一種運用動態光散射高靈敏檢測微囊藻毒素的方法
2023-08-08 20:11:56
專利名稱：一種運用動態光散射高靈敏檢測微囊藻毒素的方法
技術領域：
一種運用動態光散射高靈敏檢測微囊藻毒素的方法，屬於免疫分析化學技 術領域。
背景技術：
隨著經濟的發展，含有大量的氮、磷營養物質的汙水進入湖泊、水庫，使
水體富營養化，致使藻類異常增殖，釋放次級代謝物藻毒素(Algae Toxins)，威 脅人類的飲用水安全和水體中其它生物的安全。其中微囊藻毒素(Microcystins， MCs)的分布廣、危害大更應引起重視。其是由某些種屬的淡水藍藻，主要是銅 綠微囊藻產生的一個結構相似的環七肽家族，已知有60餘種異構體。其結構如 下formula see original document page 5
(6) D-Glu (iso) (7) dehydroAla
O COOH (2) variable
(3) D-八sp (iso)
其含有五個固定成分的胺基酸，兩個可變的胺基酸X、 Y。其中X和Y分別為Leu 和Arg的最為常見，毒性也最大。基於此，世界衛生組織(WHO)推薦的飲水中的 藻毒素標準為1.0)ig/L，我國現頒布執行的生活飲用水水質衛生規範(2001， 0.001mg/L)和地表水環境質量標準(GB3838-2002，微囊藻毒素-LR， 0.001mg/L)。
故對藻毒素準確有效監測尤為重要。
常用的檢測藻毒素的方法主要有儀器分析方法、生物化學法及免疫檢測法 等幾大類。儀器分析方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)、質譜、液質聯用等， 這些方法雖然靈敏但其需要昂貴的儀器設備，專業的操作人員，對檢材的要求 也比較高，並且需要進一步的樣本前處理才能進行，這已經不能達到現代檢測 對快速、方便、準確的要求。生物化學法主要是蛋白磷酸酶抑制試驗法，優點
是快速，數小時即可實現對大量樣品的檢測，但其最大的不足之處在於特異性 蛋白磷酸酶等沒有商品供應、特異性差。免疫分析化學方法具有快速，靈敏度
高，操作簡單，專一性好等優點。與傳統的ELISA方法相比，本發明利用擰檬酸
三鈉還原合成的金納米粒子分別與微囊藻毒素的包被原和抗微囊藻毒素的抗體 相連，在液體的環境下金連抗體和金連包被原及微囊藻毒素反應形成二聚體， 寡聚體及產生聚沉，通過動態光散射測定液體環境中的粒徑分布來測定微囊藻 毒素的含量。本發明只在液體環境中反應，不需要清洗的步驟，只需要一步反 應，簡化了反應的條件，提高了檢測的靈敏度。
發明內容
本發明的目的是提供一種運用動態光散射高靈敏檢測微囊藻毒素的方法， 靈敏度高，操作方便，線性範圍寬。
本發明的技術方案 一種運用動態光散射檢測微囊藻毒素的方法，用合成 的金納米粒子與微囊藻毒素的包被原偶聯得金連包被原，金納米粒子與抗微囊 藻毒素的抗體相連得金連抗體，用抗體和包被原的金納米粒子進行免疫反應， 利用檸檬酸三鈉還原在液體的環境下金連抗體和金連包被原及微囊藻毒素反應 形成二聚體，寡聚體及產生聚沉，通過動態光散射測定液體環境中的粒徑分布 來測定微囊藻毒素的含量；包括免疫原，包被原，抗體的製備，納米金的製備，抗
體和納米金的偶聯，包被原和納米金的偶聯，包被原和抗體蛋白濃度的選擇，抑 制曲線的測定。
工藝步驟為
(1) 免疫原的製備
將微囊藻毒素-LR與牛血清蛋白相偶聯得到免疫原；
(2) 包被原的製備
將微囊藻毒素-LR與卵清蛋白相偶聯得到包被原；
(3) 用步驟(l)得到的免疫原免疫得到特異性兔多克隆抗體；
(4) 金納米粒子的製備
(5) 將步驟(2)得到的包被原與步驟(4)得到金納米粒子偶聯；
(6) 將步驟(3)得到的抗體與步驟(4)得到金納米粒子偶聯；
(7) 對步驟(2)得到的包被原和步驟(3)得到的抗體蛋白濃度的選擇；
