一種新型預防和治療B肝病毒感染的核酸疫備及製備方法

2023-08-08 04:30:21

專利名稱：一種新型預防和治療B肝病毒感染的核酸疫備及製備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種新型預防和治療B肝病毒感染的核酸疫苗及製備方法。
背景技術：
乙型病毒性肝炎(Viral hepatitis B)是目前危害我國人民身體健康最為嚴重的感染性疾病。據調查，我國慢性B肝病毒感染者多達1.2億以上，其中慢性B肝患者達2000萬以上。攜帶者及慢性肝炎患者中部分病例可發展為重症肝炎、肝硬化甚至肝癌，每年死於肝炎及其相關性疾病的患者不下30萬例。據估算，每年因為肝炎及其相關性疾病導致的經濟支出高達300-500億元。B肝病毒感染至今尚無特效治療方法。目前臨床上應用的慢性B肝治療藥物均存在療效不盡如人意、副作用多等多方面的缺陷，遠不能滿足B肝病毒感染防治的需要，這給B肝的防治帶來了巨大困難。因此，開發高效的抗B肝病毒藥物，具有迫切的臨床需要。
核酸疫苗及治療性核酸疫苗是國際上20世紀90年代以後發展起來的新興生物技術，在預防和治療慢性B肝病毒感染方面具有廣闊的發展前景。
B肝治療性核酸疫苗與傳統藥物相比具有以下優越性(1)傳統藥物(包括α幹擾素，胸腺素α1，拉米夫定等)僅能可逆性地降低HBVDNA複製水平，部分清除HBeAg，而對清除HBsAg基本無效；從理論上講，治療性核酸疫苗可望發展為HBV感染的根治藥物，不但能清除HBV基因表達產物(HBsAg、HBeAg)，而且可以大幅度降低或清除HBV DNA，使治療更為完全、徹底。(2)Davis、Hui等通過轉基因小鼠動物模型研究發現，治療性核酸疫苗應用過程中不會導致肝功能指標的升高，不引起肝臟病理損害，這一特點也明顯優越於現有的抗病毒藥物及免疫調節藥物。(3)B肝治療性核酸疫苗表達載體為質粒載體，無病毒性載體的安全性顧慮，疫苗接種方法簡單、易行，可重複注射，目的基因表達持續時間不長，但足以介導良好的免疫應答，且目的基因不需要精確調控。(4)由於治療對象均為HBV感染者，且目的基因片段並不含有完整的病毒顆粒，在機體染色體DNA上隨機整合率低、應用較為安全。
國內外有關B肝核酸疫苗的研究主要集中在以下方面1.目的基因片段的選擇多項研究顯示，HBV S基因為誘導HBsAg特異性CTL活性所必需，而preS1或preS2基因的加入可增強機體的免疫應答。Davis等在HBV基因疫苗誘導CTL活性的研究中發現，基因疫苗可十分有效地誘導HBV特異性CTL應答，從而為開發新型B肝治療性核酸疫苗提供了強有力的理論依據。Davis等在隨後的研究中採用包含HBV DNAS及preS2基因的質粒pCMV-S2S免疫HBsAg轉基因小鼠，觀察到部分小鼠早在DNA疫苗注射後2周，血清HBsAg即消失，不經加強注射持續至12周以上，而另外一些小鼠，HBsAg水平明顯下降且維持在較低水平。同時，血清中抗HBs產生。所有小鼠均未見肝臟出現明顯的壞死及炎症病理變化。Hui等構建了包含HBV S基因及preS121-47位多肽編碼基因的重組質粒pCMV-SS1，用於免疫HBsAg轉基因小鼠，結果發現pCMV-SS1給藥導致80％的轉基因小鼠循環中HBsAg的清除或水平明顯下降(下降至用藥前的1/1000水平)，明顯高於pCMV-S(40％)，而空載質粒無效，非空載質粒給藥組均觀察到較高的抗HBs水平，而pCMV-SS1質粒組還觀察到抗preS1的產生。這亦為核酸疫苗清除慢性B肝病毒感染提供了強有力的實驗依據。採用HBe/cAg抗原編碼基因片段構建核酸疫苗的研究亦見諸報導，但Matti等的研究表明，包含HBe/cAg基因的表達質粒並無清除HBV慢性感染大猩猩體內病毒的作用。目前國內外已經採用的B肝核酸疫苗基因片段及組合方式主要有S基因、S+preS121-47位多肽編碼基因、preS2S、C、SC、preS1preS2S等基因片段，相關專利如下表1 B肝核酸疫苗基因片段選擇相關專利專利號 申請日期 發明人 基因片段 載體1 US05024 1991.07.1Nozaki，et (SC)3PSHB32 US06025 2000.02.1Jack R，et al. S1/S2/S+HCV core pcDNA3 WO0001 2000.03.2Shan LU，etC(35nts deleted) PJW4304 CN11083 1995.09.1李光地 SS1 V.V5 CN17558 1998.03.1李光地 C(AA1-144)(AA1-4 pcDNA6 CN12093 1999.03.0饒偉華 S1/S2/S7 CN13165 2000.06.1陳光明 S2S+GM-CSF/IL-2pcDNA8 CN13246 2001.05.2孫樹漢 S2S+CpGpVAX2.表達載體的選擇和載體構建方法核酸疫苗常以高效哺乳動物細胞表達質粒為載體或採用逆轉錄病毒載體。質粒載體必須是能在大腸桿菌中高拷貝擴增，哺乳動物細胞內高效表達，而不能複製，同時也不含有在宿主細胞基因中整合的序列。目前常用於構建核酸疫苗的表達質粒主要包括(1)pcDNA3Invitrogen公司開發的商品化質粒載體，是常用的克隆與表達目的基因載體，含CMV立即早期啟動子、多克隆位點及牛生長激素多聚腺苷酸信號序列，採用新黴素抗性基因進行抗性篩選。
(2)pVAX1Invitrogen公司開發的商品化質粒載體，為FDA批准唯一用於核酸疫苗的表達載體，含CMV和T7啟動子、BGH多腺苷酸信號尾和Kan抗性基因。
(2)pRC/CMVClontech公司開發的商品化質粒載體，廣泛用於研究，含CMV立即早期啟動子，外源基因有較高的表達效率，注射後可產生較高的體液免疫及細胞免疫應答。
(3)pCIPromega公司開發的商品化質粒載體，含CMV立即早期啟動子、多克隆位點、SV40晚期多聚腺苷酸信號序列及能夠提高目的基因表達水平的嵌合型內含子。
載體的選擇和構建方法對於提高核酸疫苗的免疫效應至關重要。其影響因素主要包括(1)目的基因片段的優化和連接方法核酸疫苗本身不帶目的基因的蛋白合成系統，完全依賴於宿主細胞調控。將外源基因優化為宿主細胞偏好的密碼子，可改善目的蛋白的合成，從而增強免疫效果。對於多個片段組成的共表達形式，各個片段之間的連接方式亦非常重要。目前大多數學者主張採用Gly4Ser1編碼基因的2-4次重複序列作為不同基因片段之間的連接序列，以利於蛋白質更好地表達及生物學活性的穩定。此外，目的基因轉錄翻譯起始區應含有核糖體結合位點，以提高基因轉錄和蛋白質的表達效率。
(2)外源基因轉錄啟動子/增強子序列一類是致病性的病毒啟動子，在多數哺乳動物細胞中具有較高水平的轉錄起始能力，目前認為hCMV啟動子較SV40及MPSV啟動子能更好地發揮作用。另一類是哺乳動物啟動子，適合在人體或動物中使用，如來自哺乳動物的MHC I啟動子/增強子BL3-60prmtr(HarmsJS，et al.Braz J Med Biol Res1999，32155-62)，人肌肉特異性肌酸激酶啟動子(Baztlett et al.，1996)；鼠金屬硫蛋白基因啟動子、免-β心肌重鏈及輕鏈1/3增強子；β-actin啟動子與CMV增強子合用等(Niwa etal.，1991)。
