使用微rna195提供神經保護作用的方法

2024-03-01 03:29:15

使用微rna195提供神經保護作用的方法
【專利摘要】本發明涉及一種提供神經保護作用的方法，包含向受試者給予有效量的miRNA或其變體。通過提供神經保護作用，可以預防和/或治療中風或缺血性中風。
【專利說明】使用微RNA195提供神經保護作用的方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種提供神經保護作用的方法，包含向受試者給予有效量的miRNA或其經修飾的微RNA(microRNA)。尤其是，神經保護作用可以用來治療和/或預防中風。_2] 發明背景
[0003]中樞神經系統(「CNS」)的一個關鍵特徵是分化的神經元基本上不能再生。因此十分嚴重的腦部損傷或損害將可能造成永久喪失功能的結果。因此，需要一種方式來保護中樞神經系統的細胞在受傷後免於死亡。在中樞神經系統中對不同類型細胞的損傷，如窒息的、創傷的、毒性的、感染的、退行性的、代謝的、缺血的或缺氧的損害，可能會導致感覺、運動或認知缺陷。
[0004]微RNA (miRNA)是長度約21_23個核苷酸的單鏈RNA分子。miRNA會與一個或多個信使RNA(mRNAs)的3』端非翻譯區(3』 -UTR)互補。miRNA與mRNA之間的退火(annealing)會抑制蛋白翻譯和/或促進mRNA的降解。近來的研究顯示，miRNA通過影響血管平滑肌細胞(VSMCs)及內皮細胞的基因表達而在動脈粥樣硬化的進程中起到關鍵的作用(Y.Suarez et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA105, 14082, 2008 ；L.Poliseno etal., Bloodl08, 3068 , 2006 ；and X.Liu et al., Circ.Res.104, 476 2009)。例如，miR-145被發現是一個VSMC表型引物且具有調節血管內膜新生的能力(Y.Cheng et al.，Circ.Res.105，158,2009)。急性心肌梗塞的患者中也顯示有幾個具有血漿濃度升高水平的miRNA，表明血液循環中的miRNA可作為心血管疾病的生物標記(Y.D』Alessandra etal.，Eur.Heart J.31，2765，2010)。然而，miRNA在動脈粥樣硬化的研究中仍然處於非常早期的階段。
[0005]Xu T等人指出微RNA-195能抑制腫瘤生成並調節人類肝癌細胞的G1/S轉換(XuT et al.，Hepatology.2009Jul ;50 (I): 113-21)。Huaqing Zhu 等人報導微 RNA-195 通過下調Sirtl來促進棕櫚酸誘導的心肌細胞凋亡(Xu Tet al., Card1vasc Res (2011)cvrl45first published online May27，2011)。Sekiya Y 等人報導通過微 RNA-195 下調周期素El(cyclin E)的表達會導致幹擾素-β誘導的抑制肝星狀細胞增殖(Sekiya Y etal.，J.Cell.Phys1l.Vol.226，N0.10，pp.2535-2542，2011)。
[0006]美國專利申請第12/635，178號(申請於2009年12月10日)公開了微RNA-195可用於治療動脈粥樣硬化。有幾個危險因素會增加中風的風險。通過減少這些危險因素可以預防中風。2012年4月發表的今日藥物發現期刊第17卷，第7/8期，第296-309頁說明了中風的預防方法(Drug Discovery Today, Volumel7, Numbers7/8, April2012, pp.296-309) ?然而，該文獻也指出對於急性中風只有少數有效的治療方式(參見第299頁)。本領域普通技術人員了解中風的預防不同於急性中風的治療。在美國國家中風協會(Nat1nalStroke Associat1n)的網址(http://www.stroke.0rg/site/PageServer? pagename =treatment)上可以找到關於治療中風的其他信息。因此，發現miR-195抗動脈粥樣硬化的效果並不能將其外推到miR-195對急性中風的治療效果。
[0007]Kandiah Jeyaseelan等人報導miRNA參與調節腦的病理機制與中大腦動脈梗塞(MCAo)相關，並指出與相應的DNA微陣列數據比較顯示出目標mRNA的表達與miRNA的調節相關(Kandiah Jeyaseelan et al.，Stroke, March2008, pp.959-966)。該文獻亦報導在腦部缺血時，某些高度表現的miRNAs可同時在血液樣本中被檢測出；例如，在48小時再灌流的血液樣品及腦部樣品中都可以發現微RNA-195。然而，微RNA-195卻表現出相反的表達趨勢。因此，即使該領域的普通技術人員亦無法預測在缺血性中風後微RNA-195是否具有神經保護作用。
[0008]綜上所述，現有技術並沒有教導或暗示增加微RNA-195的表達量可引發神經保護作用的效果。
[0009]發明概沭
[0010]本發明還提供了一種提供神經保護作用的方法，包含向受試者給予有效量的微RNA，該微RNA選自miRNA-195、經修飾的miRNA-195以及它們的組合。
[0011]在一實施例中，該神經保護作用是通過抑制Sema3A的表達或累積而實現的。
[0012]在另一實施例中，該神經保護作用是通過抑制或預防神經元凋亡而實現的。
[0013]在另一實施例中，該神經保護作用是通過抗發炎效果來保護神經元免於細胞壓力而實現的。
[0014]在另一實施例中，該所述神經保護作用是通過降低NO的過度生產而實現的。
[0015]在進一步的實施例中，本發明所描述的miRNA被用來作為自由基清除劑或抗發炎藥物。
[0016]在另外的進一步的實施例中，該神經保護作用與神經元損傷或腦損傷或神經退化性疾病相關。
[0017]附圖簡要說明
[0018]附圖1顯示了氧糖去除(OGD) 3小時及6小時的細胞存活率降低(A圖)，且經OGD誘導的SH-S5Y5細胞中內源性miR-195降低(B圖)。
[0019]附圖2顯示了 miR-195在0GD3小時及6小時後增加細胞存活率的效果。細胞存活率在第24小時進行測定。
