新型葡萄糖酸脫水酶的製作方法

2024-03-01 07:17:15 1

專利名稱：新型葡萄糖酸脫水酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種能有效地從醛糖酸生成2-酮-3-脫氧醛糖酸的新型葡萄糖酸脫水酶以及決定該葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼的鹼基序列，含有這些鹼基序列的質粒以及通過質粒轉化後的轉換細胞。進一步說，本發明涉及一種使用該葡萄糖酸脫水酶或該轉換細胞的2-酮-3-脫氧醛糖酸和減少1個碳原子數的2-脫氧醛糖酸或2-脫氧醛糖的製造方法。
背景技術：
作為藥品原料2-酮-3-脫氧醛糖酸類是有用的化合物。例如，通過脫羧可獲得碳原子數減少1個的2-脫氧醛糖酸類或2-脫氧醛糖類。這些作為抗生素、抗病毒藥、反義藥物(antisense)等的原料等被關注。
另一方面，已知催化醛糖酸類脫水生成2-酮-3-脫氧醛糖酸類反應的酶的存在。例如，D-葡萄糖酸脫水合成2-酮-3脫氧-D-葡萄糖酸的酶，作為葡萄糖酸脫水酶(EC4.2.1.39)的起源，已知巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurian)(參照Analytical Biochemistry，(1974)，61，275)產鹼菌屬(Alcaligenes sp.)M250菌株(參照Methods in Enzymology，(1975)，41，99)，部分硫葉菌(Sulfolobus solfataricus)(參照Biotechnol.Lett.，(1986)，8，497)等。但是，巴氏芽孢梭菌由來的葡萄糖酸脫水酶被報導了容易受空氣氧化，在空氣存在下迅速失活的特性。另外，產鹼菌屬M250菌株由來的萄萄糖酸脫水酶是熱穩定性很低的酶，報導了在含有1mM D-葡萄糖酸鈉和1mM氯化鎂的三(羥甲基)氨基甲烷(以下簡記為tris)緩衝液(pH8.0～8.8)中，0℃、保存7天，萄萄糖酸脫水活性下降50％。因此，這些微生物菌種或該微生物菌種由來的酶在培養和反應的操作中反應性下降等，使用困難，很難適用於工業製造。另外，關於部分硫葉菌，它的萄萄糖酸脫水酶沒有進行過酶的精製，對它的物理化學性質不十分清楚。使用該微生物菌株的2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸合成中，由於混雜分解生成物2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸的活性，存在收率低的問題。
如上所述，還沒有發現在工業上有實用價值的萄萄糖酸脫水酶，也還沒有確立有良好效率的2-酮-3-脫氧醛糖酸類的工業製法。

發明內容
本發明的課題涉及作為藥品原料有使用價值的2-酮-3-脫氧醛糖酸類，提供具有工業實用性的熱穩定性和保存穩定性、能有效地生成由醛糖酸相對應的2-酮-3-脫氧醛糖酸的新型葡萄糖酸脫水酶，以及使用這種酶的2-酮-3-脫氧醛糖酸的製造方法。
本發明的另一目的是提供在葡萄糖酸脫水酶的生產以及使用葡萄糖酸脫水酶的2-酮-3-脫氧醛糖酸的製造中，決定作為有用材料的葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼的鹼基序列、引入這些鹼基序列的質粒以及用該質粒使宿主細胞進行轉化得到的轉換細胞。
針對這個課題進行了尖銳討論的結果，發現木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株具有高的葡萄糖酸脫水活性。
上述現有技術的產鹼菌屬M250菌株在其文獻中有同ATCC9220菌株是同種的記載，相對於產鹼菌屬M250菌株由來的葡萄糖酸脫水酶正如上述所述的不穩定的報導，本發明者們發現將木糖氧化無色桿菌ATCC9220菌體在D-葡萄糖酸中發生作用，反應溫度即使在50℃也能保持穩定的活性，能有效地生成2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸。
在這裡，利用各種精製技術分離由該菌體由來的葡萄糖酸脫水酶，發現該葡萄糖酸脫水酶在55℃保持2小時的情況下，是維持95％或其以上活性的耐熱性酶。
進一步，相對於上述產鹼菌屬M250菌株由來的葡萄糖酸脫水酶在含有1mM D-葡萄糖酸鈉和1mM氯化鎂的tris緩衝液(pH8.0～8.8)中，0℃、保存7天，萄萄糖酸脫水活性下降50％的報導，本發明的葡萄糖酸脫水酶在同樣條件下，保持1個月穩定的活性，是保存穩定性相當優秀的酶。
另外，從上述現有技術的產鹼菌屬M250菌株精製的葡萄糖酸脫水酶的凝膠過濾層析柱的分子量有270,000±2,500的記載，但本發明的葡萄糖酸脫水酶的凝膠過濾層析柱的分子量是188,000±2,500，發現了在分子量上的不同。
進一步，成功地決定了如序列表中序列編號1所示的該萄萄糖酸脫水酶的胺基酸序列。
進一步，本發明者們由於獲得了具有如序列表中序列編號1所示的鹼基序列的DNA，通過將含有帶有這些鹼基序列的DNA片斷的質粒獲得了轉換細胞，產生作為活性型的上述萄萄糖酸脫水酶，進一步通過使該轉換細胞或該轉換細胞處理物在醛糖酸中發生作用，成功高效地製造出相應的2-酮-3-脫氧醛糖酸，從而完成本發明。
即、本發明含有以下各形態。
葡萄糖酸脫水酶，其特徵在於，具有使D-葡萄糖酸脫水生成2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸的功能，在含有1mM D-葡萄糖酸鈉和1mM氯化鎂的30mM tris緩衝液(pH8.5)中，55℃、保持2小時的情況下，保持95％或其以上的活性。
[1]所述的葡萄糖酸脫水酶是由木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)由來的。
[1]所述的葡萄糖酸脫水酶是用序列表的序列編號1中記載的胺基酸序列表示。
用與序列表的序列編號1中記載的胺基酸序列有70％或其以上相同性的胺基酸序列表示[1]所述的葡萄糖酸脫水酶。
決定[1]至[4]中任意一項所述的葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼的基因。
決定用序列表的序列編號1中記載的鹼基序列表示的[1]至[3]所述的葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼的基因。
在高嚴格條件下、與[5]或[6]所述的基因進行雜交的鹼基序列表示的、決定[1]至[4]中任意一項所述的葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼的基因。
含有決定[5]至[7]中任意一項所述的葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼基因的質粒。
利用[8]所述的質粒使宿主細胞進行轉化得到轉換細胞。
宿主細胞是大腸菌的[9]所述的轉換細胞。
用[1]至[4]中任意一項所述的葡萄糖酸脫水酶，[9]或[10]所述的轉換細胞，或它們的處理物中的任意一種，在水介質中，轉換成與醛糖酸對應的2-酮-3-脫氧醛糖酸的方法。
2-脫氧醛糖酸的製造方法，其特徵在於，由以下的工序組成，A)在醛糖酸或醛糖酸鹽中，使[1]至[4]任意一項所述的葡萄糖酸脫水酶、或[9]或[10]所述的轉換細胞、或它們的處理物的任意一種在水介質中發生作用，轉換成2-酮-3-脫氧醛糖酸的工序。