(8) 利用間接競爭免疫檢測原理，將微囊藻毒素-LR和金連包被原同時加入 到一個離心管中，而後向離心管中加入金連抗體，混勻，通過微囊藻毒素和包 被原與抗體進行競爭偶聯，通過微囊藻毒素濃度的不同會使形成的粒子形成不 同的粒徑分布，通過納米粒度儀檢測粒徑的變化從而檢測微囊藻毒素-LR。
所述的運用動態光散射檢測微囊藻毒素的方法，其免疫原的製備
① 取0.25mL溶解有MC-LR的乙醇溶液，加入0.75mL去離子水，加入 150pL的碳二亞胺，得A液；
② 用lmL 25%的乙醇溶液溶解2mg的BSA，得B液；
③ 將A液逐滴加入到B液中，再加入150(iL的EDC，混勻，4。C反應12h。 其包被原的製備
① 取O.lmg MC-LR溶於O.lmL的N,N-二甲基甲醯胺DMF中，冷卻至4 。C，加入4.8iiL的三丁胺，混勻；
② 向上述溶液中加入氯甲酸異丁酯2.7pL，混勻，4'C攪拌反應20min,得 到A液；
③ 取卵清蛋白OVA0.5mg溶於900jiLpHN9.0、50mmol/L的硼酸鹽緩衝液 中冷卻至4"C，混勻得B液；
將A液緩慢滴加至B液中，在4。C反應4h維持pH值在9.0; ⑤用pH值7.4的磷酸鹽緩衝液透析三天。
其金納米粒子的合成所有的玻璃儀器都強酸浸泡，雙蒸水清洗，晾乾備 用；製備時，向潔淨的三角燒瓶中加入100mL質量濃度為0.01%的氯金酸溶液， 加熱，煮沸，緊接著加入2.5mL 1%的檸檬酸三鈉溶液，邊加熱邊攪拌，溶液顏 色從淡黃色變成紅色，反應持續6-8分鐘以使檸檬酸三鈉完全沉降；最後，溶液 冷卻至室溫，稀釋到100mL， 4X:保藏。
其包被原和納米金的偶聯取13.4pL的蛋白濃度為3mg/mL的包被原在磁力 攪拌器輕輕攪拌的情況下逐滴加入到4mL權利要求4所述製備得到的金納米溶液 中，後在37"反應30min，再加入80iaL 10。/。的BSA溶液，37""C反應30min， 10000r/min離心25min，棄上清，取沉澱用碳酸鉀調節pH為9.0的水溶液分散後用 10000r/min離心25min，棄上清，取沉澱，重複兩次，放入4。C的冰箱中備用。
其抗體和納米金的偶聯取12jiL的蛋白濃度為3 mg/mL的抗體在磁力攪拌 器輕輕攪拌的情況下逐滴加入到4mL權利要求4所述製備得到的金納米溶液中， 後在37。C反應30min，再加入80iiL 10%的BSA溶液，37。C反應30min， 10000r/min 離心25min，棄上清，取沉澱用碳酸鉀調節pH為9.0的水溶液分散後用 10000r/min離心25min，棄上清，取沉澱，重複兩次，放入4匸的冰箱中備用。
其包被原和抗體蛋白濃度的選擇為了提高該法的靈敏度，故需要對金偶 聯的抗體和包被原的濃度需要進行選擇。最適宜的包被原和抗體蛋白的濃度是 在二者混合反應以後，稀釋到適於動態光散射儀測定的濃度下測定後二者的粒 徑分布峰最大的濃度配比。具體的步驟是①分別向離心管中加入50^iL的金連包被原後，再按照1:1、 3:1、 5:1、 1:3、 1:5、 1:8的比例分別加入50、 16.7、 10、 150、 250pL的金連抗體後，混勻，37 。C反應1小時；
②反應結束，取80^iL的反應液加入80(^L的用碳酸鉀調節至pH9.0的水 溶液稀釋，混勻，靜置2分鐘，用DLS測定該反應液的粒子的粒徑，重複兩次。
其抑制曲線的測定抑制曲線的建立是通過添加一系列的不同梯度的標準品 後標準品和包被原互相競爭抗體的結合部位，會導致不同金納米粒子形成不同 的聚合體。通過測定金納米粒子的粒徑以建立抑制曲線，具體的步驟為
① 分別向離心管中加入50pL的金連包被原後，各離心管分別加入用PBST 稀釋的l嗎/mL、 100ng/mL、 10ng/mL、 lng/mL、 0.1ng/mL、 O.Olng/mL的微囊 藻毒素後混勻，按照與金連包被原的蛋白濃度與金連抗體的蛋白濃度比例為1:1 加入金連抗體混勻，放入37"C反應1小時；