[0020]附圖3顯示了 miR-195影響幾個參與凋亡路徑的基因表達。miR-195增加了抗凋亡基因(BCL2)的表達但抑制兩個凋亡基因(半胱天冬酶3和FasL)。此外，miR-195對這些基因具有劑量依賴效應。
[0021]附圖4顯示了 miR-195在星狀神經膠細胞中對LPS誘導的前炎症反應的效果。
[0022]附圖5顯示了由納米粒子(NP)攜帶的miR-195在預防OGD後細胞死亡中具有劑量依賴效應。
[0023]附圖6顯示了抑制Sema3A及Cdc42的基因表達會增強SH-S5Y5細胞存活率。
[0024]附圖7顯示了 miR-195在調節Sema3A及Cdc42的蛋白水平上具有劑量依賴效應。
[0025]附圖8顯示了對誘導中風30分鐘後的中風大鼠靜脈內注射由微脂體攜帶的miR-195 (1.65-6.6納摩/公斤；在本發明中，50nM等同於3.3納摩/公斤)後減少腦部受損的劑量依賴效應。以大腦總體積的百分比來定量呈現梗塞體積。NC表示隨機打亂序列的miR0
[0026] 附圖9顯示了對誘導中風120分鐘後的中風大鼠靜脈內注射由微脂體攜帶的miR-195 (3.3納摩/公斤；在本發明中，50nM等同於3.3納摩/公斤)。
[0027]附圖10顯示了對中風大鼠30靜脈內注射LNA1。以大腦總體積的百分比來定量呈現梗塞體積。NC表示隨機打亂序列的miR。
[0028]發明的詳細描述
[0029]本發明驚奇地發現增加微RNA-195可提供神經保護作用。
[0030]除非另有說明，本文中所使用的所有專門術語、符號和其他科學名詞或術語具有本發明所屬領域中普通技術人員所熟知的含意。在某些情況下，具有熟知含意的術語是在本文中為達到明確和/或實時參考的目的所限定的，且本文中所納入的這些定義應被解釋為不一定與該領域所熟知的含義具有實質的差異。本文中所敘述或引用的許多技術與步驟均為本領域普通技術人員所熟知並且經常以常規的方法來使用。在適當情況下，除非另有說明，商業來源的試劑盒和試劑的使用程序一般均根據製造商指定的使用說明和/或參數進行。
[0031]術語「一」和「一個」是指文章中的文法對象為一個或多個(即至少一個)。
[0032]本文在權利要求中所使用的術語「或」是指「和/或」，除非有明確表示要僅僅指另一個選擇，或除非其他的選擇互相排斥。
[0033]術語「治療」是指減少病人所經歷的神經元或神經系統損害的症狀的頻率、範圍、嚴重程度和/或持續時間。
[0034]術語「預防」是指降低導致神經元或神經系統疾病的可能性。
[0035]本文中所使用的術語「受試者」是指接受微RNA或微RNA模擬物治療或基於本文中所述的類似目的而提供的治療的任何接受者。
[0036]術語miRNA、miR及微RNA可以互換使用並且是指來自內源基因的具有21_23個核苷酸的非編碼RNA，所述內源基因的作用為基因表達的後轉錄調控。這些微RNA是經RNAseIII酶Dicer由稱作miRNA前體的較長(ca70_80nt)髮夾狀前體切割而來。MiRNA在稱作miRNP的核糖核蛋白複合物中進行組合，並且經反義互補辨識它們的目標位點，從而介導它們對目標基因的下調。MiRNA與其目標位點之間接近完全的或完全的互補會造成目標mRNA的切割，而miRNA與其目標位點之間有限的互補則會造成目標基因的翻譯抑制。本文中可互換使用的「miR基因產物」、「微RNA」、「miR」或「miRNA」是指miR基因未加工或加工過的RNA轉錄物。因為miR基因產物並未翻譯成蛋白質，術語「miR基因產物」並不包括蛋白質。未加工過的miR基因轉錄物也稱作「miR前體」，且一般包含長約70-100個核苷酸的RNA轉錄物。該 miR 前體可經 RNAse (例如 Dicer、Argonaut、RNAse III (如大腸桿菌 RNAse III))消化而加工成21-23個核苷酸的活性RNA分子。該21-23個核苷酸的活性RNA分子也稱作「加工過的」 miR基因轉錄物或「成熟的」miRNA。
[0037]Pr1-miRNA是指初級miRNA轉錄物。一開始，miRNA基因先被RNA聚合酶II轉錄成長的初級1!^1?嫩(?1^-1^1?嫩)。接著逐步分區地將這些？1^-1^1?嫩加工為最終的成熟1^1?嫩。在動物中，pr1-miRNA在細胞核中由RNase III酶Drosha加工成為70-80個核苷酸的前體miRNA(pre-miRNA)。
[0038]術語「miRNA前體」是指源自基因組DNA的轉譯物，其包含非編碼的結構RNA，且該結構RNA包含一個或多個miRNA序列。例如，在某些實施例中miRNA前體是pre_miRNA。而在某些實施例中，miRNA前體是pr1-miRNA。「pre-miRNA」或「pre-miR」是指具有髮夾結構且含有miRNA的非編碼RNA。在某些實施例中，pre-miRNA是pri_miR經被稱為Drosha的雙鏈RNA特異性核糖核酸酶切割後的產物。
[0039]術語「有效量」是指miRNA或其模擬物能有效抑制和/或治療和/或預防神經元或神經系統損傷的量。例如，miRNA的有效量是指可抑制神經元或神經系統損傷和/或在一定程度上緩解與神經元或神經系統損傷所引起的疾病相關的一個或多個症狀。
[0040]一方面，本發明提供了一種提供神經保護作用的方法，包含向受試者給予有效量的微RNA，該微RNA選自miRNA-195、經修飾的miRNA-195以及它們的組合。
[0041]根據本發明，本文中所述的miRNA是指miRNA-195或其經修飾的微RNA或它們的組合。
[0042]在一實施例中，至少一經修飾的部分包含一鍵結至胺基酸殘基的鹼基以作為骨幹單元。具有至少一鍵結至胺基酸殘基的鹼基的經修飾部分將在本文中被稱為肽核酸(peptide nucleic acid(PNA))部分。這些部分具有核酸酶抗性，並為該領域所熟知。具有 PNA 部分的分子通常被稱為妝核酸(Nielson, Methods Enzymol.313，156-164(1999)；Elayadi, et al, id.；Braasch et al., B1chemistry41, 4503-4509(2002), Nielsen et al.，Science254, 1497-1500(1991))。
[0043]經修飾的miRNA-195包括，但不限於，pre-miRNA_195或miRNA中所有的嘧啶核苷酸均被它們的2』 -O-甲基類似物取代以改善miRNA的穩定性)或miRNA-195的模擬物(例如合成的雙鏈miRNA-195)。