B)工序A)中得到的2-酮-3-脫氧醛糖酸在水介質中使氧化劑發生作用，進行脫羧反應，得到減少1個碳原子數的2-脫氧醛糖酸的工序。
2-脫氧醛糖的製造方法，其特徵在於，由以下的工序組成，A)在醛糖酸類或醛糖酸鹽中，使[1]至[4]任意一項所述的葡萄糖酸脫水酶、或[9]或[10]所述的轉換細胞或它們的處理物的任意一種在水介質中發生作用，轉換成2-酮-3-脫氧醛糖酸的工序。
B)工序A)中得到的2-酮-3-脫氧醛糖酸在水介質中使還原劑發生作用，得到2-羥基-3-脫氧醛糖酸的工序，C)在B)工序中得到的2-羥基-3-脫氧醛糖酸在水介質中使氧化劑發生作用，進行脫羧反應，得到減少1個碳原子數的2-脫氧醛糖的工序。
[11]至[13]中任意一項所述的任意一項方法，其中，醛糖酸是D-葡萄糖酸、D-半乳糖酸(D-galactonic acid)、D-巖藻糖酸(D-Fuconicacid)、D-木糖酸(D-Xylonic acid)或L-阿拉伯糖酸(L-arabinonic acid)的任何一種。
本發明提供一種熱穩定性和保存穩定性卓越的新型葡萄糖酸脫水酶。另外提供決定該葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼的鹼基序列，引入這些鹼基序列的質粒以及用質粒進行轉化的轉換細胞。另外，通過利用該葡萄糖酸脫水酶或該轉換細胞，能夠製造收率良好的2-酮-3-脫氧醛糖酸和減少了1個碳原子數的2-脫氧醛糖酸或2-脫氧醛糖。


圖1是表示含有決定葡萄糖酸脫水酶基因的DNA的質粒構成圖。
具體實施例方式
以下詳細說明本發明。
有關本發明的葡萄糖酸脫水酶，其是在D-葡萄糖酸中發生作用催化生成2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸反應的酶，耐熱性是該酶的特徵。關於耐熱性，在含有1mM D-葡萄糖酸鈉和1mM氯化鎂的30mM tris緩衝液(pH 8.5)中，55℃、保持2小時的情況下，能夠規定為相對於保存前的酶活性保持大於等於95％的活性。
有關本發明的葡萄糖酸脫水酶只要是具有關於上述耐熱性特性的葡萄糖酸脫水活性的酶，不論是從任何微生物由來的，或者是通過基因重組改變已知的葡萄糖酸脫水酶後的產物，都是包含在本發明中的。本發明的葡萄糖酸脫水酶包括由木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)ATCC9220菌株由來的。木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)ATCC9220菌株是能由美國典型菌種保藏中心(AmericanType Culture Collection)獲得分售的菌種。這種菌種以前記載為木糖氧化產鹼菌(Alcaligenes xylosoxidans)或糞產鹼菌(Alcaligenes faecalis)，現在記載為木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)。
本發明的葡萄糖酸脫水酶活性表現為以D-葡萄糖酸為基質生成2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸的活性，能夠按下列方法確認。含有tris緩衝液(pH8.5)1mmole，D-葡萄糖酸鈉40μmole，氯化鎂1μmole和葡萄糖酸脫水酶的反應液1ml在37℃反應10分鐘，通過添加1M的鹽酸200μl停止反應。反應停止後，用高速液相層析法(層析柱Shodex AsahipakNH2P-504E(昭和電工制)，層析柱溫40℃，移動相50mM磷酸二氫鈉，流速1ml/min，檢出210nm)定量2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸。1U定義為1分鐘催化1μmole 2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸生成的酶量。另外，蛋白質的定量用蛋白質試驗工具(プロテインアツセイキツト)(バイオラツド製)通過色素結合法等進行測定。
本發明的葡萄糖酸脫水酶的一個形態，具有序列表的序列編號1所述的胺基酸序列，或序列表的序列編號1所述的胺基酸序列中1個或2個或其以上，優選數個胺基酸，在能維持葡萄糖酸脫水酶活性的範圍內，被置換，缺失或變異或插入或附加的胺基酸序列。另外，有關本發明的葡萄糖酸脫水酶含有具有同序列表的序列編號1表示的胺基酸序列至少70％或其以上，優選80％或其以上，更優選95％或其以上的同源性的蛋白質。蛋白質的同源性檢索，例如有關SWISS-PROT、PIR等的蛋白質的胺基酸序列的資料庫和有關DNA Databank of JAPAN(DDBJ)、EMBL、Gene-Bank等DNA資料庫，以有關DNA序列為基礎推定的胺基酸序列的資料庫等為對象，用FASTA program或BLAST program等，例如可以在網際網路上進行檢索。本發明的70％或其以上的同源性是例如用BLASTprogram表示的正(Positive)同源性的值。
決定本發明的葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼的多核苷酸含有序列表的序列編號1記載的鹼基序列。序列表的序列編號1表示的鹼基序列編碼表示在序列表的序列編號1的蛋白質。但是，決定序列表的序列編號1表示的胺基酸序列的鹼基序列不僅僅是序列表的序列編號1記載的鹼基序列，含有按照不同密碼的所有鹼基序列。進一步通過適當的導入置換，缺失，變異或插入或附加序列，得到多核苷酸的同源序列。本發明的多核苷酸的同源序列是相對序列表的序列編號1表示的鹼基序列，用這些序列決定的葡萄糖酸脫水酶在能維持一定的酶活性範圍內進行鹼基的置換、缺失或附加而得到的多核苷酸的同源序列。在該同源序列中，可以例舉出具有含有表示在序列表的序列編號1的鹼基序列的互補序列的多肽，在高嚴格的條件下能夠雜交的鹼基序列的多核苷酸。
在高嚴格條件下的雜交，例如可通過Molecular CloningCold SpringHarbor Laboratory Press，Current Protocols in Molecular Biology；WileyInterscience記載的方法進行，市售的裝置可列舉出Gene Image裝置(アマルシヤム)。具體的可通過以下的操作進行雜交。轉錄有應進行試驗的DNA或RNA分子的膜依照產品說明書，在說明書指定的雜交緩衝液(hybridazation buffer)中與標識的探針(probe)雜交。雜交緩衝液(hybridazation buffer)的組成是由0.1重量％的SDS、5重量％的硫酸萄聚糖、1/20溶的工具帶的封閉液(Blocking solution)和2至7×SSC組成。作為封閉液試劑，例如、可以將100×Denhardt′s solution、2％(重量/容量)的Bovine serum albumin、2％(重量/容量)的FicllTM400、2％(重量/容量)的聚乙烯吡咯烷酮調製成5倍濃度的溶液後稀釋至20分之1後使用。雜交的溫度是40℃至80℃，優選50℃至70℃的範圍，進行幾個小時乃至1個晚上的雜交(incubate)後，用清洗液緩衝液(wash buffer)進行清洗。清洗的溫度優選室溫，更優選雜交時的溫度。清洗緩衝液的組成是6×SSC+0.1重量％的SDS溶液，優選4×SSC+0.1重量％的SDS溶液，更優選1×SSC+0.1重量％的SDS溶液。用這樣的清洗液洗膜，雜交了探針的DNA分子或RNA分子利用用於探針上的標記，可以進行識別。
