花粉發育相關的ABC轉運蛋白或其編碼基因的用途、培育植物不育系的方法及植物育種方法與流程

2024-03-28 13:29:05

本發明涉及農業和生物
技術領域：
，尤其涉及一種創製溫敏不育系的方法及其在植物育種中的應用。
背景技術：
：在農業生產中，由於傳統去雄手段耗時費力，雄性不育系在雜交制種，提高農業產量中有巨大的優勢。雄性不育往往被分為細胞質雄性不育(CMS)以及細胞核雄性不育(GMS)。三系雜交體系的建立依賴於細胞質雄性不育。然而，有幾個缺點阻礙了三系配套雜交在實踐中的廣泛應用。首先，細胞質雄性不育植株普遍存在著品質較差的問題；其次，三系雜交水稻的組合增產潛力越來越小。再次，由於野敗類型的雄性不育細胞質單一，一旦胞質不育喪失或某種毀滅性病蟲害發生，會造成巨大損失。隨著細胞核雄性不育中光溫敏條件性雄性不育的發現，兩系法雜交水稻應運而生。相對於三系雜交法，光溫敏不育系兼有不育系和保持系兩種狀態。與三系法相比，兩系法具有不受恢保關係的限制，即核不育可以與大量常規品種雜交，配組自由，因而更容易獲得優良性狀的雜交優勢，從根本上解決三系中雄性不育細胞質單一化的問題。近年來，兩系雜交水稻在中國農業生產中的應用越來越廣泛。早在1973年,石明松在中國湖北省從晚粳品種(Oryzasativassp.japonica)農墾58中選育出光敏感不育系並提出了一系兩用的水稻雜種優勢利用新途徑。隨後，以農墾58S(NK58S)為父本，與秈稻雜交獲得的培矮64S(PA64S)也在兩系雜交中得到廣泛應用。但培矮64S的育性對於溫度的變化更加敏感。在水稻中，光溫敏不育系受到單基因隱性位點控制。最近的研究表明，農墾58S與培矮64S的不育性狀受到同一個遺傳位點的控制，而溫度和光照都會對該位點產生影響，這些發現使人們對光溫敏育性轉換的分子機制更加難以理解。目前為止，水稻中共有十三個光溫敏不育系被發現：pms1,pms2,pms3,rpms1,rpms2,tms1,tms2,tms3,tms4,tms5,tms6,rtms1以及Ms-h，分別定位在第7,3,12,8,9,8,7,6,2,2,5,10和9條染色體上。光溫敏不育在番茄，玉米以及小麥中也有報導。最近的研究發現，一個突變的小RNA(smallRNA),osa-smR5864m,導致pms2以及p/tms2-1(農墾58S和培矮64S)突變體的不育表型。然而，光溫敏不育的分子機理仍然不清楚，使得人們缺乏有效的理論支持和技術手段來解決兩系育種中實際問題。鑑於擬南芥較小的基因組，快速的生長周期以及大量的突變體庫等無可比擬的優勢，使其在植物生物學研究領域成為模式植物。此外，擬南芥能夠在嚴格控制溫度，光照等條件的狹小空間中進行培養。前人的研究發現了一些擬南芥條件不育突變體，如PEAMT基因突變體t365以及GA/IAA生物合成受阻的ms33突變體都表現為溫敏不育表型。然而，目前本領域中尚缺少調控方式簡便的植物不育系用於植物育種過程中，因此迫切需要調控方式簡單方便的植物不育系培育技術。技術實現要素：本發明的目的是提供一種培育植物溫敏不育系的方法，包括降低花粉發育相關的ABC轉運蛋白表達或活性來創製溫敏植物材料，從而解決目前核不育溫敏遺傳位點少，制種純度不高的問題。在本發明的第一方面，提供了一種培育植物不育系的方法，包括步驟：降低所述植物植株中花粉發育相關的ABC轉運蛋白的表達或活性。在另一優選例中，所述的ABC轉運蛋白參與所述植物的花粉發育過程的花粉外壁形成。在另一優選例中，所述的ABC轉運蛋白將花粉外壁前提物質從絨氈層中轉運到花粉上。在另一優選例中，所述的「降低」是指將所述植株中在花粉發育過程中ABC轉運蛋白的表達活性降低滿足以下條件：A1/A0的比值≤80％，較佳地≤60％，更佳地≤40％，最佳地為0-30％；其中，A1為所述植株中花粉發育相關的ABC轉運蛋白活性；A0為野生型同種類型植物植株中相同ABC轉運蛋白活性。在另一優選例中，所述ABC轉運蛋白為ABCG26或其同源蛋白。在另一優選例中，所述ABCG26的野生型胺基酸序列選自下組：SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3、SEQIDNO.:4、SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:6。在另一優選例中，所述ABC轉運蛋白是選自下組的細胞、組織或器官中特異性表達的：植物花序以及花葯中。在另一優選例中，所述細胞或組織包括：絨氈層。在另一優選例中，所述ABC轉運蛋白在花葯發育期特異性表達。在另一優選例中，所述的花葯發育期包括前花葯形成階段(-3天～0天)、花葯形成階段、後花葯形成階段(花葯形成後1-5天)。在另一優選例中，所述ABC轉運蛋白在花葯發育第7-8期特異表達。在另一優選例中，所述ABC轉運蛋白在小孢子從四分體釋放期及後達到表達最高峰。在另一優選例中，所述降低植物植株中花粉發育相關的ABC轉運蛋白活性的方法包括：使ABC轉運蛋白編碼基因的表達水平下降、和/或使ABC轉運蛋白活性下降。