(3)內含子序列載體中插入的內含子序列有利於抗原的高效表達，可能因為RNA聚腺苷酸化和/或核轉錄連接的RNA剪切速率提高的緣故。Brinster等研究表明，內含子可提高轉基因鼠的外源基因轉錄效率10-100倍。內含子序列位於抗原基因編碼區的上遊才能較好地促進外源基因的表達，增強免疫應答。目前已有載體本身包含了能增強外源基因轉錄翻譯的內含子序列，如pCI載體中含有嵌合型內含子序列。
(4)聚腺苷酸化(poly A)信號聚腺苷酸化信號序列定位於多克隆位點的下遊，可提高轉錄RNA的穩定性及翻譯效率，促進目的基因的有效加工。核酸疫苗載體中聚腺苷酸化終止序列常來源於牛生長激素或晚期SV40聚腺苷酸化信號，如pcDNA3.1mychis(BGH、SV40)、pCI(SV40)、VR1012(BGH)、pVAX1(BGH)等。
(5)其它免疫增強序列1)CpG基序作為免疫調節序列來源於細菌的DNA序列有調控動物免疫功能的作用，這些序列大部分是以CpG(非甲基化胞苷酸鳥苷)為基元的寡聚體，其排列通常遵循5-purpur CG pyrpyr-3的規律(Krieg AM，et al.，Nature1995，374546-9)。CpG可誘導IL-2的釋放、增加內源性IFN-γ的合成，下調IgE水平，具有TH1定向免疫調節的優勢，因此廣泛用於多種慢性病毒性感染、過敏性疾病以及腫瘤核酸疫苗的研製。
2)細胞因子的免疫佐劑效應業已發現多種細胞因子具有免疫佐劑作用，可調節免疫應答的強度和方向。TH1細胞主要產生IL-1、IFN-γ，在促進細胞免疫、清除細胞內病原體方面具有優勢；TH2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，以促進抗體產生為主，而IL-4又對TH1細胞因子產生明顯的抑制作用。在核酸疫苗的應用中，通常傾向於採用細胞因子作為佐劑。在使用方式上，除可直接使用細胞因子外，還可以將細胞因子表達質粒與疫苗質粒共免疫，或構建共表達質粒。IL-2是目前廣泛使用的細胞因子佐劑，在不同的模型中均表現出增強機體免疫保護作用。如融合或非融合形式的IL-2與B肝病毒表面抗原的共表達質粒可導致體液和細胞免疫反應水平的升高(Chow YH，et al.，J Immunol1998，1601320-9)。與IL-2相比，IL-12是使抗原特異性幼稚CD4+細胞向TH1方向轉變的更為關鍵的細胞因子，能調節免疫應答向著有益的TH1型方向發展，在核酸疫苗研製中越來越多地被採用。
3)共刺激因子的佐劑效應共刺激因子(costimulatory factors)如B7、ICAM-1、VCAM-1、LFA-3等是T細胞激活的第二信號，目前較受重視的是B7-1(CD80)和B7-2(CD86)分子。TCR與抗原結合產生T細胞活化的第一信號，而T細胞表面的CD28/CTLA-4與抗原提呈細胞表達的B7分子結合產生第二信號，T細胞只有同時受到這兩種信號的刺激，才能被充分活化。缺乏B7等共刺激分子提供的第二信號，則可能導致T細胞的凋亡或產生免疫耐受。用B7基因(Allovectin-7)轉染腫瘤細胞，可打破機體對腫瘤細胞的免疫耐受狀態，能引起強烈的免疫反應，使腫瘤消退。在愛滋病核酸疫苗的研究中，以B7基因與HIV-1重組質粒共同接種，雖不能使體液免疫顯著改變，但CTL應答顯著增強，且TH細胞發生增殖。
3.核酸疫苗的製劑及給藥途徑其它增強疫苗免疫應答的措施主要取決於製劑及給藥途徑。目前，核酸疫苗的主要製劑形式是脂質體藥物形式，脂質體包裹既是一種製劑形式，同時又是一種良好的免疫佐劑。脂質體藥物的主要優點是1)脂質體藥物具有緩釋和較好的靶向作用，主要分布於網狀內皮細胞，能有效地增強巨噬細胞和樹突細胞對抗原的攝取、提呈，故能有效地刺激T細胞。2)脂質體能靶向性激活MHC-I和MHC-II類分子的處理和遞呈，刺激IL-2的產生。這些特性有助於提高機體細胞免疫和體液免疫應答。3)脂質體無免疫原性，不過敏，性質穩定，機體耐受良好。4)可黏膜給藥，產生高水平分泌性IgA，提高黏膜局部免疫能力。
核酸疫苗的免疫途徑有多種(見表2)，以肌肉注射接種較為常見。但傳統的給藥途徑存在不足，這主要在於疫苗進入機體後，能被機體細胞攝入並表達的外源基因終究是少數。故近年來相繼開發出了許多新型DNA導入方法。如基因槍技術(Yang Ns，et al.，1980)、陽離子脂質體(Gregoriadis et al.，1997)、Cochleate包被(Mannino RJ et al.，1997)、可降解微粒包裹(Jone et al.，1997)、某些細菌減毒株(Darji A et al.，1997)等。國外近年來開發的一些給藥系統專利產品見表3。
表2核酸疫苗相關的免疫途徑注射途徑報導作者肌肉注射Davis，et al.，1996皮下注射Yokeyama，et al.，1996；Liu et al.，1997皮內注射Gramzinski，et al.，1993；Condon et al.，1996腹腔注射Fynan et al.，1993靜脈注射Fynan et al.，1993；Zhang GF，et al.，1999動脈注射Nabel，et al.，1993口腔黏膜Jones DH，et al.，1997；Chen SC.，et al.，1998鼻腔黏膜Fynan EF，et al.，1993；Sasaki S，et al.，1998支氣管黏膜 Tsan MF，et al.，1995；Meyer KB，et al.，1995
生殖道黏膜 Wang B，et al.，1997；Livingston JB，et al.，1998頰內注射Etchart et al.，1997；Hinkula et al.，1997乳腺內注射 Furth et al.，1992表3 國外開發的給藥系統專利產品給藥系統 開發/或專利擁有公司1.PowderJect systemPowderJect vaccines Inc(Oxford，London and Madison，Wisconsin)2.Lipoplex-Biovector systemBITVECTOR THERAPEUTICS3.Biojector2000jet Bioject Medical Technologies Incinjection delivery system(Vical，U.S.A)4.Geneswitch Gene Medicine Inc(U.S.A)5.Bacfotection Institute of Human Virology(IVH，U.S.A)目前並沒有一種具有絕對優勢的給藥途徑。肌肉注射仍是使用最廣、效果較肯定的一種；黏膜免疫能較好地誘導產生分泌性IgA抗體；基因槍接種誘生的血清抗體水平最高，而細胞免疫應答略嫌不足；靜脈注射易擴散至淋巴結甚至骨髓處，有可能轉染分裂活躍的幹細胞而導致細胞惡變，故難以應用到臨床。因此根據核酸疫苗的類型和用途，採用相應的接種措施，才有可能取得最佳的免疫防護效果。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種能大幅度提高慢性B肝病毒感染的預防和治療效果的新型B肝病毒基因片段組合核酸疫苗。
本發明公開的新型B肝病毒基因片段組合核酸疫苗是一種包含B型肝炎病毒非天然新型基因片段組合的表達載體，該表達載體是將所述的基因片段組合連接到各種非複製型哺乳動物細胞高效表達載體中獲得的。
