用於產生樹突細胞的方法

2023-08-08 17:06:16 2

專利名稱：用於產生樹突細胞的方法
技術領域：
本發明涉及用於產生樹突細胞的方法，所產生的樹突細胞，及其用途。
背景技術：
樹突細胞(DC)是存在於外周血、皮膚、淋巴器官和胸腺中的抗原呈遞細胞(APC)， 在淋巴和非淋巴組織中有廣泛的分布(見Steinman, R. M. Ann. Rev. Immunol. 9 :271 (1991)； Banchereau, J. B. and R. Μ. Steinman, Nature 392:245(1998))。樹突細胞具有強烈的抗原呈遞能力，並且在樹突細胞表面上表達I類和II類分子的抗原肽，它們分別激活CD4和 ⑶8T細胞。通過這種激活，DC誘導針對特定抗原(例如致病微生物抗原、腫瘤相關抗原和移植抗原)的體內免疫應答。DC的強免疫誘導能力在針對多種腫瘤的免疫治療(DC治療)中是有用的。本發明人先前已經證明，被仙臺病毒GeV)刺激的DC在小鼠體內具有強烈的抗腫瘤效果 (S.Shibata et al. , J. Immunol,177 :3564-3576(2006) ；Yoneyama, Y. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun.，355 129-135 (2007))。抗腫瘤效果依賴於所接種的DC的數目。臨床上，所接種的DC數目也被認為對治療效果具有很大影響。然而，可能在很多情況下，由於患者的狀況，只能收集到有限數目的DC前體細胞(DC祖先)。結果，治療效果由於所得DC 數目的不足而可能變得不充分。因此，需要有方法能夠高效地擴增有限的DC前體細胞。而且，為了實現抗癌效果，需要一種高效的方法用於製備具有高白介素12(IL-12)生產能力的 DC (Cancer Immunol Immunother.，(2005)54 :721-728)(日本特表 2008-515439 (相應於非日語國際公開的未經審查的日本國家階段公布)。下面顯示了與本發明相關的先前技術文獻。先前技術文獻非專利文獻非專利文獻 1 =Steinman, R. M.，Ann. Rev. Immunol.，(1991)9 :271-296非專利文獻 2 =Banchereau, J. B. and R. Μ. Steinman, Nature, (1998) 392 :245-252非專利文獻3 =Shibata, S. et al.，J. Immunol.，(2006) 177 :3564-35764 Yoneyama, Y. et al. ，Biochem. Biophys. Res. Commun. ， (2007) 355 129-135非專利文獻 5 :Knutson, K. L. et al.，Cancer Immunol Immunother.，(2005)54 721-728專利文獻專利文獻1 日本特表2008-515439發明公開[本發明待解決的問題]本發明是鑑於上述情況而獲得的。本發明的一個目標是提供高效的方法，用於生產具有產生高水平IL-12的能力的樹突細胞。
[解決這些問題的方法]最近，本發明人開發出了一種用於擴增DC的高效方法。然而，他們發現，通過這種方法製備的DC的IL-12生產能力非常差。這提示了如下的可能性，即這種DC可能在體內不會產生充分的抗癌效果。本發明是本發明人經過專注研究的結果，涉及用於製備具有高 IL-12生產能力的DC的高效方法。本發明涉及用於產生樹突細胞的方法，所產生的樹突細胞，及其用途等。更具體地，本發明涉及[1] 一種用於產生樹突細胞的方法，其包括如下步驟(1)在(a)和(b)的存在下培養樹突細胞前體細胞(a)從(i)-(v)中選出的任意一種(i)粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)，(ii)白介素 3(IL-3)，(iii)血小板生成素(TPO)，(iv)Flt_3 配體(Flt_3L)，和 (v)Flt-3L、TP0 和 IL-6 ；禾口(b)幹細胞因子(SCF) 』及(2)在GM-CSF和IL_4的存在下培養在步驟(1)中培養的細胞；[2] [1]中的用於產生樹突細胞的方法，其包括如下步驟(1)在粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和幹細胞因子(SCF)的存在下培養樹突細胞前體細胞；和(2)在GM-CSF和IL_4的存在下培養在步驟(1)中培養的細胞；[3] [1]中的用於產生樹突細胞的方法，其包括如下步驟(1)在IL-3和SCF的存在下培養樹突細胞前體細胞；和(2)在GM-CSF和IL_4的存在下培養在步驟(1)中培養的細胞；[4] [1]中的用於產生樹突細胞的方法，其包括如下步驟(1)在TPO和SCF的存在下培養樹突細胞前體細胞；和(2)在GM-CSF和IL_4的存在下培養在步驟(1)中培養的細胞；[5] [1]中的用於產生樹突細胞的方法，其包括如下步驟(1)在Flt_3L和SCF的存在下培養樹突細胞前體細胞；和(2)在GM-CSF和IL_4的存在下培養在步驟(1)中培養的細胞；[6] [1]中的用於產生樹突細胞的方法，其包括如下步驟(1)在Flt_3L，TPO, IL-6和SCF的存在下培養樹突細胞前體細胞；和(2)在GM-CSF和IL_4的存在下培養在步驟(1)中培養的細胞；[7] [1]-[6]中任一項的方法，其中該樹突細胞前體細胞是人類來源的細胞；和[8] [7]中的方法，其中該人類來源的細胞是臍帶血來源的CD34+細胞。在上述每一個引用相同項目的條目中，兩個或多個在這裡描述的發明的任意組合也意圖包含在所引用的上位條目內。本說明書意圖包括在這裡描述的發明的任何部分或其任意組合。本說明書還意圖包括排除了這裡描述的發明的任意部分及其任意組合的發明。 而且，當本說明書描述某些特定的優選實施方案時，本說明書不僅公開了這些實施方案，還公開了所公開的上位發明中除了這些實施方案之外的發明。[發明的效果]樹突細胞具有強烈的誘導免疫的能力。因此，通過本發明方法獲得的樹突細胞可用作在用於癌症、感染等的免疫治療中有用的樹突細胞(DC)疫苗。例如，在腫瘤免疫治療中，通過將樹突細胞與腫瘤細胞裂解物混合、用肽衝激(pulse)樹突細胞、將腫瘤抗原基因引入到樹突細胞內等方法，使樹突細胞呈遞腫瘤抗原，並在針對腫瘤的DC療法中使用。即使當從患者收集的DC數量較少時，通過使用本發明的方法也可以製備足以產生治療效果的數目的DC。附圖簡述

圖1中線圖的縱軸刻度描述如下，其表示1. E+04, le4,或 1. 00E+04 1. 0 X IO4 (個細胞)1. E+05 或 1. 00E+05 1. 0 X IO5 (個細胞)1. E+06 或 1. 00E+06 1. 0 X IO6 (個細胞)1. E+07 或 1. 00E+07 1. OXlO7 (個細胞)1. E+08 或 1. 00E+08 1. 0 X IO8 (個細胞)
1. E+09 或 1. 00E+09 1. 0 X IO9 (個細胞)1. E+10 或 1. 00E+10 1. OX IO10(個細胞)1. E+11 或 1. 00E+11 1. OX IO11 (個細胞)將人臍帶血來源的CD34+細胞在含有特定細胞因子的培養基中培養。圖1用曲線圖顯示了該擴增和分化的結果。細節如下星號(*)指示第觀天的時間點。「GMSCF」:來自在GMSCF施用組培養條件下培養35天的CD34+細胞培養物的樣品。「GMSCF- > GMIL-4」 來自在GMSCF施用組培養條件下培養28天，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養7天的⑶34+細胞培養物的樣品。「IL-3- > GMIL-4」 來自在IL-3施用組培養條件下培養28 天，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養7天的⑶34+細胞培養物的樣品。「SCFIL-3- > GMIL-4」 來自在IL-3SCF施用組培養條件下培養28天，隨後在GMIL-4施加組培養條件下培養7天的CD34+細胞培養物的樣品。「TP0/SCF- > GMIL-4」 來自在TPOSCF施用組培養條件下培養觀天，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養7天的CD34+細胞培養物的樣品。 "Flt3-L/SCF- > GMIL-4」 來自在FS施用組培養條件下培養28天，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養7天的⑶34+細胞培養物的樣品。「FST6- > GMIL-4」:來自在FST6施用組培養條件下培養觀天，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養7天的CD34+細胞培養物的樣品。圖2的照片顯示了當「⑶34+細胞在GMSCF施用組培養條件下培養28天，隨後在 GMIL-4施用組條件下培養7天」時，樹突存在與否的評估結果。在該圖中，「iDC處理」是指經過iDC處理後的細胞的照片，而「0K432處理」是指經過0K432處理後的細胞的照片。在 "0K432處理」後，樹突細胞顯示樹突。在該圖的照片中，在0K432處理組中觀察到了樹突， 而在iDC處理組中則沒有觀察到。因此，「在GMSCF施用組培養條件下培養28天，隨後在 GMIL-4施用組條件下培養7天的⑶34+細胞」被認為是樹突細胞。圖3 (A)的線圖顯示了對在含有特定細胞因子的培養基中培養35天的人臍帶血來源CD34+細胞產生的細胞因子(IL-12)的定量結果。縱軸的單位是「pg/ml/48h」(lX106個細胞在Iml培養基中培養)。使用直徑3. 5cm的皿培養細胞。IL-12的產生量通過ELISA 加以確定。將細胞在含有本圖中指示的特定細胞因子的培養基中培養35天。本圖顯示了在培養35天後用iDC處理的樣品中的細胞(在本圖中標示為「iDC處理組」)和在含有特定細胞因子的培養基中培養35天後用iDC處理的樣品中的細胞(iDC處理後用0K432處理)(在本圖中標示為「0K432處理組」)中產生的IL-12的量。確定用於活化樹突細胞的 "0K432處理」("0K432處理組」)後的樣品中產生的IL-12的量，並與「iDC處理組」進行比較。結果如圖所示。本圖所示樣品(1)-(8)在下文中有詳細的描述。括號中顯示的數值對應於每個樣品的縱軸的數值(四捨五入到兩位小數)。(1)CD34+細胞在GMSCF施用組培養條件下培養5周後獲得的樣品(iDC處理組中為0. 02 ；0K432施用組中為5. 96)。(2)⑶34+ 細胞在IL-3施用組培養條件下培養4周，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養1周後獲得的樣品(iDC處理組中為0 ；0K432施用組中為21. 12)。( ⑶34+細胞在GMSCF施用組培養條件下培養4周，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養1周後獲得的樣品(iDC處理組中為0.42 ;01(432施用組中為210.55)。(4) CD34+細胞在IL-3SCF施用組培養條件下培養4 周，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養1周後獲得的樣品(iDC處理組中為0 ；0K432施用組中為71. 40)。(5)CD34+細胞在TPOSCF施用組培養條件下培養4周，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養1周後獲得的樣品(iDC處理組中為0 ；0K432施用組中為8891. 03)。 (6)⑶34+細胞在FS施用組培養條件下培養4周，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養1周後獲得的樣品(iDC處理組中為0. 22 ；0K432施用組中為5333. 57)。(7)CD34+細胞在FST6 施用組培養條件下培養4周，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養1周後獲得的樣品(iDC 處理組中為0 ；0K432施用組中為6631. 32)。(8)⑶14+細胞在GMIL-4施用組培養條件下培養1周後獲得的樣品(iDC處理組中為0. 55 ；0K432施用組中為觀3. 76)。該培養樣品已知是可以產生IL-12的樹突細胞(特表2008-515439)，並在實驗中用作對照。圖3 (B)更詳細地顯示了圖3 (A)所示一些樣品的數據。與圖3 (A) —樣，縱軸指示 IL-12的產生量，縱軸的單位是「pg/le6細胞/ml/48h」。IL-12的產生量通過ELISA確定。 本圖中樣品(1)- )和⑶的細節與圖3(A)中一樣。圖4的曲線圖顯示了當人類臍帶血來源的CD34+細胞在下面的條件(1)-(3) 下培養時的擴增和分化結果。(1)在GMSCF施用組培養條件下培養(在本圖中指示為 「GMSCF」)。(2)在0. IGMSCF施用組培養條件下培養(在本圖中指示為「GMSCF0. 1」)。(3) 在0. 0IGMSCF施用組培養條件下培養(在本圖中指示為「GMSCF0. 01」)。圖5顯示了在上面圖4中用星號㈩指示的時間點處(即在培養第35天)在每種條件下培養的細胞中CDllc陽性細胞的測定結果(百分比)。本圖中的縮寫如下=GMSCF 在 GMSCF施用組培養條件下培養。GMSCF0. 1 在0. IGMSCF施用組培養條件下培養。GMSCF0. 01 在0. 0IGMSCF施用組培養條件下培養。圖6的曲線圖顯示了當人類外周血CD14+前體(單核細胞)在含有特定細胞因子的培養基中培養時的擴增和分化結果。細節描述如下「GMSCF」:在GMSCF施用組培養條件下培養25天的單核細胞。「GMIL-4」:在GMIL-4施用組培養條件下培養的單核細胞。該方法是一種已知的培養方法(特表2008-5151439)。實施本發明的樽式本發明涉及用於產生樹突細胞的方法，其包括在多種細胞因子存在下培養樹突細胞前體細胞的步驟。更具體地，本發明涉及用於產生樹突細胞的方法，其包括如下步驟(1)在幹細胞因子(SCF)和從下面(i)-(v)中選出的細胞因子的存在下培養樹突細胞前體細胞；和(2)在GM-CSF和IL_4的存在下培養在步驟(1)中培養的細胞。
(i)-(v)組如下(i)粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)(ii)IL-3(iii)TPO(iv)Flt-3L(ν) Flt-3L, TPO,和 IL—6DC前體細胞可以通過上述步驟被高效地擴增和/或分化。而且，通過這些步驟可以高效地產生具有高IL-12生產能力的DC。這裡，「在特定細胞因子的存在下」的意思是含有至少一種特定的細胞因子。除了特定的細胞因子之外，可以包含其它的細胞因子。優選地，特定細胞因子是排他性地含有的，例如沒有任何其它細胞因子。培養時間沒有限制，但是，優選地為3-5周，更優選地為3-4周，例如可以是15天或者更多，16天或者更多，18天或者更多，19天或者更多，20天或者更多，21天或者更多，22天或者更多，23天或者更多， 24天或者更多，25天或者更多，38天或者更少，35天或者更少，30天或者更少，四天或者更少，觀天或者更少，27天或者更少，沈天或者更少，25天或者更少，M天或者更少，22天或者更少，21天或者更少，或者20天或者更少。這裡，樹突細胞(DC)是在成熟狀態下具有樹突形態，並具有通過呈遞抗原激活T 細胞的能力的細胞。這裡，樹突細胞前體細胞是在合適細胞因子(G-CSF，GM-CSF, TNF-α， IL-4，IL-13，SCF(c-kit配體)，Flt-3配體，或其組合)的存在下分化成DC的細胞。優選地，細胞能夠在4周或更短時間內，更優選地在20天或更短時間，更加優選地在18天或更短時間，再更優選地在16天或更短時間內，分化成樹突細胞。這些細胞包括CD34+幹細胞、 造血祖細胞、和骨髓單核細胞。這些細胞可以被製備成例如細胞級分(cell fraction)。細胞級分是通過分離(或分級分離)細胞獲得的細胞群體。細胞級分可以是包含細胞和藥學可接受載體的組合物。載體包括期望的活細胞在其中能夠懸浮的溶液，例如生理鹽水、磷酸鹽緩衝液(PBS)、培養基、和血清。樹突細胞包括分布於機體各種組織和器官中的具有樹突形態的骨髓來源細胞群， 分布於機體各種組織和器官中的用細胞因子體外分化產生的具有樹突形態的細胞群，或者來自骨髓或血液幹細胞和等價細胞的類似細胞群。具體地，樹突細胞包括例如淋巴樹突細胞(包括可誘導Th2或免疫耐受的細胞)、骨髓樹突細胞(一般使用的樹突細胞，包括未成熟和成熟樹突細胞)、朗格漢斯細胞(在皮膚中作為重要抗原呈遞細胞的樹突細胞)、交錯突細胞(interdigitating cell)(分布於淋巴結和脾臟T細胞區內，被認為發揮向T細胞呈遞抗原的作用)、和濾泡樹突細胞(B細胞的重要抗原呈遞細胞；該細胞通過抗體受體或補體受體呈遞表面上的抗原-抗體複合體或抗原-補體複合體向B細胞呈遞抗原)。優選地，樹突細胞高表達MHC I類和II類分子，更優選地表達⑶11c。來自從骨髓、臍帶血或外周血收集的細胞的DC或DC前體細胞是本發明更優選使用的。DC前體細胞包括例如CD34 陽性細胞。DC所來源的物種沒有特別限制，可以是哺乳動物，包括靈長動物，例如人和猴，齧齒動物例如小鼠和大鼠，以及家兔、牛和山羊。樹突細胞還可以是具有樹突形態的細胞，並且對於從下組選出的兩個或多個表面標記呈陽性=CDllc, HLA-II類(HLA-DR，-DP，或-DQ)，CD40和CDla0本發明的樹突細胞更優選地是HLA-II類+且⑶Ilc+細胞，甚至更優選地，是⑶la+、HLA-II類+、⑶11c+、對譜系標記(lineage marker)呈陰性(LirT)的細胞，即不表達T細胞標記(⑶3)，B細胞標記(⑶19， ⑶20)，NK細胞標記(⑶56)，中性粒細胞標記(⑶15)，和單核細胞標記(⑶14)。當細胞是骨髓樹突細胞(骨髓DC)時，它們優選地還表達⑶lib。例如，CDllb+，⑶Ilc+細胞包含在本發明的DC內。當細胞是淋巴樹突細胞(淋巴DC)時，它們還可以表達⑶8。此外，本發明的樹突細胞同時包括成熟和未成熟的樹突細胞。「未成熟樹突細胞」是指，與成熟狀態相比，T細胞激活能力顯著降低的樹突細胞。具體地，未成熟樹突細胞的抗原呈遞能力低於通過添加LPS(1 μ g/ml)並培養2天而誘導成熟的樹突細胞的 1/2，優選地低於前者的1/4。抗原呈遞能力可以用例如異基因T細胞激活能力(alio T cell-activating ability)加以量化(混合淋巴細胞測試將異基因T細胞和樹突細胞以 T細胞樹突細胞1 10的比例，或者優選地以不同的比例共培養；在終止培養前8小時添加3H-胸苷，並根據摻入到T細胞DNA內的3H-胸苷的量評估T細胞生長能力(見Gene Therapy 7 ；249-254(2000)) 0或者，可以通過測試用肽誘導特異細胞毒T細胞(CTL)的能力進行評估，其中向樹突細胞添加某抗原的已知的I類限制性肽；將樹突細胞與從收集該樹突細胞相同的健康供體的外周血獲得的T細胞共培養(在第3天或更晚時間，用25U/ml 或者優選地100U/ml IL-2)。T細胞優選地在21天內用樹突細胞刺激3次，更優選地在14 天內用樹突細胞刺激2次。將所得的效應物細胞與51Cr-標記的靶細胞(肽-限制性I類陽性腫瘤細胞)以 100 1-2.5 1(100 1,50 1,25 1,20 1,12. 5 1,10 1， 5 1，或2.5 1)的比例，優選10 1的比例共培養4小時；並且定量從靶細胞釋放的 51Cr (見Arch Dermatol Res 292 =325-332 (2000)) 而且，未成熟的樹突細胞優選地具有吞噬抗原的能力，更優選地顯示可誘導用於T細胞激活的共刺激的受體的低表達(例如與如上所述通過LPS誘導的成熟DC相比顯著地低)或陰性表達。另一方面，「成熟樹突細胞」 是指如下的樹突細胞，其與未成熟狀態相比，具有顯著強烈的用於T細胞激活等的抗原呈遞能力。具體地，成熟樹突細胞可具有通過添加LPS(1 μ g/ml)並培養2天誘導成熟的樹突細胞的抗原呈遞能力的一半或者更強，優選地與之相當或者更強的抗原呈遞能力。而且，成熟的樹突細胞優選地具有微弱或沒有抗原吞噬能力，更優選地陽性表達可誘導用於T細胞激活的共刺激的受體。樹突細胞的激活是指從未成熟向成熟樹突細胞的轉變；激活的樹突細胞包括成熟的樹突細胞和處於轉變過程中的樹突細胞，其中誘導共刺激信號的CD80和 ⑶86的表達被激活刺激物提高。成熟的人樹突細胞是⑶40、⑶80、⑶86、和HLA-II類表達為陽性的細胞。未成熟的樹突細胞可以根據例如選自CD80和CD86的標記與成熟樹突細胞區別。未成熟的樹突細胞對這些標記呈弱陽性，優選陰性，而成熟的樹突細胞是陽性的。如上所述，未成熟的樹突細胞一般具有高吞噬能力。當向樹突細胞添加LPS(1 μ g/ ml)並培養2天時，它們被激活，並且其吞噬能力降低。吞噬能力可以通過測量樹突細胞攝取小分子的量或發生攝取的細胞的比例加以測定。吞噬能力優選地通過被攝入到樹突細胞內的小分子的量加以確定。例如，使用直徑大約為Iym的有色珠子，可以測量被攝入到樹突細胞內的球珠。通過減去4°C時的陽性背景進行定量。高吞噬能力是指該樹突細胞攝取的小分子的量是與如上所述用LPS(1 μ g/ml)刺激2天的樹突細胞攝取的小分子的量的4 倍或者更多，更優選地5倍或者更多，再優選地6倍或者更多的能力。或者，攝取小分子的細胞的比例是2倍或者更多，更優選地3倍或者更多。低吞噬能力是指，被該樹突細胞攝取的小分子的量少於比用LPS (1 μ g/ml)刺激2天的樹突細胞攝取的小分子的量的4倍，更優選地少於其2倍，更優選地少於其1. 5倍。或者，當作為攝取小分子的細胞的比例進行測量時，比例為小於2倍，更優選地小於1. 5倍。成熟樹突細胞的鑑別由本領域的技術人員常規地進行，並且上述的各個標記和測量其表達的方法也是本領域技術人員眾所周知的。例如，⑶Ilc是大約150kD(pl50，整聯蛋白α鏈)的粘附糖蛋白。⑶11與⑶18結合形成⑶Ilc/⑶18複合體，其能夠與纖維蛋白原結合，並被報導可發揮iC!3b和ICAM-I受體的功能。此外，已經有報導，⑶Ilc/⑶18能夠發揮粘附分子的功能，與經過刺激的上皮上的受體結合(Knapp，W. et al.，eds.，1989， Leucocyte Typing IVWhite Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press,New York ；Barclay,N. A. et al.,eds. ,1993, The Leucocyte Antigen Facts Book, CDll Section, Academic Press Inc., San Diego, California, p. 124 ；Stacker, S. A.禾口 Τ. A. Springer, 1991，J. Immunol. 146 :648)。⑶la是大約49kD的多肽，與β 2微球蛋白結合。OTl在結構上與MHCI類抗原相似，並被認為在抗原呈遞中發揮功能(Knapp, W. et al.，eds.