用於遞送白介素-1受體拮抗劑的方法和組合物的製作方法

2023-08-08 14:11:41

專利名稱：用於遞送白介素-1受體拮抗劑的方法和組合物的製作方法
用於遞送白介素-1受體拮抗劑的方法和組合物引言本發明技術涉及包含白介素-1受體拮抗劑的組合物，以及產生、分離和施用此類組合物的方法。白介素-1 (IL-1)包括能夠刺激淋巴細胞和巨噬細胞、活化吞噬細胞、增加前列腺素產生、促使骨關節退化、增強骨髓細胞增殖並參與許多慢性炎性病症的細胞因子家族。IL-1能夠由巨噬細胞、單核細胞和樹突細胞產生，並可作為針對感染的炎性應答的一部分。IL-1的作用模式可由白介素-1受體拮抗劑蛋白(IL-1ra ;也稱為「IRAP」)介導。IL-1ra與IL-1結合細胞表面上的相同受體，由此阻止IL-1向該細胞發送信號。如ArendWPjMalyak M,Guthridge CJ,Gabay C(1998)" Interleukin-1receptor antagonist:rolein biology " Annu.Rev.1mmunol.16:27-55中所述，IL-1ra由白細胞包括單核細胞、巨嗤細胞、嗜中性粒細胞、多形核細胞(PMN)和其他細胞分泌，並可調節多種IL-1相關的免疫和炎性應答。IL-1ra的產生是受幾種物質包括粘附的免疫球蛋白G(IgG)、其他細胞因子以及細胞或病毒組分刺激。IL-1ra在關節炎、結腸炎和肉芽腫性肺病中是一種重要的天然抗炎蛋白。IL-1ra可以用於治療類風溼性關節炎(IL-1在其中起關鍵作用的一種自身免疫病)，減少與該疾病相關 的炎症和軟骨降解。例如，Kineret (阿那白滯素)是IL-1ra的非糖基化重組形式(Amgen Manufacturing,Ltd.,Thousand Oaks,California)。2003 年 7 月29日授權的Sommer等人的美國專利號6，599，873、1991年12月24日授權的Hannum等人的美國專利號5，075，222以及2005年9月8日公布的Mellis等人的美國專利申請公布號2005/0197293中描述了多種重組白介素-1抑制劑和治療方法。此外，2003年9月23日授權的Reincke等人的美國專利號6，623，472、2004年3月30日授權的Reincke等人的美國專利號6，713，246以及2004年7月6日授權的Reincke等人的美國專利號6，759，188中描述了從體液產生IL-1ra的方法，包括使用自體液體。使用IL-1ra的組合物和方法為本領域所熟知。例如，如2000年8月I日授權的Collins等人的美國專利號6，096, 728中所述，IL-1ra已作為與透明質酸的組合物的一部分遞送。不過，許多此類方法和組合物帶有有關IL-1ra的穩定性和半衰期以及所提供IL-1ra的數量和速率的問題。因此，遞送IL-1ra的改進的組合物和方法是期望的，會有助於治療由白介素-1受體介導的症狀和病理，包括炎症的管理。概述本發明技術提供關於白介素-1受體拮抗劑，產生白介素-1受體拮抗劑，和向患者施用白介素-1受體拮抗劑以治療由白介素-1受體介導的病症、諸如炎症的組合物、設備和方法。用於產生白介素-1受體拮抗劑的方法包括將包含白細胞的液體與固態提取材料接觸。該液體可以是全血、骨髓穿刺液(bone marrow aspirate)、脂肪組織、其級分(例如，富含血小板的血漿)、和其混合物。固態提取材料可包括諸如玻璃、礦物、聚合物、金屬或多糖的材料，其中這些材料可以以珠、纖維、粉末、和/或多孔材料的形式。接觸可包括將液體與固態提取材料培養從約30秒至約24小時的時間段。然後可從固態提取材料分離溶液，其中溶液中白介素-1受體拮抗劑的濃度大於接觸步驟之前液體中白介素-1受體拮抗劑的濃度。用於產生白介素-1受體拮抗劑的方法還包括將包含白細胞的液體與固態提取材料接觸，和對所述液體進行電磁場處理。然後從固態提取材料分離包含白介素-1受體拮抗劑的溶液。與固態提取材料接觸和對所述液體進行電磁場處理的組合可比單獨施加任一步驟導致白細胞產生更多的白介素-1受體拮抗劑或更快地產生白介素-1受體拮抗劑。例如，組合效應可在數分鐘至多達約I小時中，產生與當包含白細胞的液體與固態提取材料接觸達24小時而不經受電磁場時產生的大約相等量的白介素-1受體拮抗劑。可使用脈衝電磁場或電容耦合電磁場。溶液中所得的白介素-1受體拮抗劑濃度大於接觸之前液體中白介素-1受體拮抗劑的濃度。提供了製備包含白細胞的液體的多種方式。一些方法包括離心組織諸如血液，以相對於全血增加白細胞和血小板的濃度。此類方法包括以下那些方法，其中將所述組織上樣到試管中，所述試管包括在所述試管中布置的浮標，其中所述浮標具有的密度使得所述浮標可被操作以在所述試管中的所述組織被離心後到達平衡位置，所述位置在白細胞級分與第二級分之間，所述白細胞級分具有大於所述第二級分中白細胞濃度的白細胞濃度。其他方法包括混合包含白細胞的組織或組織級分和與可被操作以結合單核白細胞的抗體偶合的磁珠。然後收集被所述抗體結合的單核白細胞，用作所述包含濃縮的白細胞的液體。其他方法包括將包含白細胞的組織或組織級分通過尺寸排阻濾器。本發明方法的結果提供白介素-1受體拮抗劑的組合物和溶液。白介素-1受體拮抗劑的溶液可包含白介素-1受體拮抗劑(例如，至少約30，000pg/mL)、可溶性腫瘤壞死因子受體、活的白細胞、和/或生長因子。例如，溶液中血漿蛋白的總濃度可以是至少約80mg/mL。提供了治療人類或動物受治療者的炎症的方法，包括向炎症部位施用白介素-1受體拮抗劑的溶液，其中所述溶液是使用本發明方法製備的。例如，治療方法可用於人類或動物受治療者的炎症、諸如與在人工關節植入物部位的磨屑相關的骨質溶解，或其中所述炎症與骨關節炎相關。


圖1為根據本發明技術的一個實施方案產生富含IL-1ra的溶液的一種方法的圖解說明。圖2為根據本發明技術的一個實施方案產生富含IL-1ra的溶液的另一種方法的圖解說明。圖3為根據本發明技術的一個實施方`案產生富含IL-1ra的溶液的另一種方法的圖解說明。圖4為根據本發明技術的一個實施方案用於分離包含白細胞的液體的代表性裝置的部分橫斷面剖視圖。圖5A和5B為根據本發明技術的一個實施方案用於將一定體積的白細胞與聚丙烯醯胺珠培養的代表性裝置的橫斷面剖視圖。
圖6為根據本發明技術的一個實施方案產生富含IL-1ra的溶液的另一種方法的圖解說明。圖7為根據本發明技術的一個實施方案產生富含IL-1ra的溶液的另一種方法的圖解說明。圖8為根據本發明技術的一個實施方案產生富含IL-1ra的溶液的另一種方法的圖解說明。圖9A和9B分別為可用在本發明技術的方法中的血液組分分離裝置的等距視圖(isometric view)和部分橫斷面剖視圖。圖10為根據本發明技術的一個實施方案施用IL-1ra的方法的圖解說明。圖11為根據本發明技術的一個實施方案用於施用IL-1ra的代表性裝置的部分橫斷面剖視圖。應當注意的是，本文所列附圖旨在舉例說明本發明技術中材料、裝置和方法的一般特徵，其目的是為了描述一些實施方案。這些附圖可以未必準確反映任何給定實施方案的特徵，並且不一定旨在完全限定或限制本發明技術範圍內的具體實施方案。詳述