[0044]在一實施例中，可基於現有的、可在細胞內裂解成miR-195的RNA類型，經過本文中所述的適當修飾後，設計出可用於本發明的miR-195模擬物，尤其是選擇miR-195模擬物的目標序列。經修飾的shRNA包括含有核苷酸類似物的分子，其包括在核苷鹼基、糖或骨架上具有添加、缺失、和/或取代的分子；以及交聯或經過化學修飾的分子。修飾過的核苷酸可能在該miR-195分子的某些部分或整個miR中。例如,該miR-195分子可在下列區域被修飾或含有修飾過的核酸:其5』端、其3』端或兩者都有，和/或導引鏈(guide strand)內、過渡鏈(passenger strand)內或兩者之內，和/或伸出5』端、伸出3』端或伸出5』端及3』端的核苷酸內。
[0045]在一實施例中，該miRNA-195可包含原始的人類miRNA-195 (該原始的人類miRNA-195 的序列為 UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC，即 SEQ ID NO:1)、經修飾的人類miRNA-195，例如人類 pre-miRNA-195 (該人類 pre-miRNA-195 的序列為 AGCUUCCCUGGCUCUAGCAGCACAGAAAUAUUGGCACAGGGAAGCGAGUCUGCCAAUAUUGGCUGUGCUGCUCCAGGCAGGGUGGUG，即 SEQ ID NO:2)或人類miRNA-195之模擬物。
[0046]在一實施例中，該經修飾的單鏈微RNA分子可以是微RNA分子、髮夾前體分子(hairpin precursor molecule)或其上述之等同物的任一，除非該經修飾的分子包含至少一個經修飾的部分(moiety)(即至少一部分不是未經修飾的脫氧核糖核苷酸部分或未經修飾的核糖核苷酸部分)。在此實施例中，該經修飾的微RNA分子包含最少十個部分，優選最少十三個部分，更優選最少十五個部分，再優選最少十八個部分，且最優選最少二 i 個部分。
[0047]該經修飾的微RNA分子優選包含最多五十個部分，更優選最多四十個部份，再優選最多三十個部分，最優選最多二十五個部分，且最最優選最多二十三個部分。結合上述任何最小值與上述任何最大值可得到部分之最少與最多數目的合適範圍。
[0048]各個經修飾的部分包含鍵結至骨架單元的鹼基。該骨架單元可為任何能穩定鍵結至鹼基且能形成低聚鏈(oligomeric chain)的分子單元。在本說明書中，經修飾部分的骨架單元不包括通常在天然存在的DNA或RNA分子中發現的骨架單元。
[0049]這些經修飾的微RNA分子已經增加了核酸酶抗性。因此，與僅含有未經修飾的核糖核苷酸部分、未經修飾的脫氧核糖核苷酸部分或上述兩者的序列相比，該分子的核酸酶抗性是增加的。這些經修飾的部分是該領域所熟知的並經過被評述，例如Kurreck, Eur.J.B1chem.270，1628-1644(2003)。
[0050]經修飾的部分可出現在微RNA分子上的任何位置。例如，為了保護微RNA分子免於受到3』 一5』外核酸酶的傷害，該分子可在分子的3』端具有至少一個經修飾的部分，優選是在3』端具有至少兩個經修飾的部分。如果希望保護該分子免於受到5』 一3』外核酸酶的傷害，該微RNA分子可在分子的5』端具有至少一個經修飾的部分且優選是具有至少兩個經修飾的部分。該微RNA分子也可在分子的5』端與3』端之間具有至少一個經修飾的部分且優選是具有至少兩個經修飾的部分以增加該分子對核酸內切酶的抗性。優選至少約10%的部分被修飾,更優選至少約25%的部分被修飾,甚至更優選至少約50%的部分被修飾，進一步更優選至少約75%的部分被修飾,且最優選至少約95%的部分被修飾。在一實施例中，所有的部分均被修飾(即核酸酶抗性)。
[0051]在經修飾的微RNA分子的一個實例中，該分子包含至少一個經修飾的脫氧核糖核苷酸部分。合適的經修飾的脫氧核糖核苷酸部分為該領域所熟知。這些經修飾的脫氧核糖核苷酸部分包含例如硫代磷酸化脫氧核糖基團(phosphoroth1ate deoxyribose group)作為骨架單元。另一個經修飾的脫氧核糖核苷酸部分的合適實例為N』 3-N』 5醯胺代磷酸化(phosphoroamidate)脫氧核糖核苷酸部分,其包含N』 3-N』 5醯胺代磷酸化脫氧核糖基團(phosphoroamidate deoxyribose group)作為骨架單兀。
[0052]一個經修飾的核糖核苷酸部分的合適實例為在2』 -氧原子及4』 -碳原子間具有亞甲基橋(methylene bridge)的核糖核苷酸。一個包含在2』-氧原子及4』-碳原子間具有亞甲基橋的核糖核苷酸部分的寡核糖核苷酸分子通常被稱為鎖核酸(locked nucleicacid (LNA)) ? 例如見 Kurreck et al., Nucleic Acids Res.30, 1911-1918 (2002) ；Elayadiet al., Curr.0pin1n Invest.Drugs2, 558-561 (2001) ；0rum et al., Curr.0pin1n Mol.Ther.3, 239-243(2001) ；Koshkin et al., Tetrahedron54, 3607-3630 (1998) ；0bika etal., Tetrahedron Lett.39，5401-5404 (1998)。鎖核酸可購自 Proligo (Paris, France andBoulder, Col0.，USA.)。本發明中的mir-RNA及其模擬物可以是「LNA修飾過的寡聚物」，其含有至少一個或多個LNA單體。在一些實施例中，該LNA修飾過的miR-195序列包括，但不限於下列序列。下列序列中經過該LNA修飾的核苷酸被加上下劃線。
[0053]miR-195LNAl:UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC(SEQ ID NO:3)
[0054]miR-195LNA2:TAGCAGCACAGAAAUAUUGGC (SEQ ID NO:4)
[0055]miR-195LNA3:TAGCAGCACAGAAATATTGGC (SEQ ID NO:5)
[0056]miR-195LNA4:TAGCAGCACAGAAATATTGGC (SEQ ID NO:6)