，1989，Leucocyte Typing IV White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York ； Schlossman, S. et al. , eds. ,1995, Leucocyte Typing V :ffhite Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press,New York ；Hanau,D.et al. ,1990,J. Investigative Dermatol. 95 :503 ；Calabi, F. and A.Bradbury. ,1991, Tissue Antigens 37 :1)。CDllb也稱作整聯蛋白α M鏈，Mac-I, CR3，iC3bR(3型補體受體)，或Mol， 是分子量為大約165-170的I型跨膜糖蛋白。⑶1 Ib發揮補體(iC3b)、纖維蛋白原和凝血因子X受體的功能，並參與吞噬作用(Todd R. F. et al. J. Immunol.，126， 1435-1442(1981) ；Leong Α. S.Y. Appl. Immunohistochem. Surg. Pathol. ,120-128(1993)； Todd R. F. et al. Hybridoma,1,329-337(1982) ；Cobbold S. et al. Leucocyte Typing III, 788-803(1987) ；Keizer G. et al. Eur. J. Immunol. ,15,1142-1148. (1985) ；Laffon A. et al. J. Clin. Invest. ,88,546-552(1991) ；Acevedo A. et al. J. Invest. Dermatol. , 97, 659-666(1991)) ο⑶lie(整聯蛋白αΧ亞基，或pl50白細胞表面抗原)是整聯蛋白家族的一個分子，並且與其它白細胞整聯蛋白(⑶11a，⑶11b，和⑶lid)相似，與整聯蛋白β2亞基 (CD18)非共價結合。CDllc是分子量為145-150kDa的跨膜糖蛋白，並且是眾所周知的樹突細胞標記(Molica S. et al. Blood, 81，2466 (1993) ；Van der Vieren Μ. et al. Immunity, 3,683-690(1995) ；Hogg N. et al. Leucocyte Typing III，576-602 (1987))。⑶14是53_55kD的糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨定的單鏈糖蛋白，在樹突網狀細胞和一些類型的朗格漢斯細胞中表達。⑶14被鑑定為是一種表面受體，與LPS和血清LPS-結合蛋白(LPB)的複合體具有高親和性(McMichael, A. J. et al.，eds.，1987，Leucocyte Typing III White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York ；Knapp, W. et al. , eds. ,1989, Leucocyte Typing IV White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York ；Schlossman, S. et al. , eds.,1995, Leucocyte Typing VWhite Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York ；Wright,S.D.et al. ，1990, Science 249 :1434)。
⑶40是45_48kD的I型整合膜蛋白(I型整合膜糖蛋白)。抗-⑶40抗體經常用作細胞標記(Schlossman, S. et al. , eds. , 1995, Leucocyte Typing V :ffhite Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York ；Galy, A. H. M. ；and H. Spits,1992, J. Immunol. 149 :775 ；Clark, E.A. and J.A. Ledbetter, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83 :4494 ；Itoh, H. et al.，1991，Cell 66 :233 ； Bare lay, N. A. et al.，1993，The Leucocyte Antigen Facts Book. , Academic Press)。⑶80是一個大約60kD的跨膜糖蛋白，是Ig超基因家族的一員。⑶80是T 細胞中表達的 CD^ 和 CD152(CTLA-4)的配體(Schlossman，S. et al.，eds.，1995， Leucocyte Typing V White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York ；Schwarts, R. H.，1992，Cell 71 :1065 ；Azuma, Μ. et al.，1993，J. Exp. Med. 177 :845 ；Koulova, L. et al.，1991，J. Exp. Med. 173 :759 ；Freeman, G. J. et al.，1998， J. Immunol. 161 :2708 ；Behrens, L. et al.,1998, J. Immunol. ,161(11) :5943 ；Guesdon, J.-L. et al. , 1979, J. Histochem. Cytochem. 27 :1131-1139)。⑶83是大約45kD的跨膜蛋白，是Ig超家族的一員。⑶83具有一個V型Ig的短細胞外域和一個C端胞質尾。⑶83主要在濾泡樹突細胞、循環樹突細胞、淋巴組織中的交錯突樹突細胞、體外產生的樹突細胞和胸腺樹突細胞中表達(Zhou，L-J. ,and Τ. F. Tedder, 1995, J. Immunol. 154. 3821 ；Zhou, L-J. et al. , 1992, J. Immunol. 149 :735 ；Summers,K. L. et al. , 1995, Clin Exp. Immunol. 100 :81 ；ffeissman, D. et al. , 1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 92 826 ；Hart, D. N. J.，1997，Blood 90 :3245)。CD86 (B70/B7-2)是大約75kD的細胞表面蛋白，其是⑶觀和CTLA-4的第二配體， 在早期免疫應答中的T細胞共刺激中發揮重要作用(Azuma Μ. et al. , 1993, Nature 366 76 ；Nozawa Y. et al.，1993，J. Pathology 169 :309 ；Engle, P. et al. 1994，Blood 84 1402 ；Engel, P. et al. , CD86 Workshop Report. In Leukocyte Typing V. Schlossman, S.F. et al. eds. ,1994,Oxford University Press ；Yang,X.F. et al. ,1994,Upregulation of CD86 antigen on TPA stimulated U937 cells,1994, (abstract). American Society of Hematology, Nashville, TN ；Guesdon, J. -L. et al. , 1979, J. Histochem. Cytochem. 27 1131-1139)。CCR7也稱作BLR-2，EBI-1，和CMKBR7，其是一個7次跨膜G蛋白偶聯受體，並且是 CC 趨化因子，ΜΙΡ-3 β /Exodus 3/ELC/CCL19 和 6Ckine/Exodus 2/SLC/TCA4/CCL21 的受體(Sallusto, F. et al.，1999，Nature 401 :708-12 ；Lipp, M. et al.，2000，Curr. Top. Microbiol.Immunol. 251 :173-9 ；Birkenbach, Μ. et al. ，1993, J. Virol. 67 :2209-20 ； Schweickart, V. L. et al. ,1994, Genomics 23 :643-50 ；Burgstahler, R. et al. ,1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 215 :737-43 ；Yoshida, R. et al. , 1997, J. Biol. Chem. 272 13803-9 ；Yoshida, R. et al.，1998，J. Biol. Chem. 273 :7118-22 ；Yoshida, R. et al.，1998， Int. Immunol. 10 :901-10 ；Kim, C. H. et al. ,1998, J.Immunol. 161 :2580-5 ；Yanagihara, S. et al.，1998，J. Immunol. 161 :3096-102)。DR、DP、和DQ作為HLA-II類存在，並可以用結合所有這些的抗體一併檢出 (Pawelec, G. et al.,1985, Human Immunology 12 165 ；Ziegler, A. et al.,1986, Immunobiol. 171 :77)。HLA-DR是人類MHC II類抗原的一員，是由一個由α鏈(36kDa)和一個β亞基(27kDa)構成的跨膜糖蛋白。在上皮朗格漢斯細胞中，其與⑶Ia抗原共表達。 CDla在抗原呈遞的細胞互作中發揮主要作用(Barclay, N. A. et al. ,1993, The Leucocyte Antigen Facts Book. p. 376. Academic Press)。人和非人哺乳動物的樹突細胞可以用上述標誌物基因和其同源基因的產物作為指標來指定。針對這些標誌物的抗體可以從例如BD Biosciences (BD PharMingen)獲得， 詳細信息可以在該公司網址或其分銷商網址獲得。對於樹突細胞標誌物，另見Kiertscher等和Oehler等的參考文獻(Kiertscher SM, Roth MD, Human CD14+leukocytes acquire the phenotype and function of antigen-presenting dendritic cells when cultured in GM-CSF and IL—4，J. Leukoc. Biol.，1996，59 (2) :208-18 ；Oehler, Let al.，Neutrophil granulocyte-committed cells can be driven to acquire dendritic cell characteristics, J. Exp. Med., 1998,187(7) :1019-28) 0關於流式細胞術，見Okmo等和Mites等的參考文獻(Okano, S. et al.，Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes. Gene Ther.，2003，10(16) :1381-91 ；Stites，D. et al.