檢測小麥中是否含有高大山羊草染色體片段的方法及其專用引物的製作方法

2024-01-20 19:03:15

檢測小麥中是否含有高大山羊草染色體片段的方法及其專用引物的製作方法
【專利摘要】本發明公開了檢測或輔助檢測小麥中是否含有高大山羊草染色體片段的方法及其專用引物。該專用引物是由MAG2137、BF200742、Xgwm135、Xgwm140、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781和BG262882這9種引物對組成的組合物。本發明的檢測或輔助檢測小麥中是否含有高大山羊草染色體片段的方法與基因組原位雜交實驗檢測待測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的方法的一致性為100％。本發明可用於小麥雜交群體的篩選、鑑定與輔助選育具有高大山羊草優良性狀(籽粒微量元素(Fe和Zn)含量高及高品質)的小麥新品系/品種。
【專利說明】檢測小麥中是否含有高大山羊草染色體片段的方法及其專 用引物

【技術領域】
[0001] 本發明涉及作物分子遺傳育種領域中一種檢測小麥中是否含有高大山羊草染色 體片段的方法及其專用引物。

【背景技術】
[0002] 全球有超過30億的人口處在體內缺Fe和Zn元素的"隱性飢餓"狀態下，有超過 2. 5億兒童不同程度的缺乏Fe和Zn元素（Underwood等，1998)，有超過16億兒童蛋白質攝 取量嚴重不足（Brinch-Pedersen等，2007)。礦質元素特別是微量元素缺乏和蛋白質攝入 量不足將增加社會醫療保健的開支，嚴重阻礙社會經濟的發展（Graham等，2001)。我國小 麥籽粒礦質元素尤其是Fe和Zn元素含量還不能滿足人們的基本需求（朱展才和吳兆蘇， 1991 ;張勇等，2007)，因此，需要改良我國小麥礦質元素含量來改善人們的營養狀況。通過 往土壤裡施用含微量元素的肥料（楊莉琳等，2008)和選擇礦質含量高的小麥基因型作為 親本進行育種工作（張勇等，2007)都是可以提高小麥籽粒Fe和Zn元素含量的有效途徑。 但是，在土壤偏鹼性的情況下，施用微量元素肥料也於事無補（Lavado等，2001)，施用微量 元素肥料將增加投入成本並且施用過量還會對土壤造成汙染。因此，選擇礦質元素含量高 的小麥親本或培育含有微量元素高效吸收基因的小麥品種是最為有效和經濟的手段。
[0003] 研究發現，二倍體、四倍體和六倍體小麥吸收和轉運Zn的效率各不相同，而這種 差異是由不同倍性小麥的染色體數目不同引起的（Cakmak等，1999)。小麥的遠緣物種能夠 高效吸收礦質元素（Welch, 1995)和轉運礦質元素（Schlegel等，1998)，其主要原因是因為 小麥遠緣物種部分染色體上攜帶有控制礦質元素吸收和轉運的基因（Cakmak等，1997)。因 此，可以利用染色體工程的方法將小麥遠緣物種中攜帶高效吸收和轉運微量元素尤其是Fe 和Zn元素的染色體或染色體片段導入小麥，達到有效提高小麥籽粒Fe和Zn元素含量的目 的。
[0004]高大山羊草（Aegilopslongissima，2n= 14,染色體組為S1S1)，是小麥的遠緣物 種及小麥育種的優異基因源。高大山羊草高抗小麥白粉病（Ceoloni等1992 ;Cenci等， 1999)、葉銹病和麥二叉蚜（Gill等，1985)、抗乾旱脅迫（Rekika等，1998 ;Nevo和Chen， 2010)和鹽脅迫（Nevo和Chen，2010)、對小麥加工品質有顯著正效應（Garg等，2009)，能夠 顯著提高小麥籽粒Fe和Zn元素含量（Wang等，2011)。目前，對小麥加工品質有顯著正效 應的基因（Garg等，2009)定位在IS1染色體上；此外，高大山羊草IS1染色體導入小麥能顯 著提高小麥籽粒Fe和Zn元素含量，說明促進小麥高效吸收Fe和Zn元素的基因定位在IS1 染色體上（Wang等，2011)。因此，高大山羊草IS1染色體臂特異分子標記的建立將對相應 雜交群體的的篩選與鑑定，以至輔助選育籽粒Fe和Zn元素含量高及高品質小麥品系/品 種具有重要意義。
[0005] 參考文獻：
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【發明內容】

[0013] 本發明所要解決的技術問題是如何檢測或輔助檢測小麥中是否含有高大山羊草 染色體片段。
[0014]為解決上述技術問題，本發明首先提供了一種檢測或輔助檢測小麥中是否含有高 大山羊草染色體片段的方法。
[0015] 本發明所提供的檢測或輔助檢測小麥中是否含有高大山羊草染色體片段的方法， 包括如下步驟：
[0016] 1)分別以待測小麥、參比小麥和高大山羊草的基因組DNA為模板，用9種引物對 分別進行PCR擴增，得到所述9種引物對的待測小麥PCR產物、所述9種引物對的參比小麥 PCR產物和所述9種引物對的高大山羊草PCR產物；所述參比小麥為不含高大山羊草染色 體片段的小麥，作為確定高大山羊草特異條帶的參比；
[0017] 2)將所述9種引物對的待測小麥PCR產物、所述9種引物對的參比小麥PCR產物和 所述9種引物對的高大山羊草PCR產物進行電泳，根據電泳結果確定所述9種引物對的待 測小麥PCR產物中是否含有高大山羊草相應引物對的特異條帶，如果所述9種引物對的待 測小麥PCR產物中至少有一種引物對的待測小麥PCR產物中含有高大山羊草相應引物對的 特異條帶，所述待測小麥含有高大山羊草染色體片段或候選含有高大山羊草染色體片段； 如果所述9種引物對的待測小麥PCR產物中均不含有高大山羊草相應引物對的特異條帶， 所述待測小麥不含有高大山羊草的染色體片段或候選不含有高大山羊草的染色體片段；
[0018] 所述高大山羊草相應引物對的特異條帶為同一種引物對的高大山羊草PCR產物 含有但所述同一種引物對的所述參比小麥的PCR產物不含有的條帶；
[0019]所述9種引物對的名稱分別為MAG2137、BF200742、Xgwml35、Xgwml40、BE500714、 BE489692、BF604958、BE585781和BG262882 ;
[0020] 所述MAG2137由序列表中SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的兩條單鏈DNA組成； 所述BF200742由序列表中SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的兩條單鏈DNA組成；所述 Xgwml35由序列表中SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的兩條單鏈DNA組成；所述XgwmHO 由序列表中SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的兩條單鏈DNA組成；所述BE500714由序列 表中SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 10所示的兩條單鏈DNA組成；所述BE489692由序列表中 SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示的兩條單鏈DNA組成；所述BF604958由序列表中SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示的兩條單鏈DNA組成；所述BE585781由序列表中SEQ ID No. 15和SEQ ID No. 16所示的兩條單鏈DNA組成；所述BG262882由序列表中SEQ ID No. 17 和SEQ ID No. 18所示的兩條單鏈DNA組成。所述9種引物對或/和各引物對中的所述兩 條單鏈DNA均獨立包裝。