所述的基因片段組合為PreS2S+linker+preS2，簡稱S2SS2，分子量為43KD，其鹼基序列見序列6，胺基酸序列見序列7；其中linker片段基因序列為[(GGT)4TCT1]n，n＝2～4次重複，其編碼aa為(Gly4Ser1)；基因序列來自於中國HBV感染者血清，其基因型為B或C型。
所述的非複製型哺乳動物細胞高效表達載體為pcDNA系列、pRc/CMV、pCI或pVAX1等。
本發明所要解決的另一技術問題是公開上述核酸疫苗的製備方法。
本發明公開的上述核酸疫苗的製備方法包括(1)HBVDNA模板製備取中國HBV慢性感染患者混合血清，設計5』-端包含Kpn I酶切位點(引物序列1，PF1)、3』-端包含linker融合負鏈(引物序列2，PL1)的preS2/S基因擴增引物以及5』端包含linker融合正鏈(引物序列3，PL2)、3』端包含Not I的酶切位點(引物序列4，PB2)的preS2引物，分別擴增preS2/S片段及preS2片段，經凝膠回收純化的preS2/S片段與preS2片段採用PCR方法(引物序列1、序列4)進行連接和擴增，得到全長preS2/S preS2基因片段；preS2/S preS2基因片段經凝膠回收、純化。
(2)將步驟(1)獲得的基因片段連接到非複製型哺乳動物細胞高效表達載體中，將其大量擴增純化，即得。
本發明所要解決的再一技術問題是公開上述核酸疫苗在製備預防和治療人或哺乳動物B肝病毒感染疫苗中的應用。
本發明S2SS2疫苗可用於哺乳動物或人體的HBV持續感染的預防和治療，其中預防人群為經檢測未受HBV感染群體或經常規HBV疫苗注射後無免疫應答的個體。HBV持續感染包括HBV攜帶者、各種慢性B肝患者、B肝肝硬化及B肝後肝癌而HBV DNA複製活躍者、HBV DNA呈整合狀態者等。
本發明S2SS2疫苗可製成生理上可以接受的液體製劑、乳液製劑、凍幹製劑等。經皮下、肌肉、靜脈、腹腔內注射或口服、金或鎢顆粒包被基因槍轟入等途徑給藥。
大部分B肝核酸疫苗所使用的編碼基因來源於前S/S區和C區。前S/S區的基因天然組合方式有S、preS2/S、preS1/preS2/S三種，分別編碼B肝病毒外膜抗原的主蛋白、中蛋白和大蛋白。我們採用了前S/S片段的非天然重複組合，具體組合方式為preS2S+linker+preS2。選擇重複preS2拷貝的原因在於1)前S2表面含有多聚人血清白蛋白受體(PHSR)，HBV可通過前S2蛋白、S蛋白與肝細胞表面受體結合進入肝細胞，從而導致病毒的感染。2)前S2還與病毒的免疫逃避、宿主細胞核內整合具有相關性。前S2蛋白和單體人血清白蛋白聯結後，穩定存在於血液循環中，逃避機體的抗病毒免疫應答。因此採用重複preS2拷貝的包含前S/S基因片段組合的B肝核酸疫苗從理論上講具有更好的預防及治療效應。
本發明哺乳動物細胞表達載體選擇了pcDNA系列、pRc/CMV、pCI或pVAX1等。其中1)pcDNA3.1/mychis為Invitrogen公司開發的商品化載體，含高效轉錄啟動的hCMV啟動子、BGH和SV40多聚腺苷酸信號序列、氨苄青黴素與neo抗性基因、方便的多克隆位點等。
2)pCI為Promega公司開發的商品化載體，含hCMV啟動子、SV40多聚腺苷酸信號序列、氨苄青黴素抗性基因、常用的多克隆位點以及促使目的蛋白高效表達的嵌合性內含子。
3)pVAX1為Invitrogen公司開發的商品化載體，亦是FDA批准的唯一用於預防性核酸疫苗的載體。pVAX1含pUC骨架、CMV和T7啟動子、BGH多聚腺苷酸信號序列、多克隆位點以及Kan抗性基因，分子量較小。
用本發明核酸疫苗pcDNA3.1-S2SS2、pVAX1-S2SS2對BALB/c(H-2d)小鼠細胞及體液免疫應答進行試驗一.實驗方法1.實驗動物及分組健康雌性BALB/c(H-2d)小鼠(上海西浦爾-必凱公司)，6-8周齡，體重18-20g，清潔級，標準化環境飼養。
隨機分組如下載 體 pcDNA3.1 pVAX1實驗組 ①S2SS2①S2SS2
②S2S ②S2S空白對照 生理鹽水 生理鹽水陰性對照 pcDNA3.1/mychis/LacZ pVAX12.接種方式雙側脛前肌注射，100μg/只/次；2、4周後各加強接種1次。
空白對照組接種100μl生理鹽水/只/次3.免疫應答的檢測(1)接種部位的抗原表達B肝核酸疫苗接種後第10天，處死部分小鼠，取接種部位肌肉組織，中性福馬林固定，常規石蠟包埋，製作單個組織蠟塊。
將同批組織製成組織晶片，採用常規切片，免疫細胞化學技術檢測接種部位肌肉組織的preS2Ag、HBsAg表達。I抗分別採用抗前S2單抗、抗HBs單抗，DAB顯色。
(2)小鼠血清特異性抗體初次接種後3周、5周、8周、12周，採集小鼠眶靜脈血，檢測前S2抗體、抗-HBs。
試劑分別採用B肝前S2抗體檢測試劑盒(北醫大肝炎試劑中心)、B肝表面抗體檢測試劑盒(華美)。
(3)體外CTL活性初次接種後5周，每組處死部分小鼠，採用LDH細胞毒性檢測試劑盒，進行體外CTL活性測定。基本原理是核酸疫苗接種小鼠後，誘生特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。CTL體外遇到表達特異性病毒抗原和同源性MHC I類分子的靶細胞，可使之破壞並釋放出含有乳酸脫氫酶(LDH)的細胞內容物。通過檢測細胞培養上清中LDH酶的活性，了解靶細胞破壞的程度，從而計算出小鼠的體外CTL活性(以百分率表示)。
首先收集處於對數生長期的靶細胞，PBS洗滌2次，用培養基(含1％FBS的RPMI 1640培養基)重懸細胞並計數。放血處死小鼠，無菌取脾置200目不鏽鋼篩網上，用2mL注射器針芯研磨，製備脾細胞懸液。用PBS洗滌脾細胞2次後，加入5ml LAK紅細胞裂解液(0.15mol/L NH4Cl·1mmol/L NaHCO3·0.1mmol/L Na2EDTA，PH7.2)重懸，室溫靜置5min。10000rpm離心3min；沉澱用PBS洗滌2次後，加入培養基重懸計數，作為效應細胞，其中含有較多的CTL和CTL前體細胞。取3×107效應細胞，加入5×105靶細胞(60Co 10000rad預處理)，37℃，5％CO2共同孵育5天。將靶細胞濃度調整為5×104/ml，強化刺激後的效應細胞用培養基梯度稀釋，使效應細胞與靶細胞的濃度比分別為100∶1、50∶1、25∶1、12.5∶1，二者按等體積加入96孔培養板，每種比例3個復孔，同時設置系列對照(表4.1.1)。37℃，5％CO2孵育4h；室溫1000g離心10min；取上清100μl/孔，轉至96孔酶標板的對應孔，加入LDH底物100μl(臨用前新鮮配製)，室溫避光顯色15～30min，自動酶標儀測雙峰OD值(測量波長490nm，參考波長655nm)。
體外CTL活性(％)計算公式 高限對照---靶細胞最大釋放值低限對照---靶細胞自然釋放值表4.1.1體外CTL活性檢測的對照設置內容物 背景對照 低限對照 高限對照 效應細胞自然 效/靶實驗(μl) (μl) (μl)釋放值(μl)值(μl)培養基 200 100- 100 -靶細胞-100 100 - 1002％TritonX-100- -100 --效應細胞 - - - 100μl 100二.實驗結果(一)接種部位的抗原表達常規免疫細胞化學方法檢測顯示實驗組的S基因均得到高效表達，而前S2抗原表達較弱。對照組檢測結果均為陰性。