，Flow cytometric analysis of lymphocyte phenotypes in AIDS using monoclonal antibodies and simultaneous dual immunofluorescence, Clin. Immunol. Immunopathol.，1986，38 :161-177)。每禾中標誌物的表達可以用例如當用同種型對照抗體染色時產生以下的陽性率的螢光強度作為閾值來確定，其中等於或高於閾值的螢光視為陽性，低於閾值的螢光視為陰性。樹突細胞或其前體細胞可以根據或者基於已知的方法加以製備。例如，細胞可以從血液(例如外周或臍帶血)、骨髓、淋巴結、其它淋巴器官、脾臟和皮膚分離(Bishop et al.，Blood 83 :610-616,1994 ；Bontkes, H. J. et al. (2002)J.Leukoc. Biol. 72，321—329 ； Katsuaki, S. et al. (1998)CRYOB10L0GY 37,362-371 ；Ladan, K. et al. (2006)Stem Cells 24,2150-2157 ；Ueda，T. et al. (2000) J. Clin. Invest. 105 :1013-1021)。本發明內容中使用的樹突細胞優選地從血液或骨髓獲得。或者，本發明使用的樹突細胞可以是皮膚朗格漢斯細胞、輸入淋巴細管(afferent lymphatics)的隱蔽細胞(veiled cell)、濾泡樹突細胞、脾樹突細胞和淋巴器官的交錯突細胞。本發明使用的樹突細胞包括從下組選出的樹突細胞 CD34+-來源的樹突細胞、骨髓來源的樹突細胞、單核細胞來源的樹突細胞、脾細胞來源的樹突細胞、皮膚來源的樹突細胞、濾泡樹突細胞、和生發中心樹突細胞。特別地，優選的DC前體細胞是造血幹細胞、造血祖細胞等，從骨髓、臍帶血或外周血獲得。造血幹細胞或造血祖細胞可以通過用商業可得的試劑盒等進行負選擇，或通過用CD34+等進行陽性選擇加以獲得(見美國專利申請No. 08/539，142)。例如，已知的細胞分離方法包括通過磁珠用表面抗原分離、螢光標記分選、生物素-親和素結合載體等(Berenson et al.，J. Immunol. Meth.， 91 11,1986 ；WO 93/08268)。當從包括DC或DC前體細胞和其它細胞的組合物中選擇(或富集)DC或DC前體細胞時，優選地進行所謂的負選擇，將非DC或DC前體細胞的細胞除去。通過負選擇過程， DC-粒細胞前體(J.Exp. Med.，1998，187 :1019-1028 ；Blood, 1996,87 :4520-4530)被保留而不被除去，因此認為，不僅從粘附性的CD14+細胞分化的DC，而且從前體分化的DC可被一併回收。這預期可以減少在例如將載體引入到DC中時發生的細胞毒性。例如，通過使用特異抗體除去T細胞、NK細胞、B細胞等，可以富集DC。具體地，例如，優選地獲得選自⑶2，⑶3，⑶8，⑶19，⑶56，和⑶66b，或其任意組合的表面標誌物表達低或者表達為陰性的細胞。更優選的細胞是這樣的細胞，其中⑶2，⑶3，⑶8，⑶19，⑶56和 CD66b的表達均低或為陰性。因此，優選地用針對這些標誌物的抗體除去表達這些標誌物的細胞(Hsu et al. ,Nature Med. 2 :52 (1996))。負選擇用多價抗體執行。或者，使用磁珠或類似物進行磁細胞分離(MACS)，也可以進行相似的選擇。珠子優選地用於大規模細胞製備，例如通過血細胞分離收集單核細胞等。例如，在本發明內容中可以適當使用從機體獲得的細胞溶液富集單核細胞，然後對其進行負選擇而製備的DC前體細胞。用於分離樹突細胞的具體方法在下列文獻中有描述，例如Cameron et al., Science 257 :383(1992) ；Langhoff et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :7998(1991)； Chehimi et al. , J. Gen. Viroi. 74 :1277(1993) ；Cameron et al. , Clin. Exp. Immunol. 88 226(1992) ； Thomas et al. , J. Immunol. 150 :821 (1993)；禾口 Karhumaki et al. ,Clin. Exp. Immunol. 91 :482(1993)。通過流式細胞術分離樹突細胞在例如下列文獻中有描述=Thomas et al.，J. Immunol. 153 :4016(1994) ；Ferbas et al.，J. Immunol. 152 :4649(1994)；和 0' Doherty et al.，Immunology 82:487(1994)。此外,磁細胞分離在例如 Miltenyi et al. , Cytometry 11 :231-238(1990)中有描述。進一步，例如，人樹突細胞可以用下列文獻中所述的方法加以分離和擴增 Macatonia et al. , Immunol. 74 :399-406(1991) ；0' Doherty et al. , J.Exp. Med. 178 1067-1078(1993) ；Markowicz et al. , J.Clin. Invest. 85 :955-961(1990) ；Romani et al.，J. Exp. Med. 180 :83-93(1994) ；Sallusto et al.，J. Exp. Med. 179 :1109-1118(1994)； Berhard et al.，J. Exp. Med. 55 :1099-1104(1995)；等。而且，樹突細胞可以通過 Van Tendeloo et al. ,Gene Ther. 5 :700-707 (1998)所述的方法從骨髓、臍帶血、外周血等來源的CD34+細胞形成，或從外周血來源的單核細胞形成。DC前體細胞在含有一種或多種細胞因子的培養基中擴增。例如，在甚至只用IL-3 的情況下，DC前體細胞可以擴增大約10天。然而，只用IL-3見不到更長期的擴增。本發明人發現，通過在含有SCF和IL-3的培養基中培養DC前體細胞，可以高效地擴增具有分化成 DC的能力的細胞。因此，為了擴增2周或者更長時間，優選地組合使用IL-3和SCF。特別地，通過在含有下列4種類型細胞因子的培養基中培養DC前體細胞，可以大量獲得具有強的分化成DC的能力的DC前體細胞FLT-3L、SCF、ILUPIL-6。本發明涉及用於產生DC的方法，其包括如下的培養基中擴增DC前體細胞的步驟含有IL-3和SCF但沒有FIT-3L和 IL-6的培養基，含有FLT-3L、SCF和IL-3但沒有IL-6的培養基，或者含有SCF、IL_3和IL-6 但沒有FLT-3L的培養基。本發明還涉及產生DC的方法，其包括在含有FLT-3L、SCF、IL-3 和IL-6的培養基中擴增DC前體細胞的步驟，例如含有這些細胞因子但沒有顯著量的一種或多種選自下組的細胞因子(或其任意組合)的培養基G-CSF、GM-CSF、IL-4、和TNF-α。同時，在這裡所述的在細胞因子組合的存在下進行的培養中，該組合可以額外地包含其它細胞因子(即在其它額外細胞因子的存在下進行培養)，或者可以不包含其它額外的細胞因子。或者，有可能包括或者不包含額外的在其它細胞因子存在下培養的步驟。在這裡所述的培養中，在細胞因子組合的存在下，例如，有可能使用從下組選出的一種或多種的任意組合GM-CSF、SCF、IL-4、IL-3, TPO, Flt_3L、和IL_6。本說明書還公開了這樣的情況，其中排除了從上組選出的一種或多種的任意組合。有可能包括或者不包括額外的在從上組選出的一種或多種細胞因子的任意組合的存在下進行培養的步驟。本說明書還公開了這樣的情形，其中排除了在選自上組的一種或多種細胞因子的任意組合的存在下培養的步驟。例如，當說「使用GM-CSF和SCF」時，可以意指額外地包含「選自從上述的細胞因子組中排除GM-CSF和SCF，即選自由IL-4、IL-3、TP0、Flt-3L和IL-6構成的組中的一種或多種的任意組合」，或者可以意指「不包含從該組選出的一種或多種細胞因子的任意組合」。有可能包括或者不包括額外的在該一種或多種細胞因子的任意組合的存在下進行培養的步驟。例如，培養可以在不使用ΤΡ0，不使用Flt-3L，不使用IL-6，不使用TPO和Flt_3L，不使用TPO 和IL-6，不使用Flt-3L和IL-6，或者不使用Flt_3L、TP0和IL-6的條件下進行。這同樣適用於細胞因子的其它組合。這些組合在這裡均被教導。 在本發明的培養中，例如GM-CSF(例如人GM-CSF)可以以如下濃度使用100ng/ ml或更少，50ng/ml或更少，10ng/ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少，0. lng/ml 或更少，0. 05ng/ml 或更少，0. 0lng/ml 或更少，0. 005ng/ml 或更少，0. OOlng/ ml 或更少,0. 0005ng/ml 或更少,0. 000 lng/ml 或更少,0. 00005ng/ml 或更少,0. 0000 lng/ml 或更少，或者可以不使用；SCF(例如人SCF)可以以如下濃度使用50ng/ml或更少，IOng/ ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少，0. lng/ml或更少，0. 05ng/ ml 或更少，0. 0 lng/ml 或更少，0. 005ng/ml 或更少，0. 00 lng/ml 或更少，0. 0005ng/ml 或更少，0. 000lng/ml或更少，0. 00005ng/ml或更少，0. 0000lng/ml或更少，或者可以不使用；IL-4(例如人IL-4)按照如下濃度使用:50ng/ml或更少，10ng/ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml 或更少，0. 5ng/ml 或更少，0. lng/ml 或更少，0. 05ng/ml 或更少，0. 0lng/ml 或更少,0. 005ng/ml 或更少，0. 00lng/ml 或更少，0. 0005ng/ml 或更少，0. 000lng/ml 或更少，0. 00005ng/ml或更少，0. 0000lng/ml或更少，或者可以不使用；IL_3(例如人IL-3)可以以如下濃度使用10ng/ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少， 0. lng/ml 或更少，0. 05ng/ml 或更少，0. 0 lng/ml 或更少，0. 005ng/ml 或更少，0. 00 lng/ml 或更少，0. 0005ng/ml 或更少,0. 000lng/ml 或更少,0. 00005ng/ml 或更少,0. 0000lng/ml 或更少，或者可以不使用；TPO(例如人ΤΡ0)可以以如下濃度使用50ng/ml或更少，IOng/ ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少，0. lng/ml或更少，0. 05ng/ ml 或更少，0. 0lng/ml 或更少，0. 005ng/ml 或更少，0. 00lng/ml 或更少，0. 0005ng/ml 或更少，0. 000lng/ml或更少，0. 00005ng/ml或更少，0. 0000lng/ml或更少，或者可以不使用； Flt3-L (例如人Flt3-L)可以以如下濃度使用:100ng/ml或更少，50ng/ml或更少，IOng/ ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少，0. lng/ml或更少，0. 05ng/ ml 或更少，0. 0lng/ml 或更少，0. 005ng/ml 或更少，0. 00lng/ml 或更少，0. 0005ng/ml 或更少，0. 000lng/ml或更少，0. 00005ng/ml或更少，0. 0000lng/ml或更少，或者可以不使用； IL-6(例如人IL-6)可以以如下濃度使用25ng/ml或更少，10ng/ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml 或更少，0. 5ng/ml 或更少，0. lng/ml 或更少，0. 05ng/ml 或更少，0. 0lng/ml 或更少，0. 005ng/ml 或更少，0. 00 lng/ml 或更少，0. 0005ng/ml 或更少，0. 000 lng/ml 或更少， 0. 00005ng/ml或更少，0. 0000 lng/ml或更少，或者可以不使用；G-CSF (例如人G-CSF)可以以如下濃度使用100ng/ml或更少，50ng/ml或更少，25ng/ml或更少，10ng/ml或更少，5ng/ ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少，0. lng/ml或更少，0. 05ng/ml或更少，0. Olng/ ml 或更少,0. 005ng/ml 或更少,0. 00 lng/ml 或更少,0. 0005ng/ml 或更少,0. 000 lng/ml