[0021] 上述PCR擴增中，每15μLPCR擴增反應體系中含有25ng的模板DNA、0. 75UTaq DNA聚合酶、200μΜ的dNTPs、含Mg2+的1. 5μL10XPCR緩衝溶液、10μΜ正向引物、10μΜ 反向引物、其餘為無囷雙蒸饋水。
[0022] 所述PCR擴增採用的引物退火條件可為52_57°C退火45s，其中，用所述MAG2137 進行PCR擴增的退火條件為52°C退火45s，用所述Xgwml35進行PCR擴增和用所述XgwmHO 進行PCR擴增的退火條件均為55 °C退火45s，用所述BF200742進行PCR擴增、用所述 BE500714進行PCR擴增、用所述BE489692進行PCR擴增、用所述BF604958進行PCR擴增、 用所述BE585781進行PCR擴增和用所述BG262882進行PCR擴增的退火條件均為57°C退火 45s〇
[0023] 所述PCR擴增中，用所述MAG2137進行PCR擴增採用的PCR反應溫度程序如下： 94°C預變性3min，然後進行如下35個循環：94°C變性45s，52°C退火45s，72°C延伸2min;最 後72°C延伸10min，4°C保存；
[0024] 所述PCR擴增中，用所述Xgwml35進行PCR擴增和用所述XgwmHO進行PCR擴增 採用的PCR反應溫度程序如下：94°C預變性3min，然後進行如下35個循環：94°C變性45s， 55°C退火45s，72°C延伸2min ;最後72°C延伸10min，4°C保存；
[0025] 所述PCR擴增中，用所述BF200742進行PCR擴增、用所述BE500714進行PCR擴增、 用所述BE489692進行PCR擴增、用所述BF604958進行PCR擴增、用所述BE585781進行PCR 擴增和用所述BG262882進行PCR擴增採用的PCR反應溫度程序如下：94°C預變性3min，然 後進行如下35個循環：94°C變性45s，57°C退火45s，72°C延伸2min;最後72°C延伸10min， 4°C保存。
[0026] 所述電泳中，所述MAG2137、所述Xgwml35和所述XgwmHO引物對的待測小麥PCR 產物、參比小麥PCR產物和高大山羊草PCR產物均採用非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，所述 非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳中，所述聚丙烯醯胺凝膠的濃度為8% (質量百分含量），所 述聚丙烯醯胺凝膠的交聯度為2. 5% ;所述電泳中，所述BF200742、所述BE500714、所述 BE489692、所述BF604958、所述BE585781和所述BG262882引物對的待測小麥PCR產物、參 比小麥PCR產物和高大山羊草PCR產物均採用瓊脂糖凝膠電泳，所述瓊脂糖凝膠的濃度為 2% (質量百分含量）。
[0027] 上述方法中，所述參比小麥可為下述五種小麥中的至少一種：中國春小麥、一粒小 麥（美國堪薩斯州立大學小麥遺傳與基因組資源中心（http://www.k-state.edu/wgrc/) 中編號為TA136)、圓錐小麥（美國堪薩斯州立大學小麥遺傳與基因組資源中心（http:// www.k-state.edu/wgrc/)中編號為TA10543)、綿陽11小麥和綿陽15小麥。
[0028]為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草 染色體片段的下述產品：檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的組合物 1、含有組合物1的試劑或試劑盒、檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的 組合物2,含有組合物2的試劑或試劑盒、檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體 片段的引物對和含有該引物對的試劑或試劑盒。
[0029] 本發明所提供的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的組合物 1，由名稱分別為所述MAG2137、所述BF200742、所述Xgwml35、所述Xgwml40、所述BE500714、 所述BE489692、所述BF604958、所述BE585781和所述BG262882的這9種引物對組成的組 合物。
[0030] 上述組合物1中，所述9種引物對中的每種引物對均單獨包裝，所述9種引物對的 摩爾數均相同。
[0031] 本發明所提供的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的組合 物2,由所述BE489692與下述8種引物對中7種、6種、5種、4種、3種、2種或1種引物對 進行組合得到的組合物：所述MAG2137、所述BF200742、所述Xgwml35、所述Xgwml40、所述 BE500714、所述BF604958、所述BE585781 和所述BG262882。
[0032] 上述組合物2中，每種引物對均單獨包裝，各種引物對的摩爾數相同。
[0033] 本發明所提供的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引物對， 所述引物對為BE489692。
[0034] 上文中，各個引物對中的所述兩條單鏈DNA均獨立包裝。
[0035] 本發明所提供的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的試劑或 試劑盒，為A或B或C:
[0036]A、檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的試劑或試劑盒，含有所 述的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引物對組合物1 ;