在另一優選例中，所述的下降指與野生型ABC轉運蛋白的表達水平E0相比，所述植株中花粉發育相關的ABC轉運蛋白的表達水平E1為野生型的0-80％，較佳地0-60％，更佳地0-40％；和/或與野生型的花粉發育相關的ABC轉運蛋白活性A0相比，所述植株中花粉發育相關的ABC轉運蛋白活性A1為野生型的0-80％，較佳地0-60％，更佳地0-40％。在另一優選例中，所述的降低植株中ABC轉運蛋白活性通過選自下組的方式實現：基因突變、基因敲除、基因中斷、RNA幹擾技術、或其組合。在另一優選例中，所述ABC轉運蛋白編碼基因為ABCG26基因。在另一優選例中，所述ABCG26基因能夠編碼SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3、SEQIDNO.:4SEQIDNO.:5或SEQIDNO.:6所示胺基酸序列。在另一優選例中，所述方法包括步驟：降低所述植株中ABCG26基因的表達水平、缺失ABCG26基因和/或致ABCG26基因突變來實現降低植株中ABC轉運蛋白的表達或活性。在另一優選例中，所述的植物包括農作物、林業植物、花卉；優選地包括禾本科，豆科以及十字花科植物，更優選地包括水稻、玉米、蒺藜狀苜蓿、小米、小麥或擬南芥。在另一優選例中，所述的植物選自：十字花科(Brassicaceae)植物、鼠耳芥屬(Arabidopsis)植物、擬南芥(A.thaliana)。本發明的第二方面，提供了一種花粉發育相關的ABC轉運蛋白或其編碼基因的用途，用於培育植物不育系、或用於製備培育植物不育系的試劑或試劑盒。在另一優選例中，所述的編碼基因為ABCG26基因。在另一優選例中，所述ABCG26基因能夠編碼SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3、SEQIDNO.:4、SEQIDNO.:5或SEQIDNO.:6所示胺基酸序列。本發明的第三方面，提供了一種將植物從不育轉為可育的方法，包括步驟：降低花粉ABC轉運蛋白合成速度、和/或延緩花粉發育速度。在另一優選例中，所述的植物是花粉發育相關的ABC轉運蛋白的表達或活性水平下降的植物。在另一優選例中，所述植物為根據權利要求1-6中任一項所述的方法培育的植物不育系。在另一優選例中，所述方法包括：降低花粉ABC轉運蛋白合成速度，從而延緩花粉發育。在另一優選例中，所述方法包括：降低植株代謝水平，從而降低花粉ABC轉運蛋白合成速度。在另一優選例中，所述降低或延緩是通過以下方式實現：降低植株生長的環境溫度。在另一優選例中，降低植株生長的環境溫度包括將環境溫度(平均溫度)控制在17-22℃，更優選地為17-20℃，如18℃、18℃、19℃或20℃。在另一優選例中，降低植株生長的環境溫度的時間包括花葯形成階段，花粉成熟階段以及開花授粉階段，或其前後2周。在另一優選例中，在植株抽苔或抽穗時開始降低植株的生長溫度，低溫培育3-10天後，恢復正常溫度培育。本發明的第四方面，提供了一種植物育種方法，包括維持植株不育的步驟；將植株由不育轉為可育的步驟；和，維持植株可育並育種的步驟；在所述維持植株不育的步驟中，包括，對根據本發明第一方面的方法培育的植物不育系進行維持；在將植株由不育轉為可育的步驟中，包括，利用根據本發明第三方面的方法將植株由不育轉為可育。本發明的第五方面，提供了一種植物細胞，所述植物細胞發育成的植株中花粉發育相關的ABC轉運蛋白的表達或活性降低。在另一優選例中，所述ABC轉運蛋白為ABCG26。應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。本發明的優點為：(a)提供了一種通過降低植物中花粉發育相關的ABC轉運蛋白的表達或活性來創製植物不育系的方法。(b)提供了一種通過降低花粉細胞外壁合成速度、和/或延緩花粉發育速度來使不育植株的性狀轉化為可育的方法。附圖說明圖1為低溫能夠恢復雄性不育abcg26突變體的育性圖。a.abcg26-1和abcg26-2突變體的突變位點，abcg26-1突變體中ABCG26基因的第5個外顯子上有T-DNA插入，而abcg26-2突變體中在第六個外顯子上有點突變引起的終止突變。b.Col植株的正常可育表型。c-d.在正常條件下，abcg26突變體不育，短小果莢不含種子。e-f.在正常條件下，abcg26突變體不育，短小果莢不含種子；移到低溫條件下植株恢復育性，果莢變得粗長含有種子；再放回正常條件下，突變體又變得不育，短小果莢不含種子。g-k.野生型和abcg26突變體花葯的亞歷山大染色。野生型(g)，abcg26-1(18℃)(j)和abcg26-2(18℃)(k)花葯中充滿了紫色有活力的花粉，而在abcg26-1(24℃)(h)和abcg26-2(24℃)(i)花葯只染成綠色說明花粉敗育。圖2為野生型，突變體以及恢復育性突變體花葯發育的半薄切片分析圖。