製備人/牛鹼性成纖維細胞生長因子新衍生物的方法
2024-01-28 11:28:15 3
專利名稱：製備人/牛鹼性成纖維細胞生長因子新衍生物的方法
技術領域：
本發明涉及製備鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)之新的分子整體衍生物的重組DNA方法，以及有關的表達質粒和DNA編碼順序。本發明新的bFGF分子變體可作為血管生成過程中野生型分子的拮抗物或超增效物。
本發明所公開的生產這些新分子以及野生型bFGF的方法，是基於使用已用攜帶編碼人和牛bFGF及其衍生物之核苷酸順序的質粒轉化了的大腸桿菌重組菌株。
在許多重要的生物學過程，如器官發育和傷口癒合等生理過程或腫瘤生長等病理過程中出現毛細血管生成(DenekampJVascularendotheliumasthevulnerableelementintumors.ActaRadiol.(oncol)23p.217-225，1984;HobsonB.andDenekampJ.Endothelialproliferationintumoursandnormaltissuescontinouslabellingstudies.Br.J.Cancer49p.405-413，1984;FolkmanJTumorantiogenesis，Adv.CancerRes.43p.175-203，1985)。
雖然在形態上已確定了導致新血管形成的一系列變化，但有關這一過程的分子機制尚不甚明了。因為毛細血管內皮細胞在正常情況下形成一個靜止的單層，而且其增殖是在血管形成過程中引起的，所以這些細胞的生長控制似乎是十分嚴謹的(FolkmanJTumorangiogenesis，Adv.CancerRes.43p.175-203，1985;Joseph-SilversteinJ.andRifkinB.D.EndothelialCellgrowthfactorsandthevesselwall，SeminarsinThromb.andHemost.13p.504-513，1987)。
血漿中明顯缺乏內皮細胞生長因子可部分地群釋正常情況下內皮細胞的靜止性質。
雖然在幾乎所有組織的提取物以及許多正常和腫瘤細胞系中都存在內皮細胞分裂素，但事實上在血漿卻沒有見到(JosephSilversteinJ.andRifkinB.D.Endothelialcellgrowthfactorsandthevesselwall，SeminarsinThrombandHemost.13p.504-513，1987;FolkmanJ.andKlagsbrunM.AngiogenicFactors，Science，235p.442-447，1987)。
因此，定位誘導內皮細胞的迅速增殖可包括在對環境條件反應中由細胞內釋放內皮細胞分裂素。
已明確定性的內皮細胞分裂素是一族多肽生長因子，包括鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)，因其對肝素有高度親合性，故也稱為肝素結合性生長因子(ThomasK.Fibroblastgrowthfactors，FASEBJ.，1p434-440，1987;GospodarowiczD.，NeufeldG.andSchweigererL.FibroblastgrwthfactorStructuralandbiologicalproperties，J.Cell.Physiol.，5p.15-26，1987)。
已經由大多數中胚層或神經外胚層分化的組織或細胞中純化了鹼性FGF。
結構研究表明，bFGF是由146個胺基酸構成的單鏈多肽，其也可以以缺失前10-20個胺基酸之氨基末端剪切的形式存在。
放射受體結合試驗和生物學檢驗證明修剪形式的FGF與天然bFGF有同樣的效力(GospodarowiczD.，NeufeldG.andSchweigererL，Fibroblastgrowthfactor，Mol.Cell.Endocrin.46p.187-206，1986;GospodarowiczD.，NeufeldG.andSchweigererL，Molecularandbiogicalcharacterizationoffibroblastgrowthfactoranangiogenicfactorwhichalsocontrolstheproliferationanddifferentiationofmesodermandneuroectodermderivedcells.，Cell.Differ.，19p.1-17，1986;ThomasK.andGimenezGallegoG.Fibroblastgrowthfactorsbroadspectrummitogenswithpotentangiogenicactivity.TrendsBiochem.Sci.11p81-84，1986)。