(二)血清特異性抗體1.以pcDNA3.1為載體的B肝核酸疫苗(1)前S2抗體
S2SS2組的抗體陽轉率上升快，5周時已達到87.5％並保持到12周以上；S2S組抗體陽轉率最高62.5％。對照組血清前S2抗體檢測全部陰性。見圖9S2SS2組的前S2抗體最高滴度1∶2000；S2S組最高值1∶500。見圖10(2)抗-HBsS2SS2組和S2S組的抗體陽轉率分別達到62.5％和75％。對照組血清抗HBs檢測全部陰性。見圖7S2S組抗體最高滴度1∶1000，而S2SS2抗體滴度低於1∶100。見圖82.以pVAX1為載體的B肝核酸疫苗(1)前S2抗體S2SS2的抗體陽轉率達到85.7％，高於S2S組的66.7％。對照組血清前S2抗體檢測全部陰性。見圖13S2SS2組的前S2抗體最高滴度1∶100以上；S2S組僅為1∶10。見圖14(2)抗-HBsS2SS2和S2S組的抗體陽轉率分別達到85.7和50％；見圖11抗體最高滴度分別為1∶100和1∶50。對照組血清抗HBs檢測全部陰性。見圖12(三)體外CTL活性S2SS2和S2S的體外CTL活性分別達到36.9％和19.14％左右。對照組數值較低，可能是NK細胞等作用的結果。見圖15三.結論小鼠接種B肝核酸疫苗後10天，接種部位出現目的抗原的表達。
無論使用何種載體，S2SS2和S2S組疫苗免疫後均誘生出前S2抗體。S2SS2組的抗體陽轉率上升最快，5周時達到80％以上並可保持到12周，大大高於S2S組；S2SS2組的抗體水平亦大大高於S2S組。顯示含S2多拷貝基因的S2SS2核酸疫苗突出優勢在於誘生較強的前S2抗體水平，這對於B肝的預防和治療具有重要意義。
此外，S2SS2和S2S核酸疫苗都能誘生一定水平的體外CTL活性。
用本發明核酸疫苗pcDNA3.1-S2SS2對HBV DNA轉基因C57BL/6(H-2b)小鼠的治療作用進行研究一.實驗方法1.實驗動物HBV DNA轉基因C57BL/6(H-2b)小鼠，雌雄各半，3-5月齡，體重25-30g，SPF級，SPF標準環境下飼養。
2.動物分組實驗組①S2SS2②S2S對照組pcDNA3.1/mychis/LacZ3.接種方式與BALB/c小鼠相同4.免疫效應的檢測(1)血清特異性抗體接種前1周和接種後3周、5周、8周，分期眶靜脈採血，檢測血清抗-HBs和前S2抗體。
(2)血清HBV DNA水平採用HBV DNA定量PCR檢測試劑盒，按說明書操作。
(3)肝組織中的抗原表達接種前3天和接種後3周、5周、8周，分別用1％戊巴比妥鈉50mg/Kg體重腹腔內麻醉C57BL/6小鼠，無菌手術剖腹，切取0.5×0.5CM2大小的肝組織，中性福馬林固定。手術後關閉腹腔繼續觀察飼養。同批小鼠肝組織製成組織晶片，常規切片及免疫細胞化學技術檢測前S2抗原、HBsAg。
二.實驗結果1.肝組織中的抗原表達B肝核酸疫苗接種前，小鼠肝組織均存在HBsAg及preS2Ag的表達並主要分布於細胞漿內。見圖16、圖17，陽性對照見圖18、19，陰性對照見圖20。接種後第5～8周時，抗原表達呈減弱趨勢，部分小鼠抗原表達甚至完全消失，但各組之間差異不明顯。
與此同時，對照組小鼠肝組織中的上述抗原表達在接種前和接種後第5、8周比較無明顯變化。
2.外周血特異性抗體①抗-HBs
接種B肝核酸疫苗後，S2SS2和S2S組小鼠的抗-HBs陽轉率分別達到100％和40％。見圖21抗-HBs最高滴度均為1∶50。見圖22對照組血清抗-HBs檢測全部陰性。
②前S2抗體S2SS2和S2S組小鼠前S2抗體檢出率低，＜25％。
對照組前S2抗體檢測全部陰性。
③血清HBV DNA定量接種B肝核酸疫苗後，小鼠血清HBV DNA水平似呈逐次降低的趨向。見圖23與此同時，陰性對照組的血清HBV DNA水平無明顯變化。
三.結論轉基因小鼠接種B肝核酸疫苗後，HBV DNA水平有逐次降低的趨向，肝組織中HBsAg和preS2Ag表達呈減弱趨勢甚至完全消失；S2SS2組小鼠的抗-HBs陽轉率達100％，高於S2S組。表明核酸疫苗S2SS2能全部或部分終止轉基因小鼠對HBV DNA的免疫耐受狀態，從而為HBV慢性感染者的治療提供強有力的理論依據。


圖1 HBV S2S、S2片斷及其PCR連接產物電泳圖其中1為S2S(890bp)；2為S2(220bp)；3為PCR連接產物(S2SS2、S2)；M為DNAmarker DL-2000圖2重組質粒pcDNA3.1-S2SS2的構建示意3以pcDNA3.1為載體的重組質粒的酶切圖譜其中1為pcDNA3.1-S2S；2為pcDNA3.1-S2SS2；M為DNAmarker DL-15000圖4以pVAX1為載體的重組質粒的酶切圖譜其中1為pVAX1；2為pVAX1-S2SS2；4為pVAX1-S2S；M為DNA markerλ/EcoR T14圖51-2pVAX1/S2SS2測序圖譜圖6 SP2/0-S2SS2細胞裂解物的western blot電泳圖其中1-4為SP2/0-S2SS2細胞裂解物，N為SP2/0-CMV，P為陽性對照圖7 pcDNA3.1載體核酸疫苗誘導小鼠HBs抗體陽轉率圖8 pcDNA3.1載體核酸疫苗誘導小鼠HBs抗體產生水平圖9 pcDNA3.1載體核酸疫苗誘導小鼠前S2抗體陽轉率圖10 pcDNA3.1載體核酸疫苗誘導小鼠前S2抗體水平圖11 pVAX1載體核酸疫苗誘導小鼠HBs抗體陽轉率圖12 pVAX1載體核酸疫苗誘導小鼠HBs抗體水平圖13 pVAX1載體核酸疫苗誘導小鼠前S2抗體陽轉率圖14 pVAX1載體核酸疫苗誘導小鼠前S2抗體水平圖15 體外CTL活性檢測圖16 HBsAg在C57BL/6小鼠肝組織中的表達40×10，DAB顯色，細胞漿內可見棕黃色弱陽性信號，提示HBsAg表達為胞漿型圖17 preS2Ag在C57BL/6小鼠肝組織中的表達40×10，DAB顯色，細胞漿內可見棕黃色陽性信號，提示HBsAg表達為胞漿型圖18 HBsAg陽性對照(人肝組織)40×10，DAB顯色，細胞漿內、膜上可見棕黃色強陽性信號，提示HBsAg表達為胞漿型、膜型圖19 preS2Ag陽性對照(人肝組織)40×10，DAB顯色，細胞漿內可見棕黃色陽性信號，提示preS2Ag表達為胞漿型圖20 C57BL/6小鼠陰性對照(肝組織)40×10，DAB顯色，細胞漿、核內及膜上均未見棕黃色陽性表達信號圖21 轉基因小鼠外周血抗-HBs陽轉率圖22 轉基因小鼠外周血抗-HBs水平圖23 轉基因小鼠接種後的血清HBV DNA變化
具體實施例方式實施例1、B肝病毒基因片段preS2S、preS2的擴增及連接1.HBV DNA模板的製備(1)標本來源慢性B肝病毒感染者混合血清，由四川大學華西醫院病毒性肝炎研究室提供。HBsAg(+)，抗HBc(+)，HBV DNA載量在105～109copies/mL之間。
(2)製備方法取上述血清200μl，加入含200μg/mL蛋白酶K的(臨用時加)TNES(10mmol/L Tris.Cl PH8.0，150mmol/L NaCl，25mmol/L EDTAPH8.0，1％SDS(W/V))混勻，孵育4小時；再加入等體積酚充分混勻，10000r/min離心10分鐘；取上清，加入等體積氯仿/異戊醇混勻，10000r/min離心10分鐘；棄上清，沉澱中加入200μl 70％醇洗滌，12000r/min離心5分鐘；去上清，沉澱晾乾，溶於30ul TE中。