到發育的第6，7期花葯，野生型(a)和abcg26(24℃或18℃)(h,o)突變體花葯沒有可見的區別，其中(b)為第7期的野生型花葯發育的半薄切片分析圖,其中(I、P)為第7期的abcg26(24℃或18℃)突變體花葯發育的半薄切片分析圖。在第8期，野生型(c)和abcg26(24℃或18℃)(j,q)突變體藥室中，小孢子成功的從四分體中釋放。在第9期，其中(D)為第9期的野生型花葯發育的半薄切片分析圖,在abcg26(24℃)(k)中有些小孢子開始降解，然而在abcg26(18℃)(r)中的小孢子與野生型的基本一致。在第10期，其中(E)為第10期的野生型花葯發育的半薄切片分析圖，大多數abcg26(24℃)(l)的小孢子空泡化降解。然而，abcg26(18℃)(s)中大部分恢復的小孢子較為正常。在第11期，其中(F)為第11期的野生型花葯發育的半薄切片分析圖,大多數abcg26(24℃)(m)的小孢子在藥室中降解空泡化，而除了個別敗育的小孢子abcg26(18℃)(t)中有花粉粒出現。在第12期，其中(G)為第12期的野生型花葯發育的半薄切片分析圖abcg26(18℃)(u)中出現成熟花粉粒，但是在abcg26(24℃)(n)僅有降解的細胞殘餘緊貼於藥室內壁。E,表皮層；En,藥室內壁；ML,中間層；T,絨氈層；Ms,小孢子母細胞；Tds,四分體；Msp,小孢子；PG,花粉粒；Dmsp,退化的小孢子；Dpg,退化的花粉粒；RM,殘餘。Bar＝20um。圖3為恢復育性突變體花粉發育階段的掃描電鏡分析圖；野生型和abcg26(24℃或18℃)(b,c)突變體花粉發育的掃描電鏡觀察。恢復植株abcg26(18℃)(c)與野生型(a)的成熟花葯中都含有許多正常的花粉，但其花粉沒有正常的外壁結構(f,i)。而abcg26(24℃)(e,h)突變體中則僅有殘餘的表面結構異常的小孢子。其中h-i圖為經過戊二醛固定的花粉,其中(a、d、g)為野生型花粉發育階段的掃描電鏡分析圖。圖4為恢復突變體花粉發育階段的透射電鏡分析圖；野生型和abcg26(24℃)以及abcg26(18℃)花粉發育的超顯微結構。在第7期野生型(a)和abcg26(24℃或18℃)突變體(d和g)的四分體發育正常。在第9期，abcg26(24℃)(e)小孢子外壁異常缺少野生型的外壁結構。在第11期，abcg26(18℃或24℃)(f和i)的小孢子外壁結構依然異常，沒有野生型(c)的柱狀和頂蓋外壁結構。Msp,小孢子；Ba,柱狀結構；Tc,頂蓋結構。Bars＝5um，其中(b)為野生型第9期的透射電鏡分析圖，(h)為abcg26(18℃)第9期的透射電鏡分析圖。圖5為與ABCG26共表達的基因不受低溫誘導表達圖；野生型和abcg26突變體(24℃/18℃)花序RNA中的ABCG26基因的半定量RT-PCR。圖6為ABCG26同家族基因不涉及育性恢復的過程圖；野生型和abcg26突變體(24℃/18℃)中11個ABCG26同家族基因的定量RT-PCR。圖7為低溫延緩了花粉的生長速度圖；a.不同溫度條件下花粉發育的四個時期(四分體時期，單核細胞期，雙核細胞期和三核細胞期)之間小孢子生長的速度。b.DAPI染色顯示選定時間點上不同溫度條件下小孢子發育的進程。圖8為不同物種中abcg26基因的進化分析圖，進化分析表明不同物種中的直系同源基因在雙子葉植物和單子葉植物有清晰的分岔，有共同的起源。具體實施方式本發明人經過廣泛而深入的研究，首次意外地發現，對於某些特定的植物不育系，通過調控花粉發育相關的ABC轉運蛋白的表達或活性，可以調控所述植株的育性，實現不育性與育性之間進行可控的轉換。本發明人還開發了相應的培育植物不育系等多種在農業育種等方面有廣泛應用價值的技術。在此基礎上完成了本發明。在實驗中，申請人發現擬南芥ABCG26基因(ATPBindingCassetteG26)編碼了一個ABC轉運蛋白並參與到花粉發育中孢粉素前體物質的轉運過程中，該基因的缺失使得突變體在正常生長條件下(24℃，16小時光照/8小時黑暗)顯示完全不育的表型。而低溫減緩了花粉的生長速度，使突變體克服了該基因的缺失造成的缺陷，使花粉安全度過快速膨脹期。ABC轉運蛋白及其編碼序列ABC轉運蛋白是一類在不同物種中都存在的膜定位的超家族蛋白(Sanchez-Fernandezetal.,2001)，在轉運脂肪酸，ABA以及孢粉素前體物質等過程中起重要作用(Choietal.,2011)。在植物中，目前有一些ABC轉運蛋白的功能被報導與植物生長發育，抗逆等有關(Choietal.,2011)。適用於本發明的花粉發育相關的ABC轉運蛋白沒有特別限制，可以是來自任何植物品種，代表性的植物包括，但並不限於：水稻(基因號：Os06g060770與擬南芥直系同源ABCG26蛋白同源性為60％)、玉米(SequenceID：NP_001151511.1與擬南芥直系同源ABCG26蛋白同源性為61％)、蒺藜狀苜蓿(基因號：MTR_5g096390與擬南芥直系同源ABCG26蛋白同源性為72％)、小米(SequenceID：Si008002m與擬南芥直系同源ABCG26蛋白同源性為61％)、小麥(SequenceID：Traes_7DL_439CC6EA0.1與擬南芥直系同源ABCG26蛋白同源性為65％)。