一種自發螢光的納米球及其製備方法與應用的製作方法

2023-08-08 14:12:31 1

一種自發螢光的納米球及其製備方法與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種自發螢光的納米球及其製備方法與應用。本發明涉及的納米球為實心納米球，由具有生物相容性的肽生物分子或胺基酸分子與交聯劑分子反應製備而成。具體製備方法包括以下步驟：通過溶劑將肽或胺基酸溶解後加入經水浴加熱的含脂肪族二醛的水溶液，室溫靜置24小時後即形成具有自發螢光性質的納米球。本發明涉及的納米球製備方法具有簡單易行、條件溫和及高重複性等特點，而且製備的納米球具有自發螢光性質，避免了納米球在生物技術應用時需要進行螢光標記的缺點，此外本發明中的納米球具有非常好的穩定性與生物形容性，為製備高生物相容性納米球提供了新的更有效的途徑。
【專利說明】一種自發螢光的納米球及其製備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於化學領域，涉及一種納米材料，具體涉及一種自發螢光的納米球及其製備方法與應用。
【背景技術】
[0002]肽分子由兩個或兩個以上胺基酸分子脫水縮合後形成，由於其起源於各種生命活動，因此具有良好的生物相容性與生物可降解性，是製備各種功能生物材料的優選原料；而且肽分子可以模擬部分蛋白的行為與功能，為更好的理解蛋白的作用提供了一定的理論模型；除此之外，肽分子具有非常好的組裝性能，進而可以非常容易形成包含不同功能的各種有序結構。因此，在過去幾十年中，大量的肽分子，主要包括:環狀肽，枝狀肽，兩親肽，共聚肽與芳香肽等，被選用來製備各種功能材料並探究其在生命科學與納米【技術領域】的應用。其中，肽納米球由於在生 物醫學與藥劑學方面有廣泛的應用前景而倍受青睞，因此，製備尺寸均一併且可以穩定存在的肽納米球是需首要解決的問題。
[0003]目前針對肽納米球的製備方法主要有以下幾種:(I)乳化法；(2)聚合反應法；(3)肽分子自組裝法。乳化法需要創造油水混溶體系並且往往需要有表面活性劑的參與，而聚合反應雖不需創造油水混合體系，但往往也需要加入引發劑，這兩種方法中的表面活性劑與引發劑基本不具有生物兼容性，在納米球製備之後又不容易去除，因此會產生一定的細胞毒性，大大降低肽納米球的生物相容性。肽分子自組裝法雖不像以上兩種方法需藉助於特殊分子的作用，但其肽分子自身的合成與分離通常會有一定難度，而且該方法只能針對特定某一個分子，不具有普適性。並且這些肽納米球往往不具有自發光性質，不利於肽納米球在生物體內的定位與實時觀察。以上方法製備的肽納米球存在著或多或少不利因素而限制了其在生物科學與藥劑學方面的應用，因此獲得生物相容性好並且穩定性好的肽納米球對其在生命科學領域的應用具有重大意義。
[0004]當前，針對自發光肽納米球研究主要集中於自發螢光的性質層面上，製備的基本思路是向其中引入擁有螢光特性的物質後，再將其製備成納米球，主要方法包括如下兩種:
(I)將量子點與肽分子混合後再通過物理方法使其共組裝形成納米球；(2)通過螢光分子如異硫氰酸螢光素(FITC)對肽分子進行標記後再將其組裝成肽納米球，但是這兩種方法都引入了外源物，這樣不僅使肽納米球的製備複雜化，而且外源引入的物質必然會對生物體產生不可忽視的影響，這些不利因素都嚴重影響了肽納米球的應用。因此，發展一種簡單易行而且不引入外源物的自發螢光肽納米球的製備方法是非常有必要的。
[0005]苯丙氨酸的二聚體(二苯丙氨酸)被發現是阿爾茲海默症Αβ_澱粉樣多肽成纖維的主要識別基序，自從二苯丙氨酸被發現以來，基於二苯丙氨酸的多種功能性納米結構已被獲得，如:納米管、囊泡、納米纖維、納米帶與圖案化等，這些納米結構可以應用於無機納米材料的製備、基因運輸、生物成像、細胞三維培養等方面(參見Chem.Soc.Rev.2010，39，1877—1890，Self-assembly and applicat1n of diphenylalanine-basednanostructure)，但是迄今基於二苯丙氨酸的自發焚光納米球卻鮮有報導。
【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種自發螢光的納米球及其製備方法與應用。