② 反應結束，取80iaL的反應液加入800nL的用碳酸鉀調節至pH9.0的水溶液 稀釋，混勻，靜置2分鐘，用DLS測定該反應液的粒子的粒徑，重複兩次。
本發明的有益效果與傳統的ELISA方法相比，本發明利用檸檬酸三鈉還 原合成的金納米粒子分別與微囊藻毒素的包被原和抗微囊藻毒素的抗體相連， 在液體的環境下金連抗體和金連包被原及微囊藻毒素反應形成二聚體，寡聚體 及產生聚沉，通過動態光散射測定液體環境中的粒徑分布來測定微囊藻毒素的 含量。本發明只在液體環境中反應，不需要清洗的步驟，只需要一步反應，簡 化了反應的條件，提高了檢測的靈敏度。
圖1包被原的紫外掃描圖。
圖2動態光散射高靈敏檢測微囊藻毒素結果。
具體實施例方式
實施例1
(1) 免疫原的製備
① 取0.25mL溶解有微囊藻毒素-LR(MC-LR)的乙醇溶液，加入0.75mL去 離子水，加入150nL的碳二亞胺(EDC)，得A液。
② 用lmL25。/。的乙醇溶液溶解2mg的牛血清蛋白(BSA)，得B液。
③ 將A液逐滴加入到B液中，再加入150(iL的碳二亞胺(EDC)，混勻，4。C反 應12h。
(2) 包被原的製備
①取O.lmgMC-LR的溶於O.lmL的N，N-二甲基甲醯胺(DMF)中，冷卻至
4°C，加入4.8pL的三丁胺，混勻。
② 向上述溶液中加入氯甲酸異丁酯2.7^iL，混勻，4'C攪拌反應20min，得 到A液。
③ 取卵清蛋白(OVA)0.5mg溶於900pLpH=9.0、 50mmol/L的硼酸鹽緩衝液 中冷卻至4"C，混勻得B液。
④ 將A液緩慢滴加至B液中，在4'C反應4h維持pH值在9.0。
⑤ 用pH值7.4的磷酸鹽緩衝液透析三天。
(3) 免疫原免疫得到特異性兔多克隆抗體。
(4) 抗體效價的測定
採用間接ELISA方法測定抗體效價，以吸光值達到1.0左右時判斷為陽性， 結果最後抗體的效價為1.28X106。
(5) 金納米粒子的合成
所有的玻璃儀器都強酸浸泡，雙蒸水清洗，晾乾備用。製備時，向潔淨的 三角燒瓶中加入100mL濃度為0.01。/。的氯金酸，加熱，煮沸，緊接著加入2.5mL 1%的檸檬酸三鈉溶液，邊加熱邊攪拌，溶液顏色從淡黃色變成紅色，反應持續 6-8分鐘以使檸檬酸三鈉完全沉降。最後，溶液分別冷卻至室溫，稀釋到100mL， 4。C保藏。
(6) 包被原和納米金的偶聯
取13.4^的包被原(蛋白濃度3mg/mL)在磁力攪拌器輕輕攪拌的情況下 逐滴加入到4mL上述處理過的金納米溶液中，後在37'C反應30min後用10%的 BSA溶液加入80pL後37。C反應30min後10000r/min離心25min棄上清取沉澱 用(碳酸鉀調節pH為9.0)水溶液分散後用10000r/min離心25min，棄上清取 沉澱，重複兩次放入4'C的冰箱中備用。
(7) 抗體和納米金的偶聯
取12pL的抗體(蛋白濃度3mg/mL)在磁力攪拌器輕輕攪拌的情況下逐滴加 入到4mL上述處理過的金納米溶液中，後在37。C反應30min後用10。/。的BSA溶液 加入80(iL後37。C反應30min後10000r/min離心25min棄上清取沉澱用碳酸鉀調節 pH為9.0的水溶液分散後用10000r/min離心25min，棄上清取沉澱，重複兩次放入 4"C的冰箱中備用。
(8) 包被原和抗體蛋白濃度的選擇
為了提高該法的靈敏度，故需要對金偶聯的抗體和包被原的濃度需要進行 選擇。最適宜的包被原和抗體蛋白的濃度是在二者混合反應以後，稀釋到適於 動態光散射儀測定的濃度下測定後二者的粒徑分布峰最大的濃度配比。具體的
步驟是
①分別向離心管中加入50nL的金連包被原後，再按照1:1、 3:1、 5:1、 1:3、 1:5、 1:8的比例分別加入50、 16.7、 10、 150、 250pL的金連抗體後，混勻，放 入37'C反應1小時。