[0037]B、檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的試劑或試劑盒，含有所 述的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引物對組合物2;
[0038]C、檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的試劑或試劑盒，含有所 述的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引物對BE489692 ;
[0039]為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草 染色體片段的引物對組合物或引物對或試劑或試劑盒的製備方法，包括將上述各引物對的 所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
[0040] 為解決上述技術問題，本發明還提供了下述A或B的應用：
[0041]A、上述引物對組合物、上述引物對、上述試劑或試劑盒和上述方法在檢測或輔助 檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段中的應用；
[0042] B、上述引物對組合物、上述引物對、上述試劑或試劑盒和上述方法在小麥育種中 的應用。
[0043] 本發明所提供的小麥的育種方法也屬於本發明保護的範圍，所述小麥的育種方法 包括將上述檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的方法得到的含有高大 山羊草染色體片段或候選含有高大山羊草染色體片段的待測小麥作為親本進行雜交育種 的步驟。
[0044] 上文中，所述待測小麥和所述小麥可為小麥、或小麥和含有高大山羊草染色體片 段的植物雜交得到的雜交小麥，所述待測小麥具體可為中國春IB缺體和中國春-高大山羊 草IS1附加系進行雜交得到的&群體；如所述待測小麥為中國春IB缺體與美國堪薩斯州立 大學小麥遺傳與基因組資源中心(http://www.k-state.edu/wgrc/)中編號為TA3573的中 國春-高大山羊草IS1附加系進行雜交得到的F2群體。所述中國春IB缺體是美國堪薩斯 州立大學小麥遺傳與基因組資源中心(http://www.k-state.edu/wgrc/)中編號為TA6550 中國春IB單體的自交F1後代中得到的染色體數目2n= 40的IB缺體植株。
[0045] 上述文中，所述高大山羊草染色體片段可為高大山羊草IS1染色體片段。
[0046] 本發明獲得了如9種高大山羊草IS1染色體臂的新標記：MAG2137、BF200742、 Xgwml35、Xgwml40、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781 和BG262882。本發明採用上 述9種高大山羊草IS1染色體新標記的檢測或輔助檢測待測小麥中是否含有高大山羊草染 色體片段的方法與基因組原位雜交實驗檢測待測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的 方法的一致性為100%。本發明可用於小麥雜交群體的篩選、鑑定與輔助選育具有高大山羊 草優良性狀（如籽粒微量元素（Fe和Zn)含量高及高品質）的小麥新品系/品種。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0047] 圖1為引物對MAG2137對供試材料擴增結果的非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜： A為利用高大山羊草、中國春-高大山羊草IS1附加系和參比小麥篩選引物對MAG2137的 圖譜；B為利用一套中國春-高大山羊草附加系（IS^S1附加系）對引物對MAG2137進行 染色體定位的圖譜；C為利用中國春-高大山羊草lSk2L端體附加系和中國春-高大山 羊草1S42S端體附加系對引物對MAG2137進行染色體臂定位的圖譜；箭頭所示為引物對 MAG2137擴增出的650bp高大山羊草特異DNA片段。
[0048] 圖2為引物對BF200742對供試材料擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜：A為利用高 大山羊草、中國春-高大山羊草IS1附加系和參比小麥篩選引物對BF200742的圖譜；B為利 用一套中國春-高大山羊草附加系（IS1-TS1附加系）對引物對BF200742進行染色體定位 的圖譜；C為利用中國春-高大山羊草lSk2L端體附加系和中國春-高大山羊草lSk2S端 體附加系對引物對BF200742進行染色體臂定位的圖譜；箭頭所示為引物對BF200742擴增 出的1300bp高大山羊草特異DNA片段。
[0049] 圖3為引物對Xgwml35對供試材料擴增結果的非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜： A為利用高大山羊草、中國春-高大山羊草IS1附加系和參比小麥篩選引物對Xgwml35的 圖譜；B為利用一套中國春-高大山羊草附加系（IS1-TS1附加系）對引物對Xgwml35進行 染色體定位的圖譜；C為利用中國春-高大山羊草lSk2L端體附加系和中國春-高大山 羊草1S42S端體附加系對引物對Xgwml35進行染色體臂定位的圖譜；箭頭所示為引物對 Xgwml35擴增出的220bp和275bp高大山羊草特異DNA片段。
[0050] 圖4為引物對XgwmHO對供試材料擴增結果的非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜： A為利用高大山羊草、中國春-高大山羊草IS1附加系和參比小麥篩選引物對XgwmHO的 圖譜；B為利用一套中國春-高大山羊草附加系（IS1-TS1附加系）對引物對XgwmHO進行 染色體定位的圖譜；C為利用中國春-高大山羊草lSk2L端體附加系和中國春-高大山 羊草lSk2S端體附加系對引物對XgwmHO進行染色體臂定位的圖譜；箭頭所示為引物對 XgwmHO擴增出的200bp高大山羊草特異DNA片段。
[0051] 圖5為引物對BE500714對供試材料擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜：A為利用高 大山羊草、中國春-高大山羊草IS1附加系和參比小麥篩選引物對BE500714的圖譜；B為利 用一套中國春-高大山羊草附加系（IS1-TS1附加系）對引物對BE500714進行染色體定位 的圖譜；C為利用中國春-高大山羊草lSk2L端體附加系和中國春-高大山羊草lSk2S端 體附加系對引物對BE500714進行染色體臂定位的圖譜；箭頭所示為引物對BE500714擴增 出的520bp高大山羊草特異DNA片段。