在圖8中，At為擬南芥、Os為水稻、Zm為玉米、Mt為蒺藜狀苜蓿、Si為小米、Ta為小麥；從圖8不同物種中ABCG26基因的蛋白序列相似性以及進化分析中可以看出該基因在不同物種中的的保守性較強，擬南芥中該基因的突變會造成不育性狀，因此，對該基因進行分子遺傳操作將可以用於培育其它物種的不育系。擬南芥ABCG26蛋白序列如SEQIDNO.:1所示，編碼擬南芥ABCG26蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:7所示。水稻ABCG26蛋白序列如SEQIDNO.:2所示，編碼水稻ABCG26蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:8所示。玉米ABCG26蛋白序列如SEQIDNO.:3所示，編碼玉米ABCG26蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:9所示。蒺藜狀苜蓿ABCG26蛋白序列如SEQIDNO.:4所示，編碼蒺藜狀苜蓿ABCG26蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:10所示。小米ABCG26蛋白的序列如SEQIDNO.:5所示，編碼小米ABCG26蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:11所示。小麥ABCG26蛋白序列如SEQIDNO.:6所示，編碼小麥ABCG26蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:12所示。在一方面，本發明提供一種培育植物不育系的方法，包括步驟：降低所述植物植株中花粉發育相關的ABC轉運蛋白的表達或活性。術語「ABC轉運蛋白」、「ABC多肽」、「ABC蛋白」等可互換使用，指具有ABC轉運蛋白胺基酸序列(如SEQIDNO:1-6)的蛋白或多肽。在未特別指出時，術語「ABC轉運蛋白」包括野生型和突變型ABC蛋白。本發明的ABC轉運蛋白可包含SEQIDNO:1-6所示胺基酸的序列。然而，不限於此，因為根據植物種類或品種，該蛋白的胺基酸序列可能有所不同。換言之，其可以是突變型蛋白或人工變體，所述突變型蛋白或人工變體的胺基酸序列在SEQIDNO:1-6所示胺基酸序列的一個或多個位置包含一個或幾個胺基酸的取代、缺失、插入或添加，只要有助於通過弱化該蛋白的活性而培育植物不育系。本文的「幾個」可根據蛋白中胺基酸殘基的三維結構的位置或類型而有所不同，優選是2-20，較優選是2-10，更優選是2-5。此外，根據植物的個體或種類，胺基酸的取代、缺失、插入、添加或倒置包括人工變體或天然突變所致的那些。可通過以下方式降低(弱化)本發明ABC轉運蛋白的活性：1)編碼該蛋白的多核苷酸的部分或完全缺失，2)修飾表達調控序列以降低該多核苷酸的表達，3)修飾染色體上的序列或4)它們的組合。在上文中，可利用染色體基因插入的載體，通過將編碼內源性靶蛋白的多核苷酸替換為標記基因或部分核苷酸序列缺失的多核苷酸來實施編碼蛋白的多核苷酸的部分或完全缺失。「部分」缺失的長度可根據多核苷酸的種類而有所不同，優選是2bp-300bp，較優選是2bp-100bp，更優選是1bp-5bp。還可通過以下方式修飾表達調控序列來降低多核苷酸表達：通過核苷酸序列的缺失、插入、保守或非保守性取代或它們的組合在表達調控序列中誘導突變以進一步弱化表達調控序列的活性，或將表達調控序列替換成活性更低的序列。表達調控序列包括編碼啟動子的序列、操縱子序列、核糖體結合位點和控制轉錄和翻譯終止的序列。此外，可通過以下方式修飾染色體上的多核苷酸序列以弱化蛋白的活性：通過核苷酸序列的缺失、插入、保守或非保守性取代或它們的組合在序列中誘導突變以進一步弱化該序列的活性，或將多核苷酸序列替換成經修飾的序列以便獲得更弱的蛋白活性。如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，「分離的ABC轉運蛋白或多肽」是指ABC轉運蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化水稻等植物中ABC轉運蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括ABC轉運蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的天然ABC轉運蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是：(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的；(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽；(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。