②反應結束，取80)iL的反應液加入800iiL的pH9.0用碳酸鉀調節的水溶 液稀釋，混勻。靜置2分鐘，用DLS測定該反應液的粒子的粒徑，重複兩次。
(9)抑制曲線的測定
抑制曲線的建立是通過添加一系列的不同梯度的標準品後標準品和包被原 互相競爭抗體的結合部位，會導致不同金納米粒子形成不同的聚合體。通過測 定金納米粒子的粒徑以建立抑制曲線，具體的步驟為
① 分別向離心管中加入50pL的金連包被原後，各離心管分別加入用PBST 稀釋的1)ig/mL、 100ng/mL、 10ng/mL、 lng/mL、 0.1ng/mL、 O.Olng/mL的微囊 藻毒素後混勻，按照與金連包被原的蛋白濃度與金連抗體的蛋白濃度比例為1:1 加入金連抗體混勻，放入37'C反應1小時。
② 反應結束，取80pL的反應液加入800|iL的pH 9.0用碳酸鉀調節的水溶 液稀釋，混勻。靜置2分鐘，用DLS測定該反應液的粒子的粒徑，重複兩次。
權利要求
1. 一種運用動態光散射檢測微囊藻毒素的方法，其特徵是用合成的金納米粒子與微囊藻毒素的包被原偶聯得金連包被原，金納米粒子與抗微囊藻毒素的抗體相連得金連抗體，用抗體和包被原的金納米粒子進行免疫反應，利用檸檬酸三鈉還原在液體的環境下金連抗體和金連包被原及微囊藻毒素反應形成二聚體，寡聚體及產生聚沉，通過動態光散射測定液體環境中的粒徑分布來測定微囊藻毒素的含量；包括免疫原、包被原、抗體的製備，納米金的製備，抗體和納米金的偶聯，包被原和納米金的偶聯，包被原和抗體蛋白濃度的選擇，抑制曲線的測定；(1)免疫原的製備將微囊藻毒素-LR與牛血清蛋白相偶聯得到免疫原；(2)包被原的製備將微囊藻毒素-LR與卵清蛋白相偶聯得到包被原；(3)用步驟(1)得到的免疫原免疫得到特異性兔多克隆抗體；(4)金納米粒子的製備；(5)將步驟(2)得到的包被原與步驟(4)得到的金納米粒子偶聯；(6)將步驟(3)得到的抗體與步驟(4)得到的金納米粒子偶聯；(7)對步驟(2)得到的包被原和步驟(3)得到的抗體蛋白濃度的選擇；(8)利用間接競爭免疫檢測原理，將微囊藻毒素-LR和金連包被原同時加入到一個離心管中，而後向離心管中加入金連抗體，混勻，通過微囊藻毒素和包被原與抗體進行競爭偶聯，通過微囊藻毒素濃度的不同會使形成的粒子形成不同的粒徑分布，通過納米粒度儀檢測粒徑的變化從而檢測微囊藻毒素-LR。
2. 根據權利要求1所述的運用動態光散射檢測微囊藻毒素的方法，其特徵是免疫原的製備① 取0.25mL溶解有MC-LR的乙醇溶液，加入0.75mL去離子水，加入 150pL的碳二亞胺，得A液；② 用lmL25。/。的乙醇溶液溶解2mg的BSA，得B液；③ 將A液逐滴加入到B液中，再加入150(iL的碳二亞胺，混勻，4。C反應12h。
3. 根據權利要求1所述的運用動態光散射檢測微囊藻毒素的方法，其特徵是 包被原的製備①取O.lmg MC-LR溶於O.lmL的N，N-二甲基甲醯胺DMF中，冷卻至4 °C，加入4.8(iL的三丁胺，混勻； ② 向上述溶液中加入氯甲酸異丁酯2.7pL，混勻，4'C攪拌反應20min，得到A液；③ 取卵清蛋白OVA 0.5mg溶於900|iL pH=9.0、 50 mmol/L的硼酸鹽緩衝液 中冷卻至4r，混勻得B液；④ 將A液緩慢滴加至B液中，在4T:反應4h維持pH值在9.0; 用pH值7.4的磷酸鹽緩衝液透析三天。
4. 根據權利要求1所述的運用動態光散射檢測微囊藻毒素的方法，其特徵是 金納米粒子的合成所有的玻璃儀器都強酸浸泡，雙蒸水清洗，晾乾備用；制 備時，向潔淨的三角燒瓶中加入100mL質量濃度為0.01%的氯金酸溶液，加熱， 煮沸，緊接著加入2.5mL 1%的檸檬酸三鈉溶液，邊加熱邊攪拌，溶液顏色從淡 黃色變成紅色，反應持續6-8分鐘以使檸檬酸三鈉完全沉降；最後，溶液冷卻至 室溫，稀釋至Ul00mL， 4"C保藏。