決定本發明的新型葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼的DNA，例如，可以通過以下的方法進行分離。從微生物中精製基因組DNA，通過超高速分離或電泳，根據DNA的長度，分畫用限制性內切酶消化後得到的DNA。通過回收該分畫試劑的DNA引入到質粒中，製成質粒文庫，從中選出帶有葡萄糖酸脫水酶活性的克隆，獲取含有決定葡萄糖酸脫水酶基因的DNA質粒。通過分析該質粒的鹼基序列，明確了決定目的的葡萄糖酸脫水酶基因的DNA的鹼基序列，因此可以從DNA的鹼基序列推定被決定的葡萄糖酸脫水酶的胺基酸序列。
把通過用上述方法分離的決定本發明葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼的DNA編入到，例如，宿主是大腸桿菌的情形下，pUC 18、pKK223-3、pBR322、pMW119、Bluescript IISK(+)、pSC101等代表表達用的質粒中，提供葡萄糖酸脫水酶表達質粒。作為在轉化中使用的宿主生物，只要重組載體能穩定並且自律增殖，並且外源性DNA的性質是能表達的就行。作為宿主生物的例子可以舉出大腸桿菌(Escherichia coli)，但是不特別限制在大腸桿菌，也可以使用埃希氏菌(Escherichia)屬細菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等芽孢桿菌(Bacillus)屬細菌、假單胞菌(Pseudomonas)屬細菌等細菌類、酵母(Saccharomyces)屬、畢赤酵母(Pichia)屬、假絲酵母(Candida)屬等酵母類、麴黴菌(Aspergillus)屬等絲狀菌類。
本發明可以根據公知的信息培養用該質粒進行轉化後得到的轉換細胞，可以令其生成本發明的葡萄糖酸脫水酶。作為培養基，只要是適量含有碳源、氮源、無機物和其他的營養元素的培養基，可以使用合成培養基或天然培養基中的任何一種。培養是在含有上述培養成分的液體培養基中，用振動培養、通氣攪拌培養、連續式培養、流加式培養等通常的培養方法進行。培養條件可以根據培養基的種類，培養方法適當選擇，只要是菌株生長能生成葡萄糖酸脫水酶的條件，就沒有特殊地限制。
另外，在2-酮-3-脫氧醛糖酸的製造方法中，也可以從上述具有葡萄糖酸脫水酶活性的菌體培養液本身或通過離心分離分離回收該培養液而得到的轉換細胞，該轉換細胞的菌體處理物的形式來利用葡萄糖酸脫水酶。這裡所說的菌體處理物包括該轉換細胞的提取物或破碎物、分離、精製該提取物或破碎物的葡萄糖酸脫水酶活性畫分而得到的分離物、用適當的載體固定該轉換細胞或該轉換細胞的提取物、破碎物、分離物的固定化物。
本發明使用的醛糖酸可以通過公知的製造方法得到，也可以使用市面上出售的醛糖酸。醛糖酸只要是通過本發明中的葡萄糖酸脫水酶的作用，能轉換成相應的2-酮-3-脫氧醛糖酸，就沒有特別地限制，D-葡萄糖酸、D-半乳糖酸、D-巖藻糖酸、D-木糖酸、L-阿拉伯糖酸等均適合使用。另外，醛糖酸的鹼性金屬鹽、鹼土金屬鹽、銨鹽等也適合使用。
醛糖酸的濃度沒有特別限制，通常使用1至500g/l範圍的濃度。鑑於反應性和經濟性，優選100g/l或其以上。
2-酮-3-脫氧醛糖酸生成反應的反應溫度只要是在能維持葡萄糖酸脫水酶活性的溫度範圍就可以，優選50℃至60℃的範圍。
另外，反應的pH只要是在能維持葡萄糖酸脫水酶活性的範圍就行，優選pH7至9的範圍。反應中pH變動的情況下，只要適當調整就可以。
作為用於反應的介質能夠使用水或由各種緩衝液組成的水介質。作為緩衝液可以列舉出從磷酸、tris、檸檬酸、乙酸、硼酸、甘氨酸、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸、3-嗎啉丙磺酸、2-嗎啉乙磺酸、3-環己基氨基丙磺酸、2-(環己基氨基)乙磺酸、哌嗪-N，N』-雙(2-乙磺酸)等中適宜的選出一種或兩種或兩種以上的組成成分使其含有在水中的緩衝液。
另外，為了提高反應效率和回收率，可以根據需要使用各種添加劑。由於在例如鎂離子，錳離子等金屬離子的存在下，葡萄糖酸脫水酶中有被活化的物質，可以在反應液中添加這些二價金屬。
本發明的2-脫氧醛糖酸的製造方法是由用上述方法生成2-酮-3-脫氧醛糖酸的工序及之後在得到的2-酮-3-脫氧醛糖酸中使氧化劑發生作用進行脫羧反應，生成減少1個碳原子數的2-脫氧醛糖酸的工序組成。
作為脫羧反應中使用的氧化劑可以列舉出次氯酸或次氯酸鹽或過氧化氫等，其中優選次氯酸或次氯酸鹽。作為次氯酸鹽可以列舉出次氯酸鈉、次氯酸鉀、次氯酸鈣、次氯酸鋰等，也可以使用通過像氫氧化鈉這樣的金屬氫氧化物和氯在反應體系內調整的物質。
在脫羧反應中使用的溶劑只要是使反應進行的就可以，沒有特別地限定，優選溶解原料的溶劑，可舉出水，乙酸等。
脫羧反應的反應溫度大於等於溶劑不結凍的溫度，小於等於溶劑的沸點，優選20℃至50℃。
作為脫羧反應的反應液pH是4～6，優選4.5～6。另外，在本發明中，在添加次氯酸鹽水溶液的同時，為了調整反應液的pH到上述pH優選添加酸。作為酸沒有特別限定，可以舉出鹽酸、硫酸、磷酸等的無機酸和乙酸、蟻酸等的低級脂肪族羧酸等。
另外，不用分離精製前工序中得到的2-酮-3-脫氧醛糖酸，可以通過在同一反應器中逐步反應，製造2-脫氧醛糖酸。
本發明的2-脫氧醛糖的製造方法是由用上述的方法生成2-酮-3-脫氧醛糖酸的工序，在得到的2-酮-3-脫氧醛糖酸中使還原劑發生作用生成2-羥基-3-脫氧醛糖酸的工序，使氧化劑在得到的2-羥基-3-脫氧醛糖酸中發生作用進行脫羧反應生成減少1個碳原子數的2-脫氧醛糖的工序組成。
作為還原劑只要是使反應進行的就可以，沒有特別地限定，優選氫化硼鈉。另外，可以用在鈀等金屬催化劑存在下的催化氫化法進行還原反應。
還原反應中使用的溶劑只要是使反應進行的就可以，沒有特別地限定，優選溶解原料的溶劑，可舉出水等。
還原反應的反應溫度大於等於溶劑不結凍的溫度，低於等於溶劑的沸點，優選0℃至20℃。
脫羧反應可在與上述的2-脫氧醛糖酸的製造方法相同的條件下進行。
另外，不用分離精製各工序中得到的反應生成物，可以通過在同一反應器中逐步反應，製造2-脫氧醛糖。
從生成的2-酮-3-脫氧醛糖酸、2-脫氧醛糖酸和2-脫氧醛糖反應液中分離·回收，可以使用用金屬鹽的沉澱法或層析柱分離等通常使用的分離·回收方法。
實施例以下通過實施例更詳細地說明本發明，但本發明並不限定於這些實施例。
反應中使用的醛糖酸和生成的2-酮-3-脫氧醛糖酸用高速液體柱層析法(層析柱ShodexAsahipakNH2P--50 4E(昭和電工制)、層析柱溫40℃、移動相50mM磷酸二氫鈉、流速1ml/min、檢出210nm)定量。
木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株的培養在由10g/l的D-葡萄糖酸鈉、5g/l的酵母膏、5g/l的多聚蛋白腖、3g/l的氯化鈉及0.2g/l的七水硫酸鎂組成的液體培養基(調整pH值至7.0)中接種事先在肉湯培養基中培養好的木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)ATCC9220菌體，在30℃下進行20小時通氣攪拌培養，通過離心分離回收菌體，獲得具有葡萄糖酸脫水酶活性的菌體。