以下描述技術的性質僅為對一個或多個發明的主題、生產和使用進行示例，並非旨在限制本申請中或可要求本申請優先權的其他申請或其授權專利中要求保護的任何具體發明的範圍、應用或用途。意為幫助理解本發明技術的對術語和短語的非限制性的討論在本詳述的結尾提供。本發明技術涉及產生、使用和包括白介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)的組合物、設備和方法。參考圖1，以圖解方式顯示了用於產生富含白介素-1受體拮抗劑的溶液的方法100。將包含白細胞的液體體積110與固態提取材料120接觸，如在130所示。電磁場用於刺激細胞，如在140所示。接觸130和刺激140產生富含IL-1ra的溶液，如在150所示。然而，在一些實施方案中，包含白細胞的液體不被電磁場刺激或不經受電磁場；即，省略了步驟140。當包含白細胞的液體不經受電磁場時，步驟130直接進行到步驟150，如箭頭160所示。在150的富含IL-1ra的溶液可用於治療炎症。富含IL-1ra是指該溶液比相等體積的全血包含更大量的IL-lra。將包含白細胞的液體110與固態提取材料120接觸140連同電磁場刺激140比單獨進行接觸130或刺激140可更快地產生IL-1ra和/或可產生更大量的IL_lra。例如，將包含白細胞的液體暴露於電磁場可加速白細胞與固態提取材料接觸後蛋白產生的速率。在一些情形中，本發明方法可在小於I小時內提供富含IL-1ra的溶液，而產生IL-1ra的其他方法可花費從約4至約24小時來產生相等的量。再次參考圖1，包括步驟130和140的方法比繞開步驟140的如箭頭160所示的方法可以更快的速率產生IL-1ra和/或可產生更多 IL-1ra0因此，本發明方法可提供比其他方法更快和/或更大量的IL-1ra產生。例如，本發明技術可比2003年9月23日授權的Reincke等的美國專利號6，623，472 ；2004年3月30日授權的Reinecke等的美國專利號6，713，246 ;和2004年7月6日授權的Reinecke等的美國專利號6，759，188中所述的方法；和Higgins等的美國專利申請公布號2010/0055087,Higgins等的美國專利申請公布號2009/0220482和Higgins等的PCT申請公布號W0/2009/108890中所述的方法更快和/或更大量地產生IL_lra。不限於本發明技術的機制、效用或功能，固態提取材料表現為由白細胞產生IL-1ra的激活物。類似地，與僅與固態提取材料接觸的白細胞相比，白細胞的電磁刺激表現為增加IL-1ra產生的速率和/或產生的IL-1ra的量。以這種方式，本發明方法的接觸和刺激表現為以協同方式起作用來產生富含IL-1ra的溶液。如圖1的步驟130所示，包含白細胞的液體110與固態提取材料120接觸。包含白細胞的液體110可以是全血、骨髓穿刺液、脂肪組織、其級分、和其混合物。例如，富含血小板的血漿是可包括白細胞的全血級分。骨髓穿刺液還包括濃縮的骨髓穿刺液，可通過從骨髓穿刺液去除液體來製備。包含白細胞的液體還可包括包含濃縮的白細胞的液體，其是指具有大於全血中白細胞濃度的白細胞濃度的液體。濃縮的白細胞可通過混合包含白細胞的組織或組織級分和與可被操作以結合單核白細胞的抗體偶合的固態支撐物諸如磁珠來製備。例如，包含白細胞的組織或組織級分可以是全血、骨髓穿刺液、脂肪組織、其級分、和其混合物。然後收集被抗體結合的單核白細胞(例如，用磁體保留)，而除去和/或洗去帶有未結合的細胞或其他組織成分的液體。結合的或保留的白細胞提供濃縮的白細胞。實例包括可與固態支撐物諸如磁珠偶合的抗體，其中該抗體與支撐物直接偶合或經由一種或多種分子諸如二抗或其他親和性配偶來偶合。在一些實施方案中，選擇性結合白細胞的特異性結合元件(例如，抗體)用於通過磁力捕獲從樣品收集白細胞。優選地，特異性結合元件用於為了直接捕獲而包被磁珠，或以生物素化形式使用為了由鏈黴素包被的磁珠間接捕獲白細胞。選擇性結合白細胞的特異性結合元件可以是結合白細胞但不明顯結合其他細胞諸如紅細胞的抗體。實例包括針對⑶3、⑶I lb、⑶14、⑶17、⑶31、⑶45、⑶50、⑶53、⑶63、⑶69、⑶81、⑶84、⑶102或⑶166的抗體。可使用本領域已知的方法試驗抗體結合白細胞的能力。例如，抗體可與固態支撐物諸如珠、膜或柱基質(column matrix)結合,在包含白細胞的液體與抗體培養後，可從固態支撐物洗滌和除去未結合的組分。濃縮的白細胞還可通過將包含白細胞的組織或組織級分通過尺寸排阻濾器來製備。濾器可具有保留白細胞並允許組織或組織級分的液體和比白細胞小的組分通過的孔徑。可選地，濾器可具有允許通過白細胞並保留組織或組織級分的比白細胞大的組分的孔徑。經由過濾濃縮白細胞的此類濾器和裝置的實例包括本領域已知的多種白細胞減少或耗竭濾器。實例包括來自 Pall Life Sciences (Ann Arbor,MI)的LeukoGuard 和Leukotrap 濾器，並包括2003年11月11日授權的Sheikh-Ali等的美國專利號6，645，388和1999年4月20日授權的Kraus等的美國專利號5，895，575中描述的那些，其通過引用併入本文。固態提取材料120可包括提供接觸細胞的特定表面積的多種材料。固態提取材料可包括連續材料，或可以是不連續的，並包括多個離散顆粒。例如，固態提取材料可以以多個珠、纖維、粉末、多孔材料、或包括包含細胞的液體的容器表面的形式。固態提取材料可包括具有多種橫截面形狀諸如球形、卵形或多邊形 、及其他的幾何形式。固態提取材料還可包括與海綿相似的連續的多孔網，或可包括多個單獨的多孔顆粒。固態提取材料還可因為多孔而提供與非多孔材料相比較大的表面積。在一些實施方案中，固態提取材料包括具有大的長寬比的顆粒，例如，其中顆粒是針狀形狀。固態提取材料還可形成為長纖維，並可以是、或採取類似玻璃棉的形式。在一些情形中，固態提取材料可包括容器的容納包含白細胞的液體的內壁。例如，固態提取材料可包括注射器的包括包含白細胞的液體的內腔。其他容器包括管、諸如離心管、或本文別處描述的血液分級裝置或濃縮器組件。當固態提取材料是連續材料、諸如多孔海綿樣材料時，固態提取材料可以以在固態提取材料的孔或空隙內足以吸收或包括基本上白細胞的全部液體體積的量使用。當固態提取材料是不連續材料、諸如多個顆粒時，固態提取材料可與包含細胞液體的組合來形成漿狀組合物。漿的稠度可變化，從具有高的固體比例的糊狀、到具有低的固體比例的易流動漿。固態提取材料可提供用於接觸細胞的大的表面積。然而，在一些情形中，固態提取材料可被進一步處理以增加其表面積，例如，通過物理或化學蝕刻或腐蝕固態提取材料的表面。關於化學蝕刻，取決於材料的性質，可使用腐蝕劑來改變固態提取材料的表面。改變的表面可通過採用鹼或酸來產生，例如鉻磺酸、尤其是強度約20%至約80%、優選地約50%鉻磺酸。固態提取材料可與腐蝕劑一起培養約5min至約30min，以化學蝕刻表面並增加表面積。然後可洗滌固態提取材料來去除腐蝕劑。例如，固態提取材料可包括容器的用於容納包含白細胞的液體的內壁，其中該內壁被蝕刻以隨後增加接觸液體的表面積。多種聚合物、金屬、陶瓷和玻璃可用作固態提取材料。這些包括，例如，玻璃的連續固態提取材料或多個玻璃顆粒、玻璃棉、金屬諸如鈦的連續固態提取材料、多個金屬珠、金屬粉末、和其組合。金屬的連續固態提取材料可包括由多孔金屬或具有開放的孔眼結構的金屬合金形成的塊或其他三 維形狀。固態提取材料可包括多種尺寸的多種珠或顆粒，包括基本上球形的珠。珠包括聚苯乙烯珠、聚丙烯醯胺珠、玻璃珠、金屬(例如，鈦)珠、或任何其他適合的珠。珠可以是適合所用的容器和包含白細胞的液體的量的任何尺寸。在一些情形中，珠尺寸可以從直徑約0.001毫米至約3毫米變化。當珠尺寸足夠小時，珠可以外觀上更像粉末。與固態提取材料的表面接觸可以活化細胞，而且在一些情形中，固態提取材料可幫助所得的富含IL-1ra的溶液的分離和濃縮。例如，在多孔固態提取材料的情形中，包含細胞的液體的一部分可進入孔並保留在其中。液體中的細胞可接觸這一額外的表面積。在一些實施方案中，孔對於細胞過小而不能進入，但一部分液體可進入孔。液體可通過例如離心從固態提取材料和孔去除。在一些實施方案中，固態提取材料可包括吸溼材料諸如乾燥聚丙烯醯胺珠，其吸收一部分液體，從而濃縮未被吸收進入吸溼材料的物質。適合的固態提取材料的多種實例包括玻璃、礦物、聚合物、金屬和多糖。礦物包括剛玉和石英。聚合物包括聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和聚丙烯醯胺。金屬包括鈦。多糖包括葡聚糖和瓊脂糖。固態提取材料的滅菌可使用本領域已知的技術進行，以阻止包含白細胞的液體的汙染。