[0052] 圖6為引物對BE489692對供試材料擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜:A為利用高 大山羊草、中國春-高大山羊草IS1附加系和參比小麥篩選引物對BE489692的圖譜；B為利 用一套中國春-高大山羊草附加系（IS1-TS1附加系）對引物對BE489692進行染色體定位 的圖譜；C為利用中國春-高大山羊草lSk2L端體附加系和中國春-高大山羊草lSk2S端 體附加系對引物對BE489692進行染色體臂定位的圖譜；箭頭所示為引物對BE489692擴增 出的480bp高大山羊草特異DNA片段。
[0053] 圖7為引物對BF604958對供試材料擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜：A為利用高 大山羊草、中國春-高大山羊草IS1附加系和參比小麥篩選引物對BF604958的圖譜；B為利 用一套中國春-高大山羊草附加系（IS1-TS1附加系）對引物對BF604958進行染色體定位 的圖譜；C為利用中國春-高大山羊草lSk2L端體附加系和中國春-高大山羊草lSk2S端 體附加系對引物對BF604958進行染色體臂定位的圖譜；箭頭所示為引物對BF604958擴增 出的650bp高大山羊草特異DNA片段。
[0054] 圖8為引物對BE585781對供試材料擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜：A為利用高 大山羊草、中國春-高大山羊草IS1附加系和參比小麥篩選引物對BE585781的圖譜；B為利 用一套中國春-高大山羊草附加系（IS1-TS1附加系）對引物對BE585781進行染色體定位 的圖譜；C為利用中國春-高大山羊草lSk2L端體附加系和中國春-高大山羊草lSk2S端 體附加系對引物對BE585781進行染色體臂定位的圖譜；箭頭所示為引物對BE585781擴增 出的HObp高大山羊草特異DNA片段。
[0055] 圖9為引物對BG262882對供試材料擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜：A為利用高 大山羊草、中國春-高大山羊草IS1附加系和參比小麥篩選引物對BG262882的圖譜；B為利 用一套中國春-高大山羊草附加系（IS1-TS1附加系）對引物對BG262882進行染色體定位 的圖譜；C為利用中國春-高大山羊草lSk2L端體附加系和中國春-高大山羊草lSk2S端 體附加系對引物對BG262882進行染色體臂定位的圖譜；箭頭所示為引物對BG262882擴增 出的770bp高大山羊草特異DNA片段。
[0056] 圖10為引物對MAG2137對中國春IB缺體和中國春-高大山羊草IS1附加系的 部分雜交F2分離群體的擴增結果的非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜；箭頭所示為引物對 MAG2137擴增出的650bp高大山羊草特異DNA片段。
[0057] 圖11為引物對BF200742對中國春IB缺體和中國春-高大山羊草IS1附加系的 部分雜交F2分離群體的擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜；箭頭所示為引物對BF200742擴 增出的1300bp高大山羊草特異DNA片段。
[0058] 圖12為引物對Xgwml35對中國春IB缺體和中國春-高大山羊草IS1附加系的 部分雜交F2分離群體的擴增結果的非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜；箭頭所示為引物對 Xgwml35擴增出的220bp和275bp高大山羊草特異DNA片段。
[0059] 圖13為引物對XgwmHO對中國春IB缺體和中國春-高大山羊草IS1附加系的 部分雜交F2分離群體的擴增結果的非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜；箭頭所示為引物對 XgwmHO擴增出的200bp高大山羊草特異DNA片段。
[0060] 圖14為引物對BE500714對中國春IB缺體和中國春-高大山羊草IS1附加系的 部分雜交F2分離群體的擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜；箭頭所示為引物對BE500714擴 增出的520bp高大山羊草特異DNA片段。
[0061] 圖15為引物對BE489692對中國春IB缺體和中國春-高大山羊草IS1附加系的 部分雜交F2分離群體的擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜；箭頭所示為引物對BE489692擴 增出的480bp高大山羊草特異DNA片段。
[0062] 圖16為引物對BF604958對中國春IB缺體和中國春-高大山羊草IS1附加系的 部分雜交F2分離群體的擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜；箭頭所示為引物對BF604958擴 增出的650bp高大山羊草特異DNA片段。
[0063] 圖17為引物對BE585781對中國春IB缺體和中國春-高大山羊草IS1附加系的 部分雜交F2分離群體的擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜；箭頭所示為引物對BE585781擴 增出的HObp高大山羊草特異DNA片段。
[0064] 圖18為引物對BG262882對中國春IB缺體和中國春-高大山羊草IS1附加系的 部分雜交F2分離群體的擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜；箭頭所示為引物對BG262882擴 增出的770bp高大山羊草特異DNA片段。
[0065] 圖19為基因組原位雜交鑑定分子標記鑑定出的部分中國春IB缺體和中國春-高 大山羊草IS1附加系的部分雜交F2分離群體的雜交圖譜：A為Aelon-I單株的基因組原位 雜交圖譜；B為Aelon-5單株的基因組原位雜交圖譜；C為Aelon-67單株的基因組原位雜交 圖譜。

【具體實施方式】
[0066] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。