通過木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株進行2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸的合成將由實施例1中所示方法獲得的木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)ATCC9220菌株的溼菌體120g放入50mM Tris緩衝液(pH7.0、含1mM的D-葡萄糖酸鈉及1mM的氯化鎂)200ml中，懸濁後用超音波菌體破碎機將菌體破碎，獲得粗酶液。將120.0g D-葡萄糖酸鈉和1mmole的氯化鎂溶解於600ml水中，然後將粗酶液加入到此水溶液中，用6M氫氧化鈉調整pH值至8.5，在50℃下進行反應。在反應過程中通過適量添加2M氫氧化鈉溶液體調整反應液的pH值在8.5。反應40小時後，反應液中已無D-葡萄糖酸殘留，生成95g的2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸。
反應結束後，通過離心分離從反應液中除去菌體由來的固形物，用超高倍過濾膜(バイオマツクス-10、ミリポア製)過濾上清液。將濾液通過使用ダウエツクス1×8(200-400目、OH型、ダウ·ケミカル製)的離子交換柱，用50mM的鹽酸溶出。收集溶出畫分，減壓濃縮後用氫氧化鉀中和。獲得含有73.8g 2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸鉀水溶液溶346.7g。
木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株由來的葡萄糖酸脫水酶的精製及N末端胺基酸序列的決定將由實施例1中所示方法獲得的菌體放入添加1mM D-葡萄糖酸鈉及1mM氯化鎂的50mM Tris緩衝液(pH7.0，以下記作緩衝液)中懸浮，用超音波菌體破碎機將菌體破碎後，通過冷卻離心機回收上清液，獲得無細胞提取液。在無細胞提取液中加入硫酸鏈黴素，使其濃度達到1％，攪拌30分鐘通過離心分離除去生成的沉澱，在離心後的上清液裡添加硫酸銨，收集20至60％的飽和畫分。將硫酸銨畫分通過超高倍過濾膜(ミリポア製ウルトラフリ一15、分子量斷點(カツト)為10萬)脫鹽濃縮後，使其通過DEAE-SephAroseFF層析柱，(アマルシヤムバイオサイエンス製)，用緩衝液和含有1M Nacl的緩衝液的直線濃度斜率使其溶出。回收活性畫分，添加硫酸銨至濃度為1M後，使其通過Phenyl-SephArose HP層析柱(アマルシヤムバイオサイエンス製)，用含有1M硫酸銨的緩衝液和緩衝液的直線濃度斜率使其溶出。回收活性畫分，使其通過Superose12HR層析柱(アマルシヤムバイオサイエンス製)，用添加了0.15M NaCl的緩衝液將其溶出。回收活性畫分，添加硫酸銨至0.5M後，使其通過Phenyl-Seph Arose HP層析柱，用含有0.5M硫酸銨的緩衝液和緩衝液的直線濃度斜率使其溶出。回收活性畫分，添加硫酸銨至0.5M後，使其通過Phenyl-Seph Arose HP柱，用含有0.5M硫酸氨的緩衝液和緩衝液的直線濃度斜率使其溶出。回收活性畫分，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳時，在大約60kDa的位置上確認有一個單一帶。對這一活性畫分用添加了1mM D-葡萄糖酸鈉及1mM氯化鎂的30mM Tris緩衝液(pH8.5)進行透析，置換緩衝液。將此酶液作為精製葡萄糖酸脫水酶溶液。精製總結表如表1所示。
針對這一大約是60k DA的蛋白質進行N末端胺基酸序列的分析時，如序列表的序列編號2所示決定成Thr-Asp-Thr-Pro-Arg-Lys-Leu-Arg-Ser-Gln-Lys-Trp-Phe-Asp-Asp。
表1葡萄糖酸脫水酶的精製
木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株由來的葡萄糖酸脫水酶的熱穩定性將在實施例3中所示方法獲得的溶解在添加了1mM D-葡萄糖酸鈉及1mM氯化鎂的30mM Tris緩衝液(pH8.5)中的精製葡萄糖酸脫水酶溶液分別在4、20、30、40、50、55、60、65和70℃下放置30分鐘、2小時和12小時。另外，在4℃下放置7日及30日。接著將含有這些經過熱處理的酶溶液和1mmole Tris緩衝液(pH8.5)、40μmole D-葡萄糖酸鈉、1μmole氯化鎂的反應液1ml在37℃條件下反應。10分鐘後通過添加200μl的1M的鹽酸停止反應。反應停止後，用高速液相層析法定量2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸的生成量，計算反應速度。熱處理前酶活性為100時的相對活性值如表2所示。55℃下放置2小時後保持了100％的活性。另外在4℃下放置30天活性保持穩定。
表2葡萄糖酸脫水酶的熱穩定性 [實施例5]木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株由來的葡萄糖酸脫水酶的內部胺基酸序列的決定將由實施例3中所示方法獲得的精製葡萄糖酸脫水酶溶液(相當於124μg的蛋白質)凍結乾燥後溶解於含6M鹽酸胍的0.5M Tris緩衝液(pH8.4)100μl中，在37℃下保溫15分鐘。在此溶液中添加含有0.2M二硫蘇糖醇及6M鹽酸胍的0.5M Tris緩衝液(pH8.4)10μl，60℃下保溫1小時。接著在此溶液中添加含有0.4M碘乙酸及6M鹽酸胍的0.5M Tris緩衝液(pH8.4)10μl，在37℃下保溫15分鐘。把所得的溶液通過事先用含8M尿素的0.5M碳酸氫胺溶液(pH7.8)平衡化的充填了Sepha dex G-50的快速層析柱(ロシユ·ダイアグノステイツクス製)脫鹽，得到400μl的溶液。接著在此溶液中添加2mg/ml的V8蛋白酶(和光純藥制)溶液1μl，在30℃下反應23小時。反應液供給用Vy dac 214TP54 PRO TEIN C4層析柱(アジレント製)的逆相高速液相層析，通過0.1％三氟醋酸水溶液和含0.1％三氟醋酸的90％乙腈水溶液的濃度斜率，分離生成的肽，分取其中的一種肽。對分取的肽的N末端胺基酸序列進行分析，如序列表中序列編號3所示決定為Ala-Arg-Ala-Ile-VAl-Phe-Glu-Gly-Pro-Glu-Asp-Tyr-His-Ala-Arg。