在本發明的優選地實施方式中，「ABC轉運蛋白」或「ABC多肽」序列如SEQIDNO:1-6所示。該術語還包括具有與ABC轉運蛋白相同功能的、SEQIDNO:1-6序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)：一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括ABC轉運蛋白或多肽的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹度的條件下能與ABC轉運蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含ABC轉運蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了ABC轉運蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有ABC轉運蛋白序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。修飾(通常不改變一級結構)形式包括：體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，「ABC保守性變異多肽」指與SEQIDNO:1-6所示的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生。表1最初的殘基代表性的取代優選的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro；AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；PheLeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；AlaLeu本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQIDNO:7-12所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。如本文所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQIDNO:1-6的蛋白質，但與SEQIDNO:7-12所示的編碼區序列有差別的核酸序列。編碼SEQIDNO:1-6的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。在一個優選地實施方式中，所述的ABC多肽的編碼序列選自下組：(1)編碼如SEQIDNO:1-6所述多肽的多核苷酸序列；(2)如SEQIDNO:7-12所示的多核苷酸序列；(3)與(1)或(2)所述的多核苷酸序列互補的多核苷酸。術語「編碼多肽的多核苷酸」可以是包括編碼該多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指:(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)雜交時加有變性劑,如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上,更好是95％以上時才發生雜交。並且,可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDNO:1-6所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，「核酸片段」的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼ABC轉運蛋白的多聚核苷酸。本發明的ABC轉運蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或ABC轉運蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。通過常規的重組DNA技術(Science，1984；224：1431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的水稻ABC轉運蛋白。一般來說有以下步驟：(1).