例如，取決於固態提取材料的具體組成，可使用加熱和壓力滅菌方法、諸如高壓滅菌法。當固態提取材料可被高壓滅菌法不利地影響時，可使用替代方法、諸如化學滅菌或輻射。在一些實施方案中，在接觸期間攪動包含白細胞的液體和固態提取材料以更充分地混合這些組分。攪動可通過倒轉、搖動、搖擺、攪拌或渦流液體和固態提取材料來實現。攪動可增加液體中的細胞與固態提取材料的接觸。攪動可進行一次、重複多次、周期地重複，或可以是連續的。當用電磁場刺激液體時，還可攪動包含細胞的液體和固態提取材料。包含白細胞的液體可用電磁場刺激，如圖1中的140所示。應注意的是，在一些實施方案中，對包含細胞的液體的刺激可在將液體與固態提取材料接觸之前進行。即，開始本發明方法的接觸和刺激步驟的順序可以顛倒。然而，接觸步驟的至少一部分與刺激步驟的至少一部分在時間上重疊是優選的，使得包含細胞的液體同時地接觸固態提取材料和被電磁場刺激。用電磁場刺激包含白細胞的液體可包括多種形式的電磁刺激，諸如脈衝電磁場或電容稱合電磁場。在一些實施方案中，使用與刺激線圈稱合的電源(power source)刺激液體。流經線圈的電流產生脈衝磁場，其在液體中引起脈衝電場。當液體被容納在容器諸如試管或注射器中時，線圈可部分地圍繞液體。線圈可整合於容納包含白細胞的液體的容器，或可以是可拆卸的。例如，塑料管可形成為帶有整體式線圈，或線圈可暫時地耦合於容器或放在容器中；例如，可構造試管使得線圈能夠扣在容器上。電源可以如所需地耦合於線圈以進行刺激步驟。用電磁場刺激液體還可包括跨液體放置至少兩個電極。然後可向電極施加電能以電容耦合電極並在其間產生電磁場。因此電磁場能夠穿過液體，從而增加IL-1ra產生的速率和/或量。在其他實施方案中，電極可用於產生直流電，或一個或多個線圈可用於產生脈衝電磁場。刺激期間電磁場的強度可以是至少每釐米約0.5微伏，無論由直流電、電容耦合電流或脈衝電磁場產生。在直流電電極的情形，電流的振幅可以是從約I至約200微安，在一些實施方案中，振幅可以是從約20至約100微安。在又進一步的實施方案中，電流可以是約20、約60或約100微安。然而應理解的是，電流的振幅可以是其他適合的量級。刺激步驟期間施加的電磁場可以是恆定的或隨時間變化。例如，可使用跨液體放置的電極施加正弦時變電磁場。此類正弦`時變電磁場可具有為從約I伏至約10伏的跨電極的峰值電壓，在一些實施方案中，峰值電壓可以是約5伏。產生的相應電場可具有從每釐米約0.1毫伏(mV/cm)至約100mV/cm的振幅,在一些實施方案中可以是約20mV/cm。正弦時變電場可具有從約1，OOOHz至約200，OOOHz的頻率，在一些實施方案中頻率可以是約60，OOOHz。施加於液體的電磁場也可以是脈衝電磁場。脈衝電磁場可使用外部線圈和脈衝發生器來引起。在這方面，脈衝電磁場可具有從每脈衝約10微秒至每脈衝約2000微秒的脈衝持續時間。在一個實施方案中，脈衝持續時間可以是約225微秒。脈衝可包括電磁脈衝串(burst)，其中脈衝串可包括從I個脈衝至約200個脈衝。可選地，電磁場可具有包括從約10個脈衝至約30個脈衝的脈衝串。在這方面,在一個實施方案中，每個脈衝串可包括約20個脈衝。脈衝電磁中施加脈衝串的頻率可變化。在這方面，在一些實施方案中，脈衝串可以從約IHz至約IOOHz的頻率重複，在其他實施方案中可以約IOHz至約20Hz的頻率重複。此夕卜，脈衝串可以約1.5Hz、約15Hz或約76Hz的頻率重複。脈衝串可具有從約10微秒至高達約40，000微秒的持續時間。在這方面，脈衝串可具有約4.5毫秒的持續時間。用於產生電容耦合電磁場的適合裝置包括SpinalPak 脊柱刺激器(EBI，L.P.，Parsippany, New Jersey)或DC刺激裝置諸如SpF XL IIb脊柱融合刺激器(EBI, L.P.，Parsippany, New Jersey)。脈衝電磁場可使用多種已知的方法和設備產生，諸如使用單個線圈或一對赫姆霍茲線圈。例如，適合的設備包括EBI Bone Healing System Model2001 (EBI,L.P.,Parsippany,New Jersey)和 BTBS 刺激線圈。對於直流電，電場可使用用於產生直流電電場的任何已知裝置、諸如例如，Osteogen 可植入骨生長刺激器(EBI，L.P., Parsippany, New Jersey)來產生。可使用用於產生電磁場的其他適合裝置。關於液體與固態提取材料的接觸，包含白細胞的液體的電磁刺激可如所需地繼續和/或重複。然而應理解的是，可選地或另外地，用電磁場刺激液體的步驟包括環境條件帶來的電場或電磁場(諸如偶然暴露於收音機、電話、桌上型電腦或類似裝置產生的電磁場)。在一些實施方案中，如圖1所示的接觸步驟130和刺激步驟140 二者在小於約I小時中進行。接觸和刺激步驟還可在從約20°C至約37°C範圍內的溫度進行。在一個優選的實施方案中，在接觸和刺激步驟期間將包含白細胞的液體的溫度保持在約37°C。接觸和刺激步驟之一或二者通過在活體外(ex vivo)進行。在一些實施方案中，如圖1所示，從接觸步驟130和刺激步驟140產生的富含IL-1ra的溶液150，被從固態提取材料分離。從固態提取材料分離可以多種方式進行。例如，富含IL-1ra的溶液可 通過以下從固態提取材料取出:使用注射器、過濾富含IL-1ra的溶液，離心富含IL-1ra的溶液和固態提取材料，或使用本領域已知的適於從固態提取材料分離液體的方法。可組合多種分離技術；例如，當用注射器取出富含IL-1ra的溶液時，多孔固態提取材料中包含的剩餘溶液可經受離心，形成沉澱的任何溶液也可用注射器取出。在一些實施方案中，例如當固態提取材料是彈性和海綿樣時，可使用壓力從固態提取材料取出富含IL-1ra的溶液，或可使用真空抽出。在一些實施方案中，在其中產生富含IL-1ra的溶液的容器可被構造以幫助從固態提取材料分離溶液。例如，容器可在一側、在底部、或在容器帽或蓋上包括濾器、網篩或玻璃粉(glass frit)。然後可離心容器，其中液體穿過濾器、網篩或玻璃粉，而且固態提取材料和其他材料諸如細胞被保留。在一些情形中，僅保留固態提取材料，而且基本上所有其他材料穿過濾器、網篩或玻璃粉。以這種方式，可離心富含白介素-1受體拮抗劑的溶液並收集例如到新的容器中。當容器的表面形成固態提取材料時，分離包括從容器取出液體。現在參考圖2，顯示了用於產生富含IL-1ra的溶液的另一種方法200。在步驟210從患者諸如人類受治療者取血。如以下進一步討論的，這一血液可在步驟230直接使用，或可在步驟220被處理以產生血液級分。血液或血液級分提供包含白細胞的液體。本文使用的富含血小板的血漿(PRP)理解為包括白細胞，可在本發明方法和系統中用作包含白細胞的液體。例如，如步驟220所示，可離心血液以分離包含白細胞和血小板的PRP。在一些實施方案中，包含白細胞的液體包括全血沉澱後形成的血沉棕黃層。可用於在步驟220分離富含血小板的血漿的裝置的一個實例如圖4所示。就這一點而言，裝置400包括裝有血液後置於離心機中的容器405,如管。容器405包括具有隔離器410和浮標415的浮標系統(buoy system)。浮標415具有選定的密度,其調整成以在離心後達到選定的平衡位置；該位置位於更大密度的血液級分和更小密度的血液級分之間。離心過程中，浮標415通過沉降至兩個級分之間的位置而在容器405中將血液分離成至少兩個級分，級分之間基本不會混雜。就這一點而言，隔離器410和浮標415限定了包括富含血小板的血漿420的層，而更小密度的缺少血小板的血漿425通常分級在隔離器410上方，更大密度的紅細胞430通常分級在浮標415下面。離心裝置400後，注射器或離心管可與浮標系統的一部分互相連接以抽取富含血小板的血漿。不同的實施方案中，此類裝置可用於產生包括血小板濃度約為全血中8倍且白細胞濃度約為5倍的富含血小板的血漿。該富含血小板的血漿可包括約80%至約90%的存在於全血中的白細胞。