暗紋東方魨B淋巴細胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重組應用的製作方法

2023-07-24 17:40:41

專利名稱：暗紋東方魨B淋巴細胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重組應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因組學、生物信息學、基因操作、蛋白質和細胞領域，具體涉及暗紋 東方飩B淋巴細胞刺激因子cDNA及其克隆、表達和鑑定技術。
背景技術：
人B淋巴細胞刺激因子(hTALL-Ι)是1999年新發現的一種與人體免疫調控密切相 關的腫瘤壞死因子家族成員，主要在外周血單核細胞、脾臟、淋巴結和骨髓中表達。hTALL-1 具有很強的B細胞趨化性，體外它作為B細胞增殖和分化的共刺激因子，能誘導活化的B 細胞分泌大量的IgG、IgA、IgM等，對於休眠B細胞，hTALL-Ι雖不能獨立激活使之進入細 胞周期循環，但通過上調細胞表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、BcI-Xl的表達，延長休眠B細胞的 壽命。體內它可以促進脾臟內Tl-B細胞向T2-B細胞以及成熟B細胞的發育。hTALL-Ι的 正常表達是GC形成、抗體親和力成熟、記憶性B細胞形成及B細胞正常發育的必須條件。 TALL-I-/-小鼠的次級淋巴器官囊外及過渡區B細胞完全缺失。hTALL-Ι刺激B細胞增殖、 分化並分泌抗體，成熟的B細胞及其產生的抗體構成了機體抵禦感染和抑制腫瘤滋生的關 鍵組分。由於hTALL-Ι的免疫增強特異活性，自從被發現以來就顯示了巨大的臨床應用前 景。2000年11月，美國FDA已正式批准重組人hTALL-Ι進入人體臨床試驗，用於治療普通 變異免疫缺乏症(CVID)患者。根據GenBank、EMBL和DDBJ國際三大主要核酸序列資料庫搜索結果得知，目 前只有人、鼠、雞、鴨、斑馬魚等的TALL-I cDNA已被克隆，並分別已在GenBank資料庫中申 請了序列號，序列號分別是 AF116456、AF119383、AF506010、DQ445092 及 FJ587513。暗紋 東方飩B淋巴細胞刺激因子(fTALL-1) cDNA還未被克隆出來，關於暗紋東方飩TALL-I基因 的研究在整個國內外還處於完全空白狀態。暗紋東方飩是十分重要的魚類，由於B淋巴細 胞刺激因子(TALL-I)具有較強的免疫增強能力，基因工程暗紋東方飩TALL-I蛋白有可能 開發成一種能增強魚類免疫能力的生物製劑，用於體質弱、免疫功能低下的魚，增加河飩類 抗病能力。近年來，隨著對細胞因子研究的不斷深入和分子生物學技術的發展，魚類細胞 因子得以克隆及重組表達，許多細胞因子基因工程藥物面市，給治療魚類疾病提供了新的 手段，同時創造了巨大的經濟和社會效益，因此，重組河飩魚TALL-I蛋白具有潛在的巨大 市場應用價值。同時，B淋巴細胞刺激因子(TALL-I)是新發現的免疫系統重要調控因子，對 暗紋東方飩TALL-I的研究有助於探索魚類的免疫調控機制，推動其免疫系統研究的發展。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種從暗紋東方飩提取的B淋巴細胞刺激因子 cDNA,並提供暗紋東方飩B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法及重組技術。本發明從暗紋東方飩中克隆到B淋巴細胞刺激因子cDNA，它具有SEQ ID NO. 1所 示的序列。
本發明的暗紋東方飩B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法如下
(1)根據暗紋東方飩基因組B淋巴細胞刺激因子的序列設計引物
正義寡核苷酸引物 fTALL-11 :5，- ATGGGACCAGTGAGGGTAGGTTT-3，(SEQ ID NO. 3) 反義寡核苷酸引物 fTALL-12 :5』 - TTAACCCAGTTTGATAGCACCCA-3，(SEQ ID NO. 4 )
(2)從暗紋東方飩脾臟提取總RNA；
(3)通過RT-PCR方法，以上述引物fTALL-11及fTALL-12為特異性引物，擴增出一段 cDNA序列，克隆入pMD19-T載體，並對其鹼基序列進行測定，
上述暗紋東方飩B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法具體操作如下 (1)根據暗紋東方飩基因組B淋巴細胞刺激因子全長⑶S兩端設計的正義寡核苷酸引 物 fTALL-11 (5，- ATGGGACCAGTGAGGGTAGGTTT-3，)與反義寡核苷酸引物 fTALL-12 (5，-TTAACCCAGTTTGATAGCACCCA-3，)。(2)應用組織RNA提取試劑盒(天根生物公司)，按照操作手冊，提取出暗紋東方飩 脾臟細胞的總RNA，