另外，將純化程序中自勻漿組織內提取的方法由酸性提取改為中性提取並使用蛋白酶抑制物，已得到了一種含154個胺基酸殘基較長形式的FGF(VenoN.，BairdA.，EschF.，LingN.andGuilleminR.Isolationofanaminoterminalextendedformofbasicfibroblastgrwthfactor.Biochrm.Biophys.Res.Commun.，138p.580-588，1986;StoryM.T.，Esch.F.，ShimasakiS.，SasseJ.，JacobsS.C.andLawsonR.K.AminoterminalSequenceofalargeformofbasicfibroblastgrowthfactorisolatedfromhumanbenignprostatichyperplastictissue.BiochemBiophys.Res.Commun.142p.702-709，1987;KlagsbrunM.，SmithS.，SullivanR.，SHingY.，DavidsonS.，SmithJ.A.andSasseJ.Multipleformsofbasicfibroblastgrowthfactoramino-terminalcleavagesbytumorcell-andbraincell-derivedacidproteinases.Proc.Natl.Acad.Sci.USA84p.1839-1843，1987)。
已觀察到FGF的這種微觀不均一性可能是由於在細胞內或在純化期間氨基末端附近部分水解造成的。至少有部分是這樣的。但因為各種形式似乎具有同等活性，所以這種微觀不均一性可能在生理上是無關緊要的。
在遺傳進化中，鹼性FGF似乎是極為保守的。例如，牛和人bFGF在其146個胺基酸中只有兩個不同，整個胺基酸順序同源性為98.7%(GospodarowiczD.，NeufeldG.和SchweigererL.Molecularandbiologicalcharacterizationoffibroblastgrowthfactoranangiogenicfactorwhichalsscontrolstheproliferationanddifferentiationofmesodermandneuroectodermderivedcells.，Cell.Differ.，19p.1-17，1986)。
相對於bFGF的是酸性FGF(aFGF)，它與bFGF有55%的總順序同源性。酸性FGF是一種140個胺基酸的多肽，其也可以缺失前6個胺基酸之NH2末端剪切的形式存在(Gimenez-Gallego G.，Corn G.，Hatcher V.B.and Thomas K.A.The complete amino acid sequence of human braimdericed acidic fibroblast growth factor.Biochem.Biophys.Res.Commun.138，p.611-617，1986)。
鹼性FGF和酸性FGF具有兩個潛在的肝素結合區域，一個位於它們的NH2末端附近，另一個位於COOH末端附近。兩個區域可能都與FGF對肝素的強親合性有關(Gospodarowicz D.，Neufeld G.and Schweigerer L.Fibroblast growth factor，Mol.Cell.Endocrin.46 p.187-306，1986;Gospodarowicz D.，Neufeld G.and Schweigerer L.Molecular and biological characterization of fibroblast growth factoran angiogenic factor which also controls the proliferation and differentiation of mesoderm and neuroectoderm derived cells.，Cell.Differ.，19 p.1-17，1986);BairdA.，SchubertD.，LingN.，andGuilleminR.，Receptor-andheparin-bindingdomainsofbasicfibroblastgrowthfactor，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，p.2324-2328，1988)。
aFGF和bFGF的高度同源性，提示它們是由一個原始基因衍生的。最近，已經克隆了FGF基因並已測定了bFGF和aFGF的互補DNA順序(AbrahamJ.A.，WhangJ.L.，TumoloA.，MergiaA.，FriedmanJ.，GospodarowiczD.andFiddesJ.C.Humanbasicfibroblastgrowthfactornucleotideseguenceandgenemicorganization，EMBOJ.，5p.2523-2528，1986;AbrahamJ.A.，MergiaA.，WhangJ.L.，TumoloA.，FriedmanJ.，HjerrildK.A.，GospodarowiczD.andFiddesJ.C.Nucleotidesequenceofabovinecloneencodingtheangiognicprotein，basicfibroblastgrowthfactor，Science233，p.545-548，1986;JayeM.，HowkR.，BrugessG.A..，RiccaW.，ChiuI.M.，RaveraM.W.，O′BrienS.J.，ModiW.S.，MaciagT.andDrolianW.N.HumanendothelialcellgrouwthfactorCloningnucleotidesequenceandchromosomelocalization，Science233，p.541-545，1986)。