2.preS2S、preS2基因的擴增(1)引物合成根據GenBank中已經報導的中國患者HBV感染主要型別(基因型B、C)基因序列設計通用引物，委託寶生物工程(大連)有限公司合成(PAGE純化)，用純水溶解稀釋為10μmol/L濃度，分裝貯存於-20℃。preS2S、preS2基因引物、帶linker片斷引物、片斷連接引物序列見下表。
表4 PCR擴增及連接引物PCR productsForward Backward LengthpreS2SPF1(KpnI) PB1(NotI) 866bppreS2S_ PF1(KpnI) PL1(融合負鏈) 891bp_preS2PL2(融合正鏈) PB2(NotI) 225bppreS2S-preS2PF1(KpnI) PB2(NotI) 1070bp
①preS2S的基因擴增取HBV模板5μl、dNTPmix200μmol/L、pyrobest polymerase0.5U/50μl及引物PF1、PB1進行PCR擴增。循環參數設置為預變性94℃5min；94℃45sec，55℃45sec，72℃45sec，循環35次；72℃延伸10min。反應結束後，取PCR產物於1％瓊脂糖凝膠上電泳，切膠回收分子量約為870bp的目的條帶(preS2S)，按Qiagen膠回收試劑盒說明書操作。最後用50μl純水洗脫備用。
②preS2S的基因擴增引物使用PF1、PL1，循環參數同上。PCR反應結束後，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化約890bp的目的條帶。見圖1。
③preS2的基因擴增引物使用PL2、PB2，循環參數採用預變性94℃3min；94℃15sec，58℃15sec，72℃20sec，循環35次；72℃延伸5min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化約220bp的目的條帶。見圖1。
3.preS2S與preS2基因的連接、擴增引物使用PF1、PB2，DNA模板使用「preS2S_」、「_preS2」，循環參數設置為94℃ 5min，55℃2min，72℃5min；94℃45sec，55℃45sec，72℃60sec，循環35次；72℃延伸10min。PCR反應結束後，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠分離回收分子量約1070bp的大分子目標條帶(preS2SpreS2，簡稱S2SS2)。見圖1。
實施例2、哺乳動物細胞表達載體核酸疫苗pcDNA3.1-S2SS2的構建1.目的基因片段S2SS2與載體pcDNA3.1/mychis/lacZ的雙酶切及連接KpnI、NotI雙酶切載體和DNA插入片段，37℃4h。將酶切產物在1％瓊脂糖凝膠上電泳，觀察載體是否酶切完全。分離純化酶切後的載體和DNA插入片段，取插入片段4μl、載體(1∶5～20稀釋)1μl混勻，加入等體積的sol I(Takara)，16℃保溫1h或連接過夜。
2.連接產物轉化感受態JM109及重組子篩選在連接反應的產物中，加入5mol/L NaCl至終濃度150mmol/L，再與新鮮製備的感受態菌JM109 60～80μl混勻，冰浴30min；37℃2min；立即冰浴2min。加入SOC培養基500μl混勻，37℃250rpm震搖1h。取200μl轉化菌液，塗布於LB/Amp抗性平板上(預先塗布X-gal/IPTG)，37℃培養過夜。
3.重組質粒的篩選從LB/Amp抗性平板中央挑取15個白色菌落，分別置於5mlLB(含Amp100μg/mL)液體培養基中，37℃250rpm震搖8～16h。小樣提取質粒，取1μl進行瓊脂糖凝膠電泳，以空載質粒為對照。如重組質粒分子量大於空載質粒，繼續用KpnI和NotI雙酶切鑑定。當酶切後的載體和插入片段分子量大小與預期值相符時，繼續測序分析。
經多克隆測序證實，得到了核酸疫苗哺乳動物細胞表達載體pcDNA3.1-S2SS2質粒。重組質粒pcDNA3.1-S2SS2的構建示意圖見圖2。以pcDNA3.1為載體的重組質粒的酶切圖譜見圖3。
實施例3、哺乳動物細胞表達載體核酸疫苗pCI-S2SS2的構建1.目的基因片段S2SS2與載體pCI的雙酶切及連接KpnI、NotI雙酶切pCI質粒載體和DNA插入片段，37℃4h。分離純化酶切後的載體和DNA插入片段，取插入片段4μl、載體(1∶5～20稀釋)1μl混勻，加入等體積的sol I(Takara)，16℃保溫1h或連接過夜。
2.連接產物轉化感受態JM109及重組子篩選在連接反應的產物中，加入5mol/L NaCl至終濃度150mmol/L，再與新鮮製備的感受態菌JM109 60～80μl混勻，冰浴30min；37℃2min；立即冰浴2min。加入SOC培養基500μl混勻，37℃250rpm震搖1h。取200μl轉化菌液，塗布於LB/Amp抗性平板上(預先塗布X-gal/IPTG)，37℃培養過夜。
3.重組質粒的篩選從LB/Amp抗性平板中央挑取15個白色菌落，分別置於5mlLB(含Amp100μg/mL)液體培養基中，37℃250rpm震搖8～16h。小樣提取質粒，取1μl進行瓊脂糖凝膠電泳，以空載質粒為對照。如重組質粒分子量大於空載質粒，繼續用KpnI和NotI雙酶切鑑定。當酶切後的載體和插入片段分子量大小與預期值相符時，繼續測序分析。
經多克隆測序證實，得到了核酸疫苗哺乳動物細胞表達載體pCI-S2SS2質粒。
實施例4、哺乳動物表達載體核酸疫苗pVAX1-S2SS2的構建1.目的基因片段S2SS2與載體pVAX1的雙酶切及連接Kpn I、Not I雙酶切pVAX1質粒載體和DNA插入片段，37℃4h。分離純化酶切後的載體和DNA插入片段，取插入片段4μl、載體(1∶5～20稀釋)1μl混勻，加入等體積的sol I(Takara)，16℃保溫1h或連接過夜。
2.連接產物轉化感受態JM109及重組子篩選在連接反應的產物中，加入5mol/L NaCl至終濃度150mmol/L，再與新鮮製備的感受態菌JM109 60～80μl混勻，冰浴30min；37℃2min；立即冰浴2min。加入SOC培養基500μl混勻，37℃250rpm震搖1h。取200μl轉化菌液，塗布於LB/Amp抗性平板上(預先塗布X-gal/IPTG)，37℃培養過夜。
3.重組質粒的篩選從LB/Amp抗性平板中央挑取15個白色菌落，分別置於5mlLB(含Amp100μg/mL)液體培養基中，37℃250rpm震搖8～16h。小樣提取質粒，取1μl進行瓊脂糖凝膠電泳，以空載質粒為對照。如重組質粒分子量大於空載質粒，繼續用Kpn I和Not I雙酶切鑑定。當酶切後的載體和插入片段分子量大小與預期值相符時，繼續測序分析。
經多克隆測序證實，得到了核酸疫苗哺乳動物細胞表達載體pVAX1-S2SS2質粒。