5. 根據權利要求1所述的運用動態光散射檢測微囊藻毒素的方法，其特徵是 包被原和納米金的偶聯取13.4pL的蛋白濃度為3 mg/mL的包被原在磁力攪拌器 輕輕攪拌的情況下逐滴加入到4mL權利要求4所述製備得到的金納米溶液中，後 在37。C反應30min，再加入80pL 10。/。的BSA溶液，37。C反應30min， 10000r/min 離心25min，棄上清，取沉澱用碳酸鉀調節pH為9.0的水溶液分散後用10000r/min 離心25min，棄上清，取沉澱，重複兩次，放入4。C的冰箱中備用。
6. 根據權利要求1所述的運用動態光散射檢測微囊藻毒素的方法，其特徵是 抗體和納米金的偶聯取12pL的蛋白濃度為3 mg/mL的抗體在磁力攪拌器輕輕 攪拌的情況下逐滴加入到4mL權利要求4所述製備得到的金納米溶液中，後在 37。C反應30min，再加入80jjL 10。/。的bsa溶液，37。C反應30min， 10000r/min 離心25min，棄上清，取沉澱用碳酸鉀調節pH為9.0的水溶液分散後用 10000r/min離心25min，棄上清，取沉澱，重複兩次，放入4。C的冰箱中備用。
7. 根據權利要求1所述的運用動態光散射檢測微囊藻毒素的方法，其特徵 是包被原和抗體蛋白濃度的選擇為了提高該法的靈敏度，故需要對金偶聯的 抗體和包被原的濃度需要進行選擇；最適宜的包被原和抗體蛋白的濃度是在二 者混合反應以後，稀釋到適於動態光散射儀測定的濃度下測定後二者的粒徑分 布峰最大的濃度配比；步驟是①分別向離心管中加入50^iL的金連包被原後，再按照1:1、 3:1、 5:1、 1:3、 1:5、 1:8的比例分別加入50、 16.7、 10、 150、 250(iL的金連抗體後，混勻，37 。C反應1小時；②反應結束，取80pL的反應液加入800^L的用碳酸鉀調節至pH 9.0的水 溶液稀釋，混勻，靜置2分鐘，用DLS測定該反應液的粒子的粒徑，重複兩次。 8.根據權利要求1所述的運用動態光散射檢測微囊藻毒素的方法，其特徵 是抑制曲線的測定抑制曲線的建立是通過添加一系列的不同梯度的標準品後 標準品和包被原互相競爭抗體的結合部位，會導致不同金納米粒子形成不同的 聚合體；通過測定金納米粒子的粒徑以建立抑制曲線，步驟為① 分別向離心管中加入50pL的金連包被原後，各離心管分別加入用PBST 稀釋的l|ig/mL、 100ng/mL、 10ng/mL、 lng/mL、 0.1ng/mL、 O.Olng/mL的微囊 藻毒素後混勻，按照與金連包被原的蛋白濃度與金連抗體的蛋白濃度比例為1:1 加入金連抗體混勻，放入37"C反應1小時；② 反應結束，取80nL的反應液加入800^iL的用碳酸鉀調節至pH9.0的水溶液 稀釋，混勻，靜置2分鐘，用DLS測定該反應液的粒子的粒徑，重複兩次。
全文摘要
一種運用動態光散射高靈敏檢測微囊藻毒素-LR的方法，屬於免疫分析化學技術領域。本發明合成的金納米粒子與微囊藻毒素的包被原偶聯得金連包被原，金納米粒子與抗微囊藻毒素的抗體相連得金連抗體，用抗體和包被原的金納米粒子進行免疫反應，利用檸檬酸三鈉還原在液體的環境下金連抗體和金連包被原及微囊藻毒素反應形成二聚體，寡聚體及產生聚沉，通過動態光散射測定液體環境中的粒徑分布來測定微囊藻毒素的含量。本發明只在液體環境中反應，不需要清洗的步驟，只需要一步反應，簡化了反應的條件，提高了檢測的靈敏度，達到國際領先水平。
文檔編號G01N21/47GK101393209SQ200810155548
公開日2009年3月25日 申請日期2008年10月9日 優先權日2008年10月9日
發明者徐麗廣, 李灼坤, 胥傳來, 偉 馬 申請人:江南大學