[0067] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0068] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0069]下述實施例中的一粒小麥（TA136)、圓錐小麥（TA10543)、高大山羊草（TA1910)、 中國春-高大山羊草isk2附加系（TA3573)、中國春-高大山羊草2Sk3附加系（TA7544)、 中國春-高大山羊草3Sk3附加系（TA7545)、中國春-高大山羊草4Sk3附加系（TA7546)、 中國春-高大山羊草55^3附加系（TA7547)、中國春-高大山羊草65^3附加系（TA7548)、 中國春-高大山羊草7S43附加系（TA7549)、中國春-高大山羊草lSk2S端體附加系 (TA7515)、中國春-高大山羊草1S42L端體附加系（TA7516)和中國春IB單體（TA6550)由 美國堪薩斯州立大學小麥遺傳與基因組資源中心GillBS教授提供，公眾可從美國堪薩斯 州立大學小麥遺傳與基因組資源中心(http://www.k-state.edu/wgrc/)有償獲得，該生 物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0070] 下述實施例中的綿陽11小麥（MYll)和中國春（CS)(LiuC，YangZJ，LiGR，Zeng ZXjZhangYjZhouJPjLiuZHjRenZL.2008.IsolationofanewrepetitiveDNA sequencefromSecaleafricanumenablestargetingofSecalechromatininwheat background.Euphytica，159(1-2) :249-258.);綿陽 15(MY15)(ZhouJP，ZhangHY，Yang ZJjLiGRjHuLJ，LeiMP，LiuC，ZhangY，ZhangY，RenZL. 2012.Characterizationofa newT2DS.2DL- ?RtranslocationtriticaleZH-Iwithmultipleresistancesto diseases.GenetResourCropEvol，59 (6) :1161-1168.)由電子科技大學生命科學與技術 學院楊足君教授提供，公眾可從山東省農業科學院作物所獲得，該生物材料只為重複本發 明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0071] 實施例1、高大山羊草分子標記用於檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段
[0072] 一、製備檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的PCR引物對組合 物
[0073] 本步驟製備的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的PCR引 物對組合物，由名稱為MAG2137的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段 的引物對、名稱為BF200742的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的 引物對、名稱為Xgwml35的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引 物對、名稱為XgwmHO的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引物 對、名稱為BE500714的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引物對、 名稱為BE489692的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引物對、名 稱為BF604958的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引物對、名稱 為BE585781的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引物對、名稱為 BG262882的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引物對。其中，MAG2137 由序列表中SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示的兩條單鏈DNA組成，BF200742由序列表中 SEQIDNo. 3和SEQIDNo. 4所示的兩條單鏈DNA組成，Xgwml35由序列表中SEQIDNo. 5 和SEQIDNo. 6所示的兩條單鏈DNA組成，XgwmHO由序列表中SEQIDNo. 7和SEQID No. 8所示的兩條單鏈DNA組成，BE500714由序列表中SEQIDNo. 9和SEQIDNo. 10所示的 兩條單鏈DNA組成，BE489692由序列表中SEQIDNo. 11和SEQIDNo. 12所示的兩條單鏈 DNA組成，BF604958由序列表中SEQIDNo. 13和SEQIDNo. 14所示的兩條單鏈DNA組成， BE585781由序列表中SEQIDNo. 15和SEQIDNo. 16所示的兩條單鏈DNA組成，BG262882由 序列表中SEQIDNo. 17和SEQIDNo. 18所示的兩條單鏈DNA組成。上述檢測或輔助檢測小 麥是否含有高大山羊草染色體片段的PCR引物對組合物中，MAG2137、BF200742、Xgwml35、 Xgwml40、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781 和BG262882 均獨立包裝，每種引物對中 的兩條單鏈DNA的摩爾比均為I: 1。
[0074] 二、高大山羊草分子標記用於檢測中國春IB缺體和中國春-高大山羊草IS1附加 系雜交F2群體中是否含有高大山羊草染色體片段
[0075] 從中國春IB單體（2η= 41)自交F1後代中篩選出染色體數目2η= 40的中國春 IB缺體植株。將中國春-高大山羊草IS1附加系植株（ΤΑ3573)與中國春IB缺體植株進行 雜交，其雜交F1代植株的基因組染色體中因為存在IB和IS1雙單體，不能正常配對，因此， IB和IS1染色體很容易在著絲粒處發生斷裂並重接。利用獲得的9對高大山羊草染色體標 記對中國春IB缺體和中國春-高大山羊草IS1附加系雜交F2群體進行篩選，隨機選取雜交 F2群體中編號為Aelon-I至Aelon-101株的101個F2植株（簡稱Aelon-I至Aelon-101) 每個單株均作為待測小麥，用本發明的方法檢測待測小麥是否含有高大山羊草染色體特異 DNA片段。檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的方法，包括如下步驟：
