作用的疾病的用途。還公開了該抑制劑通過補體旁路的抑制降低或預防包括缺血－再灌注損傷在內的其它疾病和病症的用途。
文檔編號C12P21/08GK101022828SQ200580011963
公開日2007年8月22日 申請日期2005年2月10日 優先權日2004年2月10日
發明者V·M·霍勒斯, J·M·瑟曼, C·陶布, E·W·格爾範德, G·S·吉爾克森 申請人:科羅拉多大學評議會, 國家猶太醫療及研究中心, 南卡羅來納醫科大學研究發展基金會