序列分析證實，pcDNA3.1-S2SS2、pCI-S2SS2、pVAX1-S2SS2三種表達載體的S2SS2序列完全一致。其片段長度為1053bp，根據S基因序列確定為基因型C、血清亞型adrq+。其中preS2S基因843bp，無終止密碼子；下遊preS2基因165bp，無起始密碼子ATG引入終止密碼子TAA；中間linker為[(GGT)4(TCT)1]3組成，編碼的preS2抗原133-141aa均為DPRVRGLYL，S抗原28-39aa為IPQSLDSWWTSL(見圖4-5)。
所有插入片段的起始密碼子ATG上遊均為ACC，符合哺乳動物細胞表達載體Kozak序列的要求，插入片段末端均加有終止密碼子。實施例5、pcDNA3.1-S2SS2、pCI-S2SS2、pVAX1-S2SS2細胞轉染及表達檢測1.SP2/0細胞的傳代培養及G418最低完全致死量測定SP2/0細胞來源於BALB/c小鼠骨髓瘤細胞系，培養液為RPMI1640完全培養基。臨用前加入20％FBS、L-穀氨醯胺2mmol/L、青黴素200u/mL、鏈黴素200u/mL、HEPES 25mmol/L、0.15％NaHCO3，調節pH至7.4。培養條件為37℃，5％CO2，95％相對溼度。每3-5d傳代1次。
經採用MTT分析法，得出SP2/0細胞的G418最低完全致死量為400μg/mL。
2.重組質粒轉染SP2/0細胞採用磷酸鈣法，將重組質粒pcDNA3.1-S2SS2、pCI-S2SS2、pVAX1-S2SS2及空載體穩定轉染SP2/0細胞。pCI和pVAX1載體需和pSV2-neo質粒共轉染。
轉染細胞經含G418抗性培養基持續作用約2周後，存活細胞採用有限稀釋法，分離出單克隆細胞並繼續培養並鑑定。
3.RT-PCR檢測目的基因轉錄的mRNA轉染細胞用PBS洗滌後，加入1ml Trizol混勻並靜置5min。加入等體積氯仿混勻，室溫放置2～3min；4℃12000g離心15min後取上清，加入等體積異丙醇混勻，室溫靜置10min；4℃12000g離心10min，沉澱用75％乙醇洗滌後晾乾，加入DEPC處理水20μl溶解。此為轉染細胞的總RNA，採用特異性的引物，通過RT-PCR擴增目的基因片段S2SS2，PCR產物電泳觀察有無目的條帶出現。
結果3種不同載體重組質粒轉染SP2/0細胞，得到的克隆細胞株提取總RNA，RT-PCR分別擴增出與S2SS2分子量相符的DNA條帶，而空載質粒轉染細胞則為陰性。
4.ELISA檢測HBsAg表達經RT-PCR證實存在目的基因轉錄的細胞株，收集細胞並加入適量的細胞裂解液，用20gauge注射器針頭反覆抽打至無粘液絲出現，冰上放置10min；4℃12000g離心10min。取上清，採用HBsAg的ELISA檢測試劑盒，檢測單克隆細胞株是否表達目的抗原蛋白。
結果提示3種不同載體重組質粒轉染SP2/0細胞均獲得了S2SS2檢測陽性細胞株。
5.Western blot檢測取ELISA檢測結果陽性的細胞株裂解蛋白，進行SDS-PAGE電泳，以空載質粒轉染細胞為陰性對照，以B肝攜帶者血清(HBsAg陽性)為陽性對照。電泳結束後，將凝膠蛋白質電轉移至PVDF膜，室溫封閉1h。加入相應的I抗(HBs單抗1∶200；前S2單抗1∶100)，4℃過夜。經洗膜後再加入II抗(羊抗鼠IgG-AP，1∶1000)，室溫3h；最後用NBT/BCIP顯色。
結果ELISA檢測HBsAg陽性株，經Western blot鑑定，表達的S2SS2蛋白呈約43KD大小條帶，分子量與預期相符(S2SS2連接部分約3KD，見圖6)實施例6、核酸疫苗pcDNA3.1-S2SS2、pCI-S2SS2、pVAX1-S2SS2的大量製備方法將重組質粒及空載質粒轉化感受態JM109，塗布LB平板(Amp或Kan抗性)孵育過夜；挑取單一菌落大量擴增，應用Qiagen MegaEndofree純化系統，按說明書操作獲得高純度的質粒超螺旋部分不少於2/3，無RNA及蛋白質殘留，無內毒素汙染。經雙酶切鑑定、紫外分光光度計定量後，無菌生理鹽水稀釋成1ug/ul，即為B肝核酸疫苗。分裝後置-80℃冰箱保存。
序列表110成都地奧 集團藥物研究所120一種新型預防和治療B肝病毒感染的核酸疫備及製備方法130說明書、權利要求書1607170PatentIn version 3.1210121136212DNA213引物PF14001gcgggtacca tgcagtggaa ctccacaaca ttccac 36210221157212DNA213引物PL14002accagaacca ccaccaccag aaccaccacc accaatgtat acccaaagac aaaagaa 57210321160212DNA213引物PL24003ggttctggtg gtggtggttc tggtggtggt ggttctcagt ggaactccac aacattccac60210421139
212DNA213引物PB24004atagcggccg cttagttcgg tgcagggtcc ccagtcctc39210521138212DNA213引物PB14005ggggcggccg cttaaatgta tacccaaaga caaaagaa 3821062111053212DNA213S2SS2鹼基序列4006atgcagtgga actccacaac attccaccaa gctctgctag atcccagagt gaggggccta 60tatcttcctg ctggtggctc cagttccgga acagtaaacc ctgttccgac tactgcctct120cccatatcat caatcttctc gaggactggg gaccctgcac cgaacatgga gaacacaaca180tcaggattcc taggacccct gctcgtgtta caggcggggt ttttcttgtt gacaagaatc240ctcacaatac cacagagtct agactcgtgg tggacttctc tcaattttct agggggagca300cccacgtgtc ctggccaaaa ttcgcagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcttgt360cctccaactt gtcctggcta tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat attcctcttc420atcctgctgc tatgcctcat cttcttgttg gttcttctgg actaccaagg tatgttgccc480gtttgtcctc tacttccaga aacttcaact accagcacgg gaccatgcaa gacctgcacg540attcctgctc aaggaacctc tatgtttccc tcttgttgct gtacaaaacc ttcggacgga600