13或更少，0. 00005ng/ml或更少，0. 00001ng/ml或更少，或者可以不使用；TNF-α (例如人 TNF- a )可以以如下濃度使用100ng/ml或更少，50ng/ml或更少，25ng/ml或更少，IOng/ ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少，0. lng/ml或更少，0. 05ng/ ml 或更少，0. 0lng/ml 或更少，0. 005ng/ml 或更少，0. 00lng/ml 或更少，0. 0005ng/ml 或更少，0. 000lng/ml或更少，0. 00005ng/ml或更少，0. 0000lng/ml或更少，或者可以不使用； c-kit配體(例如人c-kit配體)可以以如下濃度使用100ng/ml或更少，50ng/ml或更少， 25ng/ml或更少，10ng/ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少，0. Ing/ ml或更少，0. 05ng/ml或更少，0. 0 lng/ml或更少，0. 005ng/ml或更少，0. 00 lng/ml或更少， 0. 0005ng/ml 或更少,0. 000 lng/ml 或更少,0. 00005ng/ml 或更少,0. 0000 lng/ml 或更少,或者可以不使用；IL-13(例如人IL-13)可以以如下濃度使用100ng/ml或更少，50ng/ml或更少，25ng/ml或更少，10ng/ml或更少，5ng/ml或更少，lng/ml或更少，0. 5ng/ml或更少， 0. lng/ml 或更少，0. 05ng/ml 或更少，0. O lng/ml 或更少，0. 005ng/ml 或更少，0. 00 lng/ml 或更少，0. 0005ng/ml 或更少,0. 000 lng/ml 或更少,0. 00005ng/ml 或更少,0. 0000 lng/ml 或更少，或者可以不使用。這些可以按照任意組合使用。這些組合均在這裡被教導。FLT-3L (Fms樣酪氨酸激酶3配體)是Flt_3的配體，並促進造血前體細胞分化和增殖(Namikawa R. et al.，BLOOD 87 1881-1890(1996))。EP 0627487 A2 和 WO 94Λ839中描述的多肽組包含在本發明的Flt-3L內。人Flt-3L cDNA可以根據登錄號ATCC 69382從美國典型培養物保藏中心(ATCC)獲得。SCF也稱作c_kit配體、肥大細胞生長因子(MGF)或青灰因子(steel factor) (Zsebo et al.，Cell 63 :195-201(1990) ；Huan, Ε.Cell 63 :225-233 ；Williams, D.Ε. , Cell 63:167-174(1990) ；Toksoz. D et al, PNAS 89 :7350-7354(1992)) ο SCF 包括 EP 423，980 中描述的多肽。IL(白介素)-3是由活化的T細胞、肥大細胞和嗜酸性粒細胞產生的血細胞生成因子。本發明的IL-3包括在美國專利No. 5，108，910中描述的IL-3多肽。編碼人IL-3蛋白的DNA序列可以通過登錄號ATCC 67747獲得。IL-6是作為B細胞分化誘導因子被發現的。 除了參與抗體產生系統之外，IL-6還具有多種生理學活性，例如在肝臟中誘導急性期蛋白的生物合成和基於與IL-3的協同作用促進造血幹細胞增殖(Paul SR et al. ,Blood, 1991, 77 :1723-1733)。IL-4主要是由輔助T細胞產生的，對T細胞、B細胞和其它血細胞具有廣泛的生理學活性(Mosley et al.，Cell 59 :335(1989) ；Idzerda et al.，J. Exp. Med. 171 861(1990) ；Galizzi et al.，Intl. Immunol. 2 :669 (1990))。GM-CSF 是作為刺激含有巨噬細胞或粒細胞的集落生長的因子被分離出來的(美國專利Nos. 5，108，910和5，229，496)。 GM-CSF是粒細胞與巨噬細胞的前體細胞生長和發育的必需因子，並刺激成粒細胞和成單核細胞，誘導它們分化。血小板生成素(TPO)是一種造血細胞因子，其具有通過特異作用於從造血幹細胞產生巨核細胞的過程而提高巨核細胞產生的功能(日本專利特許3058353)。每種細胞因子的濃度可以被適當地調整；然而FLT-3L的濃度可以是例如5ng/ml 或更多、10ng/ml或更多、20ng/ml或更多、或者30ng/ml或更多、800ng/ml或更少、600ng/ml 或更少、500ng/ml或更少、300ng/ml或更少、200ng/ml或更少、或者100ng/ml或更少、例如， 大約5-35ng/ml、優選地大約10_30ng/ml、更優選地大約15_25ng/ml、再優選地大約20ng/ ml。GM-CSF的濃度可以是例如0. 5ng/ml或更多、lng/ml或更多、5ng/ml或更多、10ng/ml或更多、20ng/ml或更多、或者30ng/ml或更多、800ng/ml或更少、600ng/ml或更少、500ng/ ml或更少、300ng/ml或更少、200ng/ml或更少、或者100ng/ml或更少。SCF的濃度可以是例如0. 25ng/ml或更多、0. 5ng/ml或更多、lng/ml或更多、5ng/ml或更多、10ng/ml或更多、 20ng/ml或更多、或30ng/ml或更多、800ng/ml或更少、600ng/ml或更少、500ng/ml或更少、 300ng/ml或更少、200ng/ml或更少、100ng/ml或更少、或者50ng/ml或更少。IL-4的濃度可以是例如0. 5ng/ml或更多、lng/ml或更多、5ng/ml或更多、10ng/ml或更多、20ng/ml或更多、或者30ng/ml或更多、800ng/ml或更少、600ng/ml或更少、500ng/ml或更少、300ng/ ml或更少、200ng/ml或更少、100ng/ml或更少、或者50ng/ml或更少。IL-6、TPO和其它細胞因子的濃度可以是例如lng/ml或更多、2ng/ml或更多、5ng/ml或更多、lOng/ml或更多、 20ng/ml或更多、或者30ng/ml或更多、800ng/ml或更少、600ng/ml或更少、500ng/ml或更少、300ng/ml或更少、200ng/ml或更少、100ng/ml或更少、50ng/ml或更少、25ng/ml或更少、 或者lOng/ml或更少。當使用無GM-CSF培養基例如FS36時，SCF，IL-3和IL-6的濃度為大約3_20ng/ ml，優選地大約5-15ng/ml，更優選地大約7-12ng/ml，再優選地大約lOng/ml，但不僅限於此。這些可以按照任意組合使用。這些組合在這裡均被教導。例如，RPMI1640或IMDM可以用作培養基。培養基適當地補加5% -20%血清，優選地大約10%血清，優選為胎牛血清 (FBS)。DC前體細胞的培養可以從大約IX 105-5X IO5細胞/ml開始，例如從大約2. 5 X IO5 細胞/ml開始。優選地，細胞每3-4天傳代。在傳代時，優選地將細胞濃度調節到2X IO6 細胞/ml或者更低濃度。當組合使用GM-CSF和SCF培養靈長類DC前體細胞，例如人CD34+ 細胞或人CD14+細胞時，可以使用如下濃度的GM-CSF 大約l-500ng/ml (大約l-200ng/ ml或大約l-100ng/ml)，更優選地大約2_300ng/ml，例如大約5_200ng/ml，優選地大約 10-150ng/ml，更優選地大約20_120ng/ml，再優選地大約30_100ng/ml。同時，可以使用如下濃度的SCF 例如大約0. 5-500ng/ml (大約0. 5-100ng/ml或大約0. 5_50ng/ml)，更優選地大約l_300ng/ml，甚至更優選地大約2_200ng/ml，再更優選地大約5_100ng/ml，例如大約10_70ng/ml，更優選地例如大約20_60ng/ml，再更優選地大約25_50ng/ml。當組合使用IL-3和SCF培養靈長類DC前體細胞例如人⑶34+細胞時，可以以如下濃度使用IL-3，例如大約0. l-10ng/ml，優選地大約Ι-lOng/ml，更優選地大約10ng/ml。SCF 可以按照例如如下濃度使用大約0. 5-500ng/ml (大約0. 5-100ng/ml或大約0. 5_50ng/ ml)，更優選地大約l_300ng/ml，甚至更優選地大約2_200ng/ml，再更優選地大約5_100ng/ ml，例如大約10_70ng/ml，更優選地例如大約20_60ng/ml，更優選地大約25_50ng/ml。當組合使用TPO和SCF培養靈長類DC前體細胞例如人⑶34+細胞時，可以以如下濃度使用TP0，例如大約0. 5-50ng/ml，優選地大約5_50ng/ml，更優選地大約50ng/ml。SCF 可以按照如下的濃度使用，例如大約0. 5-500ng/ml (大約0. 5-100ng/ml或大約0. 5_50ng/ ml)，更優選地大約l_300ng/ml，甚至更優選地大約2_200ng/ml，在更優選地大約5_100ng/ ml，例如大約10_70ng/ml，更優選地例如大約20_60ng/ml，更優選地大約25_50ng/ml。當組合使用Flt_3L和SCF培養靈長類DC前體細胞例如人⑶34+細胞時，可以以如下濃度使用Flt-3L，例如大約Ι-lOOng/ml，優選地大約lO-lOOng/ml，更優選地大約 100ng/ml。SCF可以以如下濃度使用，例如大約0. 5_500ng/ml (大約0. 5-100ng/ml或大約0. 5-50ng/ml)，更優選地大約l_300ng/ml，甚至更優選地大約2_200ng/ml，再更優選地大約5-100ng/ml，例如大約10_70ng/ml，更優選地例如大約20_60ng/ml，更優選地大約 25-50ng/mlo當組合使用Flt-3L，SCF, TPOjP IL_6培養靈長類DC前體細胞例如人CD34+細胞時，可以以如下濃度使用Flt-3L，例如大約Ι-lOOng/ml，優選地大約lO-lOOng/ml，更優選地大約100ng/ml。SCF可以以如下濃度使用，例如大約0. 5-500ng/ml (大約0. 5-100ng/ ml或大約0. 