對人和牛中cDNA克隆之核苷酸順序的分析提示，鹼性FGF的初級轉譯產物包含155個胺基酸。然而，最近Sommer等人已分離出一種在NH2末端有兩個多餘胺基酸之新的157個胺基酸形式的人鹼性FGF(Sommer A.，Brewer M.T.，Thompson R.C.，Moscatelli D.，Presta M.and Rifkin D.B.A form of human basic fibroblast growth fator with an extended amino terminus，Biochem.Biophys.Res.Commun.144，p.543-550，1987)。
有趣的是，這兩個氨基相應於以前描述的人cDNA克隆中的密碼子。圖1中總結了迄今分離的或根據cDNA順序推測的鹼性FGF的不同形式。圖2則顯示了155胺基酸形式之FGF的一級結構。
如上面提到的，本發明涉及人鹼性FGF的分子變體。已通過對編碼155胺基酸形式FGF之基因的位點特異性誘變獲得了這些以前在自然界中從未見到的新的分子載體。
然而，鹼性FGF氨基末端的微觀不均一性及其生理學不相干性表明，本發明公開並描述的對155胺基酸形式的修飾等效於可能基於FGF的其他形式得到的同一種FGF(見下述)。
正如已經指出的，血管形成是一個嚴格控制的過程，其保證了它在實體腫瘤發展中發揮重要的病理學作用。從bFGF在血管形成中所起的重要作用看，如果這種與內源性FGF競爭的分子變體是生物學上無活性的，便可以在抗腫瘤治療中作為一種有價值的工具。
另一方面，新毛細血管生長是在控制再生、生長和發育的自動調節機制的基礎上進行的。因此，提高了生物學活性的bFGF類似物則可能具有許多潛在應用價值，如用於癒合燒傷、創傷(包括角膜創傷)和外科手術切口;治療皮膚潰瘍(包括褥瘡);心臟病發作後通過加速損傷組織內血管生成而恢復心肌血流量;以及用於治療某些肌肉骨骼損傷。
因此，本發明的目的在於設計並產生已改變了生物學活性之鹼性FGF的重組類似物。
為了了解鹼性FGF的胺基酸順序中如何改變會影響其功能性質，可以考慮許多與鹼性FGF有很高同源性的相關蛋白質，這個蛋白質家族包括酸性FGF以及hst和int-2這兩個最近發現的致癌基因產物(YoshidaT.，MiyagawaK.，OdagiriH.，SakamotoH.，LittleP.F.R.，TeradaM.andSugomuraT.Geromicsequenceofhst，afibroblastgrowthfactorsandtheint-2-encodedprotein，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，p.7305-7309，1987;DelliBoviP.，CuratolaA.M.，KernF.G.，GrecoA.，IttmannM.andBasilicoC.AnoncogeneisolatedbyfransfectionofKaposi′ssarcomaDNAencodesagrowthfactorthatisamemberoftheFGFfamily，Cell50，p.729-737，1987)。
包括bFGF在內的所有這些分子構成了一個參予細胞生長和調節的因子家族。圖3中比較了這些蛋白質的一級結構順序。
當考慮這些蛋白質之間的同源性時，可觀察到一級結構中的高保守區域。這些區域的保守性不僅是結構上的，而且表現於這些蛋白質間的某些功能同等性。
這些蛋白質確實對肝素有很強的親合力，而且似乎在血管形成過程(可能包括支持腫瘤生長的新的毛細血管增生)中起到重要作用。
如果保守區域是這些蛋白質具有共同特徵的根源，則高度差異的順序便是這些因子有不同生物學作用的原因。因此，改變任何高度差異區域即可顯著地影響鹼性FGF的生物學活性。
基於這些考慮，本發明人已使用基因工程技術構建了人和牛鹼性FGF的新衍生物，其一種情況是在bFGF分子的不同區域內丟失了胺基酸順序，第二種情況是在特定位置上有胺基酸取代。應根據幾種已知生長因子間的同源性和差異選擇修飾方法。有關分子變體的特徵如下所述。可在選擇的表達系統中獲得以重組蛋白質形式的類似物。
當bFGF基因在適當生物體內表達之前，用基因工程技術對其進行修飾，即可達到預期的改變。bFGF基因即是指能夠通過克隆cDNA文庫或組裝合成的寡核苷酸而得到的DNA順序(ManiatisT.，FrischE.F.andSambrookJ.Molecularcloning，Alaboratorymanual，coldspringHarbounLaboratory，ColdSpringHarbour，NY，1982)。本發明還涉及生產bFGF及其衍生物的重組DNA方法。