此類裝置的市售實施方案包括來自BiometBiologies,LLC(Warsaw, Indiana,USA)的GPS II 血小板濃縮系統(GPS 工工 PlateletConcentrate System)和來自 Biomet Biologies,LLC(Warsaw, Indiana,USA)的GPS'!.工工工血小板分離系統(G1)S III Platelet Separation System)。可用於在圖2中的步驟220中分離富含血小板的血漿的裝置包括以下描述的那些，例如，2002年6月4日授權的Blasetti等的美國專利號6，398，972，2003年11月18日授權的Brandt等的美國專利號6，649，072，2004年9月14日授權的Dolocek的美國專利號6，790，371，2006 年 3 月 14 日授權的 Sukavaneshvar 等的美國專利號 7，011，852，2004 年 12月16日公布的Leach等的美國專利申請公布號2004/0251217(通過引用併入本文)，2005年5月26日公布的Leach等的美國專利申請公布號2005/0109716 (通過引用併入本文)，2005年9月8日公布的Dorian等的美國專利申請公布號2005/0196874 (通過引用併入本文)，以及2006年8月10日公布的Dorian等的美國專利申請公布號2006/0175242 (通過引用併入本文)。在步驟220中也可使用其他方法分離富含血小板的血漿。例如，可對全血進行離心而不使用浮標系統，可對全血進行多階段離心，可以使用連續流離心，還可以過濾。此外，包括富含血小板的血漿和白細胞在內的血液組分可以通過將紅細胞與血漿分離而產生，其中使用低速離心步驟以防止血小板沉澱。在其他實施方案中，可將從離心血液中形成的血沉棕黃層級分與餘下的血漿分離，並重懸形成包括白細胞的富含血小板的血漿。

除了 GPSu.血小板濃縮系統及分離系統之外，許多其他的市售裝置也可用於步驟220分離富含血小板的血眾,包括Medtronic, Inc.(Minneapolis, Minnesota, USA)出售的Magellan 自體血小板分離器系統(Magellan Autologous Platelet Separator System)、Harvest Technologies Corporation (Plymouth, Massachusetts, USA)出售的 SmartPReP 、DePuy (Warsaw, Indiana, USA)、Cytomedix, Inc.(Rockville, Maryland, USA)出售的AutoloGel Process、EmCyte Corporation (Fort Myers, Florida, USA)出售的 GenesisCS系統以及 Biomet3i, Inc.(Palm Beach Gardens, Florida, USA)出售的 PCCS 系統。再次參考圖2，在隨後用於步驟220或230之前，在步驟210從受治療者抽取的血液可以與抗凝血劑混合。適用的抗凝血劑包括本領域已知的那些，諸如肝素、檸檬酸磷酸葡萄糖(CPD)、乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸葡萄糖溶液(AOT)及其混合物。抗凝血劑可以置於用於從受試者抽取血液的注射器內，或者可在血液抽出後與其混合。可選地或此外，可在步驟230中將來自步驟210、未經受步驟220中離心的血液與包括聚丙烯醯胺珠的固態提取材料混合併培養。這一選項在圖2中由直接從步驟210導向步驟230的箭頭示出。在這種情形，聚丙烯醯胺珠活化血液中IL-1ra的產生,但IL-1ra的濃度可以低於使用包含白細胞或血小板的富含血小板的血漿或其中細胞已經相對於全血濃縮的另一種白細胞液體體積。
包含白細胞的液體還可使用本領域熟知的方法製備。例如，白細胞可通過溶解紅細胞而從全血中製備，或通過使用密度梯度離心全血，其中白細胞沉降物位於離心管底部。密度離心法的一個實例包括採用Ficoll-Paque Plus產品(GE HealthcareBio-Sciences, Piscataway, New Jersey, USA)的方法。一些情況下中，密度梯度可以用於進一步分離單核細胞和多形核細胞。白細胞還可用過濾法從全血中製備；一個實例包括Ace I ere MNC Harvest System (Pall Life Sciences, Ann Arbor, Michigan, USA)。白細胞還可從骨髓中獲取。如圖2的步驟230所示，將來自步驟220的富含血小板的血漿與包括聚丙烯醯胺珠的固態提取材料接觸。在一些實施方案中，將富含血小板的血漿與乾燥聚丙烯醯胺珠培養足以去除富含血小板的血漿中一部分液體的時間。培養可以進行約30秒至約72小時的時間段，並且可以在約20°C至約41°C溫度下進行。例如，培養可以從約I分鐘至48小時，從約5分鐘至約12小時，或從約10分鐘至約6小時。在一些實施方案中，培養在約37°C下進行。在一些實施方案中，富含血小板的血漿不進行培養，而是與聚丙烯醯胺珠僅接觸至進行後續處理所必需的時間。接觸可發生在環境條件下，例如約20-25°C的溫度下。步驟230中用作固態提取材料的聚丙烯醯胺珠可使用本領域已知的可控的標準操作流程由丙烯醯胺單體聚合形成，以產生由聚丙烯醯胺凝膠形成的相對均一的珠。通常，聚丙烯醯胺由丙烯醯胺與適當的雙官能團交聯劑聚合形成，最常用的為N，N』 -亞甲基雙丙烯醯胺(雙丙烯醯胺)。凝膠聚合通常用過硫酸銨來起始，並通過加入催化劑例如N，N, N』，N』-四甲基乙二胺(TEMED)加快反應速度。在多個實施方案中，聚丙烯醯胺珠包括每毫升珠0.5微摩爾的羧基，賦予輕微的陰離子特徵(負電荷)。珠通常也耐受pH值的變化，並在許多水溶液和有機溶液中穩定。通過調整總丙烯醯胺濃度，可以形成多種孔徑範圍的聚丙烯醯胺凝膠。此外，可形成許多種尺寸的聚丙烯醯胺珠，並具有相對均一的大小分布。珠大小可從直徑幾微米至直徑幾毫米。例如，多種類型的Bio-GelTMP聚丙烯醯胺凝膠珠(Bio-RadLaboratories, Hercules, California, USA)具有的粒徑從小於約 45 μ m 到多至約 180 μ m。聚丙烯酸胺珠還可購於 SNF Floerger (Riceboro, Georgia, USA)、Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford, Illinois, USA)和 Polymers, Inc.(Fayetteville, Arkansas, USA)。聚合後，聚丙烯醯胺珠可以乾燥並以粉末樣形式貯存。乾燥的珠不溶於水，但經再水化後可顯著膨脹。再水化還原了聚丙烯醯胺珠的凝膠稠度，可變成乾燥狀態的約2倍至約3倍大小。因此，乾燥的聚丙烯醯胺珠(即，乾燥聚丙烯醯胺珠)可用於吸收一部分液體體積，包括小於珠孔徑大小的溶質，並可用於濃縮由白細胞產生的IL-lra。例如，步驟230中乾燥聚丙烯醯胺珠與血液和/或富含血小板的血漿的結合激活了白細胞對IL-1ra的產生，也因為乾燥珠的再水化和膨脹而減少了總液體體積。不作為對本發明技術的機制、效用或功能的限制，聚丙烯醯胺珠可作為白細胞產生IL-1ra的活化劑。因此，就乾燥聚丙烯醯胺珠而言，不僅液體被從白細胞的體積中吸收，從而濃縮了所形成的IL-lra，而且珠還作為刺激白細胞產生IL-1ra的表面。例如，利用使用按照圖4的裝置諸如GPSu II系統獲得的富含血小板的血漿收集的IL-lra，可導致IL-1ra濃度相對於全血的約5倍增加。如以下進一步描述的，使用按照圖5A和5B的裝置諸如 PlasmaxTM 裝置(Biomet Biol ogies, LLC, Warsaw, Indiana, USA)培養和分離富含IL-1ra的溶液後，隨後IL-1ra的濃度可增加約40倍或更多，至終濃度增加約200倍。