用本發明的編碼ABC轉運蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。本發明中，ABC轉運蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語「重組表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含ABC轉運蛋白編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈黴菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞等。本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法：磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法。對於轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得耐受性改變的植物。獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達分析。用ABC轉運蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測ABC轉運蛋白的轉錄產物。花粉發育植物中不同器官特異表達的ABC轉運蛋白基因也提示了其在植物發育中ABC轉運蛋白對調控脂肪，孢粉素前體物質運輸起到重要的作用(Choietal.,2011)。作為轉運蛋白的ABC轉運蛋白可轉運脂肪，孢粉素等物質(Choietal.,2011)。在花粉發育中，小孢子壁的快速生長需要許多原料包括孢粉素前體物質等以供花粉壁合成使用，認為其參與到小孢子外壁的形成中，為小孢子外壁的合成提供原料。本發明的主要優點包括：(a)提供了一種通過降低植物中花粉發育相關的ABC轉運蛋白的表達或活性來創製植物不育系的方法。(b)提供了一種通過降低花粉細胞外壁合成速度、和/或延緩花粉發育速度來使不育植株的性狀轉化為可育的方法。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆-實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)或植物分子生物學-實驗手冊(PlantMolecularBiology-ALaboratoryMannual,MelodyS.Clark編,Springer-verlagBerlinHeidelberg,1997)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。材料與方法植物材料與種植本發明中擬南芥材料為Col背景。T-DNA插入突變株來自美國擬南芥生物資源中心ABRC。4℃條件下，種子預萌發於0.1％瓊脂糖培養基上72小時。植物材料培養於蛭石中，培養條件則為：室溫24℃，光培養16小時/暗培養8小時(正常條件)直至抽苔。之後，抽苔植株轉移至光照培養箱中低溫培養(18℃-22℃)。細胞學分析用尼康數位相機(D-7000)拍攝植物材料。亞歷山大染色與DAPI染色可參考方法(Alexander,1969；Rossetal.,1996)。對於半薄切片，選取花苞不同發育階段進行固定並包埋於Spurr環氧樹脂中(具體方法可參考Zhangetal.,2007)。使用PowertomeXL(RMCProducts,Tucson,Arizona,USA)切片機進行每1μm切片並用甲苯胺藍進行染色。使用OlympusDX51數位相機(Olympus,Japan)進行花葯切片的拍攝。將8nm金顆粒包裹新鮮雄蕊和花粉粒材料進行掃描電鏡實驗，並利用JSM-840顯微鏡(JEOL,Japan)觀察。對於透射電鏡實驗，將擬南芥花絮冰上固定於固定液中(配方是：含有2.5％戊二醛的0.1M磷酸緩衝液，pH7.2)。花苞材料則進一步依次包埋至樹脂(『HardPlus』EmbeddingResin,UniteKingdom)中(具體方法可參考Zhangetal.,2007)。超薄切片(50-70nm)則利用JEM-1230透射電子顯微鏡(JEOL,Japan)進行觀察。RNA抽提、半定量RT-PCR以及定量RT-PCR總RNA可利用Trizol試劑(Invitrogen,USA)由成熟的土培擬南芥植物花組織進行提取。利用poly-dT(12–18)引物；MMLV反轉錄酶和相應試劑將5μg的RNA反轉第一條cDNA鏈(60分鐘，42℃)。合成好的cDNA鏈作為PCR的模板。半定量RT-PCR操作參照方法(Zhangetal.,2007)；定量RT-PCR則是利用SYBRGreenImastermix(Toyobo,Japan)通過ABIPRISM7300系統(AppliedBiosystems,USA)進行檢測。