決定木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株的葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼DNA的取得根據「基礎生化學實驗法2抽出·分離·精製阿南功一他著丸善株式會社出版」中記載的微生物基因組DNA的分離方法調製由實施例1中所示方法獲得的木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌體由來的基因組DNA。將此基因組DNA作為模板，以實施例3中決定的N末端胺基酸序列為基礎合成的序列表序列編號4中記載的寡糖核苷酸鏈以及以實施例5中決定的內部胺基酸序列為基礎合成的序列表序列編號5中記載的寡糖核苷酸鏈為引物進行多聚酶鏈式反應(PCR)，獲得約1.2kb的DNA斷片。用代表性的限制性內切酶消化基因組DNA，把PCR法獲得的1.2kb的DNA斷片進行標記製成探針，進行Southern hybridization實驗的結果為基因組DNA在被限制性內切酶PstI完全消化的情況下在約4kb的斷片上發現了陽性信號。為了按長度分畫用限制性內切酶PstI完全消化基因組DNA而得到的DNA斷片，進行濃度斜率超離心分離，回收主要含有4kb的DNA斷片的畫分。把此畫分和經限制性內切酶PstI消化的5』末端脫磷酸化的載體pUC118用於DNA連接反應，做成質粒文庫。通過這一質粒文庫把大腸菌DH5α轉化後的產物塗抹到添加了50μg/ml氨苄西林的LB(Luria-Bertani)寒天培養基上靜置培養，使其生成菌落。使用上述的約1.2kb DNA斷片標記後的探針進行菌落雜交實驗，分離出顯示陽性信號的菌落。從陽性菌落中回收質粒，進行得到的質粒的鹼基序列的解析。鹼基序列的解析時使用AppliedBiosystems公司的BigDye Teminator Cycle Sequencing kit，在同一公司制的Genetic Analyzer 310上進行。以質粒的鹼基序列情報為基礎設計了兩種引物、序列表序列編號6和序列編號7中所記載的寡糖核苷酸鏈。序列表序列編號6中記載的引物中加入限制性內切酶HindIII的部位，序列表序列編號7中記載的引物中加入限制性內切酶XbaI的部位。以基因組DNA為模板，利用上述引物進行PCR反應，擴增含有決定葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼的DNA的領域。將獲得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切取作為目的的移動度的移動帶，用快速試劑(キアクイツク)(キアゲン製)從凝膠中抽出DNA。把這一提取物和經限制性內切酶HindIII及XbaI消化的5』末端脫磷酸化的載體pMW119用於DNA的連結反應，獲得含有決定葡萄糖脫水酶遺傳密碼的DNA的質粒。
決定葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼的DNA的鹼基序列的決定在研究調查由實施例6所獲得的質粒的物理圖譜時，辨明其為圖1所示。進而進行了鹼基序列的解析。鹼基序列的決定時使用AppliedBiosystems公司的BigDye Teminator Cycle Sequencing kit，在同一公司產的Genetic Analyzer 310上進行。結果獲得了如序列表序列編號1中所示的決定葡萄糖脫水酶遺傳密碼的DNA的全部鹼基序列。將該葡萄糖酸脫水酶基因的鹼基序列翻譯成胺基酸，如序列表的序列編號1所示。其N末端的胺基酸序列與實施例3中所示的N末端胺基酸序列相一致。
使用通過含有木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)ATCC9220菌株由來的葡萄糖酸脫水酶基因的DNA而轉化後的大腸菌合成2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸把用實施例7圖1中所示的質粒進行轉化後的大腸菌K 12W3110接種於添加了50μg/ml氨苄西林的LB液體培養液中，在37℃下振蕩培養一晚。培養後通過離心分離回收菌體。將含有所獲溼菌體0.3g、D-葡萄糖酸鈉6.0g、氯化鎂50μmole、Tris緩衝液(pH8.5)2.5mmole的反應液50.0g於50℃條件下進行反應。反應24小時後，反應液中無D-葡萄糖酸的殘留，生成4.8g的2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸。
使用通過含有木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)ATCC9220菌株由來的葡萄糖酸脫水酶基因的DNA而轉化後的大腸菌合成2-酮-3-脫氧-D-半乳糖酸把用實施例7圖1中所示的質粒進行轉化後的大腸菌K 12W3110接種於添加了50μg/ml氨苄西林的LB液體培養液中，在37℃下振蕩培養一晚。培養後通過離心分離回收菌體。將含有所獲溼菌體0.6g、D-半乳糖酸鈉6.0g、氯化鎂50μmole、Tris緩衝液(pH8.5)2.5mmole的反應液50.0g於50℃下進行反應。反應24小時後，反應液中無D-半乳糖酸的殘留，生成4.5g2-酮-3-脫氧-D-半乳糖酸。
使用通過含有木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)ATCC9220菌株由來的葡萄糖酸脫水酶基因的DNA而轉化後的大腸菌合成2-酮-3-脫氧-D-木糖酸把用實施例7圖1中所示的質粒進行轉化後的大腸菌K12W3110接種於添加了50μg/ml氨苄西林的LB液體培養液中，在37℃下振蕩培養一晚。培養後通過離心分離回收菌體。將含有所獲溼菌體0.7g、D-木糖酸銨鹽13.0g、氯化鎂50μmole、Tris緩衝液(pH8.5)5.5mmole的反應液110.0g於50℃下進行反應。反應24小時後，反應液中無D-木糖酸的殘留，生成9.9g 2-酮-3-脫氧-D-木糖酸。
使用通過含有木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)ATCC9220菌株由來的葡萄糖酸脫水酶基因的DNA而轉化後的大腸菌合成2-酮-3-脫氧-L-阿拉伯糖酸把用實施例7圖1中所示的質粒進行轉化後的大腸菌K12W3110接種於添加了50μg/ml氨苄西林的LB液體培養液中，在37℃下振蕩培養一晚。培養後通過離心分離回收菌體。將含有所獲溼菌體0.7g、L-阿拉伯酸鈉1.0g、氯化鎂10μmole、Tris緩衝液(pH8.5)500μmole的反應液10.0g於50℃下進行反應。反應24小時後，反應液中無L-阿拉伯糖酸的殘留，生成0.7g2-酮-3-脫氧-L-阿拉伯糖酸。
使用葡萄糖酸鈉作為醛糖酸合成2-脫氧核糖把用實施例7圖1中所示的質粒進行轉化後的大腸菌K12W3110接種於添加了50μg/ml氨苄西林的LB液體培養液中，在37℃下振蕩培養一晚。培養後通過離心分離回收菌體。將所獲溼菌體3.3g加入到含有D-葡萄糖酸鈉130g、氯化鎂10μmole、用氫氧化鈉調整pH至8.5的反應液400g中，在40℃下進行反應。反應24小時後，反應液中無D-葡萄糖酸的殘留，生成106g 2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸。
持續攪拌含有2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸的反應液使其冷卻至10℃，在注意氣泡的同時緩緩加入硼氫化鈉6.0g。硼氫化鈉添加結束後在10℃下繼續反應2小時。此反應液中生成100g 2-羥基-3-脫氧-D-葡萄糖酸。
用35％的鹽酸把含有2-羥基-3-脫氧-D-葡萄糖酸的反應液的pH值調整到5.0。將反應溫度調至35℃，同時用1小時的時間把13％的次氯酸鈉水溶液377g滴入反應液中進行脫羧反應。此時用醋酸把反應液的pH值控制在5至6之間。次氯酸鈉水溶液滴加完了後，當反應進行到1小時時反應液中生成69g 2-脫氧-D-核糖。從D-葡萄糖酸鈉中獲得的收率為86.3％。