因此，IL-1ra量的增加並非簡單地由於通過減少樣品體積來增加濃度引起的，而是表現為部分地由於白細胞和來自血小板的其他生長因子被聚丙烯醯胺珠活化而增加了 IL-1ra的產生和/或釋放。參考圖2，用電磁場刺激富含血小板的血漿，如240所示。使用靠近富含血小板的血漿放置的線圈施加脈衝電磁場(PEMF)。例如，可將一個或多個線圈放置在容納富含血小板的血漿和聚丙烯醯胺珠的容器諸如PlasmaxTM裝置中或一部分附近。在一些情形中，使用兩個線圈，其中將包括富含血小板的血漿的容器排列在線圈之間。PEMF可使用Simon的美國專利號7,744,869(2010年6月29日授權)、7，520，849 (2009年4月21日授權)和6，955，642 (2005年10月18日授權)中描述的參數來施加，其通過引用併入本文。在將富含血小板的血漿與聚丙烯醯胺珠接觸和電磁場刺激後，如圖2中步驟250所述，產生富含IL-1ra的溶液並可從珠分離。可以通過抽出液體體積並留下珠來完成富含IL-1ra的溶液的分離。一些情況下，可以在抽出富含IL-1ra的溶液之前通過離心使珠沉澱。還可以通過過濾進行分離，其中聚丙烯醯胺珠被濾器保留，富含IL-1ra的溶液流過濾器，例如利用離心力或利用真空。如果步驟230中與聚丙烯醯胺珠的接觸利用乾燥的聚丙烯醯胺珠，則液體體積可由於珠的再水化膨脹而減少，從而濃縮所得富含IL-1ra的溶液。為保持增加的濃度，步驟250中應十分小心，以避免擠壓珠或從已膨脹珠中抽出液體。例如，高離心力或高真空度可能壓碎珠和/或從珠內部體積中抽出液體。在一些情況下，富含血小板的血漿與聚丙烯醯胺珠的接觸(有關步驟230)、電磁場刺激(有關步驟240)、和所得富含IL-1ra溶液的分離(有關步驟250)可用同一裝置進行。將富含血小板的血漿與聚丙烯醯胺珠一起培養的裝置的一個實例如圖5A和5B所示。就這一點而言，裝置500具有上室505和下室510。上室505具有端壁515，被凝膠珠攪拌器525的攪拌器杆520從中穿 過。裝置500還具有穿過端壁515進入上室505的入口 530。裝置500還包括與血漿濃縮液導管540相通的出口 535。上室505的底面包含濾器545，其上表面支撐乾燥的濃縮聚丙烯醯胺珠550。使用過程中，將含有白細胞的流體555 (如，富含血小板的血漿)通過入口 530注射到上室505中，與聚丙烯醯胺珠550混合。流體555和聚丙烯醯胺珠550可通過旋轉攪拌器杆520和凝膠珠攪拌器525來混合，以幫助混合流體555和珠550。混合的流體555和聚丙烯醯胺珠550隨後在期望的溫度下培養期望的時間。在此期間，用電磁場刺激混合的流體555和聚丙烯醯胺珠550，諸如使用跨上室505的包括混合的流體555和聚丙烯醯胺珠550的部分放置的兩個線圈施加脈衝電磁場。隨後對裝置500進行離心以使液體進入到下室510而聚丙烯醯胺珠550被濾器545保留，從而將聚丙烯醯胺珠550與下室510中收集的所得IL-1ra溶液560分離。溶液560可通過出口 535從裝置中移出。2006年8月10日公布的Dorian等人的美國專利申請公布號2006/0175268和2006年11月2日公布的Swift等人的美國專利申請公布號2006/0243676中公開了圖5的示例性裝置；兩者均通過引用併入本文。此類裝置作為Biomet Biologies,LLC(Warsaw,Indiana, USA)的Plasmax Plus血眾濃縮機以商品銷售。再參考圖2,步驟260中向患者諸如人或動物受治療者施用富含IL-1ra的溶液。接受富含IL-1ra的溶液的患者可以是步驟210中獲得或取得血液的同一患者。這種情況下，該方法提供了 IL-1ra的自體製備。可以使用多種手段給藥，例如通過使用注射器注射富含IL-1ra的溶液、手術施用或在其他外科手術時同時施用。然而，應當理解，步驟260可包括用於植入、注射或以其他方式在部位處或附近施用富含IL-1ra的溶液的任何生物醫藥可接受的方法或程序，以便介導與白介素-1受體刺激例如炎症相關的效應。例如，為治療由關節炎導致的炎症，可通過注射向患者施用富含自體IL-1ra的溶液。注射可在炎症關節的滑液腔處或之內，或在關節處或附近。以與圖2所示的方法類似的方式，脂肪組織可用於提供包含脂肪細胞的液體，以用於圖3中圖解顯示的另一種方法300。在這種情形中，在步驟310從患者獲得脂肪組織，其中脂肪組織被進一步處理320，或直接用作包含脂肪細胞的液體。脂肪組織可與包括聚丙烯醯胺珠的固態提取材料接觸和培養330，用電磁場刺激340，和分離富含IL-1ra的溶液350，並以對圖2中所示的類似步驟描述的方式施用360於患者。然而，獲得脂肪組織310和處理脂肪組織320可進一步包括以下方面。脂肪細胞的液體體積可以是分離的脂肪組織的一部分；例如，其中所述脂肪組織可包括其他細胞類型。脂肪細胞與聚丙烯醯胺珠的接觸330可包括將脂肪細胞的液體體積與聚丙烯醯胺珠培養約30秒至約24小時的時間，優選地小於約I小時，包括電磁場刺激340。除了脂肪細胞的液體體積與聚丙烯醯胺珠的接觸外，接觸330還可包括將含有白細胞的液體體積與聚丙烯醯胺珠接觸。白細胞的液體體積可以是全血、富含血小板的血漿，或者全血和富含血小板的血漿。白細胞還可以從骨髓獲得。脂肪組織指任何脂肪組織，白色或棕色脂肪組織均可，其可來源於皮下、網膜/內臟、乳腺、性腺或其他脂肪組織部位。一些實施方案中，脂肪組織來源於通過抽吸輔助脂肪切除術或抽脂術分離的人皮下脂肪。脂肪細胞和可包括白細胞的其他細胞，可以用任何適宜方法從脂肪組織和/ 或組織部分中分離和/或解聚，包括本領域已知方法，例如機械離心和分解離心。脂肪細胞和其他細胞還可用酶解消化的方法分離。例如，脂肪細胞和其他細胞可以從脂肪抽吸物(Iipoaspirate)中分離，用超聲波和/或酶解消化處理，並通過離心富集。從脂肪組織中分離的脂肪細胞和其他細胞可進行一次或多次清洗和沉澱。分離脂肪組織和脂肪細胞的方法可以包括如下方面。可通過抽吸輔助的腫脹抽脂術(tumescent liposuction)將約50cc的脂肪組織收集在與抽吸膠管和抽脂套管相連的專門的收集容器中。收集容器可以帶有紗布型格柵濾器，其允許使腫脹液(tumescentfluid)通過並保留固體脂肪組織。收集完脂肪組織後，將收集容器從抽吸裝置中移出，再與離心裝置相連。過濾單元還可包含具有約100微米孔徑的濾器。一旦含有脂肪組織的收集容器與離心裝置相連，即對組織進行超聲處理。超聲完成後，將整個裝置放入離心桶內離心，以約300Xg離心約5分鐘。離心後，將收集容器以及過濾單元分離。含有脂肪細胞和其他細胞的沉澱可重懸於生物相容性溶液中，例如自體血漿、血漿濃縮液和/或富含血小板的血漿。脂肪組織也可用消化酶類和減弱相鄰細胞間連接的螯合劑處理，使其能夠將組織分散成單細胞(包括脂肪細胞)的懸液，而無明顯的細胞破損。解聚後，可從細胞和解聚組織的懸液中分離脂肪細胞和其他細胞。多種用於分離和/或分級分離脂肪組織和脂肪細胞的方法和裝置包括Leach等在美國專利號7，374，678(2008年5月20日授權)和7，179，391 (2007年2月20日授權)中以及Leach等在美國專利申請公布號2009/0014391(2009年I月15日公布)、2008/0283474(2008年11月20日公布)和2007/0208321(2007年9月6日公布)中描述的那些。諸如GPS 血小板濃縮系統(Biomet，WarSaw，IN)的裝置可用於分離脂肪細胞。這些方法可包括如下獲得脂肪細胞和其他細胞:通過對患者實施抽脂術獲得脂肪組織，對脂肪組織進行酶促消化，並用這些裝置分離和/或清洗脂肪細胞。在一些實施方案中，脂肪組織的分離可通過以下進行:由標準脂肪抽吸提取組織，從切除的脂肪組織分離，或通過使用VASER 超聲破裂儀連同可從Sound SurgicalTechnologies, LLC, Louisville, Colorado 獲得的 VENTX 插管。