5-50ng/ml)，更優選地大約l_300ng/ml，再更優選地大約2_200ng/ml，再更優選地大約5-100ng/ml，例如大約10_70ng/ml，更優選地例如大約20_60ng/ml，更優選地大約25-50ng/ml。TPO可以以如下濃度使用，例如大約0. 5_50ng/ml，優選地大約5_50ng/ml， 更優選地大約50ng/ml。IL-6可以以如下濃度使用，例如大約0. 25-25ng/ml，優選地大約 2. 5-25ng/ml，更優選地大約 25ng/ml。當組合使用GM-CSF和IL-4培養靈長類DC前體細胞例如人⑶34+細胞時，可以以如下濃度使用GM-CSF，例如大約大約l-500ng/ml (大約l_200ng/ml或l-100ng/ml)， 更優選地大約2-300ng/ml，例如大約5_200ng/ml，優選地大約10_150ng/ml，更優選地大約20-120ng/ml，更更優選地大約30-100ng/ml。IL-4可以以如下濃度使用，例如大約 0. 5-50ng/ml，優選地大約5_50ng/ml，更優選地大約50ng/ml。本發明人發現，通過將DC前體細胞擴增的時期調節到3-5周，可以顯著增加隨後分化成DC的效率。更長的培養時期可產生更多的細胞，但是分化成DC的效率降低。特別地，當DC前體細胞在FS36培養基中擴增5周時，分化成DC的效率顯著降低。因此，如果使用無GM-CSF培養基，例如FS36，DC前體細胞培養的時期大約3-大約4周，優選地大約3周， 例如18-M天，更優選地20-22天；優選地避免使DC前體細胞在含有相同細胞因子組合的培養基中擴增更長的時間。在培養這些時間之後，將DC在如下所述的DC分化培養基中培養和分化。例如，當DC前體細胞在含有FLT-3L、SCF、IL-3和IL-6的培養基中培養時，在培養了上面指示的時期之後，將它們在除含有全部FLT-3L、SCF、IL-3和IL-6的培養基之外的培養基中培養。而且，本發明包括在GM-CSF和IL-4的存在下培養在含有一種或多種細胞因子的培養基中擴增的細胞的步驟。在GM-CSF和IL-4存在下的培養時間為大約3-14天，優選地 7天(例如5天或更長時間，優選地6天或更長時間，9天或更短時間，優選地8天或更短時間)。在優選實施方案中，本發明的方法能夠產生具有高IL-12生產能力的樹突細胞。 IL-12生產能力可以例如如下地確定。例如，通過本方法的第一步培養人臍帶血來源的 CD34+細胞，具體地，在幹細胞因子(SCF)和從由下面(i)-(v)構成的組中選出的細胞因子的存在下培養4周。補充有10% FBS的IMDM可以用作培養基。(i)GM-CSF, (ii)IL-3, (iii)TPO, (iv)Flt_3L，(ν)Flt_3L、TPO 和 IL-6然後，通過第二步培養基細胞，具體地，在GM-CSF和IL-4的存在下培養1周。接著，用0K432處理細胞，具體地，在補充有10% FBS並含有0K432 (0. 5KE/ml)的IMDM中培
2 (48h)(Chugai Pharmaceutical Co. ；Japan Standard Commodity Classification No. 874299)。然後，通過ELISA或類似方法定量在2天期間釋放到培養基中的IL-12。通過上述0K432處理，本發明的方法能夠產生下述量的IL-12，例如50或更多，優選地60或更多，70或更多，80或更多，90或更多，100或更多，150或更多，200或更多，250或更多，300或更多，400或更多，500或更多，1000或更多，2000或更多，3000或更多，4000或更多，5000或更多，6000或更多，7000或更多，或者8000或更多(單位在圖3的圖注中有描述)。(i)當在上述第一步中使用GM-CSF時，特別地，該方法可能能夠產生下述量的IL-12， 例如50或更多，100或更多，優選地200或更多。(ii)當在上述第一步中使用IL-3時，該方法可能能夠產生下述量的IL-12，例如20或更多，30或更多，40或更多，優選地50或更多。 (iii)當在上述第一步中使用TPO時，該方法能夠產生下述量的IL-12，例如100或更多， 200或更多，500或更多，1000或更多，3000或更多，4000或更多，優選地5000或更多。(iv) 當在上述第一步中使用Flt-3L時，該方法可能能夠產生下述量的IL-12，例如100或更多， 200或更多，500或更多，1000或更多，3000或更多，4000或更多，優選地5000或更多.(ν) 當在上述第一步中使用Flt-3L，TP0和IL-6時，該方法可能能夠產生下述量的IL-12，例如 100或更多，200或更多，500或更多，1000或更多，3000或更多，4000或更多，優選地5000 或更多。靈長動物⑶34+細胞包括例如臍帶血來源的⑶34+細胞，骨髓來源的⑶34+細胞， 和外周血來源的⑶34+細胞。有可能使用合適的期望培養基作為培養溶液。這些培養溶液包括例如 DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle Medium), MEM (Minimum Essential Medium), RPMI-1640，X-VIV0 (Lonza)，和 IMDM(Iscove，s Modified Dulbecco's Medium)。IMDM 是最優選使用的。優選地，培養基適當地補充血清，例如1 % -20 % (ν/ν)，更優選地2 % -20 %， 甚至更優選地5% -15%，再更優選地5% -10% (例如大約10% )。血清優選地是牛來源血清，最優選地是胎牛血清(FCS)。培養溫度沒有限制，可以是例如32°C -3935°C _38°C， 或大約37°C。CO2也沒有限制，可以是例如大約5% (4% -6% )0本發明提供了用於擴增樹突細胞的組合物，用於製備樹突細胞的組合物，用於產生樹突細胞的組合物，用於擴增樹突細胞的培養基，用於製備樹突細胞的培養基，和用於產生樹突細胞的培養基，所有這些均包含SCF和下面(i)-(v)組中任一個的細胞因子(i)粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)(ii)IL-3(iii) TPO(iv)Flt-3L(v)Flt_3L、TP0 和 IL-6。在本發明中，用於擴增樹突細胞的組合物、用於製備樹突細胞的組合物、用於產生樹突細胞的組合物、用於擴增樹突細胞的培養基、用於製備樹突細胞的培養基、和用於產生樹突細胞的培養基，除了 SCF和從上述(i)-(v)組中任一個的細胞因子之外，可以包含 GM-CSF 和 IL-4。而且，組合物可以適當地包括無菌水、緩衝劑、鹽等。培養基包括上述的培養溶液， 但是不僅限於此。培養基可以含有或者不含血清。而且，培養基可以含有或者不含抗生素。本發明還涉及SCF和下面(i)-(v)組中任一個的細胞因子在產生上述組合物或培養基中的用途(i)粒細胞/巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF)(ii)IL-3
(iii)TPO(iv)Flt-3L(v)Flt_3L、TP0 和 IL-6。本發明還涉及SCF和上面(i)-(v)組中任一個的細胞因子，以及GM-CSF和IL_4 在產生上述組合物或培養基中的用途。本發明還涉及用於擴增樹突細胞的試劑盒，用於製備樹突細胞的試劑盒，和用於產生樹突細胞的試劑盒，所有這些均包括上述(i)-(v)和SCF作為組分。所述試劑盒可以進一步包括培養溶液(例如不包含血清)或用於製備培養溶液的粉末(含有胺基酸、鹽等，但是不含任何血清、抗生素等)。優選地，這些組合物、培養基和試劑盒意圖用於擴增、 製備和產生靈長動物樹突細胞，包括人樹突細胞，更優選地，用於從靈長動物⑶34+細胞包括人CD34+細胞擴增、製備和產生具有高IL-12生產能力的樹突細胞。優選地，它們不含有 TNF-α和/或IL-4。例如，在組合物和培養基中，當添加血清時，TNF-α和IL-4的濃度範圍優選地不顯著高於它們在血清中的濃度。例如，濃度優選地是血清中細胞因子濃度的3 倍、2倍、1倍或者低於血清(例如正常FCQ中濃度，優選地是一半或更低，更優選地三分之一或更低，或者五分之一或更低，具體地為50ng/ml或更低，優選地40，30，20，10，5，3，或 lng/ml或更低。當不添加血清時，優選地只包含GM-CSF和SCF作為細胞因子。根據本發明的方法，DC可以從⑶34+細胞擴增例如IO2倍，優選地0. 5 X IO3倍，更優選地1 X IO3倍，甚至更優選地0. 5 X IO4倍，再更優選地1 X IO4倍，再更優選地0. 5 X IO5 倍，甚至再更優選地ι χ IO5倍，進一步再更優選地0. 5 X IO6倍或更多。例如，通過1周培養，細胞可以以5倍，優選地6、7、8、9、10、11、12、或13倍或者更多的比率增加。擴增的細胞含有高純度的DC(iDCs)。擴增細胞中⑶Ilc-陽性細胞的百分比(⑶Ilc+在總細胞中的比值)是例如30 %或更高，優選地40 %或更高，更優選地50 %或更高，60 %或更高，70 %或更高，75%或更高，80%或更高，或者85%或更高。而且，通過用LPS、Poly (I :C)、仙臺病毒、 0K432等處理iDC可以獲得成熟的DC。通過本發明方法獲得的具有高IL-12生產能力的樹突細胞可以用作DC疫苗，其可用於感染、癌症和其它可望從免疫誘導獲得有益效果的感興趣疾病的免疫治療。例如，在腫瘤免疫療法中，通過將樹突細胞與腫瘤細胞裂解物混合、用肽衝激、將腫瘤抗原基因引入到樹突細胞內等方法，可以使樹突細胞呈遞腫瘤抗原。所得到的樹突細胞可以在針對腫瘤的 DC療法中使用。例如，與腫瘤裂解物和肽衝激相比，將腫瘤抗原引入樹突細胞內的方法可以預期延長腫瘤抗原在體內呈遞的持續時間，並且還具有不受HLA限制的優勢(在肽的情況下使用來自抗原的特定肽；然而，由於需要HLA結合，當HLA類型改變時，抗原中使用的肽區域也要改變)。例如，通過在GM-CSF和SCF存在下培養前體細胞並進一步再GM-CSF和IL_4存在下培養細胞來使通過本發明方法擴增的DC前體細胞分化成DC，然後通過在0K432、RNA病毒等存在下培養來活化DC。培養時間可以適當地進行調節，例如2-7天。例如，當於用於免疫刺激(例如腫瘤免疫)時，RNA病毒例如負鏈RNA病毒可用於基因轉移，並且RNA病毒感染自身可以誘導樹突細胞的活化。因此有可能省略引入後通過細胞因子處理等活化的步驟，這預期有助於保持細胞活力、降低成本，並進一步減少用於離體操作所需的時間。通過使用用RNA病毒載體引入了基因的樹突細胞，能夠在短期內高效而容易地離體誘導活化的T細胞，特別是T細胞轉移療法必需的腫瘤特異性細胞毒T細胞等(W0 2005/042737 ；WO 2006/001122)。DC能夠與藥學可接受的載體一起適當地配製成組合物。載體的實例包括能夠用於懸浮活細胞的期望溶液，例如生理鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBQ、培養液和血清。組合物可以包括要呈遞到樹突細胞上的抗原肽。而且，當DC被用作疫苗時，可以向疫苗組合物添加免疫刺激物，例如細胞因子、霍亂毒素、和沙門氏菌毒素，以增加免疫原性。而且，疫苗可以和佐劑組合，例如明礬、弗氏不完全佐劑、MF59(油乳劑)、MTP-PE(分枝桿菌細胞壁來源的胞壁醯三肽)，和QS-21 (來自皂皮樹Quilaja saponaria)。可以通過將DC與細胞裂解物抗原混合、通過肽衝激、或通過將編碼抗原基因載體引入到DC中，來在DC上呈遞抗原。抗原包括與感染性微生物、病毒、寄生蟲、病原體、癌症等相關的期望抗原。這些可以是結構或非結構蛋白。這些抗原(或其經過加工的肽)與樹突細胞表面上的MHC分子結合，並被呈遞在細胞表面上，誘發免疫應答。當用作疫苗時，抗原可以被應用於例如腫瘤、感染性疾病、和其它一般性疾病。