[0007]本發明提供的自發螢光的納米球，由生物肽或生物胺基酸與交聯劑反應製備而得;
[0008]其中，所述生物肽為苯丙氨酸的二聚體(也即二苯丙氨酸)或二苯丙氨酸羧基端醯胺化的鹽酸鹽(也即陽離子二肽)；
[0009]所述生物胺基酸為苯丙氨酸；
[0010]所述交聯劑為脂肪族二醛的水溶液。
[0011]具體的，所述交聯劑的質量百分濃度為20-30%，具體為25% ；
[0012]所述脂肪族二醛為戊二醛或丁二醛；
[0013]所述二苯丙氨酸的構型均為L型。
[0014]所述納米球為實心納米球，直徑為350-550nm，具體為450nm ；
[0015]所述螢光為紅色螢光、藍色螢光和綠色螢光中的至少一種，上述螢光的激發光波長可為405nm。
[0016]本發明提供的制 備所述自發螢光的納米球的方法，包括如下步驟:
[0017]I)將所述生物肽或生物胺基酸溶於溶劑a形成溶液a ；
[0018]2)將所述交聯劑用溶劑b稀釋形成溶液b ；
[0019]3)將步驟I)所得溶液a與步驟2)所得溶液b混勻進行席夫鹼反應，反應完畢得到所述自發螢光的納米球。
[0020]上述方法的步驟I)中，溶解生物肽的溶劑a選自六氟異丙醇和二甲基亞碸中的至少一種；
[0021]含生物肽的溶液a中，生物肽的濃度為100mg/ml~150mg/ml,具體為125mg/ml ；
[0022]溶解生物胺基酸的溶劑a為水，具體為超純水；
[0023]含有生物胺基酸的溶液a中，生物胺基酸的濃度為5mg/ml~50mg/ml，具體為40mg/ml。
[0024]所述步驟2)中，溶劑b選自水、乙醇和甲醇中的至少一種；
[0025]所述溶液b的質量百分濃度小於25%，具體為0.06-0.6%。
[0026]所述生物肽與交聯劑的投料摩爾比為5:1~1:5，具體為1:1。
[0027]所述生物胺基酸與交聯劑的投料摩爾比為10:1~1:10，具體為1:1。
[0028]所述反應為席夫鹼反應；所述反應步驟中，溫度為室溫到90°C，具體為65°C，時間為大於12小時,具體為24小時。
[0029]另外，上述本發明提供的自發螢光的納米球在螢光標記中的應用及在製備螢光標記材料或具有生物相容性的螢光標記材料中的應用，也屬於本發明的保護範圍。
[0030]本發明利用自組裝技術，藉助共價鍵與芳香環作用等相互作用，通過一步法簡單的製備了自發螢光肽納米球，該方法不僅不需要乳化劑或引發劑的加入，而且不需要引入外援發光物質:如量子點與螢光素等，簡化了製備步驟。
[0031]本發明提供的納米球，具有如下優點:
[0032](I)穩定性好:通過向二苯丙氨酸羧基端醯胺化的鹽酸鹽陽離子二肽納米球(⑶PNSs)濁液中滴加NaOH後發現該納米球可以在pH為3到8的溶液中可以穩定存在，之後將一定量該納米球浸泡於細胞培養介質中，間隔相同時間進行動態光散射表徵，發現其在細胞培養介質中可以穩定存在10天以上。
[0033](2)好的生物兼容性與生物可降解性=CDPNSs納米球與細胞共培養10天後，細胞仍能保持90%以上的成活率，表現出非常好的生物相容性，而且被細胞內吞的CDPNSs納米球可以直接被細胞分解。
[0034](3)自發螢光:由於該方法在製備肽納米球的過程中有席夫鹼鍵的生成，因而使納米球表現出自發螢光的性質。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為⑶PNSs納米球製備過程中涉及的反應方程式。
[0036]圖2是肽納米球製備過程示意圖。
[0037]圖3是自然乾燥⑶PNSs納米球掃描電鏡圖。
[0038]圖4是自然乾燥⑶PNSs納米球透射電鏡 圖。
[0039]圖5是⑶PNSs納米球的雷射共聚焦圖，A、B、C為通過405nm雷射激發樣品時分別於藍色(430-480nm)、綠色(500_550nm)與紅色(590-64_nm)通道收集的螢光圖，D為A、B、C三通道的螢光疊加圖，表明其有自發螢光性質。
[0040]圖6是⑶PNSs納米球在含胰蛋白酶的PBS中培養不同時間的透射電鏡圖。
[0041]圖7是CDPNSs納米球生物相容性評價圖:CDPNSs納米球與Hela細胞(a)或C0S-7細胞(b)共培養十天後，兩種細胞都能保持90%以上的成活率，說明CDPNSs納米球有非常好的生物相容性。
【具體實施方式】