分子變體的特徵本發明中，「類似物」、「變體」或「衍生物」是指改變了胺基酸順序的bFGF分子。迄今已分離出的及在引言部分中描述的天然bFGF均可被改變成等價類似物。其中優選的類似物是含155個胺基酸的變體。本發明中人和牛bFGF胺基酸順序都已經過了修飾。新的bFGF衍生物則是以寡核苷酸定向誘變方法構建的。
特別是本發明設計併合成了特定的寡核苷酸以造成人和牛bFGF基因內編碼區的缺失。在「方法」部分中將詳細描述用以獲得變體的誘變技術。
可將突變的基因引入可指導新bFGF衍生物合成的大腸桿菌表達載體內。然後純化、定性並最後大量產生重組分子。
下文中將詳細描述構成本發明主題的新的bFGF衍生物，並在圖4中作一般性的圖解說明。其相應於155個殘基形式胺基酸編號即蛋氨基是1號殘基，絲氨酸是155號殘基。但所有已述及的bFGF都可用於構建變體。
優選的bFGF的衍生物是M1-bFGF，為缺失胺基酸順序中殘基27至32(Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu)的bFGF衍生物;
M2-bFGF，為缺失胺基酸順序中殘基54到58(Glu-Lys-Ser-Asp-Pro)的bFGF衍生物;
M3-bFGF，為缺失胺基酸順序中殘基70至75(Gly-Val-Val-Ser-Ile-Lys)的bFGF衍生物;
M4-bFGF，為缺失胺基酸順序中殘基78到83(Cys-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu)的bFGF衍生物;
M5-bFGF，為缺失胺基酸順序中殘基110到120(Asn-Asn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr)的bFGF衍生物;
M6a-bFGF，為分別在128和129位的賴氨酸和精氨酸殘基被穀氨醯胺取代的bFGF衍生物;
M6b-bFGF，為119和128位的賴氨酸殘基以及118和129位的精氨酸殘基均被穀氨醯胺取代的bFGF衍生物。
分子變體的具體胺基酸順序如圖5所示。
在氨基或羧基末端加有或在兩個末端都加有附加胺基酸殘基的多肽被視為屬於本發明範圍內的。
從用DNA重組技術表達變體的技術原因看，這樣的延伸可能是必要的(CourtneyM.，JallatS.，TessierL.H.，BenaventeA.andCrystalR.G.SynthesisinE.Coliofalfal-anti-trypsinvariantsoftherapeuticpotentialforemphysemaandthrombosisNature313，p.149-151，1985;NagaiL.andThogersenH.C.Generationofβ-globinbyseguencespecificproteolysisofahybridproteinproducedinE.Coli.Nature，309，p.810-812，1984)。
另外，附加殘基可用於提高變體的藥理學效能，如通過延長其在血漿內的循環半壽期。
建立了生產變體的具體方法。
為了有效地產生新的bFGF衍生物，我們建立了在實驗室和中試規模上製備為對不同分子進行生物學和臨床估價所需量之變體的重組DNA方法。
該方法是基於發酵培養出經基因工程技術修飾，從而可在高水平上表達突變基因之大腸桿菌的菌株。
具體生產程序包括1)表達bFGF的合成DNA序列的構建用合成方法重組構建用於表達野生型鹼性FGF和其衍生物的所有順序。此可通過使用自動DNA合成儀(如AppliedBiosystem公司的380B型DNA合成儀)合成含交迭順序的寡核苷酸來完成(CaruthersM.H.Genesynthesismachines;DNAchemistryanditsuses.Science，230，p.281-285，1985)。
連接交迭寡核苷酸以形成雙股DNA鏈，並用DNA聚合酶和T4連接酶充填缺口。
直接在有意義鏈的FGF編碼順序之5′端提供了一個ATG起始信號。就155胺基酸形式的bFGF來說，我們可使用天然存在編碼第一個胺基酸殘基之蛋氨酸的ATG作為起始密碼子，這樣就沒有額外的胺基酸加到被表達之多肽的N末端(AbrahamJ.A.，WhangJ.L.，TumoloA.，MergiaA.，FriedmanJ.，GospodarowiczD.andFiddesJ.C.Humanbasicfibroblastgrowthfactornwcleotidesequenceandgenomicorganization，EMBOJ.，5，p.2523-2528，1986;AbrahamJ.A.，MergiaA.，WhangJ.L.，TumoloA.，FriedmanJ.，HjerrildK.A.，GospodarowiczD.andFiddesJ.C.Nucleotidesequnenceofabovinecloneencodingtheangiogenicprotein，basicfibroblastgrowthfactor，Science233，p.545-548，1986)。