(3)應用兩步RT-PCR方法，以上述fTALL-11及fTALL-12為特異性引物，擴增出全長 cDNA序列，全長為789bp，克隆入pMD19_T載體，並對其鹼基序列進行測定。第一步逆轉錄的 反應條件為以總RNA為模板，在25 μ 1反應體系中，加入5 XM-MLV反應緩衝液5 μ 1、IOmM dNTP 混合物 1· 5μ 1、RNase inhibitor (HRPl) 1 μ l、M_MLV(RNase F)逆轉錄酶(Takara 公司)lyl、01igo (dT) 18 primer Ιμ 、及 RNA 模板 3 μ 1，補水至 25 μ 1，42°C 保溫 lh。 第二步進行用兩個特異性弓I物進行30個PCR循環(940C變性30s，56 V退火30s，72°C延伸 lmin)，最後於72°C延伸7 min。RT-PCR產物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離後，用膠回收試劑 盒回收約789bp的DNA條帶，克隆入pMD19-T載體，挑取8個陽性克隆進行鹼基序列測定。將所得序列與GenBank資料庫序列進行相似性搜索，發現與已知的虹鱒魚、斑馬 魚TALL-I序列相似率分別是68. 2%,56. 14%、，可以確定該序列是暗紋東方飩B淋巴細胞刺 激因子(fTALL-Ι)的全長cDNA，其開放閱讀框如SEQ ID NO. 1所示。對該基因的進一步研究表明該基因主要表達在暗紋東方飩免疫器官中，包括脾 髒及腎臟。該基因的重組融合蛋白具有fTALL-Ι的高活性功能；該基因編碼的蛋白對暗紋 東方飩B淋巴細胞具有明顯的促存活/增殖效應；對鼠的B淋巴細胞都具有促存活/增 殖的生物學功能；充分表明本發明克隆得到的基因就是暗紋東方飩B淋巴細胞刺激因子 (fTALL-Ι)的 cDNAo上述暗紋東方飩B淋巴細胞刺激因子(fTALL-Ι)的cDNA的重組應用，通過現有基 因工程方法，生產重組fTALL-Ι，作為河飩魚免疫增強劑。所說的暗紋東方飩B淋巴細胞刺激因子cDNA通過現有基因工程和細胞工程方法， 轉入河飩魚體內，增加其免疫力，在飼養中應用。


圖1是暗紋東方飩TALL-I全長cDNA鹼基序列及推測編碼胺基酸序列。圖2是暗紋東方飩TALL-I與綠河飩、斑鱒魚、虹鱒魚、斑馬魚TALL-I全長胺基酸 序列同源性比較圖。其中波浪線代表furin酶切位點；虛線代表跨膜區；雙線代表flap環； 粗橫線代表保守區域；深色陰影代表保守的三個半胱氨酸。
圖3是暗紋東方飩TALL-I胞外區結構模型。深灰色代表β摺疊，白色代表其他 胺基酸殘基。a和b代表暗紋東方飩的卡通模型和球體模型結構。c和d代表人的卡通模 型和球體模型結構。圖4是暗紋東方飩TALL-I mRNA在各組織中的表達水平分析圖。GAPDH作為內參。圖5是融合蛋白His-fsTALL-Ι在BL21 (DE3)中的誘導表達，Ni+柱純化的 SDS-PAGE鑑定及鼠抗His6-tag的western-blotting鑑定結果，圖中泳道1是未經 IPTG誘導的全菌，泳道2是經IPTG誘導4. 5小時後的全菌蛋白，泳道3是經Ni+柱純化 後目的蛋白，泳道4是經sumo蛋白酶切後的目的蛋白，泳道5是鼠抗His6-tag單抗的 western-blotting 鑑定結果。圖6是本發明克隆的基因對暗紋東方飩B淋巴細胞的促存活作用結果示意圖。說 明不同濃度的sumo-fsTALL-Ι作用暗紋東方飩B淋巴細胞48小時後，對暗紋東方飩B淋巴 細胞可見顯著的促存活作用，且呈劑量依賴效應。
具體實施例方式在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常 理解的含義。下面結合具體的製備實施例和應用實施例，並參照數據進一步詳細地描述本發 明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的範圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。 所用到的引物，均在首次出現時標明，其後所用相同引物，均以首次標明的內容相同。實施例1