[0057]miR-195LNA5:TAGCAGCACAGAAATATTGGC(SEQ ID NO:7)
[0058]在另一個實施例中，miRNA可以與一納米粒子結合。因此，本發明提供了一種醫藥混合物，其包含miRNA或其經修飾過並與一納米粒子結合的miRNA。優選地,該納米粒子為微脂體、微胞、金屬納米粒子或聚合物納米粒子。納米粒子是界定為尺寸範圍為1-1OOOnm的微粒分散體或固體顆粒。納米粒子可以由各種材料(例如脂質、蛋白質、多糖及合成聚合物)製備。根據製備方法可獲得納米粒子、納米球或納米膠囊。納米膠囊是一種系統，其中的試劑被限定在一環繞有獨特聚合物膜的腔體中，而納米球是一種基質系統，其中的藥物完全被物理性地均勻地分散。納米粒子最常利用三種方法來製備:(I)分散預製的聚合物；(2)聚合單體；和(3)親水性聚合物的離子凝膠化或凝聚(coacervat1n)。然而,文獻中也描述了製造納米粒子的其他方法，例如超臨界流體技術及非潮溼模板中的顆粒複製(particle replicat1n in non-wetting templates(PRINT))。
[0059]本發明中的miRNA分子可從miR前體通過自然加工路徑(例如使用完整細胞或細胞裂解物)或通過合成加工路徑(例如使用分離的加工酶，如分離的Dicer、Argonaut或RNAse III)來獲得。應了解到miRNA分子也可由生物或化學合成來直接製備，而不需經過miR前體的加工。當在本文中以名稱稱呼miRNA時，除非另有說明，該名稱既對應至該前體也對應至該成熟的形式。
[0060]微RNA可以在體內經稱為Dicer及Drosha的酶由pre-miRNA產生,該酶專一性地將長pre-miRNA加工為功能性miRNA。作為本發明特色的該miRNA或前體miRNA可以在體內經基於細胞的系統合成或被化學合成。MiRNA可以被合成為包含修飾以給予所希望的特性。例如，該修飾可以增強穩定性、與目標核酸的雜交熱力學、靶向至特定組織或細胞類型、或者細胞滲透性，例如通過依賴於內吞作用或獨立於內吞作用的機制。修飾也可增加序列特異性，從而降低祀向至位點外的機率(off-site targeting)。合成及化學修飾方法在下面將有更詳細的描述。
[0061]miRNA或pre_miRNA可被設計併合成為包含非互補區(即長度為3、4、5或6個核苷酸的區域)，其兩側為足夠互補區(即長度為7、8、9、10或11個核苷酸的區域)以形成雙鏈。該miRNA序列可包含2』 -O- 甲基、2』 -氣、2』 -O-甲氧乙基、2』 -O-胺丙基、2』 -胺基和/或硫代磷酸酯鍵合以增加核酸酶抗性和/或與目標的結合親和力。寡核苷酸骨架中嵌入呋喃糖也可降低內核分離(endonucleolytic cleavage)。miRNA或pre-miRNA可進一步修飾成包含3』-陽離子基團，或通過顛倒具有3』-3』鍵合的3』-端核苷酸進行修飾。或者，該3』 -端可以被胺烷基基團封閉，例如3』 -C5-胺烷基dT。其他的3』 -共軛物可以抑制3』 -5』的核酸外切裂解。
[0062]在一實施例中，miRNA或pre-miRNA包括增強靶向能力的修飾，例如上述的靶向修飾。將miRNA分子靶向至特定細胞種類的修飾實例包括碳水化合物，如半乳糖、N-乙醯半乳胺糖、甘露糖；維生素，如葉酸；其它配體，如RGDS和RGD模擬物；及小分子或其它已知的蛋白結合分子。
[0063]miRNA或pre-miRNA可以利用化學合成和/或利用該領域熟知的酶連接反應(enzymatic ligat1n react1n)進行建構。例如，miRNA 或 pre-miRNA 可以利用天然生成的核苷酸或各種經過修飾的核苷酸來進行化學合成，其中經過修飾的核苷酸被設計成可增加該分子的生物穩定性或增加在miRNA或pre-miRNA及目標核酸之間所形成的雙鏈的物理穩定性，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物及經吖啶取代的核苷酸。其他合適的核酸修飾也在本文中敘述。或者，可以利用其中插入有已在反義方向亞克隆的核酸的表現載體對該miRNA或pre-miRNA核酸進行生物性製造,亦即，從插入的核酸轉錄出的RNA將會是感興趣的目標核酸的反義方向。
[0064]根據本發明，miRNA或其修飾可用於提供神經保護作用，即指預防或減少包括神經元和神經膠細胞的神經細胞死亡或損傷的能力，或是挽救神經細胞或使神經細胞復甦或復原的能力，例如在大腦、中樞神經系統或周圍神經系統的病理或有害條件下。神經保護作用包括神經細胞的再生，即疾病或外傷後一群神經細胞的再生長。神經保護作用是在神經系統中用來防止急性疾病(如中風或腦部或神經系統損傷/創傷、缺氧、脊髓損傷或周圍神經損傷)後或慢性神經變性疾病(如帕金森氏症、阿茲海默症、多發性硬化症)所引起的大腦/神經元損傷或退化的機制及策略。神經保護作用的目標在於限制神經系統損傷後的神經功能障礙/死亡並試圖在大腦中保持儘可能高度完整的細胞相互作用以使神經功能不受幹擾。通過提供神經保護作用，miRNA或其變異體可用來治療神經元損傷(如中風，尤其是缺血性中風、腦損傷、缺氧、脊髓損傷或周圍神經損傷)及治療/或預防神經退化性疾病。因此，在一實施例中，本發明涉及使用微RNA作為活性成分用於製備神經細胞再生的藥物。換句話說，本發明涉及用於神經細胞保護和/或再生的微RNA。同樣地，本發明涉及一種保護和/或再生神經細胞的方法，包含向有需要的受試者給予有效量的微RNA或其模擬物。
[0065]神經保護作用可通過例如測量神經元死亡的延遲或預防來直接測定，像是例如在培養的大腦皮質神經細胞中給予壓力後凋亡神經元的數目減少。神經保護作用也可通過例如在經過該壓力後測量神經系統的組織或器官遭受損害的嚴重性或程度或功能喪失來直接測定，像是例如測量中大腦動脈梗塞(MCAO)或再灌流損傷後腦栓塞大小的減少程度。神經保護作用也可通過核磁共振造影(測量大腦體積、神經纖維追蹤(tractography)、由光譜看出的N-乙醯基-天門冬鹽酸(N-acetyl-asparte)水平)或是通過光學同調成像的視網膜成像(視神經纖維層細化)或視網膜光譜(細胞色素C、氧合血紅素、乳酸、穀氨酸鹽、iNOS的水平)來判定。或者，神經保護作用可通過檢測用於保護神經元的一個或多個生物學機制是否活化來間接地確定，包括但不限於，檢測Sema3路徑的活化或減少產生自神經元中iNOS的NO的過量生產以停止神經細胞死亡。