aactgcactt gtattcccat cccatcatcc tgggctttcg caagattcct atgggagtgg 660gcctcagtcc gtttctcctg gctcagttta ctagtgccat ttgttcagtg gttcgtaggg 720ctttccccca ctgtttggct ttcagttata tggatgatgt ggtattgggg gccaagtctg 780tacaacatct tgagtccctt tttaccgcta ttaccaattt tcttttgtct ttgggtatac 840attggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctggtggtg gtggttctca gtggaactcc 900acaacattcc accaagctct gctagatccc agagtgaggg gcctatatct tcctgctggt 960ggctccagtt ccggaacagt aaaccctgtt ccgactactg cctctcccat atcatcaatc 1020ttctcgagga ctggggaccc tgcaccgaac taa 10532107211350212PRT213S2SS2編碼胺基酸序列4007Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg1 5 10 15Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val20 25 30Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg35 40 45Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu50 55 60
Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile65 70 75 80Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe85 90 95Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr100 105 110Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg115 120 125Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu130 135 140Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro145 150 155 160Val Cys Pro Leu Leu Pro Glu Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys165 170 175Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys180 185 190Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro195 200 205Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg210 215 220Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly
225 230 235 240Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp245 250 255Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro260 265 270Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly275 280 285Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His290 295 300Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly305 310 315 320Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro325 330 335Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn340 345 350
權利要求
1.一種B肝病毒基因片段組合核酸疫苗，其特徵在於該疫苗是將B肝病毒基因片段組合與非複製型哺乳動物細胞高效表達載體連接後獲得。
2.根據權利要求1所述的疫苗，其特徵在於其中所述的B肝病毒基因片段組合為PreS2S+linker+preS2，分子量為43KD。
3.根據權利要求1所述的疫苗，其特徵在於其中所述的B肝病毒基因來自於中國HBV感染者血清，其基因型為B或C型。
4.根據權利要求1所述的疫苗，其特徵在於其中所述的非複製型哺乳動物細胞高效表達載體為pcDNA系列、pRc/CMV、pCI或pVAX1。
5.根據權利要求2所述的疫苗，其特徵在於其中所述的linker片段基因序列為[(GGT)4TCT1]n，n＝2～4。
6.根據權利要求1或2所述的疫苗，其特徵在於其中所述的B肝病毒基因片段組合具有下述基因序列atgcagtgga actccacaac attccaccaa gctctgctag atcccagagt gaggggccta 60tatcttcctg ctggtggctc cagttccgga acagtaaacc ctgttccgac tactgcctct120cccatatcat caatcttctc gaggactggg gaccctgcac cgaacatgga gaacacaaca180tcaggattcc taggacccct gctcgtgtta caggcggggt ttttcttgtt gacaagaatc240ctcacaatac cacagagtct agactcgtgg tggacttctc tcaattttct agggggagca300cccacgtgtc ctggccaaaa ttcgcagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcttgt360cctccaactt gtcctggcta tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat attcctcttc420atcctgctgc tatgcctcat cttcttgttg gttcttctgg actaccaagg tatgttgccc480gtttgtcctc tacttccaga aacttcaact accagcacgg gaccatgcaa gacctgcacg540attcctgctc aaggaacctc tatgtttccc tcttgttgct gtacaaaacc ttcggacgga600aactgcactt gtattcccat cccatcatcc tgggctttcg caagattcct atgggagtgg660gcctcagtcc gtttctcctg gctcagttta ctagtgccat ttgttcagtg gttcgtaggg720ctttccccca