[0076] 1)分別以待測小麥（Aelon-I至Aelon-IOl中的任一個單株）、參比小麥（中國春 小麥）、中國春-高大山羊草isk2附加系（ΤΑ3573)(簡稱小麥-高大山羊草附加系）和 高大山羊草的基因組DNA為模板，用9種引物對分別進行PCR擴增，得到9種引物對的待 測小麥PCR產物、9種引物對的參比小麥PCR產物、9種引物對的小麥-高大山羊草附加系 PCR產物和9種引物對的高大山羊草PCR產物；參比小麥不含高大山羊草染色體片段的小 麥，作為確定高大山羊草特異條帶的參比；所述9種引物對為步驟一的MAG2137、BF200742、 Xgwml35、Xgwml40、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781 和BG262882 ;
[0077] 2)將9種引物對的待測小麥PCR產物、9種引物對的參比小麥PCR產物、9種引物 對的小麥-高大山羊草附加系PCR產物和9種引物對的高大山羊草PCR產物進行電泳，根 據電泳結果確定9種引物對的待測小麥PCR產物中是否含有高大山羊草相應引物對的特異 條帶，如果9種引物對的待測小麥PCR產物中至少有一種引物對的待測小麥PCR產物中含 有高大山羊草相應引物對的特異條帶，則待測小麥含有高大山羊草染色體片段或候選含有 高大山羊草染色體片段；如果9種引物對的待測小麥PCR產物中均不含有高大山羊草相應 引物對的特異條帶，則待測小麥不含有高大山羊草的染色體片段或候選不含有高大山羊草 的染色體片段；高大山羊草相應引物對的特異條帶為同一種引物對的高大山羊草PCR產物 含有但所述同一種引物對的參比小麥的PCR產物不含有的條帶。
[0078] 具體方法如下：提取高大山羊草、中國春-高大山羊草IS1植株附加系（TA3573)、 Aelon-I至Aelon-IOl植株和中國春小麥的各個單株的基因組DNA，用步驟一的MAG2137、 BF200742、Xgwml35、Xgwml40、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781 和BG262882 這 9 種引物對中任一引物對分別進行擴增，PCR反應體系如實施例2中表3所示。PCR反應在 BIO-RADPCR擴增儀上進行，其中，MAG2137引物對的擴增程序為：94°C預變性3min，然後 進行如下35個循環：94°C變性45s，52°C退火45s，72°C延伸2min;最後72°C延伸lOmin， 4°C保存；Xgwml35和XgwmHO引物對擴增程序為：94°C預變性3min，然後進行如下35個循 環：94°C變性 45s，55°C退火 45s，72°C延伸 2min;最後 72°C延伸 10min，4°C保存；BF200742、 BE500714、BE489692、BF604958、BE585781 和BG262882 引物對的擴增程序為：94°C預變性 3min，然後進行如下35個循環：94°C變性45s，57°C退火45s，72°C延伸2min;最後72°C延伸 IOmin，4°C保存，得到上述9種引物對中的每一種引物對的高大山羊草的PCR擴增產物、中 國春-高大山羊草IS1附加系植株（TA3573)的PCR擴增產物、Aelon-I至Aelon-IOl植株 的PCR擴增產物和中國春小麥（參比小麥）的PCR擴增產物。
[0079] 將上述9對引物對的每一種引物對的高大山羊草的PCR擴增產物、中國春-高大 山羊草IS1附加系植株（TA3573)的PCR擴增產物、Aelon-I至Aelon-IOl植株（待測小 麥）的PCR擴增產物和中國春小麥（參比小麥）的PCR擴增產物進行電泳，其中，MAG2137、 Xgwml35和XgwmHO引物對的高大山羊草的PCR擴增產物、中國春-高大山羊草IS1附加 系植株（TA3573)的PCR擴增產物、Aelon-I至Aelon-IOl植株（待測小麥）的PCR擴增產 物和中國春小麥（參比小麥）的PCR擴增產物均採用非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，非變性 聚丙烯醯胺凝膠電泳中，聚丙烯醯胺凝膠的濃度為8% (質量百分含量），聚丙烯醯胺凝膠 的交聯度為2. 5% ;電泳緩衝液為1XTBE，分別取15μL上述同一種引物對的擴增產物，力口 入3yL指示劑（含0. 1%溴酚藍和0. 1%二甲苯青），混勻，上樣量為3yL，採用180V恆定 電壓電泳約55min，所用康為世紀公司生產的DM2000plusDNAMarker(8條分子量分別為： lOObp，250bp, 500bp, 750bp,IOOObp, 2000bp, 3000bp和 5000bp)，經硝酸銀染色 30min後觀 察照相。BF200742、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781 和BG262882 引物對的高大 山羊草的PCR擴增產物、中國春-高大山羊草IS1附加系植株（TA3573)的PCR擴增產物、 Aelon-I至Aelon-IOl植株（待測小麥）的PCR擴增產物和中國春小麥（參比小麥）的PCR 擴增產物均採用瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠的濃度為2% (質量百分含量），電泳緩衝液 為1XTAE，分別取上述同一種引物對的擴增產物10μL，在150V恆定電壓下電泳約25min， 所用康為世紀公司生產的DM2000plusDNAMarker(8條分子量分別為：100bp，250bp，500 bp，750bp，lOOObp，2000bp，3000bp和5000bp)，然後用1μg/mL的溴化乙錠溶液進行染色 30min，最後在⑶S-GelDol2000紫外凝膠成像系統下掃描照像。
[0080] 根據電泳結果確定9種引物對的待測小麥PCR產物中是否含有高大山羊草相應引 物對的特異條帶，如果9種引物對的待測小麥PCR產物中至少有一種引物對的待測小麥PCR 產物中含有高大山羊草相應引物對的特異條帶，則待測小麥含有高大山羊草染色體片段或 候選含有高大山羊草染色體片段；如果9種引物對的待測小麥PCR產物中均不含有高大山 羊草相應引物對的特異條帶，則待測小麥不含有高大山羊草的染色體片段或候選不含有高 大山羊草的染色體片段。
[0081] 高大山羊草相應引物對的特異條帶為同一種引物對的高大山羊草PCR產物含有 但所述同一種引物對的所述參比小麥的PCR產物不含有的條帶。