為了治療感染性疾病，可以對例如感染性微生物的抗原蛋白的表位進行分析，然後將其表達或通過樹突細胞呈遞。病原體來源的抗原包括例如如下A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、 δ型肝炎病毒、乳頭瘤病毒抗原、單純皰疹病毒(HSV)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、EB 病毒、巨細胞病毒(CMV)、HIV、瘧疾等的蛋白質，或其部分肽(G.L. Mandell et al. (Ed.) Hinman et al. , Principles and Practice of Infectious Diseases,3rd Ed., Churchill Livingstone Inc. , NY, pp. 2320-2333) 呈遞這些抗原的 DC 可以預防性或治療性用於感染性疾病。具體地可以列舉流感的流感高毒力病毒株H5W的包膜、日本腦炎的日本腦炎病毒的包膜蛋白(Vaccine, vol. 17，No. 15-16，1869-1882 (1999))、AIDS 的 HIV 和 SIV gag 蛋白(J. Immunology(2000)vol. 164,4968-4978)、HIV 包膜蛋白、Nef 蛋白、和其它病毒蛋白。此外，可以列舉，例如，霍亂的霍亂毒素B亞基(CTB) (Arakawa T, et al. , Nature Biotechnology(1998) 16(10) :934-8, Arakawa Τ, et al., Nature Biotechnology(1998) 16(3) :292-7)；狂犬病的狂犬病病毒糖蛋白(Lodmell DL et al.， 1998，Nature Medicine 4(8) :949-52)；和子宮頸癌的人6型乳頭瘤病毒的衣殼蛋白Ll。 而且。有可能使用日本腦炎的JE-E抗原蛋白(日本專利申請特開昭64-74982(未經審查公開的日本專利申請)，特開平1力邪498)，人單純皰疹病毒gD2蛋白(特開平5-25四65)， C型肝炎病毒來源的多肽(特開平5-192160)，偽狂犬病毒來源的多肽(特表平7-502173) 等。例如，可以對來自被這些病原微生物感染的患者的細胞進行分析，以鑑定被呈遞在抗原呈遞細胞(APC)上的抗原肽供使用。還優選地適當地選擇HLA類型，鑑定與期望HLA類型相應的表位以便使用。為了特異促進針對腫瘤的免疫應答，在樹突細胞上呈遞一種或多種腫瘤抗原。腫瘤相關抗原可以通過例如製備粗腫瘤細胞提取物或者通過部分純化抗原而獲得((Cohen et al. , Cancer Res. 54 :1055(1994) ；Cohen et al. , Eur. J. Immunol. 24 :315(1994) ；Itoh et al.，J. Immunol. 153 :1202(1994))。所獲得的腫瘤抗原可以被進一步純化，或者可以被合成或作為重組肽表達。
當將純化的樹突細胞(暴露於)或用抗原衝激並使其攝取抗原時，抗原被DC加工並呈遞在細胞表面(Germain, R.N.，Cell 76 :287(1994))。有多種已知的方法用於用抗原衝激樹突細胞，並且本領域的技術人員可以根據待呈遞的抗原常規地選擇合適的方法。本發明提供了包括通過本發明方法產生並呈遞抗原的DC的組合物，及其在免疫治療中的用途。為了刺激免疫應答，本發明的組合物可以通過注射、連續輸注、從植入體持續釋放或其它合適的技術施用。典型地，包括樹突細胞的組合物與生理可接受的載體、賦形劑或稀釋劑一起施用。在所用劑量或濃度下對接受施用的個體不顯示任何顯著毒性的載體均可用作載體，並且包括例如生理鹽水。腫瘤抗原可以是腫瘤細胞特異性抗原(即存在於腫瘤細胞內但不存在於非腫瘤細胞內)或者在腫瘤細胞內的表達水平高於相同類型抗原在非腫瘤細胞內的表達水平的抗原。通過施用樹突細胞對免疫系統進行刺激。當CTL作為主要效應物時，可以使用期望的細胞內或細胞外腫瘤抗原。當通過使用樹突細胞活化CD4T細胞，繼而通過B細胞活化刺激抗體產生，使抗體作為效應物進行反應時，優選地使用被呈遞在細胞表面上的抗原。例如，可以使用細胞表面受體或細胞粘附蛋白作為抗原。腫瘤抗原包括例如誘發卵巢癌等的 Muc-I或Muc-I樣粘蛋白串聯重複肽(美國專利No. 5，744，144)；導致子宮頸癌的人乳頭瘤病毒的E6和E7蛋白；黑色素瘤抗原MART-I，MAGE-I, -2，-3，gplOO，和酪氨酸酶；前列腺癌抗原 PSA ；以及 CEA (Kim, C. et al.，Cancer Immunol. Immunother. 47(1998)90-96)和 Her2neu(HER2p63-71，p780_788 ；Eur. J. Immunol. 2000 ；30 :3338-3346)。根據本發明製備的樹突細胞可用於有效的對癌症和感染性疾病的免疫治療。由引入了腫瘤抗原基因或感染性疾病相關抗原的樹突細胞或用這些樹突細胞刺激的T細胞導致的免疫致敏是在患者體內誘發抗腫瘤或抗感染性疾病免疫的有效方法。本發明還涉及通過本發明方法獲得的樹突細胞在誘導免疫應答中的用途。具體地，本發明涉及通過本發明方法獲得的樹突細胞在免疫治療中的用途，特別地，例如在腫瘤或感染性疾病的治療中的用途。而且，本發明涉及通過本發明方法獲得的樹突細胞在產生免疫激活劑中的用途。具體地，本發明涉及通過本發明方法獲得的樹突細胞在產生免疫治療劑特別是例如抗腫瘤劑 (腫瘤生長抑制劑)或感染性疾病的治療劑中的用途。細胞還可以應用於一般性疾病。為了治療糖尿病，例如，胰島素片段的肽可以在I 型糖尿病患者或其動物模型中用作表位(Coon, B. et al.，J. Clin. Invest.，1999，104(2) 189-94)。DC組合物可以進一步包括可溶的細胞因子受體、細胞因子、或其它免疫調節分子 (Schrader，J. W. Mol. Immunol. 28 :295(1991))。這些細胞因子可以製備成與DC組合物分離的組合物，並且可以和DC同時、分別或順次施用。此外，通過在樹突細胞中表達細胞因子，細胞刺激免疫系統，從而提高針對癌症或感染性微生物的免疫應答。因此，引入了編碼細胞因子的基因的樹突細胞也可用於治療癌症和其它預期細胞因子治療有效的疾病。引入了攜帶編碼免疫刺激性細胞因子的載體的樹突細胞可用作有效的免疫誘導劑。例如，免疫刺激性細胞因子包括白介素(例如IL-Ici， IL-I β，IL-2, IL-3, IL-4，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12，IL-15，IL-18，IL-19， IL-20，IL-21，IL-23，和 IL-27)，幹擾素(例如 IFN-α，IFN-^jP IFN-Y)，腫瘤壞死因子(TNF)，轉化生長因子(TGF)-i3，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，GM-CSF，含有IL-3和GM-CSF的融合蛋白，胰島素樣生長因子(IGF)-I，IGF-2， Flt-3配體，Fas配體，c-kit配體，⑶40配體(⑶40L)，和其它免疫調節蛋白(例如趨化因子和共刺激分子)。這些可以單獨或者組合使用。這些細胞因子的胺基酸序列是本領域技術人員眾所周知的。可以參考對於 IL-4,例如 Arai et al. (1989)，J. Immunol. 142 (1) 274-282 ；對於 IL-6，例如 Yasukawa et al. (1987)，EMBO J.，6 (10) :2939-2945 ；對於 IL-12，例如 Wolf et al. (1991)， J. Immunol. 146(9) :3074-3081 ；對於 IFN-α，例如 Gren et al. (1984) J. Interferon Res.4(4) :609-617,禾口 Weismann et al. (1982)Princess Takamatsu Symp. 12 1—22 ；對於 TNF，例如 Pennica et al. (1984)Nature 312 :724-729 ；對於 G-CSF，例如 Hirano et al. (1986)Nature 324 :73-76 ；和對於 GM-CSF，例如 Cantrell et al. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82 (18) :6250_62M。更具體地，編碼GM-CSF的核酸序列包括含有登錄號 NM_000758第84-461位序列的序列(相應於NP_000749第18-144位的胺基酸序列)。編碼 IL-4的核酸序列包括含有登錄號NM_000589第443-8 位序列的序列(相應於NP_000580 第25-153位的胺基酸序列)。可以設計出包含編碼這些細胞因子的天然基因、或者由於遺傳密碼子的簡併性而仍然編碼功能細胞因子的突變體基因的載體，並引入樹突細胞內。而且，基因可以被修飾表達被修飾形式的細胞因子。例如，具有前體和成熟形式兩種形式的細胞因子(例如通過剪切其信號肽或通過限制性蛋白水解產生活性片段的細胞因子)，可以被遺傳修飾從而表達其前體或成熟形式。也可以使用其它的修飾形式(例如細胞因子的活性片段與異源序列(例如異源信號肽)的融合蛋白)。樹突細胞可用於體內刺激患者自身的T細胞，也可以用於體外刺激T細胞。可以通過離體免疫治療來刺激患者的免疫系統，其中向患者施用被致敏的T細胞。例如，可以使 T細胞與呈遞抗原的成熟樹突細胞接觸而製備用樹突細胞刺激的T細胞。被樹突細胞呈遞的抗原可以是從載體表達的蛋白質(或其加工產物)，或者可以通過外源衝激進入樹突細胞。被激活的τ細胞誘導CTL。本發明還涉及用通過本發明方法產生的樹突細胞刺激免疫系統的方法。例如，對於患有感染、癌症等的患者，可以刺激其免疫系統來進行治療。這些方法包括施用樹突細胞或T細胞的步驟。具體地，該方法包括向患者施用治療有效量的根據本發明產生的DC或用 DC刺激的T細胞的步驟。通過用期望的抗原肽衝激樹突細胞從而使它們呈遞該抗原，可以誘導針對期望抗原的免疫。當T細胞與樹突細胞在體外接觸時，優選地從患者收集T細胞， 並進行離體施用。包括DC或T細胞的組合物向受試者施用的劑量取決於疾病、患者體重、年齡、性別、症狀、施用目的、施用組合物的形式、施用方法等而變化；然而，劑量可以由本領域的技術人員適當地加以確定。施用的途徑可以適當地選擇；例如，優選地施用到受影響的部位。 一般地，組合物可以通過肌肉內、腹膜內、皮下或靜脈內注射進行輸注，或者通過直接輸注進入淋巴結。優選地，組合物通過皮下或腹膜內注射，或者直接輸注進入淋巴結施用給患者。患者可以被施用的量通常為IO5-IO9個樹突細胞，優選地IO6-IO8個細胞，更優選地大約IO7個細胞。施用的次數可以是一次，或者可以是在臨床可接受的副作用的範圍內施用多次。施用的對象沒有特定限制，包括例如鳥類和哺乳動物(人和非人哺乳動物)，包括雞、 鵪鶉、小鼠、大鼠、狗、豬、貓、牛、兔、綿羊、山羊、猴和人，以及其它脊椎動物。