ctgtttggct ttcagttata tggatgatgt ggtattgggg gccaagtctg780tacaacatct tgagtccctt tttaccgcta ttaccaattt tcttttgtct ttgggtatac840attggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctggtggtg gtggttctca gtggaactcc 900acaacattcc accaagctct gctagatccc agagtgaggg gcctatatct tcctgctggt 960ggctccagtt ccggaacagt aaaccctgtt ccgactactg cctctcccat atcatcaatc1020ttctcgagga ctggggaccc tgcaccgaac taa 1053胺基酸序列為Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg1 5 10 15Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val20 25 30Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg35 40 45Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu50 55 60Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile65 70 75 80Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe85 90 95Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr100 105 110Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg115 120 125Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu130 135 140Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro145 150 155 160Val Cys Pro Leu Leu Pro Glu Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys165 170 175Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys180 185 190Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro195 200 205Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg210 215 220Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly225 230 235 240Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp245 250 255Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro260 265 270Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly275 280 285Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His290 295 300Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly305 310 315 320Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro325 330 335Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn340 345 350
7.據權利要求1所述的疫苗的製備方法，其特徵在於該方法包括(1)HBVDNA模板製備取中國HBV慢性感染患者混合血清，以PF1、PL1為preS2/S基因擴增引物，以PL2、PB2為preS2引物，分別擴增preS2/S片段及preS2片段，經凝膠回收純化的preS2/S片段與preS2片段採用PCR方法進行連接和擴增，引物為PF1和PB2，得到全長preS2/SpreS2基因片段；preS2/SpreS2基因片段經凝膠回收、純化；(2)將步驟(1)獲得的基因片段連接到非複製型哺乳動物細胞高效表達載體中，將其大量擴增純化，即得。
8.據權利要求7所述的疫苗的製備方法，其特徵在於其中所述的引物PF1的序列為5′-GCGggTACCATG CAG TGG AAC TCC ACA ACA TTC CAC-3′
9.據權利要求7所述的疫苗的製備方法，其特徵在於其中所述的引物PL1的序列為5′-ACCAgAACCACCACCACCAgAACCACCACCACC AAT gTA TAC CCA AAg ACAAAA gAA-3′
10.據權利要求7所述的疫苗的製備方法，其特徵在於其中所述的引物PL2的序列為5′-GGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCT CAG TGG AAC TCC ACAACA TTC CAC-3′
11.據權利要求7所述的疫苗的製備方法，其特徵在於其中所述的引物PB2的序列為5′-ATAGCGGCCGCTTA GTT CGG TGC AGG GTC CCC AGT CCT C-3′
12.根據權利要求1所述的疫苗在製備預防和治療人或哺乳動物B肝病毒感染疫苗中的應用。
13.根據權利要求12所述的疫苗的應用，其特徵在於其中所述B肝病毒感染的預防適用於經檢測未受HBV感染群體或經常規HBV疫苗注射後無免疫應答的個體。
14.根據權利要求12所述的疫苗的應用，其特徵在於其中所述B肝病毒感染的治療適用於HBV持續感染者，包括HBV攜帶者、各種慢性B肝患者、B肝肝硬化及B肝後肝癌而HBV DNA複製活躍者、HBV DNA呈整合狀態者等。
15.根據權利要求12所述的疫苗的應用，其特徵在於其中所述的疫苗為生理上可以接受的液體製劑、乳液製劑、凍幹製劑等。
16.根據權利要求12所述的疫苗的應用，其特徵在於其中所述的疫苗經皮下、肌肉、靜脈、腹腔內注射或口服、金或鎢顆粒包被基因槍轟入等途徑給藥。
全文摘要
本發明涉及一種新型B肝病毒基因片段組合核酸疫苗。該疫苗是一種B型肝炎病毒非天然新型基因片段組合pre S
文檔編號A61P31/00GK1552446SQ0312903
公開日2004年12月8日 申請日期2003年6月4日 優先權日2003年6月4日
發明者陳守春, 周陶友, 李伯剛, 劉忠榮, 王若竹, 及元喬, 閻娟, 陳毅榮 申請人:成都地奧集團藥物研究所