[0066]根據本發明，該miRNA-195具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列。在另一實施例中，miRNA或其變異體與納米粒子結合。優選地，該納米粒子為微脂體、微胞、金屬納米粒子或聚合物納米粒子。
[0067]在一特定的實施例中，微脂體是用來將miRNA產物傳送至受試者。微脂體也可增加核酸的血中半衰期。用於本發明的合適的微脂體可形成自標準的成囊泡脂質(vesicle-forming lipid),其通常包括中性或帶負電的磷脂和固醇,如膽固醇。脂質的選擇通常會考慮一些因素，如預期的微脂體大小以及微脂體在血流中的半衰期。用於製備微脂體的各種方法為熟知，例如如同在美國專利第4，235，871、4，501，728、4，837，028及5，019，369號中所述，其全部公開的內容皆併入本文中作為參考。
[0068]經抑制調理作用部分修飾的微脂體留在循環系統中的時間遠長於未經修飾的微脂體。出於這個原因，該些微脂體有時被稱為「隱形」微脂體(stealth liposome) 0已知隱形微脂體會由多孔或「有漏洞」(leaky)的微血管漏出而積聚在組織中。因此，以該種微血管缺陷為特徵的組織，例如固態腫瘤，將會有效地累積這些微脂體，見Gabizon，etal.(1988), Proc.Natl.Acad.Sc1., U.S.A., 18:6949-53。
[0069] 用於本發明方法中的微脂體可包含將該微脂體靶向至目標細胞的配體分子。用於本發明方法中的微脂體也可被修飾以避免被單核巨噬細胞系統(MMS)及網狀內皮系統(RES)清除。該些經修飾的微脂體在表面上具有抑制調理作用的部分，或者該抑制調理作用的部分整合到微脂體結構中。在一特定優選的實施例中，本發明的微脂體可同時包含抑制調理作用的部分及一配體。
[0070]因此，本發明發現miRNA-195在提供神經保護作用上具有一些有益的作用和功能，使得miRNA-195可以用來治療神經元或腦損傷以及治療/或預防神經退化性疾病，包括急性或慢性神經變性疾病。
[0071]本文中所使用的術語「神經退化性疾病」也用來描述由中樞神經系統的損害所引起的急性、漸進性或慢性疾病，且該損害根據本發明可通過微RNA治療來減少和/或減輕，微RNA可直接投入但優選通過全身途徑以允許細胞或其可溶性因子到達患者的腦和/或脊髓的受損區域。術語「急性神經退化性疾病」是指突然發生的疾病或病症，其導致相關的神經元死亡或損傷。作為示例的急性神經退化性疾病包括腦血管供血不足(cerebrovascular insufficiency)、病灶性或瀰漫性腦外傷、脊髓損傷、大腦缺血或梗塞，包括栓塞性阻塞(emolic occlus1n)及血栓性阻塞(thrombotic occlus1n)、周產其月之缺氧缺血腦病變(perinatal hypoxic-1schemia)、新生兒缺氧缺血性腦病(neonatalhypoxia-1schaemic encephalopathy) >Sr5ijLMl/iz:S9S；B (perinatal asphyxia) >
髒驟停(cardiac arrest)、盧頁內出血(intracranial hemorrhage)、蜘蛛膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage)、中風及創傷性腦損傷(traumatic brain injury)。在一實施例中，該神經退化性疾病為顱內出血或蜘蛛膜下腔出血。蜘蛛膜下腔出血(SAH)是指血液進入蜘蛛膜下腔一蜘蛛膜與軟腦膜之間環繞腦部的區域。這可能會自發性地發生，通常源自於腦動脈瘤破裂，或可能源自頭部損傷。SAH的症狀包括突發的劇烈頭痛、嘔吐、混亂(confus1n)或意識水平下降,有時會癲癇發作。診斷時通常以頭部CT掃描確認,或偶爾會以腰椎穿刺確認。治療是通過快速的神經外科手術或伴隨藥物的放射線導引介入性治療以及其他治療以幫助預防復發的出血和併發症的復發。SAH是一種急症(medical emergency)並可能導致死亡或嚴重殘疾一即使在早期階段便被識別和治療。經歷SAH存活的患者往往有神經上或認知上的功能障礙。
[0072]可利用本發明的方法治療的神經退化性疾病的範例包括例如帕金森氏症、杭丁頓症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)、阿茲海默症、雷特氏症(Rett Syndrome)、溶素體儲積病(lysosomal storage diseases)(例如如同Folkerth, J.Neuropath.Exp.Neur0., Septemberl999, 58:9 中所描述的「白質病(whitematter disease) 」 或神經膠質脫髓鞘症(glial demyelinat1n disease)),包括聖菲利柏氏症(Sanfillippo)、高雪氏症(Gaucher disease)、戴薩克斯症(Tay Sachs disease)(β -己糖胺酶缺乏症)、其他的遺傳性疾病、多發性硬化症、缺血引起的腦損傷或創傷、意外事故、來自環境的傷害等等、脊髓損傷、運動失調(ataxia)及酒精中毒。此外，本發明可用於減少和/或減輕中風或心臟病發作的患者對中樞神經系統的影響，或者該影響是因為患者的血流量不足或腦部中某個位點缺血所造成的，或者來自腦和/或脊髓的物理損傷。神經退化性疾病亦包括神經發展障礙症(neurodevelopmental disorder),包括例如腦性麻痺(cerebral palsy)、自閉症及相關神經疾病如在眾多疾病之中的精神分裂症。
[0073]本發明進一步提供一種預防或治療神經元退化性疾病(如阿茲海默症(Alzheimer’s dementia (AD))或帕金森氏症(Parkinson disease (PD)))的方法，該方法包含提供該mir-RNA、mir-195模擬物以在受試者或患者中抑制Sema3A的表達、累積或活性。
[0074]預防或治療AD或H)的方法包含向需要該種治療的患者給予有效量的m1-RNA或m1-RNA物質，該m1-RNA會抑制Sema3A的表達、累積或活性。