使用葡萄糖酸鈉作為醛糖酸合成2-脫氧-D-核糖內酯和2-脫氧-D-核糖酸鈉的混合物把用實施例7圖1中所示的質粒進行轉化後的大腸菌K12W3 110接種於添加了50μg/ml氨苄西林的LB液體培養基中，在37℃下振蕩培養一晚。培養後通過離心分離回收菌體。將所獲溼菌體3.3g加入到含有D-葡萄糖酸鈉130g、氯化鎂10μmole、用氫氧化鈉調整pH至8.5的反應液530g中，在40℃下進行反應。反應24小時後，反應液中無D-葡萄糖酸的殘留，生成106g 2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸。
用30％氫氧化鈉水溶液把2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸水溶液的pH值調至9.0，然後用濃鹽酸把pH值調至5.0，在水冷下一邊用濃鹽酸把pH值調至4.5～5.0一邊用1小時的時間把次氯酸鈉水溶液(12.2重量％)473g滴入到反應液中。反應結束後添加碳酸氫鈉調整pH值至8.0，將所得反應液在50℃下減壓濃縮後，在殘渣中加入甲醇，除去無機鹽的結晶回收濾液。重複此操作兩次後，濃縮除去濾液溶媒，獲得2-脫氧-D-核糖內酯和2-脫氧-D-核糖酸鈉的混合物106g。用27g水溶解獲得的2.7g混合物，通過陽離子交換樹脂(アンバ一ライトIR120 plus)脫鹽後，用12NHCL把pH調至0.9，室溫下攪拌12小時。所得反應液減壓濃縮後，通過矽膠凝膠層析柱(溶離液組成氯仿/甲醇＝10/1～5/1)精製，定量獲得2.0g 2-脫氧-D-核糖內酯漿液。
使用木糖酸鈉作為醛糖酸合成3，4-二羥基丁烷酸鈉把用實施例7圖1中所示的質粒進行轉化後的大腸菌K12W3110接種於添加了50μg/ml氨苄西林的LB液體培養基中，在37℃下振蕩培養一晚。培養後通過離心分離回收菌體。將所獲溼菌體0.5g加入到含有D-木糖酸鈉13g、氯化鎂10μmole、用氫氧化鈉調整pH至8.5的反應液53g中，在40℃下進行反應。反應24小時後，反應液中無D-木糖酸的殘留，生成9.8g 2-酮-3-脫氧-D-木糖酸。
用濃鹽酸把2-酮-3-脫氧-D-木糖酸水溶液的pH值調至5.0，在水冷下一邊用濃鹽酸把pH值調至4.5～5.0一邊用1小時的時間把次氯酸鈉水溶液(12.2重量％)53g滴入到反應液中。反應結束後添加碳酸氫鈉調整pH值至8.0，把所得反應液在50℃下減壓濃縮。在殘渣中加入甲醇，除去無機鹽的結晶回收濾液。重複此操作兩次後，濃縮除去濾液溶媒，獲得9.4g 3，4-二羥基丁烷酸鈉。
序列表110三井化學株式會社120D-葡萄糖酸脫水酶130案卷參考號140專利申請號141專利申請日150優先權號151優先權日160序列表中序列的個數21012111782212DNA213木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)220
223發明人三宅仁基；八卷俊文；及川利洋220
221名稱/關鍵詞2221..1782223/生物體＝″木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)″/菌株＝″ATCC9220″220
222(1)..(1779)223/基因＝″D-葡萄糖酸脫水酶(D-gluconic acid dehydratase)″/產物＝″D-葡萄糖酸脫水酶(D-gluconic acid dehydratase)″4001atg acc gac act ccc cgc aag ctg cgc agc cag aaa tgg ttc gac gat48Met Thr Asp Thr Pro Arg Lys Leu Arg Ser Gln Lys Trp Phe Asp Asp1 5 10 15ccc gcc cac gcc gac atg acg gcg atc tac gtc gag cgc tac ctg aac96Pro Ala His Ala Asp Met Thr Ala Ile Tyr Val Glu Arg Tyr Leu Asn20 25 30tac ggc ctg acg cgc cag gaa ctg caa tcg ggc cgg ccc atc atc ggc144Tyr Gly Leu Thr Arg Gln Glu Leu Gln Ser Gly Arg Pro Ile Ile Gly35 40 45atc gcc cag acc ggc agc gac ctg gcg ccc tgc aac cgc cac cac ctg192Ile Ala Gln Thr Gly Ser Asp Leu Ala Pro Cys Asn Arg His His Leu50 55 60gcg ctg gcc gaa cgc atc aag gcc ggc atc cgc gac gcc ggc ggc atc240Ala Leu Ala Glu Arg Ile Lys Ala Gly Ile Arg Asp Ala Gly Gly Ile65 70 75 80
ccg atg gag ttc ccg gtg cat ccg ctg gcc gag cag ggc cgc cgc ccg288Pro Met Glu Phe Pro Val His Pro Leu Ala Glu Gln Gly Arg Arg Pro85 90 95acc gcg gcg ctg gac cgc aac ctg gcc tac ctg ggc ctg gtg gag atc336Thr Ala Ala Leu Asp Arg Asn Leu Ala Tyr Leu Gly Leu Val Glu Ile100 105 110ctg cac ggc tat ccg ctg gac ggc gtg gtg ctg acc acg ggc tgc gac384Leu His Gly Tyr Pro Leu Asp Gly Val Val Leu Thr Thr Gly Cys Asp115 120 125aag acc acg ccc gcc tgc ctg atg gcg gcg gcc acc gtc gac att ccc432Lys Thr Thr Pro Ala Cys Leu Met Ala Ala Ala Thr Val Asp Ile Pro130 135 140 145gcc atc gtg ctg tcc ggc ggc ccg atg ctg gac ggc tgg cat gac ggc480Ala Ile Val Leu Ser Gly Gly Pro Met Leu Asp Gly Trp His Asp Gly150 155 160cag cgc gtc ggg tcc ggc acg gtc atc tgg cat gcc cgc aac ctg atg528Gln Arg Val Gly Ser Gly Thr Val Ile Trp His Ala Arg Asn Leu Met165 170 175gcc gcg ggc aag ctg gac tac gaa ggc ttc atg acg ctg gcc acc gcc576Ala Ala Gly Lys Leu Asp Tyr Glu Gly Phe Met Thr Leu Ala Thr Ala180 185 190