另外，為提高FGF在大腸桿菌內的表達，可在不改變蛋白質一級結構的情況下改變其5′末端順序。更具體地說，即是按圖6所示修飾核苷酸順序。
2)表達bFGF衍生物之突變順序的構建為得到本發明中所述的變體，可改變野生型bFGF，使之產生預期的缺失。為此可用位點特異性誘變方法進行基因修飾(NorrisK.，NorrisF.，ChrisiansenL.andFiilN.Efficientsite-directedmutagenesisbysimultaneoususeoftwoprimers，NucleicAcidResearch11，5103-5112，1983)。
該方法的原理是將bFGF基因再克隆到能夠以單鏈形式得到的載體(如噬菌體載體M13)內。該重組單鏈則與編碼所需修飾部分的互補性合成寡脫氧核苷酸退火。然後使用DNA聚合酶和連接酶延伸新鏈並將其連接成環形。用新產生的異源雙鏈DNA轉化一個使之能在其中複製並產生子代的細胞系，在這裡攜帶野生型基因或有所需缺失之基因的噬菌體將分離為兩種不同的分子。
然後可用起始誘變寡核苷酸作探針去識別突變的基因。位點針對性誘變技術將在「方法」部分中詳細描述。
具體地說，是將編碼野生型bFGF(牛或人的)的合成順序插入到M13載體中，並用所得單鏈作為誘變模板(NorrisK.，NorrisF.，ChristiansenL.andFiilN.Efficientsiite-directedmutagenesisbysimultaneoususeoftwoprimers，NucleicAcidResearch11，p.5103-5112，1983)。
3)野生型bFGF及其衍生物的表達為在大腸桿菌中的重組體菌株中表達bFGF的野生型和突變順序，可將這些順序插入到攜帶負責轉錄和轉譯新基因之順序的表達質粒中。更具體地說，我們使用了大腸桿菌的色氨酸啟動子和λCⅡ蛋白的核糖體結合位點區域作為調節信號(HendrixR.W.，RobertsJ.W.，StahlF.W.andWeisbergR.A.LambdaⅡ，ColdSpringHarbourLaboratory，ColdSpringHarbour，N.Y，1983)。
啟動子Ptrp得自產品質粒pDR720(Pharmacia)。Shine-DalgarnoCⅡ順序則是根據已公布的順序用化學合成方法製得的(HendrixR.W.，RobertsJ.W.，StahlF.W.andWeisbergR.A.LarnbdaⅡ，ColdSpringHarbourLaboratory，ColdSpringHarbowr，N.Y，1983)。
圖7中圖群顯示了用於野生型bFGF及其衍生物的典型表達載體。具體地說，它是經組裝下列片段而構建的a)質粒pDS20的大的EcoRⅠ-BamHⅠ片段(DuesterG.，ElfordR.M.，HolmesW.N.FusionoftheEscherichiacolileucyltransfer-RNA-IPromotertothegal-Kgene，Analysisofseguencesnecessaryforgrowthratedependentregulationcell30，p.855-964，1982);
b)質粒pDR720的EcoRⅠ-SalⅠ片段(Pharmacia，Sweden)，其攜帶色氨酸啟動子;
c)合成的編碼CⅡ核糖體結合位點的SalⅠ-NdeⅠ寡核苷酸;
d)合成的攜帶編碼bFGF和其衍生物之野生型或突變順序的NdeⅠ-XhoⅡ(BamHⅠ-可相容的)片段。
圖6中給出了編碼野生型bFGF的優選順序。編碼bFGF類似物的優選順序是按圖5所示突變情況對該順序進行修飾得到的。
對新基因表達的誘導和對所得重組蛋白的分析如「方法」部分所述。
4)重組分子的純化及生物學檢測可由細菌溶胞產物中純化重組突變體，並在與野生型bFGF平行進行的比較實驗中檢測其生物學特徵。
典型的純化方法是用超聲波破碎細胞，離心並將上清液過S-Sepharose離子交換柱。
用氯化鈉梯度洗脫蛋白質並直接加於肝素-Sepharose親合柱上。
用氯化鈉梯度洗脫蛋白質並用凝膠過濾法除鹽，然後凍幹。如此純化的類似物即可用於生物學活性檢測。
變體的性質、其實用性及使用方法。
本發明的新分子可用作野生型bFGF分子的拮抗物和/或增效物。
可參照Presta等人所述的方法(MolecularandCellularBiol.6，p.4060，1986)，基於增加內皮細胞增殖的能力來估計bFGF增效活性。
可參照Baird等所述的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，p.2324，1988)，基於125I-bFGF的結合抑制率來估計bFGF拮抗活性。
例如，已發現當以1ng/ml的劑量給予本發明縮寫為M6b的化合物時，內皮細胞增殖能力提高50%，此表明其具有特別明顯的bFGF增效活性。
另如，當存在300ng/ml本發明縮寫為M3-bFGF和M6a的變體化合物時，125I-bFGF(3ng/ml)的結合抑制率分別約為20%和70%，此即表明它們具有bFGF拮抗活性。