[0075]「受試者」或「患者」是可能發展為AD或H)的人類或動物，更特定為哺乳類，優選為人類、嚙齒類動物或靈長類動物，如上面在診斷應用中所述。術語「預防」是指預防AD或PD的發生，即是指預防性地幹預造成該疾病的病理機制。在本發明的上下文中，這樣的病理機制可為Sema3A表達或累積的增加。該患者可以是發展為該疾病的風險增加的受試者。舉例來說，對於AD而言，該受試者可能具有發展澱粉樣變性病(amyloidosis)的遺傳易染病體質，例如來自家族中有成員帶有家族性AD (familial AD(FAD))的人。或者，某人在他或她七、八十歲時有較高的風險罹患與年齡相關的阿茲海默症。
[0076]本文中所使用的術語「治療有效量」是指足夠量或足夠劑量的miRNA，例如mir-195，其可減少Sema3A活性水平，例如，減少約10%，優選約50%，且更優選90%。優選地，治療有效量可改善或呈現臨床上有意義的Sema3A活性、功能和效果的衰退。或者,治療有效量的miRNA，例如mir-195，足以造成經給予的受試者在臨床上發生顯著改善的條件。
[0077]Mir-195的抑制活性可通過其他細胞內信號傳遞的合作夥伴，⑶C42，和其下遊的效應器，例如上調的BCL2和下調的半胱天冬酶3(Caspase3)，直接對抗Sema3A以預防神經元凋亡。
[0078]在一實施例中，本發明中的miRNA顯示了抗發炎特性，可保護神經元免於各種細胞壓力，如興奮性毒性和氧化壓力(oxidative stress)等等、脊髓損傷、運動失調和酒精中毒，證實了在哺乳動物CNS中會保護數量最多的非興奮性星狀細胞。
[0079]在關於活化星狀細胞介導的神經細胞死亡的進一步實例中，本發明的miRNA減少了神經元中經由iNOS產生的NO的過度生產，以停止神經細胞死亡。
[0080]本發明的miRNA利用活性含氧物產生與抗氧化劑活性之間的不平衡，稱為氧化壓力，來作為有效的自由基清除劑以及抗發炎藥物，並在LPS誘導的iNOS表達測試中證實可減少iNOS活性。因此，本發明的miRNA會減輕神經元損傷導致的缺氧性傷害，並與各式各樣的人類CNS退化性疾病，包括阿茲海默症、帕金森氏症，和病理狀態，如局部缺血，相關聯。
[0081]本發明的miRNA進一步可用於對任何合適的局部缺血(ischemia)的治療。本文中所提及的局部缺血是指流向器官和/或組織的血流量減少。減少的血流量可能是由任何適當的機制所引起的，包括供應血液至該器官和/或組織的一條或多條血管的部分或全部堵塞(梗塞)、變窄(收縮)和/或缺口 /破裂等等。因此，局部缺血可能是由血栓、栓塞、動脈粥狀硬化、高血壓、出血、動脈瘤、手術、創傷、藥物和/或其類似物所引起的。因此減少的血流量可能為慢性的、短暫的、急性的、偶爾發生的和/或與上述類似的性質。
[0082]本發明進一步的目標是提供對中風的治療。本文中所提及的中風是指腦缺血，其是因為供應到部分(或全部)腦部的血液供應到部份(或全部)腦部減少所產生之的腦缺血。中風產生的症狀可能是突然的(如失去知覺)，也可以是一個為期數小時或數天的漸進式發病。此外，該中風可能是重大的腦缺血發作(全面中風(full stroke))或較輕微的短暫性腦缺血發作等。中風產生的症狀可能包括例如半身輕癱、半身不遂、一側麻木、一側無力、一側麻痺、暫時的四肢無力、四肢發麻、神智不清、說話困難、無法理解別人說的話、單眼或雙眼無法看到、視力模糊、視力減退、行走困難、頭暈、容易跌倒、喪失協調性、突發劇烈頭痛、呼吸聲嘈雜及和/或意識喪失。或者，或是此外，症狀可能更容易被檢測出或只能透過通過試驗及和/或儀器檢測，例如缺血試驗(如檢測改變的白蛋白，特別是蛋白異構體、損壞的蛋白質等)、心電圖、腦電圖、運動壓力測試和/或它們的類似物。
[0083]本發明的miRNA提供對缺血受試者的治療以減輕缺血對該受試者所造成的傷害。本文中所提及的缺血受試者是任何有局部缺血、缺血相關病況、缺血歷史和/或在治療開始之後及在治療仍然有效的一段時間期間內有顯著機會發展為缺血的人(人類受試者)或動物(動物受試者)。
[0084]缺血治療受試者的選擇可以採用任何合適的標準。標準的範例可以包括任何可檢測出的缺血症狀、缺血歷史、增加(或減少)缺血風險的事件(如外科方法、創傷、藥物投予等)和/或其類似物。缺血歷史可能涉及一個或多個先前的缺血性發作。在一些實例中，選擇治療的受試者可能在治療開始前的至少約一、二或三小時有出現缺血發病，或是在治療開始前少於約一天、十二小時或六小時內有多個缺血性發作(如暫時性腦缺血)。
[0085]該領域普通技術人員可通過考慮如下因素來決定要給予既定受試者的miRNA產品的有效量:例如受試者的大小和重量；疾病的嚴度程度；該受試者的年齡、健康和性別；給藥途徑；和局部或全身給藥，。例如，可以基於給藥受試者的大致重量來確定分離的miRNA產品的有效量。基於受試者重量所確定的分離的miRNA產品的有效量範圍可以是約
1.0納摩(nanomole) /公斤至約15.0納摩/公斤的範圍。優選地，該量是約3.0至約10.0納摩/公斤或約3.0至約7.0納摩/公斤。更佳優選地，該量是約3.3至約6.6納摩/公斤。
[0086]該領域普通技術人員也可以輕易地確定給予既定受試者的分離的miRNA產品的大致給藥方案。例如，miRNA產品可給予受試者一次或兩次。當治療方案包含多次給藥時，可理解為給予給該受試者的miRNA產品的有效量可以包含整個治療方案中給予的產品總量。
[0087]miRNA也可以通過任何合適的腸內或腸外給藥途徑給予受試者。本發明的方法中合適的腸內給藥途徑包括如口服、直腸、或鼻內給藥。合適的腸外給藥途徑包括如血管內給藥(例如靜脈單次全劑量注射(intravenous bolus inject1n)、靜脈輸液、動脈內單次全劑量注射、動脈灌注及導管滴注至血管)；組織周圍和組織內注射(例如肌肉內注射、腫瘤周圍和瘤內注射、視網膜內注射或視網膜下注射)；皮下注射或沉積，包括皮下輸注(如透過滲透幫浦)；直接給予至目標組織，例如通過導管或其他放置裝置(例如一視網膜顆粒(retinal pellet)或栓劑或包含一多孔、非多孔、或者凝膠狀物質的植入物)；以及吸入。特別合適的給藥途徑為注射、輸液和直接注射給靶標。
[0088]本文引用的所有出版物的相關教導，若沒有明確地被納入參考，其全部內容仍併入本文中作為參考。雖然本發明已經特別展示及描述了供參考的較佳實施例，本領域普通技術人員將了解到，在不脫離所附的權利要求包含的本發明範圍的情況下，可以在其中進行形式和細節上的各種改變。
實施例
[0089]實施例lMiR-195的神經保護作用分析試驗