[0042]下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述，但本發明並不限於以下實施例。所述方法如無特別說明均為常規方法。所述原材料如無特別說明均能從公開商業途徑而得。所用苯丙氨酸的二聚體(二苯丙氨酸)的英文名為d1-L-phenylalanine (Phe-Phe),購自Sigma公司，貨號為P4126;二苯丙氨酸羧基端醯胺化的鹽酸鹽(陽離子二肽)的英文名為cat1nic dipeptide (H-Phe-Phe-NH2.HCl),購自 Bachem 公司，貨號為 G-2930。
[0043]實施例1、二苯丙氨酸納米球(FFNSs)的製備
[0044]I)將Img生物肽二苯丙氨酸溶於8 μ I六氟異丙醇中，得到生物肽的六氟異丙醇溶液(也即溶液a)，濃度為125mg/ml，4°C存放24小時以上使其充分溶解；
[0045]2)將1.2 μ I質量百分濃度為25%的戊二醛的水溶液通過超純水稀釋到500 μ 1，得到溶液b，濃度為0.06% ;二苯丙氨酸與戊二醛的投料摩爾比為1:1;
[0046]3)將溶液b於65°C水浴加熱至恆溫充分溶解後，加入到溶液a中，經席夫鹼反應，室溫靜置24小時老化後，溶液變為淡黃色濁液，離心既得FFNSs。
[0047]實施例2、陽離子二肽納米球(⑶PNSs)的製備
[0048]I)將Img陽離子二肽溶於8 μ I六氟異丙醇中，得到生物肽的六氟異丙醇溶液(也即溶液a)，濃度為125mg/ml，4°C存放24小時以上使其充分溶解；
[0049]2)將1.2 μ I質量百分濃度為25%的戊二醛的水溶液通過超純水稀釋到500 μ 1，得到溶液b，濃度為0.06% ;陽離子二肽與戊二醛的投料摩爾比為1:1 ；
[0050]3)將溶液b於65°C水浴加熱至恆溫充分溶解後，加入到溶液a中，經席夫鹼反應，室溫靜置24小時老化後，溶液變為淡黃色濁液，離心既得CDPNSs。該方法涉及的反應如圖1所示，具體製備過程如圖2所示。
[0051]實施例3、苯丙氨酸納米球(FNSs)的製備
[0052]I)將20mg生物胺基酸苯丙氨酸溶於500 μ I超純水中，得到苯丙氨酸的水溶液(也即溶液a)，濃度為40mg/ml，4°C存放24小時以上使其充分溶解；
[0053]2)將12 μ I質量百分濃度為25%的戊二醛的水溶液通過超純水稀釋到500 μ 1，得到溶液b，濃度為0.6% ;苯丙氨酸與戊二醛的投料摩爾比為1:1 ;
[0054]3)將溶液b於65°C水浴加熱至恆溫充分溶解後，加入到溶液a中，經席夫鹼反應，室溫靜置24小時老化後，溶液變為淡黃色濁液，離心既得FNSs。
[0055]實施例4、實施例2所得⑶PNSs納米球的表徵
[0056]⑶PNSs納米球掃描電鏡表徵:將5μ I經過離心洗漆的納米球懸池液滴於娃片表面，真空將其抽乾後，通過導電膠固定於樣品臺，通過濺射儀向其表面噴灑Au顆粒後於HITACHI S-4800掃描電鏡顯微鏡下觀察，其加速電壓為10kV。
[0057]由圖3可知，所得材料為納米球狀結構並且具有非常好的單分散性。 [0058]⑶PNSs納米球透射電鏡表徵:將5 μ I經過離心洗滌的納米球懸濁液滴於銅網表面於真空將其抽乾後於JEOL JEM-1011透射電鏡顯微鏡下觀察，其加速電壓為100kV。
[0059]由圖4可知，所得納米球為實心納米球，直徑為450nm。
[0060]CDPNSs納米球雷射共聚焦表徵:將20 μ I納米球稀釋至Iml後加入到共聚焦培養皿內，5分鐘後於Olympus FV500共聚焦顯微鏡下選用405nm雷射器激發，在對應波長範圍內觀察。
[0061]所得結果如圖5所示。
[0062]由圖可知，當用405nm雷射激發納米球時，在三個發射通道藍光(A)、綠光(B)和紅光(C)都觀察到了明顯的螢光，說明該方法製備的納米球有強的自螢光性質，D圖為A、B、C三通道的疊加圖。
[0063]CDPNSs納米球體外納米球降解測試:將一定量CDPNSs納米球置於含胰酶PBS溶液中於37°C培養O天，I天，4天和10天後，取5 μ I滴於碳膜覆蓋的銅網上真空抽乾後於JEOL JEM-1011透射電鏡顯微鏡下觀察，其加速電壓為100kV。
[0064]所得結果如圖6所示。