暗紋東方飩(Takifugu obscures )，人工飼養。(1)引物設計以綠河飩的TALL-I序列為種子序列在紅鰭東方飩的基因組數 據庫中找出B淋巴細胞刺激因子全長cDNA序列。將綠河飩和紅鰭東方飩的序列比對 精心選取出兩段高保守區域用來設計同源克隆的正義寡核苷酸引物fTALL-11 (5』 -ATGGGACCAGTGAGGGTAGGTTT-3，，如 SEQ ID NO. 3 所示)與反義寡核苷酸引物 fTALL-12 (5，-TTAACCCAGTTTGATAGCACCCA-3，如 SEQ ID NO. 4 所示)。(2)提取總RNA 應用RNA抽提試劑盒(天根公司)按照其操作手冊提取出約0. 5 克暗紋東方飩脾臟細胞的總RNA，並通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑑定其質量和純度，紫外 分光光度計測定其濃度。(3)應用RT-PCR方法，以上述fTALL-11及fTALL-12為特異性引物，擴增出 fTALL-1 cDNA的一段序列，全長為789bp，克隆入pMD19_T載體，並對其鹼基序列進行測定。 第一步逆轉錄的反應條件為以總RNA為模板，在25 μ 1反應體系中，加入5 XM-MLV反應緩 衝液5 μ l、10mM dNTP混合物 1· 5μ 1、RNase inhibitor (HRPl) 1 μ l、M_MLV(RNase『)逆 轉錄酶(Takara 公司)1μ l、01igo (dT)18 primer Ιμ 、及 RNA 模板 3「1，補水至25口1， 42°C保溫lh。第二步進行用兩個特異性引物進行30個PCR循環(94°C變性30s，56°C退火 30s，72°C延伸lmin)，最後於72°C延伸7 min。RT-PCR產物用的瓊脂糖凝膠電泳分離 後，用膠回收試劑盒回收約789bp的DNA條帶，克隆入pMD19-T載體，經含Amp抗生素(50mg/
5ml)的瓊脂糖平板篩選轉化子，挑取出8個陽性克隆送往上海英駿測序公司進行鹼基序列 測定，得到如圖1所示的fTALL-Ι全長cDNA鹼基序列及推測編碼胺基酸序列。(6)同源檢索將所得序列向http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/提交克隆得 到的cDNA序列在GenBank、EMBL和DDBJ國際三大主要核酸序列資料庫進行相似性搜索及 同源性分析，如圖3所示，發現與已知的虹鱒魚(ABC84582)、斑鱒魚(NP_001135232)、綠河 M (ENSTNIP00000016931)TALL-I胺基酸序列相似性分別是98%、92%、55%、44%，可以確定該 序列是暗紋東方飩B淋巴細胞刺激因子(gTALL-Ι)的全長cDNA。並且其開放閱讀框具有 SEQ ID NO. 1序列，碥碼的蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。實施例2
fTALL-Ι基因在各組織的表達水平分析
採用實施例1中的提取RNA的方法，分別提取了暗紋東方飩肝(liver)、腎(kidney)、 脾(sp 1 een)、心(heat)、鰓(gi 11)、腸(intestine )的總 RNA，運用定量 RT-PCR 法對 fTALL-I 基因在各組織的表達水平進行了研究，結果如圖4所示，fTALL-Ι基因主要表達在暗紋東 方飩類免疫器官中，包括脾臟及腎臟。試驗中暗紋東方飩GAPDH作為內參，採用的引物為 RT-Gl (5，- CACCTCCAAGAAGGTGGAAA-3，，SEQ ID NO. 5)和 RT-G2 (5，-CTCTCGTGGAAAACGGTGAT-3，，SEQ ID NO. 6)。RT-PCR 體系如實施例 1。可溶性fTALL-Ι重組載體的構建及其在大腸桿菌中的誘導表達
以實施例1得到的fTALL-Ι全長cDNA為模板，設計引物SPl (5，-TTTGGCCGGGACAGACACGTT-3，(Stu / )，SEQ ID N0. 7)及 SP2 (5，- ACTGAGGGATCCTCAGA AGAGTCTGACGGCACCA -3，QiindIII), SEQ ID N0. 8)擴增出 fTALL-l cDNA 胞外可溶區段 (fsTALL-Ι)，引物分別引入酶切位點份 I RHindIII,亞克隆入pSUMO載體，構建成重組載 體pSUMO-fsTALL-Ι。將此重組載體轉入大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)，胞漿內可高可溶性 表達出目的蛋白sumo-fsTALL-Ι，此融合蛋白經促存活與增殖試驗(圖6，7)，活性檢測證實 具有fsTALL-Ι的高活性功能。重組目的蛋白的的Ni+親和純化