樹突細胞可以用作抗腫瘤劑。例如，通過向腫瘤部位內部施用呈遞腫瘤抗原的樹突細胞可以抑制腫瘤生長。腫瘤部位是指腫瘤及其周圍區域(例如距離腫瘤5mm的區域內，優選地，距離腫瘤3mm的區域內)。通過在將樹突細胞施用到腫瘤內之前使腫瘤抗原與樹突細胞接觸可以獲得更強的效果。腫瘤抗原與樹突細胞的接觸可以通過使用如下的方法進行其中將腫瘤細胞裂解物與樹突細胞混合的方法，其中用腫瘤抗原肽衝激樹突細胞的方法，或者其中將腫瘤抗原肽基因引入到樹突細胞內並使樹突細胞表達該抗原肽的方法。當施用用樹突細胞激活的T細胞時，例如，可以施用T細胞的劑量為，大約IO5-IO9 個細胞、優選地IO6-IO9個細胞、更優選地IO8-IO9個細胞每Im2體表面積，靜脈內注射(見 Ridell et al.、1992，Science 257:238-241)。注射可以以期望的間隔重複(例如每月)。 在施用後，如果需要，可以監視接受者在T細胞注射期間和之後的任何副作用。在這種情況下，優選地，T細胞從與樹突細胞所來源的患者相同的患者獲得。或者，T細胞可以從患者獲得，而用於刺激T細胞的樹突細胞可以來自HLA相容的健康供體。相反，樹突細胞可以從患者獲得，而T細胞可以來自HLA相容的健康供體。作為根據本發明產生的疫苗的活性成分，含有樹突細胞的細胞作為治療疫苗被接種於人體。因此，可以使生長能力發生缺陷而增加安全性。例如，已知臍帶血來源的單核細胞的生長能力在誘導分化後被極度降低。然而，為了將細胞作為更安全的細胞疫苗使用，可以通過加熱、輻射、絲裂黴素C(MMC)處理等消除其生長能力，而不會損失疫苗功能。例如， 當使用X-射線輻射時，X-射線輻射的總輻射劑量可以是1000-3300Rad。對於絲裂黴素C處理，向樹突細胞添加的絲裂黴素C的濃度可以是25-50 μ g/ml，並在37°C溫育30-60分鐘。 當用加熱處理細胞時，例如，細胞可以被50°C -65°C熱處理20分鐘。
實施例下面，通過參考實施例對本發明進行具體地描述；然而，不應解釋本發明僅限於此。這裡引用的所有公開均被合併作為本說明書的一部分。下面，在實施例和這些實施例所涉及的附圖中描述的特定施用組具有如下的組成。GMSCF 施用組補充 10 % FBS 的 IMDM，其含有重組人 GM-CSF (10ng/ml) (Peprotech)和重組人幹細胞因子(SCF) (5ng/ml) (Peprotech)0. IGMSCF 施用組補充 10 % FBS 的 IMDM，其含有重組人 GM-CSF (100ng/ml) (Peprotech)和重組人幹細胞因子(SCF) (50ng/ml) (Peprotech)0. OIGMSCF 施用組補充 10 % FBS 的 IMDM，其含有重組人 GM-CSF (lng/ml) (Peprotech)和重組人幹細胞因子(SCF) (0. 5ng/ml) (Peprotech)GMIL-4 施用組補充 10 % FBS 的 IMDM,其含有重組人 GM-CSF (100ng/ml) (Peprotech)禾口重組人 IL-4 (50ng/ml) (ffako, Japan)IL-3 施用組IMDM 補充 10% FBS 的 IMDM，其含有 IL-3 (10ng/ml) (R&D Systems Inc.)IL-3SCF 施用組補充 10 % FBS 的 IMDM，其含有 IL-3 (10ng/ml) (R&DSystems Inc.)和重組人 SCF(50ng/ml) (Peprotech)TPOSCF施用組補充 10% FBS 的 IMDM，其含有重組人 TPO(50ng/ml) (ffako, Japan)和重組人 SCF(50ng/ml) (Peprotech)FS施用組補充10 % FBS的IMDM，其含有重組人Flt3_L (100ng/ml) (Richter-HELM BioLogics GmbH & Co. KG)和重組人 SCF (50ng/ml) (Peprotech)FST6 施用組補充 10 % FBS 的 IMDM，其含有重組人 Flt3_L (100ng/ml) (Richter-HELM BioLogics GmbH & Co. KG)，重組人 SCF(50ng/ml) (Peprotech)，重組人 TP0(50ng/ml) (ffako, Japan)，和重組人 IL-6Q5ng/ml)SCF 施用組補充 10% FBS 的 IMDM，其含有重組人 SCF(50ng/ml) (Peprotech)下面，在實施例相關附圖中描述的(l)iDC處理和(2)0K432處理是指如下的處理(1) iDC處理在如下培養基中溫育2天補充10% FBS 的 IMDM(2)0K432處理在如下培養基中溫育2天補充10% FBS 的 IMDM，並含有 0Κ432 (0. 5KE/ml) (Chugai Pharmaceutical Co.； Japan Standard Commodity Classification No. 874299)除非另外指明，否則細胞在37°C和5% CO2下培養，並且所用培養基為補充10% FBS 的 IMDM。實施例1 用特定細胞因子從人來源的樹突細胞前體細胞製備樹突細胞通過在含有特定細胞因子的培養基中培養35天，擴增並分化人臍帶血來源的 CD34+細胞(購自 Lonza)。圖1的結果顯示，通過如下方法，即在GMSCF施用組培養人臍帶血來源的⑶34+細胞預定的時間，隨後在GMIL-4施用組中培養(圖1表示為「GMSCF- > GMIL-4」)，可以獲得大量的細胞。細胞形態學觀察顯示，這些細胞在0K432處理(其是一種樹突細胞活化處理) 後，具有樹突(圖幻。通過上述方法製備的大群細胞被預期是樹突細胞。如圖1所示，當與在GMSCF施用組培養條件下培養特定時期，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養的培養方法比較時，如下的方法可以產生大量的細胞，雖然其中一些方法產生的細胞數目少於其它方法在IL-3SCF施用組培養條件下培養特定時期，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養的方法；在TPOSCF施用組培養條件下培養特定時期，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養的方法；在FS施用組培養條件下培養特定時期，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養的方法；和在FST6施用組培養條件下培養特定時期，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養(圖1 ；表示為「SCFIL-3- > GMIL-4」，"TP0/SCF- > GMIL-4」，"Flt3-L/SCF- > GMIL-4",和"FST6- > GMIL-4")。還進行了圖1中沒有顯示的另一個實驗，其中將上述人臍帶血細胞來源的⑶34+ 細胞在SCF施用組培養條件下培養。在開始培養後第一周內觀察細胞擴增(開始培養的細胞計數為1. OX IO5 (個細胞)，1周後為大約2. 25 X IO5 (個細胞)。然而，在第一周後，由於沒有細胞擴增，細胞計數降低。實施例2 用特定細胞因子製備的樹突細胞中IL-12的產生水平的確定對於用特定細胞因子從人臍帶血細胞來源的⑶34+細胞，評估其產生IL-12的能力。在本實驗中使用Beckton Dickinson公司(BD)的人炎症試劑盒(目錄號N0. 551811) (圖 3)。
0K432刺激增加了全部施用組中IL-12的生產能力。然而，圖3㈧和⑶所示的結果證明，圖3中(3)-(7)的樣品與其它樣品(除圖3中的對照樣品⑶之外)相比，具有更強的IL-12生產能力。實施例3 用特定細胞因子從人外周血CD14+前體(單核細胞)製備樹突細胞人外周血CD14+前體細胞(單核細胞)通過在含有特定細胞因子的培養基中培養 28天進行擴增和分化。圖6所示的結果提示，使用含有GM-CSF和SCF的培養的方法與使用含有GM-CSF 和IL-4的培養基的傳統方法相比，更適合從單核細胞製備大量樹突細胞。工業應用性本發明使得大量生產樹突細胞成為可能。可以使所產生的DC呈遞癌抗原以用作抗腫瘤DC疫苗。通過使用本發明的方法，有可能高效地產生大量DC，即使當從患者獲得的 DC前體細胞的數目較少時也是如此。通過這些生產方法獲得的DC具有強抗腫瘤效果，因此可以用作DC疫苗，可用於癌症、感染等的免疫治療。本發明預期大大有助於針對癌症的免疫療法。本發明並不僅限於上述實施例所述的方法。本發明還包括各種修改的實施方案， 它們能夠由本領域技術人員容易地想到，而不背離附加權利要求中提供的描述。上述實施例具體地描述了用於製備大量具有IL-12生產能力的樹突細胞的方法實例，其是基於「在GMSCF施用組培養條件下培養⑶34+細胞4周，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養1周」。但是，例如，下面描述的備選方法也是可能的。這是由於如下的事實。備選方法是指這樣的方法，其中「CD34+細胞在特定培養基中培養預定時期，隨後在GMIL-4施用組培養條件下培養1周」。這裡，「特定培養基」是指「含有lng/ml或更高濃度GM-CSF和0. 5ng/m或更高濃度SCF的培養基」。「如下的事實」是指，即使將GM-CSF(lOOng/ml)和SCF(50ng/ml)的濃度降低到 1/10 (10ng/ml GM-CSF和5ng/ml SCF)，仍能夠保持高增殖，儘管細胞計數略有減少，而且， 即使 GM-CSF (100ng/ml)和 SCF (50ng/ml)的濃度降低到 1/100 (lng/ml GM-CSF 和 0. 5ng/ml SCF)，也能夠實現DC擴增(圖4)。圖5顯示了培養35天的⑶Ilc陽性細胞的百分比。還有一個事實，即所有施用組均產生了高百分比的CDllc陽性細胞(圖5)。
權利要求
1.一種用於產生樹突細胞的方法，其包括如下步驟(1)在下述的存在下培養樹突細胞前體細胞(a)從(i)-(v)中選出的任意一項(i)粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)， (ii)白介素 3(IL-3)，(iii)血小板生成素(TPO)，(iv)Flt-3 配體(Flt_3L)，和(v)Flt_3L、 TPO 和 IL-6 ；及(b)幹細胞因子(SCF)；和(2)在GM-CSF和IL-4的存在下培養在步驟(1)中培養的細胞。
2.權利要求1的用於產生樹突細胞的方法，其包括如下步驟(1)在GM-CSF和SCF的存在下培養；和(2)在GM-CSF和IL-4的存在下培養在步驟(1)中培養的細胞。
3.權利要求1的用於產生樹突細胞的方法，其包括如下步驟(1)在IL-3和SCF的存在下培養樹突細胞前體細胞；和(2)在GM-CSF和IL-4的存在下培養在步驟(1)中培養的細胞。
4.權利要求1的用於產生樹突細胞的方法，其包括如下步驟(1)在TPO和SCF的存在下培養樹突細胞前體細胞；和(2)在GM-CSF和IL-4的存在下培養在步驟(1)中培養的細胞。
5.權利要求1的用於產生樹突細胞的方法，其包括如下步驟(1)在Flt-3L和SCF的存在下培養樹突細胞前體細胞；和(2)在GM-CSF和IL-4的存在下培養在步驟(1)中培養的細胞。
6.權利要求1的用於產生樹突細胞的方法，其包括如下步驟(1)在Flt-3L、TPO、IL-6和SCF的存在下培養樹突細胞前體細胞；和(2)在GM-CSF和IL-4的存在下培養在步驟(1)中培養的細胞。
7.權利要求1-6中任一項的方法，其中該樹突細胞前體細胞是人類來源的細胞。
8.權利要求7的方法，其中該人類來源的細胞是臍帶血來源的CD34+細胞。
全文摘要
公開了用於產生樹突細胞(DC)的方法，其包括在多種細胞因子的存在下培養DC前體細胞。還提供用該方法產生的樹突細胞。進一步公開了所述DC的用途。發現通過在多種細胞因子的存在下培養DC祖細胞，隨後在GM-CSF和IL-4的存在下培養所得的培養產物大約1周，可以獲得具有高IL-12生產能力的樹突細胞。從少數DC前體細胞產生大量具有高IL-12生產能力的DC成為可能。因此，利用DC的抗腫瘤免疫治療、感染性疾病治療等所施用的DC數目能夠容易地增加，並且可以預期提高DC疫苗的效果。
文檔編號A61K39/00GK102307989SQ20098015429
公開日2012年1月4日 申請日期2009年11月13日 優先權日2008年11月14日
發明者上田泰次, 原田結, 米滿吉和 申請人:上田泰次, 生物載體株式會社