作為bFGF增效物，本發明的化合物可用作血管形成、細胞生長或細胞存活的促進劑，用於組織修復，如創傷、燒傷、骨折、表面損傷、潰瘍的癒合，還包括心肌缺血和梗塞期間的組織修復。
作為bFGF的拮抗物，本發明的化合物可用作血管形成抑制劑，故可用於治療以新血管生成為主要病理改變的疾病，如眼視網膜病、神經血管性青光眼、皮膚病如牛皮癬、慢性炎症、溼風溼性關節炎，以及如前所述用於治療某些腫瘤，特別是可作為抑制腫瘤血管生成有價值工具用治療血管生成性腫瘤。
本發明的化合物可與一種或多種醫藥上可接受的載體和/或稀釋劑結合，製成一種藥物組合物用於哺乳動物和人體。
活性物質的實用劑量將根據病人的年齡、體重和狀態，以及給藥途徑和預期的療程而定。
該醫藥組合物可經局部、眼、口、靜脈內、皮下或肌肉內給藥，可使用常用賦形劑以常規方法配製。
局部用藥時，可將活性成分與常用的油脂或乳化佐劑混合製成乳劑、洗劑或糊劑。局部使用的洗劑可含有10-100mg/ml活性物質，並可每天在感染部位施用達7次。
用於滴眼時，可在緩衝液或生理鹽水或其他適當賦形劑中配成藥水。
口服給藥時可配製成片劑或膠囊劑，其中可含有活性成分及稀釋劑，如乳糖、右旋糖、蔗糖、纖維素、玉米澱粉或馬鈴薯澱粉;潤滑劑如矽膠、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂或鈣，和/或聚乙二烯;粘合劑如澱粉、阿拉伯膠、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮;解聚劑劑澱粉、藻酸、藻酸鹽或澱粉甘醇酸鈉;發泡混合物;著色劑;甜味劑;潤滑劑如卵磷脂、多乙氧基醚、十二烷基硫酸鹽;以及一般用於醫藥配方中的非毒性、無藥理學活性的物質。可按已知方法，經混合、造顆、壓片、包糖衣或包膜等過程製造所說的藥物製劑。
用於肌肉內注射的懸浮液或溶液可含有活性化合物及其藥醫上可接受的載體，如無菌水、橄欖油、油酸乙脂、二元醇如α-丙二醇，必要時還可含有適當量的鹽酸利多卡因。
用於靜脈內注射或輸注的溶液可含有無菌水(最好是無菌等滲鹽溶液)作為載體。
本發明的化合物可以作為其醫藥上可接受的鹽或絡合物使用。
作為鹽，可以是與無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸鹽，以及有機酸如馬來酸、檸檬酸、乙酸、苯甲酸、琥珀酸、抗壞血酸和酒石酸形成的酸加成鹽。
絡合物的例子如鋅或鐵絡合物。
方法1)質粒的構建使用自動DNA合成儀(AppliedBiosysten，380B型)合成含有交迭順序的寡核苷酸，得到合成的DNA片段。將片段再克隆到M13載體中之後用雙脫氧法測定核苷酸順序(MessingJ.MethodsEnzymol，101，p.20-78，1983)。
使用限制性內切酶、連接酶和聚合酶(按製造商推薦的劑量和使用方法)，依據標準程序轉化大腸桿菌細胞(ManiatisT.，FrischE.F.andSambrookJ.MolecularCloning，Alaboratrymanual，ColdSpringHarbourLaboratory，ColdSpeingHarbour，NY，1982)。
2)誘變將編碼野生型bFGF(人或牛形式的)的合成順序再克隆到M13噬菌體載體中。按照已公開的方法(MessingJ.MethodsEnzymol.101，p.20-78，1983)培養單鏈形式的重組噬菌體載體。取20ng這些M13單鏈DNA在10mMTris-HCl(pH7.5)、0.1mMEDTA、50mMNaCl中於95℃下加熱5分鐘，並經逐步冷卻至室溫與合適的寡核苷酸一起退火。然後加入下列各組分ATP加到0.4mM(終濃度);dCTP、dGTP、dTTP加到0.12mM;dATP加到0.04mM;1單位大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段及0.5單位T4 DNA連接酶(Boehringer Mannheim)。終體積為50μl的35mM Tris-HCl(pH7.5)、0.1mM EDTA、6mM MgCl2、0.006mM DTT。於15℃下保溫12小時後，用該DNA按已公開的方法(Manniatis T.，Frisch E.F.and Sambrook J，Molecular cloning，ALaboratory manual，Cold Spring Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour，NY，1982)轉染大腸桿菌JM101細胞。
在含有10mM MgCl2、5mM DTT和10單位T4多核苷酸激酶(Boehringer Mannheim)的70mM Tris-HCl緩衝液(pH8)中，於50μl於37℃保溫30分鐘的反應混合物內，使用150μCi(r-32P)ATP(New Emgland Nuclear，6000 Ci/mmol)放射標記用以引起預期突變的寡核苷酸。然後用標記的寡核苷酸與誘變的噬菌體DNA進行噬班雜文。
在含有3×SSC、0.1%SDS、10×Denhardt氏液和0.2mg/ml變性鮭魚精子DNA的10mMTris-HCl緩衝液(pH8)中於65℃下雜交過夜。