[0090]作為神經元損傷的體外模型，測試了 miR-195在氧糖去除(oxygen-glucosedeprivat1n (OGD))的神經母細胞瘤細胞株細胞系(SH-SY5Y)中的神經保護效果，作為神經元損傷的體外模型。在0GD6小時後，miR-195的內源表達顯著降低(62% )(見附圖1B)，且與對照組相比，0GD3小時後SH-SY5Y的細胞存活率減少降低35%，而0GD6小時後減少降低55% (見附圖1A)。為了測定miR-195在OGD下在SH-SY5Y的保護效果中扮演的角色，用Lipofectamine2000 試劑(Invitrogen, CA, USA)將 miR-195 模擬物轉染進細胞中。用二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽(MTT ；Sigma-Aldrich, MO, USA)評估miR-195誘導的細胞存活率程度。MiR-195模擬物(濃度在25-100nM之間)在0GD3小時和6小時時對細胞存活率的治療效果顯示於附圖2。如圖2所示，miR-195在挽救損傷細胞時具有劑量依賴效應。因此，該體外研究顯示出miR-195具有神經保護的潛力。
[0091]為了研究miR-195對凋亡信號傳遞途徑的影響，也採用蛋白免疫印跡法(westernblot)對OGD誘導的SH-SY5Y細胞死亡中B細胞淋巴瘤2 (Bcl-2)、Fas配體(FasL)和半胱天冬酶3蛋白水平的變化進行了評估。結果發現miR-195的治療增加了 SH-SY5Y中Bcl_2，一種抗凋亡因子，的蛋白濃度。MiR-195的治療也大大地降低了凋亡因子FasL和半胱天冬酶3的蛋白水平(圖3)。
[0092]脂多醣(LPS)誘導的星狀神經膠細胞增生(astrogl1sis):經LPS刺激的初代培養的星狀神經膠細胞系一是被廣泛被接受的體外模型，用來仿真星狀神經膠細胞在腦損傷(包括中風)時的再活化。星狀神經膠細胞中的誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)有助於大腦的炎症反應。iNOS可以在缺血性中風後重新被誘導。在缺血性中風的嚙齒類動物模型中抑制iNOS活性或iNOS基因缺失提供了神經保護作用。缺血會誘導出COX - 2且COX - 2在腦損傷後具有興奮性毒性。為了研究miR-195對初代星狀神經膠細胞的影響，將小鼠麻醉然後斷頭。小心地移出大腦皮層並使其均勻化進行勻漿。稀釋細胞懸浮液，將細胞接種在燒瓶中。通過軌道搖動燒瓶去除小神經膠質細胞和寡樹突細胞。倒出懸浮的細胞以得到附著在底部的純星狀神經膠細胞層。將純化的星狀神經膠細胞進行繼代培養，然後用LPS處理I小時。使用實時PCR以測量誘導型一氧化碳合成酶(iNOS)及C0X-2的mRNA水平。使用蛋白免疫印跡法以測量iNOS及C0X-2的蛋白表達(見附圖4)。結果發現miR-195可減少有害的iNOS及C0X-2，在星狀神經膠細胞中發揮神經保護作用。
[0093]隨後，我們使用攜帶有miR-195的納米粒子(NPniR-195)來重複相同的OGD細胞研究。在0GD6小時時，用細胞毒性檢測試劑盒(乳糖脫氫酶，LDH5Roche)分析細胞死亡的資料。6小時的OGD有力地促進了 LDH分泌，比基礎濃度多了 47%。然而，在NP-miR-195的存在下，LDH被有效地抑制了 49% (25nM ;附圖5)。
[0094]此外，使用祀向至Sema3A的shRNA(ShSema3A)以抑制Sema3A和下遊的Cdc42的基因表達，來證實細胞存活率增加。結果顯示抑制Sema3A的基因表達會增強SH-S5Y5的細胞存活率(見附圖6)。附圖6中，(A)用定量實時PCR測定Sema3A mRNA水平的改變。(B及C)用細胞計數和LDH的釋放來測量經OGD處理的細胞存活率。⑶用定量實時PCR測定在經3小時及6小時OGD處理的細胞中被shSema3A抑制的Cdc42mRNA。數據為三個實驗的平均值土SD ;*P〈0.05及**P〈0.01，對照細胞未暴露在OGD下。使用隨機打亂序列的shRNA作為轉染對照組。以miR-195模擬物或NC-miR轉染經OGD處理3小時或6小時的Sh_S5Y5細胞。在培養第24小時時用蛋白免疫印跡法檢測細胞中的Sema3A、Cdc42及Nrp-1蛋白水平。附圖7顯示了 MiR-195調節Sema3A及Cdc42的蛋白水平。
[0095]實施例2納米粒子攜帶的miR-195的體內神經保護作用分析試驗
[0096]使用SD雄鼠(280至350g)，以先前報導的手術方法誘導中大腦動脈梗塞(MCAO)(Candelar1-Jalil, E.et al.Effects of the eyelooxygenase-2inhibitor nimesulideon cerebral infarct1n and neurological deficits induced by permanent middlecerebral artery occlus1n in the rat.J.Neuroinflammat1n2, 3, 2005)。將一個尖端經過娃修飾的 3-0 尼龍細絲(Spratt, N.J.et al.Modificat1n of the methodof thread manufacture improves stroke induct1n rate and reduces mortalityafter thread—occlus1n of the middle cerebral artery in young or aged rats.J.Neurosc1.Methodsl55, 285-290, 2006)插入右頸總動脈(CCA)上的一個小缺口並且推進到超出頸動脈分叉處約22mm。隨後，沿著CCA喙端到該缺口紮好手術縫合線以固定該尼龍細絲並封住血管。以手術縫合線關閉皮膚切口並用抗生素軟膏局部治療。納米粒子由於其粒徑小，使得它們較容易通過血腦屏障，因此已被提倡作為一個中樞神經系統疾病理想的藥物載體。微脂體納米粒子作為一種更理想的藥物載體，已被用來攜帶miR-195。在本研究中，使用市售的微脂體來攜帶miR-195。該市售的微脂體納米粒子將miR-195整合入半乾燥製劑，其由天然脂質、非離子清潔劑、油和小分子所組成，來自MaxSuppressor的體內RNALancerII試劑盒(ΒΙ00 Scientific, Inc.)。簡而言之,在試劑盒的單一玻璃皿中，於無菌無RNA酶的10X PBS存在下,混合微脂體乳液(liposome emuls1n)和miR-195 (100 μ g)(I:2w/w miR-195-磷脂-乳化油)至儲存濃度為10-20mg/mL。為了增加包囊效率並減少微脂體的大小，將微脂體乳液在室溫下超聲波水浴中高頻聲波降解5分鐘。