脂肪細胞和包括白細胞的其他細胞與固態提取材料(例如，聚丙烯醯胺珠)的表面的接觸表現為刺激IL-1ra的產生和分泌。產生IL-1ra的量與白細胞濃度之間也表現為存在相關性，其中脂肪組織可包括白細胞。因此，本發明方法可使用脂肪組織和解聚的脂肪組織來獲得脂肪細胞，其中白細胞可存在於脂肪組織和從脂肪組織獲得的脂肪細胞二者中。參考圖6，顯示了用於產生富含IL-1ra的溶液的另一種方法600。在這一情形中，首先在步驟610中從患者取血。進行到步驟620，離心血液以分離富含血小板的血漿。如同圖2的方法，可用多種裝置、諸如圖4所示的裝置分離富含血小板的血漿。例如，包括雙重浮標機構的裝置可在浮標415與分離器410之間包括聚丙烯醯胺珠。聚丙烯醯胺珠可以是乾燥或水合的，如參考圖2步驟230所述的。在步驟620的離心期間，在浮標415與分離器410之間收集富含血小板的血漿並接觸聚丙烯醯胺珠。較不稠的貧血小板血漿組分在富含血小板的血漿之上形成，較稠的紅細胞組分在之下形成。離心完成後，可在期望溫度培養包含分離的血液組分的試管期望的時間，如步驟630所示，其中富含血小板的血漿被電磁場進一步刺激。以這種方式，由位於浮標與分離器之間的富含血小板的血漿和聚丙烯醯胺珠的混合物中的白細胞產生IL-lra。在使用乾燥聚丙烯醯胺珠的情形中，在步驟620中的離心完成後，在培養前可從試管去除上方的貧血小板血漿組分和下方的紅`細胞組分，留下兩個浮標部分之間的富含血小板的血漿和聚丙烯醯胺珠的混合物。可選地，可從試管取出富含血小板的血漿和聚丙烯醯胺珠的混合物。在任一種情形中，從接觸貧血小板血漿和紅細胞組分的流體分離富含血小板的血漿和聚丙烯醯胺珠的混合物，允許乾燥聚丙烯醯胺珠的隨後膨脹和再水合，以有效減少富含血小板的血漿的液體體積，進一步濃縮所得的IL-1ra溶液。如步驟640所示，在步驟630中接觸和刺激後從聚丙烯醯胺珠分離富含IL-1ra的溶液。從珠分離富含IL-1ra的溶液可使用多種手段實現，諸如參考圖2步驟250所述的那些。如步驟650所示，然後將富含IL-1ra的溶液施用於患者。施用可使用多種手段進行，諸如參考圖2步驟260所述的那些。現在參考圖7，顯示了用於產生富含IL-1ra的溶液的另一種方法700。在步驟710中從患者取血。使用大體積濃縮裝置來過濾血液和有效地去除一些血液組分，如步驟720所示，以產生包含白細胞和血小板的富含血小板的血漿。步驟720中使用的適合裝置包括分離器組件和濃縮器組件。分離器組件在濾器諸如氈濾器中捕獲紅細胞。濾器具有尺寸定製為在離心期間接收和捕獲紅細胞的孔和通道。該裝置通過在與濾器成行的平衡柱狀分離室中以一定速度旋轉血液來捕獲紅細胞，其中分離室和濾器由徑向伸入分離區的板來分段。分離室的轉速允許在分離區中分離包括白細胞的富含血小板的血漿。濃縮器組件可使用乾燥聚丙烯醯胺珠吸收富含血小板的血漿中的液體來濃縮富含血小板的血漿，如參考圖2步驟230所述的。當珠被攪拌時，富含血小板的血漿在旋轉濃縮室中與聚丙烯醯胺珠接觸來產生富含血小板的血漿濃縮物。然後可用電磁場刺激濃縮器組件中的富含血小板的血漿和聚丙烯醯胺珠的混合物以允許產生IL-lra，包括由於珠的膨脹和對液體的吸收而對溶液的任何另外的濃縮。通過以從珠分離富含血小板的血漿濃縮物的速度旋轉濃縮室來 收集所得的富含IL-1ra的溶液。此類裝置的實例包括Vortech 濃縮系統(Biomet Biologies, LLC, Warsaw,Indiana, USA),並包括在2006年8月10日公布的Dorian等的美國專利申請公布號2006/0175244、2006年8月10日公布的Dorian等的美國專利申請公布號2006/0175242中公開的那些，其通過引用特此併入。代替具有參考圖2步驟220所述的浮標的試管或除了其以外使用這些裝置，以製備包括白細胞和血小板的富含血小板的血漿。如步驟730所示，然後將富含IL-1ra的溶液施用於患者。施用可使用多種手段進行，諸如參考圖2步驟260所述的那些。參考圖8，顯示了用於產生富含IL-1ra的溶液的另一種方法800。從患者取血，如步驟810所示，並與聚丙烯醯胺珠混合，如步驟820所示。聚丙烯醯胺珠可以是乾燥或水合的，如參考圖2步驟230所述的。然後在步驟830中使用過濾來從紅細胞分離一定體積的白細胞和聚丙烯醯胺珠。過濾可使用單個濾器或一系列尺寸排阻濾器來完成，以捕獲白細胞和珠，而其他血液組分諸如紅細胞與一種或多種濾液一起通過。過濾完成後，培養白細胞和聚丙烯醯胺珠的體積，如步驟840所示，以活化IL-1ra的產生並且如果使用的是乾燥的聚丙烯醯胺珠，以進一步減少液體體積。此時，當液體處於與聚丙烯醯胺珠接觸時，白細胞的液體體積還經受電磁場以產生IL-lra，如步驟850所示。在步驟840和850的培養期間還可向液體加入血小板。在步驟860中從聚丙烯醯胺珠分離富含IL-1ra的溶液。可使用分離的多種手段，諸如通過脫去液體體積並留下珠。在一些情形中，在脫去富含IL-1ra的溶液之前通過離心沉澱珠。分離還可通過過濾進行，其中例如使用離心機產生的力或通過使用真空，聚丙烯醯胺珠被濾器保留，富含IL-1ra的溶液穿過濾器。在一些情形中，富含IL-1ra的溶液經由步驟830中使用的相同濾器或系列濾器取出溶液來從聚丙烯醯胺珠分離。可將富含IL-1ra的溶液取至新的收集室，或取至此前使用的濾液收集室，其中一種或多種此前的濾液已被去除。然後向患者施用富含IL-1ra的溶液，如步驟870所示。可以通過包括無菌濾器來處理最終分離的IL-1ra產物而對通過本發明方法和系統產生的富含IL-1ra的溶液的多種製備物進行滅菌。同樣地，抗生素可以在培養過程中包含在聚丙烯醯胺中，或在本文所述方法的各種步驟的一步或多步中加入。本發明技術提供了製備富含IL-1ra的溶液、包括富含自體IL-1ra的溶液的改進的方法，其減少和/或基本上消除了使用非自體材料或重組材料時可能出現的免疫學問題。此外，由於IL-1ra由患者的細胞產生，因此天然的翻譯後修飾如糖基化已經存在。大部分重組蛋白不是這樣，因為它們是在原核宿主中產生的。以本發明方法和系統產生的富含IL-1ra的溶液可如下表徵:包含活的全血細胞，具有相對於全血增加濃度的IL-lra、可溶性腫瘤壞死因子受體包括sTNF_rI和sTNFr_I1、血漿蛋白和生長因子。然而，應該理解，在任何給定溶液中存在的濃度可因本發明方法中所用全血或血漿中存在的組分的起始水平而變化，並且濃度的增加是與那些材料的起始水平相比較而言的。通常，IL-1ra在富含IL-1ra的溶液中可以以至少約10，000pg/mL、至少約25，000pg/mL或至少約30，000pg/mL的濃度存在。血眾蛋白水平通常以至少約50mg/mL、至少約80mg/mL、至少約100mg/mL、至少約200mg/mL或至少約250mg/mL的濃度存在。具體地，白蛋白以約40mg/mL或至少約100mg/mL的濃度存在；纖維蛋白原以至少約2mg/mL或至少約4mg/mL的濃度存在。sTNF_rl通常以大於全血的濃度存在，諸如至少約1500pg/mL。增加濃度的生長因子包括:血小板衍生生長因子P⑶F-AB，以大於50，000pg/mL或大於70，000pg/mL的濃度；轉化生長因子TGF-β 1，以大於150，000pg/mL或大於190，000pg/mL的濃度；胰島素樣生長因子IGF-1,以大於約140，000pg/mL或大於160，000pg/mL的濃度；鹼性成纖維細胞生長因子bFGF，以大於150，000pg/mL或大於170，000pg/mL的濃度；和血管內皮生長因子VEGF，以大於1，200pg/mL或大於1，400pg/mL的濃度。炎性細胞因子(例如，白介素Ia、白介素I β、腫瘤壞死因子-α和白介素10)的濃度通常不顯著大於全血，並可以更低。組分的具體水平的實例列在以下表I。表1.組合物組分的實例
權利要求