IPTG誘導含有重組載體pSUMO-fsTALL-Ι的大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3) 4. 5小時 後，4°C收菌，冰上超聲破碎(工作10s，暫停10s，共99次)表達菌體，40C，13,000 X g，20min 離心超聲破碎液後，棄沉澱，留上清過Ni+-NTA柱。簡要過程是3體積Binding Buffer 平衡Ni+-NTA柱後，手動上樣含可溶性重組蛋白的上清，6體積Wash Buffer (50mM咪唑， 0.5M NaCl,20mM Tris-HCl pH8. 0)洗去未結合上Ni+-NTA柱的雜蛋白，最後6體積Elute Buffer(lM 咪唑，0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl ρΗ8· 0)洗脫目的蛋白，20mM Tris (ρΗ8· 0)透 析除鹽，以SGS-PAGE檢測蛋白純度，如圖5 (泳道3)所示，表達得到的目的蛋白經Ni+柱親 和純化得到純度達95%的活性目的蛋白。western 印跡分析
Western-blot中所用一抗為羊抗His6單抗，二抗為辣根過氧化酶標記的鼠抗羊IgG。 其簡要步驟是將誘導的產物先行SGS-PAGE，然後以浸入式法將蛋白電轉移至硝酸纖維素 膜(NC膜)上，用記號筆標記蛋白marker各條帶，然而依次經5%脫脂奶粉室溫封閉lh，與 一抗孵育lh，與HRP標記的二抗IgG孵育lh，每步完成後均嚴格洗膜，最後化學顯影。結果 如圖5所示在目的蛋白位置出現了特異性條帶。
fTALL-I對鼠B淋巴細胞促存活作用實驗
採用淋巴細胞分離液常規無菌分離小鼠B淋巴細胞(約98%為B淋巴細胞)，用 RPMI1640調節細胞密度至5 X IO7個/mL.將B細胞懸液加入96孔培養板，每孔100 μ 1。向 每孔內加入不同濃度的sumo-fsTALL-1, 37°C，5% CO2培養48h後每孔加入10 μ 1 5mg/mL MTT, 37°C，5% CO2繼續培養4h，加入100 μ 1 DMSO(二甲基亞碸)溶解沉澱物，37°C過 夜，測定各孔OD57tl值.實驗設三復孔，取其平均值，並計算標準誤差。在體外通過MTT細 胞毒試驗檢測fTALL-Ι對小鼠B淋巴細胞的促存活作用，如圖6所示，結果表明本發明克隆 得到的fTALL-1對小鼠B淋巴細胞具有明顯的促存活效應，與鴨、雞、人、鼠TALL-I的生物 學功能相同，且呈現劑量依賴效應，即當sumo-fsTALL-Ι為12Pg/ml時fTALL-Ι的促增殖作 用最強。實施例3:
將實施例1獲得的暗紋東方飩B淋巴細胞刺激因子cDNA通過現有基因工程方法，生產 重組fTALL-1，作為暗紋東方飩類免疫增強劑。實施例4
將實施例1獲得的暗紋東方飩B淋巴細胞刺激因子cDNA通過現有基因工程方法，轉入 暗紋東方飩體內，增加其免疫力，在飼養中應用。按照本發明的方法可以通過現有基因工程技術，修飾暗紋東方飩B淋巴細胞刺激 因子基因並用於所述研究和生產。
權利要求
1.暗紋東方飩B淋巴細胞刺激因子CDNA，其特徵在於，它的序列如SEQID NO. 1所示。
2.—種權利要求1所述的暗紋東方飩B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法如下(1)根據B淋巴細胞刺激因子的保守序列設計引物正義寡核苷酸引物 fBAFFl :5』 -ATGGGACCAGTGAGGGTAGGTTT-3』 反義寡核苷酸引物 fBAFF2 :5』 -TTAACCCAGTTTGATAGCACCCA-3』(2)從暗紋東方飩脾臟提取總RNA，(3)通過RT-PCR方法，以上述引物fBAFFl及fBAFF2為特異性引物，擴增出一段cDNA 序列，克隆入PMD19-T載體，挑取陽性克隆進行鹼基序列測定。
3.一種權利要求1所述的暗紋東方飩B淋巴細胞刺激因子cDNA的重組應用，是通過現 有基因工程方法，生產重組暗紋東方飩B淋巴細胞刺激因子，作為魚類免疫增強劑。
4.暗紋東方飩B淋巴細胞刺激因子，其特徵在於，具有SEQID N0.2所示的序列。
全文摘要
本發明涉及暗紋東方魨B淋巴細胞刺激因子(fuguTALL-1)cDNA及其克隆方法和重組應用,屬於生物基因工程領域。暗紋東方魨B淋巴細胞刺激因子的基因具有SEQIDNO.1所示的序列。其克隆方法如下根據B淋巴細胞刺激因子的保守序列設計引物；從暗紋東方魨脾臟提取總RNA；通過兩步RT-PCR方法，擴增出全長cDNA序列，克隆入pMD19-T載體，挑取陽性克隆進行測序。所述暗紋東方魨B淋巴細胞刺激因子的cDNA可通過現有基因工程方法，生產重組fuguTALL-1，作為河魨魚免疫增強劑。
文檔編號A61P37/04GK102121010SQ201010598068
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月21日 優先權日2010年12月21日
發明者張雙全, 艾洪新 申請人:南京師範大學