在幾次變液的0.4×SSC、0.1%SDS中於65℃下將硝酸纖維素濾膜洗滌30分鐘，並對X光膠片曝光過夜。使用AmershamM13順序檢測藥盒，以Sanger氏雙脫氧核苷酸順序測定法檢測顯示陽性雜交之噬斑的核苷酸順序。
3)基因表達的誘導和分析用含有四環素(3μg/ml)的Luria核養液培養攜帶質粒的細胞。用添加於0.4%葡萄糖、0.4%酪蛋白胺基酸和10mg/ml硫胺素的M9培養基誘導處於色氨酸啟動子控制下的基因表達。
在沒有色氨酸的M9培養基中生長6小時後，離心收集細胞。沉澱細菌培養物的等分樣品，用載樣緩衝液重新懸浮並用Laemmli所述的SDS-PAGE法分析之(LaemmliU.K.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4，Nature227，p.680-685，1970)。
另外，也可用溶菌酶或超聲波破碎細胞，並分別分析經離心分離的可溶性和不溶性部分。電泳後用考馬氏亮蘭染色凝膠中的總細胞蛋白質。
用抗合成肽(含bFGF衍生的順序)的多克隆兔抗血清探查Western轉移印跡。按生產商推薦的方法使用包含生物素化羊抗兔IgG(作為第二抗體)的VectastainABC藥盒(VectorLaboratories，Ca.USA)進行檢測。
圖1圖示了迄今分離的不同天然形式的鹼FGF。已根據cDNA核苷酸順序推斷出的含155個胺基酸的bFGF。
圖2顯示了人和牛FGF的胺基酸順序。兩順序的差異在121和137位。相當於牛bFGF的胺基酸(不同於人形式者)用黑體符號示出。
圖3為前已公開發表的資料(YoshidaT.，MiyagawaK.，OdagiriH.，SakamotoH.，LittleP.F.R.，TeradaM.andSugimuraT.Genomicsequenceofhst，atransforminggeneencodingaproteinhomologoustofibroblastgrowthfactorsandtheint-2-encodedprotein，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84p.7305-7309，1987)。
hst蛋白、人鹼性FGF(hbFGF)、人酸性FGF(haFGF)及小鼠int-2蛋白的完整胺基酸順序對準排列並互相比較。短橫線指示為有最適排列而插入的間隙。完全相同於hst順序的殘基括在方框內，順序上方的編號以hst為準。
圖4圖示了鹼性FGF衍生物。編號是指155胺基酸bFGF的順序編號。塗黑的區域代表缺失的胺基酸順序。黑點代表單個胺基酸取代。
圖5並列顯示了人bFGF及其變體的完整胺基酸順序。短橫線指示缺失的胺基酸。星號代表單個胺基酸置換。
圖6為人和牛bFGF的核苷酸順序。該順序是用合成法重新構建的，並用於表達bFGF。用星號標示前20個胺基酸的密碼子，它們已在沒有改變相應胺基酸殘基的情況得以修飾。編碼牛順序中兩個不同胺基酸的密碼子在相對之密碼子下方並列示出。
圖7中pDS20代表用於構建bFGF表達質粒的通用質粒本底物。用bFGF基因取代galk基因，並向其中插入得自λ噬菌體的表達信號Ptrp和Shine-Dalgarno順序「CⅡ」以構建pEC80。
本發明涉及到分離新的鹼性FGF分子衍生物。所說的鹼性FGF分子可以是人或牛來源的。
使用DNA重組技術製得的這些新衍生物都是155胺基酸bFGF的缺失或置換變異體。據文獻報導，可以分離到人或牛不同形式的鹼性FGF，其不同僅在於氨基末端延伸的長度。具體地說，短到126個胺基酸或長到157個胺基酸的bFGF均具有等同的活性。
本發明人已在bFGF分子的完全不同於該異源氨基末端區的區域中完成了突變。例如使用了155胺基酸形式的bFGF。因此，很顯然也可以對其他形式的bFGF，如含有126個到157個胺基酸的bFGF，進行代表了本發明之主題的修飾。
如前所述，本發明的新分子可以作為野生型bFGF分子的拮抗物和/或超級增效物。另如上面所指出的，bFGF的拮抗物可能是抑制腫瘤血管形成的十分有價值的治療工具。而bFGF的超級增效物與天然順序相比則表現有改善了的藥理學性質。
對本發明化合物之生物學活性的估計，可明確鑑別bFGF分子中某些對bFGF的生物學和生物化學性質特別重要的區域。
經鑑定這些區域，特別是衍生物M1-bFGF、M2-bFGF和，M3-FGF中缺失的區域，指示在同樣區域中進行進一步突變(如置換、缺失或修飾)可產生治療上更為有效的bFGF衍生物。
這些進一步的突變也包括於本發明的範圍內。
如前面已述及的，本發明還涉及生產這些新的分子整體的DNA重組方法。令人感興趣的是，該方法也可成功地應用於生產野生型bFGF。另外，所有這些考慮對人和牛鹼性FGF順序都是有效的。
本發明說明書中公開的DNA重組方法，是基於使用用攜帶編碼預期的FGF分子之基因的質粒DNA轉化的大腸桿菌菌株而進行的。當然，本發明人也注意到已公開的其他DNA重組方法這一事實(IwaneM.，KurokawaT.，SasadaR.，SenoM.，NakagawaS.，IgarashiK.ExpressionofcDNAencodinghumanbasicfibroblastgrowthfactorinE.Coli，Biochem.Biophis.Res.cCommun.146，p.470-477，1987)。但本文所公開的方法就其新穎性和重組bFGF的產量特徵來說，此前卻從未描述過。