tcc tcg ccc tcg atc ggc cac tgc aac acc atg ggc acg gcg ctg tcc624Ser Ser Pro Ser Ile Gly His Cys Asn Thr Met Gly Thr Ala Leu Ser195 200 205atg aat tcg ctg gcc gag gcg ctg ggc atg tcg ctg ccc acc tgc gcc672Met Asn Ser Leu Ala Glu Ala Leu Gly Met Ser Leu Pro Thr Cys Ala210 215 220 225agc atc ccc gcg ccc tac cgc gaa cgc ggg cag atg gcc tac gcc acc720Ser Ile Pro Ala Pro Tyr Arg Glu Arg Gly Gln Met Ala Tyr Ala Thr230 235 240ggc ctg cgc atc tgc gac atg gtg cgc gag gac ctg cgc ccg tcc cgc768Gly Leu Arg Ile Cys Asp Met Val Arg Glu Asp Leu Arg Pro Ser Arg245 250 255atc ctg acg cgc gag gcc ttc gaa aac gcc atc gtc gtg gcc tcg gcg816Ile Leu Thr Arg Glu Ala Phe Glu Asn Ala Ile Val Val Ala Ser Ala260 265 270ctg ggc gcg tcc agc aac tgt ccg ccg cac ctg atc gcc atg gcg cgc864Leu Gly Ala Ser Ser Asn Cys Pro Pro His Leu Ile Ala Met Ala Arg275 280 285cat gcc ggc atc gac ctg agc ctg gac gac tgg cag cgg ctg ggc gaa912
His Ala Gly Ile Asp Leu Ser Leu Asp Asp Trp Gln Arg Leu Gly Glu290 295 300 305gac gtg ccg ctg ctg gtg aac tgc gtg ccc gcc ggc gaa cac ctg ggc 960Asp Val Pro Leu Leu Val Asn Cys Val Pro Ala Gly Glu His Leu Gly310 315 320gag ggc ttc cac cgc gcc ggc ggc gtg ccg gcc gtg atg cac gaa ctg 1008Glu Gly Phe His Arg Ala Gly Gly Val Pro Ala Val Met His Glu Leu325 330 335ctg gcc gcc ggc cgc ctg cac gcc gac tgc gcc acc gtg tcc ggc aag 1056Leu Ala Ala Gly Arg Leu His Ala Asp Cys Ala Thr Val Ser Gly Lys340 345 350acc atc ggc gaa atc gcg gcc ggc gcc aag acc cac gac gcc gac gtc 1104Thr Ile Gly Glu Ile Ala Ala Gly Ala Lys Thr His Asp Ala Asp Val355 360 365atc cgc ggc tgc gac gcg ccg ctc aag cac cgc gcc ggc ttc atc gtg 1152Ile Arg Gly Cys Asp Ala Pro Leu Lys His Arg Ala Gly Phe Ile Val370 375 380 385ctg tcg ggc aat ttc ttc gac agc gcg gtc atc aag atg tcg gtg gtg 1200Leu Ser Gly Asn Phe Phe Asp Ser Ala Val Ile Lys Met Ser Val Val390 395 400
ggc gag gcg ttc cgc cgc gcc tac ctg tcc gcg ccc ggc gac gag aat 1248Gly Glu Ala Phe Arg Arg Ala Tyr Leu Ser Ala Pro Gly Asp Glu Asn405 410 415gcc ttc gag gcc cgg gcc atc gtg ttc gaa gga ccg gag gac tac cac 1296Ala Phe Glu Ala Arg Ala Ile Val Phe Glu Gly Pro Glu Asp Tyr His420 425 430gcg cgc atc gaa gac ccg gcc ctg aac atc gac gaa cac tgc atc ctg 1344Ala Arg Ile Glu Asp Pro Ala Leu Asn Ile Asp Glu His Cys Ile Leu435 440 445gtc atc cgc ggc gcc ggc acg gtc ggc tat ccg ggc agc gcc gag gtc 1392Val Ile Arg Gly Ala Gly Thr Val Gly Tyr Pro Gly Ser Ala Glu Val450 455 460 465gtc aac atg gcg ccg cca tcg cac ctg atc aag cgc ggc atc gac tcg 1440Val Asn Met Ala Pro Pro Ser His Leu Ile Lys Arg Gly Ile Asp Ser470 475 480ctg ccc tgc ctg ggc gac ggc cgc cag agc ggc acc tcg gcc agt ccg 1488Leu Pro Cys Leu Gly Asp Gly Arg Gln Ser Gly Thr Ser Ala Ser Pro485 490 495tcg atc ctg aac atg tcg cca gaa gcc gcc gtg ggt ggc ggt ctg gcg 1536