定量RT-PCR的程序參數是：95℃5分鐘，94℃10秒變性40個循環,60℃退貨延伸1分鐘。定量RT-PCR中所使用的引物列表於電子版的附件中。β-Tubulin則作為對照。實施例1擬南芥abcg26突變體的不育表型在低溫條件下得以恢復發明人利用從ABRC中心購買的擬南芥Col生態型的T-DNA插入突變體庫中分離到了abcg26-1和abcg26-2突變體，如圖1中a所示。在正常的環境溫度下(24℃)，純合的abcg26突變體的營養生長正常，但育性喪失，只有短小無種子的果莢，如圖1中c和d所示。遺傳分析表明abcg26突變體屬於孢子體雄性不育，受到單基因隱性位點控制。申請人將abcg26-1和abcg26-2突變體在24℃培養至抽苔，將其移入18℃連續培養，其後續的果莢皆恢復育性，然後把該突變體放回到正常的環境溫度下，突變體又恢復不育的表型，果莢短小，如圖1中e和f所示。在同樣低溫條件下，野生型植株沒有受到影響(結果未顯示)。亞歷山大染色顯示低溫條件下突變體的花粉被染成紫紅色，與野生型的基本相同如圖1中g、j、k所示，而正常條件下的突變體花葯內沒有被染成紫紅色的可育花粉，如圖1中h,i所示。這個結果說明低溫能夠彌補abcg26突變體中的雄配子體發育缺陷。實施例2低溫能夠彌補abcg26突變體中從四分體釋放後的小孢子發育缺陷為了確定abcg26突變體在花粉發育中的缺陷，發明人進行了花葯半薄切片。在野生型第6和7期，小孢子母細胞經歷減數分裂形成四分體(Sandersetal.,1999)。隨後，小孢子從四分體釋放，並逐漸形成正常可育的花粉，如圖3中a-g所示。在常溫條件下(24℃)的abcg26(24℃)突變體中，直到花葯發育第7期突變體和野生型沒有觀察到可見差異，這表明突變體雄配子體減數分裂不受影響如圖3中h-i所示；至花葯發育第8期，abcg26(24℃)小孢子從四分體釋放，與野生型相比，呈現不規則的腫脹表型；第9期，大部分abcg26(24℃)小孢子開始降解，最終，藥室內只有一些敗育花粉的碎片，基本沒有正常的花粉形成如圖3所示。另一方面，在低溫狀態下(18℃)，abcg26(18℃)小孢子在第8期的腫脹表型仍然存在。但在後續的發育階段，大部分小孢子並沒有破裂降解，而是繼續發育，最後除去一小部分的敗育花粉外，低溫下的藥室中產生了正常的成熟花粉粒，如圖3所示。掃描電鏡顯示，abcg26突變體在常溫條件下(24℃)的藥室中基本沒有花粉粒，在低溫條件下有花粉粒但沒有正常的外壁結構，如圖3所示。TEM觀察表明abcg26小孢子的細胞完整性在低溫條件下得以恢復，如圖4所示。在四分體時期，在不同條件下，abcg26小孢子與野生型相比都比較正常，如圖4中a,d,g所示。第九期在正常溫度(24℃)下，abcg26小孢子沒有形成野生型那樣的外壁結構，如圖4中e所示。在低溫條件(18℃)下，abcg26小孢子發育雖然沒有破裂，但也沒有完整外壁形成，如圖4中h所示。實施例3ABCG26基因等表達不受低溫誘導為了闡明abcg26突變體溫敏的機制，申請人對不同溫度條件下的野生型和突變體花苞中的ABCG26轉錄水平進行了檢測。定量PCR檢測表明，常溫(24℃)與低溫(18℃)條件下突變體和野生型的ABCG26在轉錄水平上沒有顯著差異,如圖5。為了檢測共表達基因是否存在補償機制，申請人提取了野生型和突變體的花序總RNA，進行了共表達基因轉錄水平檢測，半定量RT-PCR結果顯示在低溫時也沒有表達的變化，如圖5。同時，為了鑑定是否存在ABCG26同家族基因的補償機制，申請人選取了11個在花葯表達的ABCG26同家族基因進行了不同條件下的定量RT-PCR檢測。結果顯示都沒有明顯的變化，如圖6所示。這些結果表明，在低溫條件下，擬南芥花粉發育過程對於ABCG26共表達基因或者其同家族基因並不依賴。因此，低溫條件下突變體育性的恢復與這些基因沒有關係。實施例5較低的環境溫度導致擬南芥花粉的發育速度減緩上述的細胞學觀察表明在常溫(24℃)下大多數abcg26突變體小孢子在第九期開始降解。早期的文獻報導在擬南芥花粉發育過程中小孢子體積不斷增大擴展。申請人推測在abcg26突變體中，小孢子由於不能渡過快速膨脹過程而導致花粉破裂和敗育。因此，申請人測定了野生型小孢子在雄配子體發生過程中的生長速率，根據花苞的大小初步確定花粉發育過程的4個時期：四分體時期，單核花粉期，雙核花粉期以及三核花粉期，如圖7中a所示。數據統計結果表明，小孢子從四分體釋放後發育到單核期需要時間為Col(24℃)24小時，而Col(18℃)為30小時；從單核期發育到雙核期需要時間為Col(24℃)75小時，而Col(18℃)為96小時；從雙核期發育的三核期需要時間為Col(24℃)84小時，而Col(18℃)為150小時，如圖7中a所示。這些數據說明在低溫下小孢子發育進程變慢了。同時，申請人也研究了不同溫度下不同時間節點野生型小孢子的發育進程。