[0082] 結果表明Xgwml35的Aelon-I的PCR產物和表1的Xgwml35列為" + "的其它植株 的PCR產物和中國春-高大山羊草IS1附加系植株（TA3573)的PCR產物均含有220bp和 275bp的高大山羊草特異條帶（Xgwml35的高大山羊草的PCR產物中含有220bp和275bp條 帶而Xgwml35的參比小麥中國春的PCR產物中不含有220bp和275bp條帶），說明Aelon-I 和表1的Xgwml35列為" + "的其它植株均含有高大山羊草染色體片段；XgwmHO的Aelon-I 的PCR產物和表1的XgwmHO列為" + "的其它植株的PCR產物和中國春-高大山羊草IS1 附加系植株（TA3573)的PCR產物均含有200bp的高大山羊草特異條帶（XgwmHO的高大山 羊草的PCR產物中含有該200bp條帶而XgwmHO的參比小麥中國春的PCR產物中不含有 該200bp條帶），說明Aelon-I和表1的XgwmHO列為" + "的其它植株均含有高大山羊草 染色體片段；BE500714的Aelon-I的PCR產物和表1的BE500714列為" + "的其它植株的 PCR產物和中國春-高大山羊草IS1附加系植株（TA3573)的PCR產物均含有520bp的高 大山羊草特異條帶（BE500714的高大山羊草的PCR產物中含有該520bp條帶而BE500714 的參比小麥中國春的PCR產物中不含有該520bp條帶），說明Aelon-I和表1的BE500714 列為" + "的其它植株均含有高大山羊草染色體片段；BF604958的Aelon-I的PCR產物和 表1的BF604958列為" + "的其它植株的PCR產物和中國春-高大山羊草IS1附加系植株 (TA3573)的PCR產物均含有650bp的高大山羊草特異條帶（BF604958的高大山羊草的PCR 產物中含有該650bp條帶而BF604958的參比小麥中國春的PCR產物中不含有該650bp條 帶），說明Aelon-I和表1的BF604958列為" + "的其它植株均含有高大山羊草染色體片段； BE585781的Aelon-I的PCR產物和表1的BE585781列為" + "的其它植株的PCR產物和中 國春-高大山羊草IS1附加系植株（TA3573)的PCR產物均含有HObp的高大山羊草特異條 帶（BE585781的高大山羊草的PCR產物中含有該HObp條帶而BE585781的參比小麥中國 春的PCR產物中不含有該HObp條帶），說明Aelon-I和表1的BE585781列為" + "的其它 植株均含有高大山羊草染色體片段；BG262882的Aelon-I的PCR產物和表1的BG262882列 為" + "的其它植株的PCR產物和中國春-高大山羊草IS1附加系植株（TA3573)的PCR產物 均含有770bp的高大山羊草特異條帶（BG262882的高大山羊草的PCR產物中含有該770bp 條帶而BG262882的參比小麥中國春的PCR產物中不含有該770bp條帶），說明Aelon-I和 表1的BG262882列為" + "的其它植株均含有高大山羊草染色體片段；BE489692的Aelon-I 的PCR產物和表1的BE489692列為" + "的其它植株的PCR產物和中國春-高大山羊草IS1 附加系植株（TA3573)的PCR產物均含有480bp的高大山羊草特異條帶（BE489692的高大 山羊草的PCR產物中含有該480bp條帶而BE489692的參比小麥中國春的PCR產物中不含 有該480bp條帶），說明Aelon-I和表1的BE489692列為" + "的其它植株均含有高大山 羊草染色體片段;MAG2137的Aelon-2的PCR產物和表1的MAG2137列為" + "的其它植株 的PCR產物和中國春-高大山羊草IS1附加系植株（TA3573)PCR產物均含有650bp的高大 山羊草特異條帶（MAG2137的高大山羊草的PCR產物中含有該650bp條帶而MAG2137的參 比小麥中國春的PCR產物中不含有該650bp條帶），說明Aelon-2和表1的MAG2137列為 " + "的其它植株均含有高大山羊草染色體片段；BF200742的Aelon-2的PCR產物和表1的 BF200742列為" + "的其它植株的PCR產物和中國春-高大山羊草IS1附加系植株（TA3573) PCR產物均含有1300bp的高大山羊草特異條帶（BF200742的高大山羊草的PCR產物中含 有該1300bp條帶而BF200742的參比小麥中國春的PCR產物中不含有該1300bp條帶），說 明Aelon-2和表1的BF200742列為" + "的其它植株均含有高大山羊草染色體片段。該9 種引物對中任一引物對在Aelon-9、Aelon-12、Aelon-52、Aelon-53、Aelon-57、Aelon-60、 Aelon-62、Aelon-63、Aelon-67和Aelon-87這10株單株中均不能擴增出高大山羊草染色 體特異DNA片段，說明這10株單株中不含有高大山羊草染色體片段。上述檢測結果表明 Aelon-I至Aelon-8 這 8 株單株、Aelon-10、Aelon-11、Aelon-13 至Aelon-51 這 39 株單 株、Aelon-54、Aelon-55、Aelon-56、Aelon-58、Aelon-59、Aelon-61、Aelon-64、Aelon-65、 Aelon-66、Aelon-68 至Aelon-86 這 19 個單株、Aelon-88 至Aelon-101 這 14 個單株共 91 株單株含有高大山羊草染色體片段，Aelon-9、Aelon-12、Aelon-52、Aelon-53、Aelon-57、 Aelon-60、Aelon-62、Aelon-63、Aelon_67和Aelon-87這10株單株不含有高大山羊草染色 體片段。
[0083] 圖10至圖18展示了9種引物對的中國春IB缺體和中國春-高大山羊草IS1附 加系雜交F2群體Aelon-I至Aelon-IOl中部分單株PCR擴增結果的電泳結果。
[0084] 表1、高大山羊草IS1染色體臂特異分子標記對雜交後代群體的分子檢測情況
[0085]

【權利要求】
1. 檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引物對組合物，其名稱為組 合物 1,由 MAG2137、BF200742、Xgwml35、Xgwml40、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781 和BG262882這9種引物對組成的組合物； 所述MAG2137由序列表中SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的兩條單鏈DNA組成； 所述BF200742由序列表中SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的兩條單鏈DNA組成； 所述Xgwml35由序列表中SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的兩條單鏈DNA組成； 所述Xgwml40由序列表中SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的兩條單鏈DNA組成； 所述BE500714由序列表中SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 10所示的兩條單鏈DNA組成； 所述BE489692由序列表中SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示的兩條單鏈DNA組成； 所述BF604958由序列表中SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示的兩條單鏈DNA組成； 所述BE585781由序列表中SEQ ID No. 15和SEQ ID No. 16所示的兩條單鏈DNA組成； 所述BG262882由序列表中SEQ ID No. 17和SEQ ID No. 18所示的兩條單鏈DNA組成。