1.一種組合物，包含: 白介素-1受體拮抗劑；和 可溶性腫瘤壞死因子受體； 其中所述白介素-1受體拮抗劑和所述可溶性腫瘤壞死因子受體來源於同一受治療者，且所述白介素-1受體拮抗劑和所述可溶性腫瘤壞死因子受體的濃度各自大於全血或血漿中存在的濃度。
2.如權利要求1所述的組合物，其中所述白介素-1受體拮抗劑的濃度是所述可溶性腫瘤壞死因子受體的濃度的至少約5，OOO倍。
3.如權利要求1所述的組合物，其中所述白介素-1受體拮抗劑的濃度是全血中存在的濃度的至少約10，000倍。
4.如權利要求1所述的組合物，其中所述溶液中所述白介素-1受體拮抗劑的濃度是約30,000pg/mL 至約 110，000pg/mL。
5.如權利要求1所述的組合物，其中所述可溶性腫瘤壞死因子受體包括可溶性腫瘤壞死因子受體1、可溶性腫瘤壞死因子受體I1、或二者。
6.如權利要求1所述的組合物，還包含白介素-1a，其中所述溶液中所述白介素-1受體拮抗劑的濃度是所述白介素-1 a的濃度的至少約10，000倍。
7.如權利要求1所述的組合物，還包含活的白細胞、溶解的白細胞、或二者。
8.如權利要求1所述的組合物,還包含血小板。
9.如權利要求1所述的組合物，其中總的蛋白濃度比全血的總的蛋白濃度大。
10.一種治療受治療者的炎症的方法，包括向炎症部位施用權利要求1的組合物。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述炎症與骨質溶解相關。
12.如權利要求10所述的方法，其中所述炎症與骨關節炎相關。
13.如權利要求10所述的方法，還包括向所述炎症部位施用纖維蛋白原、凝血酶、鈣、或其組合。
14.一種產生富含白介素-1受體拮抗劑的溶液的方法，包括: 將包含白細胞的液體與固態提取材料接觸；和 從所述固態提取材料分離包含白介素-1受體拮抗劑的溶液，其中所述溶液中白介素-1受體拮抗劑的濃度大於將所述液體與所述固態提取材料接觸之前所述液體中白介素-1受體拮抗劑的濃度。
15.如權利要求14所述的 方法，其中將包含白細胞的液體與固態提取材料接觸包括在容器中合併所述包含白細胞的液體和所述固態提取材料。
16.如權利要求14所述的方法，其中所述接觸包括將所述液體與所述固態提取材料培養約30秒至約24小時。
17.如權利要求14所述的方法，其中所述固態提取材料包括選自珠、纖維、粉末、多孔材料、和其組合組成的組的形式。
18.如權利要求14所述的方法，其中所述固態提取材料的表面被蝕刻以增加其表面積。
19.如權利要求14所述的方法，其中所述固態提取材料包括選自礦物、聚合物、金屬、多糖、和其組合組成的組的成員。
20.如權利要求14所述的方法，其中所述固態提取材料包括選自剛玉、石英、鈦、葡聚糖、瓊脂糖、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚丙烯醯胺、和其組合組成的組的成員。
21.如權利要求14所述的方法，其中所述包含白細胞的液體包括全血、骨髓穿刺液、月旨肪組織、其級分、和其混合物。
22.如權利要求14所述的方法，其中所述包含白細胞的液體包括富含血小板的血漿。
23.如權利要求14所述的方法，其中所述包含白細胞的液體包括濃縮的骨髓穿刺液。
24.如權利要求14所述的方法，其中所述包含白細胞的液體包括骨髓穿刺液且所述固態提取材料包括聚丙烯醯胺。
25.如權利要求14所述的方法，其中所述溶液中可溶性腫瘤壞死因子受體的濃度是以大於將所述包含白細胞的液體與所述固態提取材料接觸之前所述液體中存在的所述可溶性腫瘤壞死因子受體的濃度的濃度。
26.如權利要求14所述的方法，其中所述包含白細胞的液體包括來源於選自全血、骨髓穿刺液、或其組合組成的組的組織的白細胞級分。
27.如權利要求26所述的方法，其中所述白細胞級分通過離心所述組織以相對於全血增加白細胞的濃度來製備。
28.如權利要求26所述的方法，其中所述白細胞級分由包括以下的方法製備: 將所述組織上樣到試管中，所述試管包括在所述試管中布置的浮標，其中所述浮標具有的密度使得所述浮標可被操作以在所述試管中的所述組織被離心後到達平衡位置，所述平衡位置在第一級分與包含白細胞的第二級分之間，所述第二級分具有大於所述第一級分中白細胞濃度的白細胞濃度； 離心所述試管，從而所述浮標界定所述第一級分與所述第二級分之間的界面；和 取出所述白細胞級分。
29.如權利要求26所述的方法，其中所述組織包括全血且所述白細胞級分由包括以下的方法製備: 將一定體積的全血上樣到包含兩個浮標的分離器中，所述浮標可被操作以將血液分離為包括包含白細胞的級分的三種或更多種級分； 離心所述分離器以產生所述白細胞級分；和 從所述分離器提取所述白細胞級分。
30.如權利要求26所述的方法，其中所述組織包括骨髓穿刺液，且所述白細胞級分由包括以下的方法製備: 將一定體積的骨髓穿刺液上樣到包含兩個浮標的分離器中，所述浮標可被操作以將所述骨髓穿刺液分離為包括包含白細胞的級分的三種或更多種級分； 離心所述分離器，產生所述白細胞級分；和 從所述分離器提取所述白細胞級分。
31.一種治療受治療者的炎症的方法，包括向炎症部位施用根據權利要求14的方法製造的富含白介素-1受體拮抗劑的溶液。
32.如權利要求31所述的方法，其中所述炎症與骨質溶解相關。
33.如權利要求31所述的方法，其中所述炎症與骨關節炎相關。
34.如權利要求31所述的方法，還包括向所述炎症部位施用纖維蛋白原、凝血酶、鈣、或其組合。
35.如權利要求31所述的方法，其中所述包含白細胞的液體得自或來源於被治療的受治療者。
36.一種產生用於治療受治療者的炎性病症的富含白介素-1受體拮抗劑的溶液的方法，所述方法包括: (1)從所述受治療者獲得包括全血、骨髓穿刺液、或二者的組織； (2)將所述組織和抗凝血劑上樣到試管中，所述試管包括在所述試管中布置的浮標，其中所述浮標具有的密度使得所述浮標在所述試管中的所述組織被離心後到達平衡位置，所述平衡位置在第一級分與包含白細胞的第二級分之間，所述第二級分具有大於所述第一級分中白細胞濃度的白細胞濃度； (3)離心所述試管，從而所述浮標界定所述第一級分與所述第二級分之間的界面；和 (4)收集所述第二級分； (5)將所述第二級分上樣到包含固態提取材料的濃縮器組件，並培養與所述固態提取材料接觸的所述第二級分；和 (6)以離心速度旋轉所述濃縮器組件 以從所述固態提取材料分離具有大於全血的白介素-1受體拮抗劑濃度的白介素-1受體拮抗劑濃度的富含白介素-1受體拮抗劑的溶液。
37.如權利要求36所述的方法，其中所述第一級分包括紅細胞。
38.如權利要求36所述的方法，其中所述第二級分包括包含白細胞的富含血小板的血漿。
39.如權利要求36所述的方法，其中所述固態提取材料包括包含選自剛玉、石英、鈦、葡聚糖、瓊脂糖、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚丙烯醯胺、和其混合物組成的組的材料的珠。
40.一種治療受治療者的炎症的方法，包括向炎症部位施用根據權利要求36的方法製造的富含白介素-1受體拮抗劑的溶液。
41.根據權利要求36的方法製造的富含白介素-1受體拮抗劑的溶液，所述溶液包含: 白介素-1受體拮抗劑和可溶性腫瘤壞死因子受體，其中二者以大於步驟(I)中所述組織中其各自的濃度的濃度存在； 活的白細胞、溶解的白細胞、或二者；和 生長因子。
42.一種產生富含白介素-1受體拮抗劑的溶液的方法，包括: 將包含濃縮的白細胞的液體與固態提取材料接觸；和 從所述固態提取材料分離富含白介素-1受體拮抗劑的溶液，其中所述溶液中白介素-1受體拮抗劑的濃度大於將所述液體與所述固態提取材料接觸之前所述液體中白介素-1受體拮抗劑的濃度； 其中所述包含濃縮的白細胞的液體由包括以下的方法製造: 混合包含白細胞的組織或組織級分和與可被操作以結合單核白細胞的抗體偶合的磁珠；和 收集被所述抗體結合的單核白細胞，用作所述包含濃縮的白細胞的液體。
43.如權利要求42所述的方法，其中所述組織或組織級分選自全血、富含血小板的血漿、骨髓穿刺液、脂肪組織、和其混合物組成的組。
44.如權利要求42所述的方法，其中所述組織或組織級分包括全血。
45.如權利要求42所述的方法，其中所述組織或組織級分還包含抗凝血劑。
46.如權利要求42所述的方法，其中所述抗體是針對CD45的。
47.如權利要求42所述的方法，其中所述固態提取材料包括選自剛玉、石英、鈦、葡聚糖、瓊脂糖、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚丙烯醯胺、和其混合物組成的組的成員。
48.如權利要求42所述的方法，其中所述固態提取材料包括聚丙烯醯胺。
49.一種治療受治療者的炎症的方法，包括向炎症部位施用根據權利要求42的方法製造的富含白介素-1受體拮抗劑的溶液。
50.如權利要求49所述的方法，其中所述炎症與骨質溶解相關。
51.如權利要求49所述的方法，其中所述炎症與骨關節炎相關。
52.如權利要求49所述的方法，還包括向所述炎症部位施用纖維蛋白原、凝血酶、鈣、或其組合。
53.如權利要求49所述的方法，其中所述組織或組織級分得自或來源於被治療的受治療者。
54.如權利要求49所述的·方法，其中所述富含白介素-1受體拮抗劑的溶液還包含以大於所述組織或組織級分中存在的可溶性腫瘤壞死因子受體的濃度的濃度的可溶性腫瘤壞死因子受體。
55.—種產生富含白介素-1受體拮抗劑的溶液的方法，包括: 將包含濃縮的白細胞的液體與固態提取材料接觸；和 從所述固態提取材料分離液體以獲得富含白介素-1受體拮抗劑的溶液，其中所述溶液中白介素-1受體拮抗劑的濃度大於將所述液體與所述固態提取材料接觸之前所述液體中白介素-1受體拮抗劑的濃度； 其中所述包含濃縮的白細胞的液體通過將包含白細胞的組織或組織級分通過尺寸排阻濾器來製備。
56.如權利要求55所述的方法，其中所述組織或組織級分選自全血、富含血小板的血漿、骨髓穿刺液、脂肪組織、和其混合物組成的組。
57.如權利要求55所述的方法，其中所述組織或組織級分包括全血。
58.如權利要求55所述的方法，其中所述組織或組織級分還包含抗凝血劑。
59.如權利要求55所述的方法，其中所述尺寸排阻濾器是白細胞減少或耗竭濾器。
60.如權利要求55所述的方法，其中所述組織或組織級分是全血或包含白細胞的富含血小板的血漿，且所述尺寸排阻濾器可被操作以捕獲紅細胞。
61.如權利要求55所述的方法，其中所述固態提取材料包括選自剛玉、石英、鈦、葡聚糖、瓊脂糖、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚丙烯醯胺、和其混合物組成的組的成員。
62.如權利要求55所述的方法，其中所述固態提取材料包括聚丙烯醯胺。
63.一種治療受治療者的炎症的方法，包括向炎症部位施用根據權利要求55的方法製造的富含白介素-1受體拮抗劑的溶液。
64.如權利要求63所述的方法，其中所述炎症與骨質溶解相關。
65.如權利要求63所述的方法，其中所述炎症與骨關節炎相關。
66.如權利要求63所述的方法，還包括向所述炎症部位施用纖維蛋白原、凝血酶、鈣、或其組合。
67.如權利要求63所述的方法，其中所述組織或組織級分得自或來源於被治療的受治療者。
68.如權利要求63所述的方法，其中所述富含白介素-1受體拮抗劑的溶液還包含以大於所述組織或組織級分中存在的可溶性腫瘤壞死因子受體的濃度的濃度的可溶性腫瘤壞死因子受體。
69.—種產生富含白介素-1受體拮抗劑的溶液的方法，包括: 將包含白細胞的液體與固態提取材料接觸； 對所述液體進行電磁場處理；和 從所述固態提取材料分離液體以獲得富含白介素-1受體拮抗劑的溶液，其中所述溶液中白介素-1受體拮抗劑的濃度大於將所述液體與所述固態提取材料接觸之前所述液體中白介素-1受體拮抗劑的濃度。
70.如權利要求69所述的方法，其中將包含白細胞的液體與固態提取材料接觸包括在容器中合併所述包含白細胞的液體與所述固態提取材料。
71.如權利要求69所述的方法，其中所述液體選自全血、富含血小板的血漿、骨髓穿刺液、脂肪組織、和其組合組成的組。
72.如權利要求69所述的方法，其中所述液體包含全血或富含血小板的血漿。
73.如權利要求69所述的方法，其中所述液體還包含抗凝血劑。
74.如權利要求69所述的方法，其中對所述液體進行電磁場處理在將所述液體與所述固態提取材料接觸時進行。
75.如權利要求69所述的方法，其中所述溶液中可溶性腫瘤壞死因子受體的濃度是以大於將所述液體與所述固態提取材料接觸之前所述包含白細胞的液體中存在的所述可溶性腫瘤壞死因子受體的濃度的濃度。
76.如權利要求69所述的方法，其中所述包含白細胞的液體包括來源於選自全血、骨髓穿刺液、或其 組合組成的組的組織的白細胞級分。
77.如權利要求76所述的方法，其中所述白細胞級分通過離心所述組織以相對於全血增加白細胞的濃度來製備。
78.如權利要求76所述的方法，其中所述白細胞級分由包括以下的方法製備: 將所述組織上樣到試管中，所述試管包括在所述試管中布置的浮標，其中所述浮標具有的密度使得所述浮標可被操作以在所述試管中的所述組織被離心後到達平衡位置，所述平衡位置在第一級分與包含白細胞的第二級分之間，所述第二級分具有大於所述第一級分中白細胞濃度的白細胞濃度； 離心所述試管，從而所述浮標界定所述第一級分與所述第二級分之間的界面；和 取出所述第二級分。
79.如權利要求78所述的方法，其中所述組織包括全血或包含白細胞的富含血小板的血漿。
80.如權利要求78所述的方法，其中所述試管還包括分離器和聚丙烯醯胺珠，所述分離器可被操作以界定所述第二級分與包含貧血小板血漿的級分之間的界面；所述聚丙烯醯胺珠作為在所述浮標與所述分離器之間布置的固態提取材料； 其中在所述離心後將所述第二級分接觸所述聚丙烯醯胺珠。
81.如權利要求80所述的方法，其中對所述液體進行電磁場處理在將所述第二級分與所述聚丙烯醯胺珠接觸時進行。
82.如權利要求76所述的方法，其中所述白細胞級分由包括以下的方法製備: 將所述組織上樣到包含兩個浮標的分離器中，所述浮標可被操作以將所述組織分離為包括包含白細胞的級分的三種或更多種級分； 離心所述分離器以產生所述包含白細胞的級分；和 從所述分離器提取所述包含白細胞的級分。
83.如權利要求69所述的方法，其中所述固態提取材料是選自剛玉、石英、鈦、葡聚糖、瓊脂糖、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚丙烯醯胺、和其混合物組成的組的成員。
84.如權利要求69所述的方法，其中所述固態提取材料包括聚丙烯醯胺。
85.如權利要求69所述的方法,其中所述電磁場包括脈衝電磁場或電容稱合電磁場。
86.如權利要求69所述的方法，其中將所述包含白細胞的液體與所述固態提取材料接觸和對所述液體進行電磁場處理在少於約I小時中進行。
87.一種治療受治療者的炎症的方法，包括向炎症部位施用根據權利要求69的方法製造的富含白介素-1受體拮抗劑的溶液。
88.如權利要求87所述的方法，其中所述炎症與骨質溶解相關。
89.如權利要求87所述的方法，其中所述炎症與骨關節炎相關。
90.如權利要求87所述的方法，還包括向所述炎症部位施用纖維蛋白原、凝血酶、鈣、或其組合。
91.如權利要求87所述的方法，其中所述包含白細胞的液體得自或來源於被治療的受治療者。
全文摘要
提供了有關產生和使用富含白介素-1受體拮抗劑的溶液的方法、系統和組合物。方法包括將包含白細胞的液體與固態提取材料接觸並以電磁場刺激來活化白介素-1受體拮抗劑的產生。可從固態提取材料分離白介素-1受體拮抗劑。治療患者的炎症部位的方法包括向該炎症部位施用富含白介素-1受體拮抗劑的溶液。
文檔編號C07K1/14GK103249425SQ201180045732
公開日2013年8月14日 申請日期2011年8月24日 優先權日2010年9月3日
發明者喬爾·希金斯, 潔西·霍布納爾, 詹妮弗·伍德爾-梅 申請人:巴奧米特生物公司