[0097]納米粒子的實驗結果大有可為且令人興奮。詳細的流程如下:在由MCAO誘導的中風30分鐘或2小時後，經尾靜脈注射(量的大小為150mm3)靜脈內(1.V.)給予微脂體所攜帶的配製好的miR-195。
[0098]處理二十四小時後，將大鼠安樂死並斷頭。收集大鼠大腦並切成2mm的冠狀切面，並以 0.1 % 的 2，3，5-氯化三苯四銼(TTC)染色(Joshi, C.N.，Jain, S.K.&Murthy, P.S.Anoptimized triphenyltetrazoIium chloride method for identificat1n of cerebralinfarcts.Brain Res.13，11-17，2004)。以平臺掃瞄器掃描染色好的大腦切片。根據Lin等人的方法，以ImageJ(vers1nl.40, NIH, Bethesda, MD, USA)測量和處理梗塞的區域(Lin, T.N., He, Y.Y., ffu, G., Khan, M.&Hsu, C.Y.Effect of brain edema on infarctvolume in a focal cerebral ischemia model in rats.Stroke24, 117-121，1993)。
[0099]測量梗塞的區域。當miR-195在誘導中風的30分鐘後給予時，劑量為3.3納摩/公斤的處理可減少梗塞體積40%，而劑量為6.6納摩/公斤的處理可減少梗塞體積60%(見附圖8)。當miR-195在誘導中風的2小時後給予時，劑量為3.3納摩/公斤的處理仍可減少梗塞體積40% (附圖9)。
[0100]根據上述提及的大鼠體內神經保護作用分析試驗，使用本發明經LNA修飾的微RNA195處理中風大鼠。結果顯示經LNA修飾的微RNA195(如LNA1、LNA2、LNA3、LNA4及LNA5)提供了顯著的治療效果。如附圖10所示，與隨機打亂序列的LNA-NC-miR相比，LNAl的平均治療效果為減少梗塞體積30%，而LNA5甚至可減少梗塞體積58%。
【權利要求】
1.一種提供神經保護作用的方法，包含向受試者給予有效量的微RNA，所述微RNA選自miRNA-195、經修飾的miRNA_195以及它們的組合。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述微RNA為miRNA-195。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述經修飾的miRNA-195為經LNA修飾的miRNA-195。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述miRNA具有選自SEQID NOs: 1_7所示的序列。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述miRNA具有SEQID NO:1或SEQ ID N0:2所示的序列。
6.如權利要求 1所述的方法,其中所述miRNA-195的用量範圍從1.0至10.0納摩/公斤。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述miRNA-195的用量範圍從3.0至10.0納摩/公斤。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述miRNA-195得自其模擬物。
9.如權利要求1所述的方法，其中所述miRNA可與納米粒子結合。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述納米粒子為微脂體、微胞、金屬納米粒子或聚合物納米粒子。
11.如權利要求9所述的方法，其中所述納米粒子為微脂體。
12.如權利要求1所述的方法，其中所述神經保護作用是通過抑制Sema3A的表達或累積而實現的。
13.如權利要求1所述的方法，其中所述神經保護作用是通過抑制或預防神經元凋亡而實現的。
14.如權利要求1所述的方法，其中所述神經保護作用是通過抗發炎效果來保護神經元免於細胞壓力而實現的。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述壓力為興奮性毒性壓力、氧化壓力、或由脊髓損傷、運動失調或酒精中毒所造成的壓力。
16.如權利要求1所述的方法，其中所述神經保護作用是通過降低NO的過度生產而實現的。
17.如權利要求1所述的方法，其中所述miRNA被用來作為自由基清除劑或抗發炎藥物。
18.如權利要求1所述的方法，其中所述神經保護作用與神經元損傷或腦損傷或神經退化性疾病相關。
19.如權利要求1所述的方法，其中所述神經退化性疾病為急性或慢性神經退化性疾病。
20.如權利要求1所述的方法，其中所述神經保護作用與腦血管供血不足、病灶性或瀰漫性腦外傷、脊髓損傷、大腦缺血或梗塞、帕金森氏症、杭丁頓症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、阿茲海默症、雷特氏症、溶素體儲積病或多發性硬化症、缺氧、脊髓損傷、周圍神經損傷或中風相關。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述大腦缺血或梗塞為栓塞性阻塞及血栓性阻塞、周產期之缺氧缺血腦病變、新生兒缺氧缺血性腦病、新生兒周產期窒息、心臟驟停、顱內出血、蜘蛛膜下腔出血、中風或創傷性腦損傷。
22.如權利要求21所述的方法，其中所述中風為缺血性中風。
23.一種修飾的miR NA-195，其具有選自由SEQ ID NOs: 3_7所組成的組的序列。
【文檔編號】C12N15/11GK104080910SQ201280053577
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2012年11月5日 優先權日:2011年11月3日
【發明者】卓夙航, 王永松, 鄭欣芸 申請人:高雄醫學大學