2. 檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引物對組合物，其名稱為組 合物2,由權利要求1所述BE489692與下述8種引物對中7種、6種、5種、4種、3種、2種或 1種引物對進行組合得到的組合物：權利要求1所述MAG2137、權利要求1所述BF200742、 權利要求1所述Xgwml35、權利要求1所述Xgwml40、權利要求1所述BE500714、權利要求1 所述BF604958、權利要求1所述BE585781和權利要求1所述BG262882。
3. 檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引物對，所述引物對為權利 要求1所述BE489692。
4. 檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的試劑或試劑盒，為A或B或 C ： A、 檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的試劑或試劑盒，含有權利要 求1所述的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引物對組合物； B、 檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的試劑或試劑盒，含有權利要 求2所述的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引物對組合物； C、 檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的試劑或試劑盒，含有權利要 求3所述的檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的引物對。
5. 權利要求1或2所述的引物對組合物、或權利要求3所述的引物對、或權利要求4所 述的試劑或試劑盒的製備方法，包括將所述引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步 驟。
6. 檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段的方法，包括如下步驟： 1) 分別以待測小麥、參比小麥和高大山羊草的基因組DNA為模板，用9種引物對分別 進行PCR擴增，得到所述9種引物對的待測小麥PCR產物、所述9種引物對的參比小麥PCR 產物和所述9種引物對的高大山羊草PCR產物；所述參比小麥為不含高大山羊草染色體片 段的小麥，作為確定高大山羊草特異條帶的參比； 2) 將所述9種引物對的待測小麥PCR產物、所述9種引物對的參比小麥PCR產物和所 述9種引物對的高大山羊草PCR產物進行電泳，根據電泳結果確定所述9種引物對的待測 小麥PCR產物中是否含有高大山羊草相應引物對的特異條帶，如果所述9種引物對的待測 小麥PCR產物中至少有一種引物對的待測小麥PCR產物中含有高大山羊草相應引物對的特 異條帶，所述待測小麥含有高大山羊草染色體片段或候選含有高大山羊草染色體片段；如 果所述9種引物對的待測小麥PCR產物中均不含有高大山羊草相應引物對的特異條帶，所 述待測小麥不含有高大山羊草的染色體片段或候選不含有高大山羊草的染色體片段； 所述高大山羊草相應引物對的特異條帶為同一種引物對的高大山羊草PCR產物含有 但所述同一種引物對的所述參比小麥的PCR產物不含有的條帶； 所述9種引物對為權利要求1所述BE489692、權利要求1所述MAG2137、權利要 求1所述BF200742、權利要求1所述Xgwml35、權利要求1所述Xgwml40、權利要求1所 述BE500714、權利要求1所述BF604958、權利要求1所述BE585781和權利要求1所述 BG262882。
7. 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於：所述PCR擴增採用的引物退火條件為 52-57°C退火 45s。
8. 根據權利要求6或7所述的方法，其特徵在於：用所述MAG2137進行PCR擴增的退 火條件為52°C退火45s，用所述Xgwml35進行PCR擴增和用所述Xgwml40進行PCR擴增的 退火條件均為55°C退火45s，用所述BF200742進行PCR擴增、用所述BE500714進行PCR擴 增、用所述BE489692進行PCR擴增、用所述BF604958進行PCR擴增、用所述BE585781進行 PCR擴增和用所述BG262882進行PCR擴增的退火條件均為57°C退火45s ; 所述電泳中，所述MAG2137、所述Xgwml35和所述Xgwml40引物對的待測小麥PCR產物、 參比小麥PCR產物和高大山羊草PCR產物均採用非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，所述非變性 聚丙烯醯胺凝膠電泳中，所述聚丙烯醯胺凝膠的濃度為8 % (質量百分含量），所述聚丙烯 醯胺凝膠的交聯度為2. 5%;所述電泳中，所述BF200742、所述BE500714、所述BE489692、所 述BF604958、所述BE585781和所述BG262882引物對的待測小麥PCR產物、參比小麥PCR產 物和高大山羊草PCR產物均採用瓊脂糖凝膠電泳，所述瓊脂糖凝膠的濃度為2% (質量百分 含量）。
9. 權利要求1或2所述的引物對組合物、或權利要求3所述的引物對、或權利要求4所 述的試劑或試劑盒和權利要求6-8中任一所述的方法的下述A或B的應用： A、 在檢測或輔助檢測小麥是否含有高大山羊草染色體片段中的應用； B、 在小麥育種中的應用。
10. 小麥的育種方法，包括以按照權利要求6-8中任一所述的方法得到的含有高大山 羊草染色體片段或候選含有高大山羊草染色體片段的待測小麥作為親本進行雜交育種的 步驟。
【文檔編號】C12Q1/68GK104357571SQ201410636769
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月12日 優先權日:2014年11月12日
【發明者】劉成, 宮文英, 劉建軍, 李根英, 楚秀生, 宋華東, 黃承彥, 趙振東 申請人:山東省農業科學院作物研究所