Ser Ile Leu Asn Met Ser Pro Glu Ala Ala Val Gly Gly Gly Leu Ala500 505 510ctg ctg cgc acc ggc gac cgc atc cgc gtc gac ctg aac cag cgc agc 1584Leu Leu Arg Thr Gly Asp Arg Ile Arg Val Asp Leu Asn Gln Arg Ser515 520 525gtc atc gcg ctg gtg gac gaa gcc gaa ctg gcg cgg cgg cgg cag gat 1632Val Ile Ala Leu Val Asp Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Asp530 535 540 545ccg ccc tac cag ccg ccg ccg gcc cag acg ccg tgg cag gag ctg tac 1680Pro Pro Tyr Gln Pro Pro Pro Ala Gln Thr Pro Trp Gln Glu Leu Tyr550 555 560cgg caa ctg gtc ggc cag ttg tca acc ggc ggc tgc ctg gaa ccc tcc 1728Arg Gln Leu Val Gly Gln Leu Ser Thr Gly Gly Cys Leu Glu Pro Ser565 570 575acc ctg tac ctg aag gtg gtc gaa acg cgc ggt gat ccc cgg cat tcg 1776Thr Leu Tyr Leu Lys Val Val Glu Thr Arg Gly Asp Pro Arg His Ser580 585 590cae tga1782
His210221115212PRT213木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)220
223發明人三宅仁基；八卷俊文；及川利洋220
223由賴氨酸末端肽酶(lysil-end peptidase)分解的D-葡萄糖酸脫水酶片斷的N末端胺基酸序列。
4002Thr Asp Thr Pro Arg Lys Leu Arg Ser Gln Lys Trp Phe Asp Asp1 5 10 15210321115212PRT213木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)220
223發明人三宅仁基；八卷俊文；及川利洋220
223由賴氨酸末端肽酶(lysil-end peptidase)分解的D-葡萄糖酸脫水酶片斷的N末端胺基酸序列。
4003Ala Arg Ala Ile Val Phe Glu Gly Pro Glu Asp Tyr His Ala Arg1 5 10 15210421144212DNA213人工序列220
223發明人三宅仁基；八卷俊文；及川利洋220
223作為PCR引物的寡核苷酸4004acngayacnc cgcggaaryt nmgnwsncar aartggttyg ayga44210521140212DNA213人工序列220
223發明人三宅仁基；八卷俊文；及川利洋220
223作為PCR引物的寡核苷酸4005ctcgagcrtg rtartcytcn ggnccytcra anacdatngc40210621140212DNA213人工序列220
223發明人三宅仁基；八卷俊文；及川利洋220
223作為PCR引物的寡核苷酸4006ccgaagctta cgaggcaccc20210721140212DNA213人工序列220
223發明人三宅仁基；八卷俊文；及川利洋220
223作為PCR引物的寡核苷酸
4007acgcatctag atcctctaca ttgcgggcgt30
權利要求
1.葡萄糖酸脫水酶，其特徵在於，具有使D-葡萄糖酸脫水生成2-酮-3-脫氧-D-葡萄糖酸的功能，在含有1mM D-葡萄糖酸鈉和1mM氯化鎂的30mM tris緩衝液(pH8.5)中，於55℃、保持2小時的情況下，保持95％或其以上的活性。
2.如權利要求1所述的葡萄糖酸脫水酶，其源自木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)。
3.如權利要求1所述的葡萄糖酸脫水酶，其是用序列表的序列編號1中記載的胺基酸序列表示。
4.如權利要求1所述的葡萄糖酸脫水酶，其是用顯示出與序列表的序列編號1中記載的胺基酸序列有70％或其以上同源性的胺基酸序列表示。
5.決定權利要求1至4中任意一項所述的葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼的基因。
6.決定用序列表的序列編號1中記載的鹼基序列表示的權利要求1至3所述的葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼的基因。
7.以在高嚴格條件下、與權利要求5或6所述的基因進行雜交的鹼基序列表示的、決定權利要求1至4中任意一項所述的葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼的基因。
8.含有決定權利要求5至7中任意一項所述葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼基因的質粒。
9.利用權利要求8所述的質粒使宿主細胞進行轉化得到的轉換細胞。
10.如權利要求9所述的轉換細胞，其中，宿主細胞是大腸菌。
11.用權利要求1至4中任意一項所述的葡萄糖酸脫水酶、權利要求9或10所述的轉換細胞，或它們的處理物中的任意一種，在水介質中，轉換成與醛糖酸對應的2-酮-3-脫氧醛糖酸的方法。
12.2-脫氧醛糖酸的製造方法，其特徵在於，由以下的工序組成，(A)在醛糖酸類或醛糖酸鹽中，使權利要求1至4任意一項所述的葡萄糖酸脫水酶、或權利要求9或10所述的轉換細胞、或它們的處理物的任意一種在水介質中發生作用，轉換成2-酮-3-脫氧醛糖酸的工序；(B)上述工序(A)中得到的2-酮-3-脫氧醛糖酸在水介質中使氧化劑發生作用，進行脫羧反應，得到碳原子數減少1個的2-脫氧醛糖酸的工序。
13.2-脫氧醛糖的製造方法，其特徵在於，由以下的工序組成，A)在醛糖酸類或醛糖酸鹽中，使權利要求1至4任意一項所述的葡萄糖酸脫水酶、或權利要求9或10所述的轉換細胞或它們的處理物的任意一種在水介質中發生作用，轉換成2-酮-3-脫氧醛糖酸的工序；B)上述工序(A)中得到的2-酮-3-脫氧醛糖酸在水介質中使還原劑發生作用，得到2-羥基-3-脫氧醛糖酸的工序；C)上述工序(B)中得到的2-羥基-3-脫氧醛糖酸在水介質中使氧化劑發生作用，進行脫羧反應，得到碳原子數減少1個的2-脫氧醛糖的工序。
14.權利要求11至13中任意一項所述的方法，其中，醛糖酸是D-葡萄糖酸、D-半乳糖酸、D-巖藻糖酸、D-木糖酸或L-阿拉伯糖酸的任何一種。
全文摘要
本發明提供一種具有生產上實用的熱穩定性及保存穩定性，可以由醛糖酸高效生成相應的2－酮－3－脫氧醛糖酸的新型葡萄糖酸脫水酶、和決定該葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼的基因、以及用含有該葡萄糖酸脫水酶或該基因的轉換細胞製造2－酮－3脫氧醛糖酸以及減少一個碳原子的2－脫氧醛糖酸或2－脫氧醛糖的方法。本發明提供一種源自木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)ATCC9220菌株的新型葡萄糖酸脫水酶、以及決定這一葡萄糖酸脫水酶遺傳密碼的基因。提供使該葡萄糖酸脫水酶或含有該基因的轉換細胞作用於醛糖酸中，製造相應的2－酮－3－脫氧醛糖酸。
文檔編號C12N9/88GK1597942SQ20041006246
公開日2005年3月23日 申請日期2004年7月8日 優先權日2003年7月10日
發明者三宅仁基, 八卷俊文, 及川利洋, 中村武史, 石橋大樹, 福入靖, 佐久間篤, 小松弘典, 安藤知行, 富樫和彥, 梅谷豪毅 申請人:三井化學株式會社