該方法的主要特徵之一是用作生產鹼性FGF的宿主的大腸桿菌菌株的類型。事實上，菌株的類型是影響大腸桿菌中異源基因表達的主要參數之一(HarrisT.J.R.andEmtageJ.S.ExpressionofheterologousgeneinE.ColiMicrobiologicalSciences3，p.28-31，1986)。
根據本發明，業已發現B型大腸桿菌菌株是用於生產重組bFGF及bFGF衍生物的十分有效的宿主。當將相同的bFGF表達載體轉化到其他大腸桿菌(K-12型、C型等)內時，確實並不能產生同樣多的bFGF。
本方法的第二個特徵是與在編碼不同bFGF分子的基因內導入某些「最適密碼子」。事實上，發明人已發現，為了提高表達水平，在不改變胺基酸順序的情況下修飾一定數目的DNA密碼子是必要的。本發明說明書中公開的順序(見圖6)是優選的DNA編碼順序。
用作宿主的菌株類型和最適密碼子這兩個特徵構成了本發明用於生產bFGF及其突變型之DNA重組方法的新穎性方面。適用於生產鹼性FGF的這兩方面的特徵，在迄今為止的科學文獻中從未提到或發表過。
權利要求
1.製備選自下列一組中之鹼性成纖維細胞生長因子衍生物的DNA重組方法a)一種人或牛鹼性成纖維細胞生長因子衍生物；其特徵在於缺失胺基酸殘基27至32(Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu)，上述胺基酸殘基的序號相當於155胺基酸形式的人或牛鹼性FGF；b)一種人或牛鹼性成纖維細胞生長因子衍生物，其特徵在於缺失胺基酸殘基54至58(Glu-Lys-Ser-Asp-Pro-)，上述胺基酸殘基的序號相當於155胺基酸形式的人或牛鹼性FGF；c)一種人或牛鹼性成纖維細胞生長因子衍生物，其特徵在於缺失胺基酸殘基70至75(Gly-Val-Val-Ser-Ile-Lys)，上述胺基酸殘基的序號相當於155胺基酸形式的人或牛鹼性FGF；d)一種人或牛鹼性成纖維細胞生長因子衍生物，其特徵在於缺失胺基酸殘基78至83(Cys-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu)，上述胺基酸殘基的序號相當於155胺基酸形式的人或牛鹼性FGF；e)一種人或牛鹼性成纖維細胞生長因子衍生物，其特徵在於缺失胺基酸殘基110至120(Asn-ASn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr)，上述胺基酸殘基的序號相當於155胺基酸形式的人或牛鹼性FGF；f)一種人或牛鹼性成纖維細胞生長因子衍生物，其特徵在於用穀氨醯胺(Gln)殘基取代胺基酸殘基128(Lys)129(Arg)，上述胺基酸殘基的序號相當於155胺基酸形式的人或牛鹼性FGF；以及g)一種人或牛鹼性成纖維細胞生長因子衍生物，其特徵在於用穀氨醯胺(Gln)殘基取代所有胺基酸殘基118(Arg)、119(Lys)、128(Lys和129(Arg)，上述胺基酸殘基的序號相當於155胺基酸形式的人或牛鹼性FGF。
2.根據權利要求1的製備人或牛鹼性成纖維細胞生長因子衍生物的方法，所說的衍生物包括具有根據權利要求1之突變的其他天然形式的人或牛bFGF。
3.根據權利要求1的製備任何前述權利要求所述的bFGF衍生物的方法，其中所說的衍生物還在氨基和/或羧基末端包含附加的胺基酸殘基。
4.根據權利要求1的製備前述權利要求所述之bFGF衍生物的方法，其中所說的衍生物有或沒有糖苷側鏈。
5.用於表達基因組DNA、cDNA、合成的或經修飾的基因之表達質粒pFC80，其中所說的基因編碼天然或經修飾的人或牛bFGF胺基酸順序。
6.根據權利要求5的表達質粒，其至少包含一個對一種抗生素具有抗性的基因或任何其他可選擇的標誌。
7.根據權利要求5或6的表達質粒，它用於表達編碼權利要求1之衍生物的基因。
8.B型大腸桿菌菌株用於生產權利要求1之重組衍生物。
9.利用權利要求5的質粒和B型大腸桿菌菌株生產權利要求1的衍生物。
10.如圖6所示的DNA編碼順序。
11.基於結合使用B形大腸桿菌菌株及圖6所示的DNA順序以生產人和牛bFGF的重組DNA方法。
12.基於結合使用B形大腸桿菌菌株和圖6所示的DNA順序以生產根據權利要求1之衍生物的DNA重組方法。
全文摘要
本發明涉及用DNA重組技術生產鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)衍生物。這些bFGF衍生物可在血管形成過程中用作野生型分子的拮抗物和/或超級增效物。可使用已用攜帶編碼人和牛bFGF及其衍生物之核苷酸順序的質粒轉化的大腸桿菌菌株製備這些衍生物以及野生型bFGF。
文檔編號C07K14/00GK1041181SQ89107069
公開日1990年4月11日 申請日期1989年9月14日 優先權日1988年9月16日
發明者波爾功造尼·蘿拉, 伊薩奇·安東尼拉, 沙米恩道斯·帕洛, 考埃特·奇裡斯 申請人:法米塔利亞·卡洛·阿巴有限責任公司