[0065]由圖可知，開始時CDPNSs納米球表面光滑，隨著培養時間增長，CDPNSs納米球表面出現了不同大小的洞，當培養時間延長至10天時，CDPNSs納米球基本消失而且只能發現少量納米球的邊緣，說明CDPNSs納米球可以在酶的作用下而分解。
[0066]實施例1和3所得納米球的表徵結果與上無實質性差別，不再贅述。
[0067]將實施例2所得⑶PNSs納米球進行生物相容性測試:選用人宮頸癌細胞(Hela)與非洲綠猴腎成纖維細胞(C0S-7)為例進行納米球生物相容性測試。
[0068]具體步驟如下:將細胞置於聚苯乙烯(Corning)培養皿中，在37 °C培養箱(STERI371, Thermo Electron Corporat1n)且含有 5% (v/v% )C02 的溼空氣中培養，培養基中含10% (v/v%)的胎兒牛血清，I %的鏈黴素和青黴素。當細胞豐度達到90%時，用標準的消化技術經PBS洗滌、消化與離心後將細胞種於多個96培養孔板，24小時後，吸去原培養液，換新液，其中一行中不加入任何樣品，作為參比樣，另外幾行中分別加入不同體積(5、
10、15、20、25、3(^1)0^吧8納米球(2mg/ml)樣品，繼續培養2天、4天、7天與10天後測細胞相對成活率，進而反映出納米球的生物相容性。
[0069]為了測定細胞的成活率，每孔中各加入20μ 15mg/ml MTT溶液，在培養箱中避光繼續孵育4h後，去除所有孔中的液體，然後在每個孔中加入400 μ L DMS0,震蕩20min使沉澱於培養板底部的MTT-甲臢晶體充分溶解。
[0070]隨後通過酶標儀檢測其在490nm處的吸光度值，吸光度與活細胞數量成正比，以沒有加納米球的孔中的細胞成活率計為100 %，通過吸光度作比計算加入納米球的孔中的
細胞相對成活率。
[0071]
【權利要求】
1.一種自發螢光的納米球，由生物肽或生物胺基酸與交聯劑反應製備而得； 其中，所述生物肽為苯丙氨酸的二聚體或二苯丙氨酸羧基端醯胺化的鹽酸鹽； 所述生物胺基酸為苯丙氨酸； 所述交聯劑為脂肪族二醛的水溶液。
2.根據權利要求1所述的納米球，其特徵在於:所述交聯劑的質量百分濃度為20-30%，具體為 25% ； 所述脂肪族二醛為戊二醛或丁二醛； 所述二苯丙氨酸的構型均為L型； 所述納米球為實心納米球，直徑為350-550nm，具體為450nm ； 所述螢光為紅色螢光、藍色螢光和綠色螢光中的至少一種。
3.一種製備權利要求1-2任一所述自發螢光的納米球的方法，包括如下步驟: 1)將所述生物肽或生物胺基酸溶於溶劑a形成溶液a； 2)將所述交聯劑用溶劑b稀釋形成溶液b； 3)將步驟I)所得溶液a與步驟2)所得溶液b混勻進行席夫鹼反應，反應完畢得到所述自發螢光的納米球。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於:所述步驟I)中，溶解生物肽的溶劑a選自六氟異丙醇和二甲基亞碸中的至少一種； 含生物肽的溶液a中，生物肽的濃度為100mg/ml~150mg/ml,具體為125mg/ml ； 溶解生物胺基酸的溶劑a為水,具體為超純水； 含有生物胺基酸的溶液a中，生物胺基酸的濃度為5mg/ml~50mg/ml,具體為40mg/ml ο
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特徵在於:所述步驟2)中，溶劑b選自水、乙醇和甲醇中的至少一種； 所述溶液b的質量百分濃度小於25%，具體為0.06^-0.6?^
6.根據權利要求3-5任一所述的方法，其特徵在於:所述生物肽與所述交聯劑中脂肪族二醛的投料摩爾比為5:1~1:5 ; 所述生物胺基酸與所述交聯劑中脂肪族二醛的投料摩爾比為10:1~1:10。
7.根據權利要求3-6任一所述的方法，其特徵在於:所述反應步驟中，溫度為室溫到90°C，具體為65°C，時間為大於12小時，具體為24小時。
8.權利要求1-2任一所述自發螢光的納米球在螢光標記中的應用。
9.權利要求1-2任一所述自發螢光的納米球在製備螢光標記材料或具有生物相容性的螢光標記材料中的應用。
【文檔編號】C07K5/065GK104031636SQ201410258182
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月11日 優先權日:2014年6月11日
【發明者】李峻柏, 張鶴, 崔嶽 申請人:中國科學院化學研究所