以四分體時期為起始點(記為0時)，在24小時後，常溫下的Col從四核聚集在一處變成一個染色較亮的核位於小孢子的正中央；而低溫下的Col則正處於第七期第八期的中間時段，能同時觀察到四分體和單核小孢子；約在70個小時後常溫下的Col小孢子到達雙核期，DAPI染色顯示一個不位於中央的螢光較亮的小核，以及一個位於小核邊上螢光較暗的大核；但是低溫下的DAPI染色觀察到Col小孢子正處於有絲分裂期，核位於小孢子的邊緣而且呈彌散狀，還未形成雙核；90小時後，常溫下的Col到達三核期，顯示特有的兩個螢光較亮的生殖核和一個螢光較暗的營養核；而低溫下的野生型小孢子則剛剛進入二核時期，如圖7中b所示。這些結果也顯示在低溫下小孢子發育進程變慢了。總之，以上這些結果說明低溫延緩了花粉發育進程，而且這種花粉發育緩慢的過程是彌補abcg26小孢子發育缺陷的重要原因。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。參考文獻：Alexander,M.P.Differentialstainingofabortedandnonabortedpollen.StainTechnol.44:117–122(1969).AlonsoJ.M.,Stepanova,A.N.,Leisse,T.J.,Kim,C.J.,Chen,H.,Shinn,P.,Stevenson,D.K.,Zimmerman,J.,Barajas,P.&Cheuk,R.Genome-wideinsertionalmutagenesisofArabidopsisthaliana.Science301:653–657(2003).Choi,H.,Jin,J.Y.,Choi,S.,Hwang,J.U.,Kim,Y.Y.,Suh,M.C.&Lee,Y.AnABCG/WBC-typeABCtransporterisessentialfortransportofsporopolleninprecursorsforexineformationindevelopingpollen.PlantJ.65:181–193.(2011).Ebling,F.J.PhotoperiodicdifferencesduringdevelopmentinthedwarfhamstersPhodopussungorusandPhodopuscampbelli.GenCompEndocrinol.95(3):475-482(1994).Hu,W.,Wang,Y.,Bowers,C.&Ma,H.Isolation,sequenceanalysis,andexpressionstudiesofXorallyexpressedcDNAsinArabidopsis.PlantMolBiol.53:545–563(2003).Quilichini,T.D.,Friedmann,M.C.,Samuels,A.L.&Douglas,C.J.ATP-BindingCassetteTransporterG26IsRequiredforMaleFertilityandPollenExineFormationinArabidopsis.PlantPhysiol.154:678–690(2010).Sanchez-Fernandez,R.,Davies,T.G.E.,Coleman,J.O.D.&Rea,P.A.TheArabidopsisthalianaABCProteinSuperfamily,aCompleteInventory.JBiolChem.276(32):30231–30244(2001).Yoo,S.D.,Cho,Y.H.&Sheen,J.Arabidopsismesophyllprotoplasts:aversatilecellsystemfortransientgeneexpressionanalysis.NatProtoc2:1565–1572(2007).Zhang,Z.B.,Zhu,J.,Gao,J.F.,Wang,C.,Li,H.,Zhang,H.Q.,Zhang,S.,Wang,D.M.,Wang,Q.X.,Huang,H.,Xia,H.J.&Yang,Z.N.TranscriptionfactorAtMYB103isrequiredforantherdevelopmentbyregulatingtapetumdevelopment,callosedissolutionandexineformationinArabidopsis.PlantJ.52:528-538(2007).Zhu,Y.X.&Davies,P.J.TheControlofApicalBudGrowthandSenescencebyAuxinandGibberellininGeneticLinesofPeas.PlantPhysiol.113:631-637(1997).當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp