一種具內外水相梯度差的囊泡及其製備方法和應用的製作方法

2024-01-29 04:25:15 4

專利名稱：一種具內外水相梯度差的囊泡及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及藥物製劑領域，具體涉及一種具內外水相梯度差的囊泡及其製備方法 和應用。
背景技術：
某些兩親性分子，如許多天然的或合成的表面活性劑及不能簡單締合成膠團 的磷脂，分散於水中時會自發形成一類具有封閉雙層結構的分子有序組合體，稱為囊泡 (vesicle)，也稱為脂質體(liposome)。囊泡和脂質體這兩個術語的意義在文獻中有些含 混。一般認為，如果這些兩親分子是天然表面活性劑卵磷脂，則形成的結構就稱為脂質體； 若由合成表面活性劑組成，則稱為囊泡。因此，脂質體特指由磷脂形成的一類特殊的囊泡， 它是人類最先發現的囊泡體系。自20世紀60年代初脂質體作為藥物載體應用以來，受到了廣泛關注和研究。但 是，傳統的被動載藥法製得的脂質體通常包封率不高，特別是包封一些兩親性弱酸或弱鹼 藥物，由於其油水分配係數受介質的PH值和離子強度影響較大，包封條件不易掌握，製備 的脂質體包封率差異較大。因此，包封率低及易滲透問題在很大程度上限制了脂質體作為 藥物載體的推廣。離子梯度法可以將某些兩親性藥物高效地裝載入脂質體內，克服了早期 藥物突釋和洩漏，在一定程度上解決了這些藥物脂質體製劑的大規模工業化生產難題。離 子梯度法的實現取決於適宜離子梯度差的建立，如氫離子梯度，可以形成「質子池」，酸性的 內部環境使擴散入脂質體內部的中性兩親性藥物發生質子化作用而荷正電，阻止其再次跨 膜洩露。同時，離子梯度法中還常常採用適宜的陰離子和/或大分子物質(離子化合物) (大分子物質可以只交換大分子物質一種離子，如肝素鈉，可以只交換一種離子，即肝素陰 離子，餘下的鈉離子(留在體系中)與藥物在脂質體內部形成凝膠狀沉澱，進一步提高包 封率和穩定性。目前普遍採用的梯度差建立方法包括透析法、超濾法、葡聚糖凝膠法即分 子篩法。透析法廉價方便，但操作耗時長，易引起內外水相梯度差流失；超濾法耗時相對較 短，但超濾中的高壓和攪拌過程容易對脂質體的穩定性、均勻性造成影響，造成內外水相梯 度差流失；葡聚糖凝膠法耗時短，但相對成本較高。離子交換技術具有相當長的歷史，某些天然物質如泡沸石和用煤經過磺化製得的 磺化煤都可用作離子交換劑。隨著現代有機合成工業技術的迅速發展，研究製成了許多種 性能優良的離子交換樹脂，並開發了多種新的應用方法，離子交換技術迅速發展，在許多行 業特別是高新科技產業和科研領域中廣泛應用。近年國內外生產的樹脂品種達數百種，年 產量數十萬噸。在工業應用中，離子交換樹脂的優點主要是處理能力大，交換範圍廣，能除 去各種不同的離子，交換容量高，可以反覆再生使用，工作壽命長，運行費用較低。以離子交 換樹脂為基礎的多種新技術，如色譜分離法、離子排斥法、電滲析法等，各具獨特的功能。離 子交換樹脂在50年代已作為藥物載體用於延緩藥物釋放，其控釋應用主要是在胃腸道中 控制藥物釋放，即口服藥物樹脂控釋系統。它是根據離子交換原理設計的，利用胃腸道中的 離子，如鈉離子、鉀離子，將結合於樹脂上的藥物交換出來，達到減少不良苦味等目的。其主要應用是製備口服藥物樹脂液體控釋系統(簡稱0RCRS)。離子交換技術的開發和應用還在 迅速發展之中。離子交換樹脂都是用有機合成方法製成。常用的原料為苯乙烯或丙烯酸(酯)， 通過聚合反應生成具有三維空間立體網絡結構的骨架，再在骨架上導入不同類型的化學活 性基團(通常為酸性或鹼性基團)而製成。大多數離子交換樹脂製成顆粒狀，也有一些制 成纖維狀或粉狀。樹脂顆粒的尺寸一般在0. 3 1. 2mm範圍內，大部分在0. 4 0. 6mm之 間。它們有較高的機械強度(堅牢性)，化學性質也很穩定，在正常情況下有較長的使用壽 命。離子交換樹脂的品種很多，因化學組成和結構不同而具有不同的功能和特性，適應於不 同的用途。應用樹脂要根據工藝要求和物料的性質選用適當的類型和品種。離子交換樹脂中化學活性基團的種類決定了樹脂的主要性質和類別。首先區分為 陽離子樹脂和陰離子樹脂兩大類，它們可分別與溶液中的陽離子和陰離子進行離子交換。 混合樹脂中，由於陽、陰樹脂是均勻混合的，所以陽、陰離子交換反應幾乎同時進行，即水的 陽離子交換和陰離子交換多次交錯進行，交換過程所產生的H+和0H_都不能積累起來，基本 上消除了反離子對交換反應的影響，這就避免了逆反應，使交換反應進行得很徹底。

發明內容
針對目前脂質體/囊泡作為藥物載體及其離子梯度差建立方法存在的上述缺點， 如載藥範圍不廣、藥物包封率低、耗時長、成本高、梯度小等等，本發明第一個發明目的是提 供一種具內外水相梯度差的囊泡，第二個發明目的是提供所述囊泡的製備方法，第三個發 明目的是提供所述囊泡的應用。為實現本發明的第一個發明目的，發明人提供如下技術方案一種具內外水相梯度差的囊泡(包括脂質體)，其是通過採用包括離子交換方法 除去空白囊泡水化介質中的陰離子、陽離子、陰陽離子和/或離子大分子物質(即荷電大分 子物質)後獲得。發明人研究發現，採用離子交換方法處理空白囊泡可以快速建立囊泡內外水相滲 透壓梯度差，而且離子交換方法所建立的梯度大於常規方法，如透析法、超濾法、葡聚糖凝 膠法即分子篩法建立的梯度差。本發明所述的離子交換方法是指採用適宜的離子交換劑去 除囊泡外水相中的陰離子、陽離子、荷電大分子物質，或者陰陽離子同時除去，而內水相中 的陰陽離子、大分子物質未被除去或者除去很少，從而建立囊泡膜內外梯度。除去囊泡外水 相中離子的方法包括單獨使用陰離子或陽離子交換劑或者混合使用陰陽離子交換劑，在單 獨使用陽離子或者陰離子交換劑時，可以有目的除去相應的陽離子或者陰離子，這是現有 的超濾、分子篩色譜、高速離心等方法所不能達到的，如果合理選擇/搭配離子交換劑與離 子的作用力大小，亦可實現建立有目的除去某一離子或者兩種離子或者兩種以上離子的目 的。本發明可以單獨除去某類離子，甚至從幾種離子中選擇性地除去某種離子，例如，可以 利用氫型陽離子交換樹脂的交換能力順序，強酸性Fe3+ > Fe2+ > Mn2+ > Ca2+ > Mg2+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ ；弱酸性H+ > Fe3+ > Fe2+ > Mn2+ > Ca2+ > Mg2+ > K+ > NH4+ > Na+，來有 目的地除去水化介質中多種離子中的某一或者某多種離子，留下無需除去的離子。在採用 混合離子交換劑時，陽、陰離子交換反應幾乎同時進行，即陽離子交換和陰離子交換多次交 錯進行，交換過程所產生的HVNa+和0H_/C1_都不能積累起來，基本上消除了反離子對交換反應的影響，避免了逆反應，使交換反應進行得很徹底，於是可以保證製劑PH值保持穩定。用於交換的離子交換劑用量優選為水化介質中離子所需交換容量的1 1000倍， 更優選為所需交換容量的2 20倍，最優選為所需交換容量的3 10倍。空白囊泡的洗 脫方式包括，但並不限於淋洗、離心、通過離子交換膜等方法。通過本發明的方法將空白囊 泡與離子交換劑交換除去水化介質中陰陽離子、荷電大分子物質後即建立相應的離子梯度 差。另外，發明人也發現非常重要的一點，即現有的pH梯度，是加入鹼性物質獲得梯 度，往往會大大降低脂質體濃度，如阿黴素脂質體MY0CET，大約稀釋2. 5倍。而採用離子交 換方法除去外水相物質建立的梯度不會引發稀釋/或者很少稀釋，同時在配製藥物溶液時 提高其濃度(如阿黴素溶液)，可以達到最終產品的阿黴素濃度為4mg/ml 8mg/ml (而現 有的MYOCET是2mg/ml)，這樣可減少產品1 2倍的體積，為原產品體積的1/2 1/4，利 於大劑量藥物來實現製備脂質體。更為重要的是，採用常規pH調節方法，往往是三瓶裝製劑，如在歐洲上市的阿黴 素脂質體(MYOCET)、長春新鹼脂質體(MARQIB0)，分別為「藥物」、「空白脂質體」、「pH調節 劑」，在裝載藥物時，脂質體外水相中的枸櫞酸或者其它物質不能除去，而枸櫞酸的毒性較 大，因此限制了此種技術的應用。本發明人採用離子交換方法，可以除去外水相枸櫞酸，從 而可以極大地減少枸櫞酸等物質的毒性，大大提高脂質體給藥量，利於臨床應用。另外，可 以單獨採用微孔離子交換膜或離子交換樹脂，或者將微孔離子交換膜與離子交換樹脂結 合，組裝成一個裝置，在臨床應用時，將空白脂質體(如枸櫞酸為水化介質)通過此裝置，則 可以在位除去脂質體外水相物質，建立脂質體/囊泡梯度，實現主動裝載藥物。本發明的 方法可以將原來的藥物製劑三瓶裝(「藥物」、「空白脂質體」、「PH調節劑」)減少為兩瓶裝 (「藥物」、「空白脂質體」)，降低成本的同時，亦會達到縮短生產時間、簡化操作、減少汙染機 會的效果。現有的所有主動載藥技術/方法，普遍存在不能適用於膜材料濃度大於10% (g/ g或g/ml)的高濃度囊泡(包括脂質體)來建立梯度差的缺點；另外，由於大分子存在選擇 性吸附、質點大(可以達到幾十納米，甚至100納米)等特點，用常規的透析、超速離心、分 子篩等方法存在難以除盡，甚至根本與囊泡(包括脂質體)不能分離的缺點，我們意外地發 現，採用離子交換方法，可以非常簡單、快速地建立膜材料濃度大於10% (g/g或g/ml)的 高濃度囊泡(包括脂質體)梯度，可高達60% (g/g或g/ml)，用於主動載藥；離子交換方 法也能非常有效地將大分子與囊泡(包括脂質體)分離，提高包封率與穩定性，如在採用肝 素-硫酸銨梯度裝載阿黴素，製備阿黴素脂質體時，用透析方法，包封率小於50 %，且穩定 性差，放置一天後，有沉澱產生；而採用離子交換樹脂，包封率大於90 %，放置60天亦未產 生沉澱，包封率未變；也可以利用大分子的滲透壓特性，製造囊泡內外水相的大滲透壓差， 獲得囊泡(包括脂質體)內部滲透壓遠大於外水相的滲透壓，從而提高內水相體積、提高包 封率、縮短包封時間，並可以增加被包封藥物洩漏的阻力，大大延長囊泡(包括脂質體)穩 定性！更令人驚喜的是，發明人研究發現，本發明所述的囊泡可通過採用離子交換方法 和透析法或超濾法相結合除去空白囊泡水化介質中陰離子、陽離子、陰陽離子和/或荷電 大分子物質後獲得。用於交換的離子交換劑用量可小於水化介質中離子所需交換容量的1倍。如先採用透析法或超濾法或離心法除去外水相中待除去離子的50% 90%，餘下的離 子僅需要起始離子所需交換容量的0. 5 0. 1倍，如此可以大大降低樹脂量，特別是減少昂 貴的離子交換膜用量。本發明離子交換方法中採用的離子交換劑包括固體離子交換劑、液體離子交換 劑、離子交換膜；陽離子交換劑、陰離子交換劑、兩性離子交換樹脂、螯合樹脂和氧化還原樹 脂等；無機質離子交換劑、有機質離子交換劑；大孔離子交換樹脂和特種離子交換樹脂。其中，上述離子交換膜包括陽離子交換膜、陰離子交換膜、兩性交換膜、鑲嵌離子 交換膜、聚電解質複合膜；均相膜和非均相膜。離子交換劑包括以DEAE-纖維素(二乙基氨 基纖維素)和CM-纖維素(羧甲基纖維素)為代表的纖維素、球狀纖維素、葡聚糖、瓊脂糖 為基質的離子交換劑。作為優選方案，根據本發明所述的囊泡，其中，所述離子交換方法中採用的離子交 換劑為特種樹脂時，其選自下列物質WA 2胺基酸專用樹脂、催化劑樹脂、WDX-3果汁脫色 專用樹脂、WD-6脫色樹脂、WL-XF核用樹脂、WTT脫鐵樹脂、IND90變色樹脂、D208脫色專用 樹脂、D209飲用水除硝酸根樹脂、D309脫色專用樹脂或XDA-7均孔脫色樹脂。作為優選方案，根據本發明所述的囊泡，其中，所述離子交換方法中採用的離子交 換劑為陽離子交換樹脂時，其選自下列物質中至少一種001強酸性苯乙烯系陽離子交換 樹脂、111弱酸性丙烯酸系陽離子交換樹脂、112弱酸性丙烯酸系陽離子交換樹脂、122弱酸 性酚醛系陽離子交換樹脂、DOOl大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂、Dlll大孔弱酸性丙 烯酸系陽離子交換樹脂、D390鹽酸除鐵專用樹脂、D401大孔苯乙烯系螯合型離子交換樹 脂、CAT600大孔苯乙烯系強酸催化樹脂大孔強酸氫型陽離子交換樹脂、CAT601大孔強酸催 化樹脂苯乙烯系大孔強酸氫型陽離子交換樹脂、C005催化專用樹脂苯乙烯系凝膠強酸陽離 子交換樹脂、D002-II型耐高溫樹脂、C004生物鹼提取專用樹脂苯乙烯系凝膠強酸陽離子 交換樹脂、C008生物鹼提取專用樹脂苯乙烯系大孔強酸陽離子交換樹脂、B108胺基酸提取 專用樹脂苯乙烯系大孔強酸陽離子交換樹脂、C610硫脲樹脂、C620巰基樹脂、C700硼選擇 性樹脂、C800氨基羧酸樹脂或C900氨基膦酸樹脂，其用量為水化介質中陽離子所需交換容 量的1-1000倍。作為更優選，陽離子交換樹脂用量為水化介質中陽離子所需交換容量的 2-20倍。作為最優選，陽離子交換樹脂用量為水化介質中陽離子所需交換容量的3-10倍。作為優選方案，根據本發明所述的囊泡，其中，所述離子交換方法中採用的離子交 換劑為陰離子交換樹脂時，其選自下列物質中至少一種201強鹼性季胺I型陰離子交換樹 脂、301弱鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂、303弱鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂、331弱鹼性 環氧系陰離子交換樹脂、401螯合性胺羧基離子交換樹脂、D201大孔強鹼性季胺I型陰離子 交換樹脂、D202大孔強鹼性季胺II型陰離子交換樹脂、D301大孔弱鹼性苯乙烯系陰離子交 換樹脂、D302大孔弱鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂、D311大孔弱鹼性丙烯酸系陰離子交換 樹脂、D206耐高溫陰離子交換樹脂、D215大孔丙烯酸系強鹼陰離子交換樹脂、D363大孔弱 鹼陰離子交換樹脂或D204大孔苯乙烯系強鹼性陰離子交換樹脂，其用量為水化介質中陰 離子所需交換容量的1-1000倍。作為更優選，陰離子交換樹脂用量為水化介質中陰離子所 需交換容量的2-20倍。作為最優選，陰離子交換樹脂用量為水化介質中陰離子所需交換容 量的3 10倍。實際應用中，凡是符合離子交換、吸附原理的離子交換劑都可以應用在本發明中。具體地，本領域的技術人員可根據實際需要選擇採用上述陽離子交換樹脂的鈉型或氫型， 陰離子交換劑的氯型或氫氧型形式。根據本發明所述的囊泡，其中所述空白囊泡水化介質中含有可交換的各種陽離 子或者陰離子或者陰陽兩種離子，離子種類可以是一種或者兩種以上，可以是以任意比例 混合的任意濃度。作為優選方案，根據本發明所述的囊泡，其中，所述水化介質中陰陽離子為陽 離子包括 Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、NH4\ K+、Fe2+、Fe3+、C2H4(NH3+)2、(CH3CH2) 3NH\ H0C2H4NH3\ (HOC2H4) 3NH+、(HOCH2)6CH3NH2+ 或三羥甲基氨基甲烷；陰離子包括 SO/-、Ρ043\ ΗΡ042\ Η2Ρ04\ Cl_、枸櫞酸根、醋酸根、EDTA4—、六偏磷酸根、三聚磷酸根、焦磷酸根、甘油磷酸根、果糖二磷 酸根、三磷酸腺苷根、植酸根、鄰苯二甲酸根、間苯二甲酸根、對苯二甲酸根、苯甲酸根、間苯 二甲酸根、間苯三甲酸根、乳糖酸根、二巰基丁二酸根、二乙三胺五乙酸根、乙二醇雙(2-氨 基乙基醚)四乙酸根或氨基三乙酸根。所述的大分子物質是指荷電大分子物質，如蛋白質、 肽類、酶類，更廣泛的含義包括這些物質及其他大分子物質的硫酸酯、磺酸酯或磷酸酯衍生 物，如磷酸化蛋白質，肝素、右旋糖酐硫酸酯、殼聚糖及其衍生物、明膠及其衍生物、琥珀醯 明膠及其衍生物、多糖硫酸酯、低聚巖藻聚糖硫酸酯、木聚糖硫酸酯、海藻酸及其衍生物、透 明質酸及其衍生物。為實現本發明的第二個發明目的，發明人提供如下技術方案一種上述具內外水相梯度差的囊泡(包括脂質體)的製備方法，所述製備方法包 括下述步驟(1)製備空白囊泡；(2)將(1)得到的空白囊泡用離子交換劑處理，然後洗脫處理即可得到具內外水 相梯度差的囊泡。製備空白囊泡的膜材包括適宜的表面活性劑、大分子物質，如各種磷脂及其衍生 物，還可選留醇類及其衍生物，以及其它必要膜材。其中表面活性劑包括HLB8 20的表面活性劑，如磷脂可選自下列的至少一種 天然磷脂、半合成磷脂、合成磷脂，如大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、磷脂醯甘油、EPG、磷脂酸、 心肌磷脂、鞘磷脂、磷脂酸絲氨酸、磷脂醯肌醇、磷脂醯乙醇胺、氫化大豆卵磷脂、氫化蛋黃 卵磷脂、二硬脂醯磷脂醯膽鹼，二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二油醯磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯磷脂 醯膽鹼、二月桂醯磷脂醯膽鹼、二癸醯磷脂醯膽鹼、二辛醯磷脂醯膽鹼、二己醯磷脂醯膽鹼、 二硬脂醯磷脂醯甘油及其鹽，二棕櫚醯磷脂醯甘油及其鹽，L-α-二肉豆蔻醯磷脂醯甘油 及其鹽，二月桂醯磷脂醯甘油、二癸醯磷脂醯甘油、二辛醯磷脂醯甘油、二己醯磷脂醯甘油、 二硬脂醯磷脂醯乙醇胺，二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺、二油醯磷脂醯乙醇胺，二肉豆蔻醯磷脂醯 乙醇胺、二月桂醯磷脂醯乙醇胺、雙二硬脂醯磷脂醯甘油及其鹽、雙二棕櫚醯磷脂醯甘油及 其鹽、雙二肉豆蔻醯磷脂醯甘油及其鹽、雙二月桂醯磷脂醯甘油、二硬脂醯磷脂醯肌醇、二 棕櫚醯磷脂醯肌醇、二油醯磷脂醯肌醇、二肉豆蔻醯磷脂醯肌醇、二月桂醯磷脂醯肌醇、棕 櫚醯油醯磷脂醯膽鹼、棕櫚醯亞油醯磷脂醯膽鹼、硬脂醯亞油醯磷脂醯膽鹼、硬脂醯油醯磷 脂醯膽鹼、硬脂醯花生四烯醯磷脂醯膽鹼或各種磷脂PEG衍生物，如DSPE-PEG、DPPE-PEG、 DMPE-PEG、DLPE-PEG，其中 PEG 的分子量為 100 100000。上述PEG衍生物包括但不限於各種磷脂PEG衍生物，如DSPE-PEG、DPPE-PEG、DMPE-PEG、DLPE-PEG，其中PEG的分子量為100 100000 ；也包括其他各種PEG脂質衍生物， 如PEG留醇類衍生物、PEG脂肪酸衍生物、PEG脂肪醇類衍生物，具體講如膽固醇半琥珀酸酯 PEG 衍生物、Solulan C-24 (PEG-24 cholesterol ether)、吐溫類、Bri j (節澤)、維生素類 的PEG衍生物(如TPGS)、PEG脂肪酸酯衍生物(賣澤)，聚甘油脂質衍生物，如聚甘油磷脂 衍生物、聚甘油單(雙)油酸酯、硬脂酸酯等；聚丙二醇脂質衍生物；聚胺基酸脂質衍生物； 甾醇類衍生物；蔗糖脂質衍生物；氧乙烯-氧丙烯共聚物(HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)a H)，如 F68 ；聚乙二醇-二酸甘油脂(或者單酯)等等。本發明離子交換方法中採用的離子交換劑包括固體離子交換劑、液體離子交換 劑、離子交換膜；陽離子交換劑、陰離子交換劑、兩性離子交換樹脂、螯合樹脂和氧化還原樹 脂等；無機質離子交換劑、有機質離子交換劑。上述離子交換膜包括陽離子交換膜、陰離子交換膜、兩性交換膜、鑲嵌離子交換 膜、聚電解質複合膜；均相膜和非均相膜。上述離子交換劑包括以DEAE-纖維素(二乙基氨 基纖維素)和CM-纖維素(羧甲基纖維素)為代表的纖維素、球狀纖維素、葡聚糖、瓊脂糖 為基質的離子交換劑，如葡聚糖凝膠DEAE-A25、葡聚糖凝膠DEAE-A50、葡聚糖凝膠CM-C25、 葡聚糖凝膠CM-C50、葡聚糖凝膠QAE-A25、葡聚糖凝膠SP-C25、瓊脂糖凝膠DEAE-CL-6B、 瓊脂糖凝膠CM-CL-6B、瓊脂糖凝膠DEAE-FF、瓊脂糖凝膠CM-FF、磷酸纖維素、磷酸葡聚糖； (B-DEAE)-纖維素、(B-DEAE)-葡聚糖。上述的離子交換劑包括陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂、螯合樹脂、大孔樹脂和 特種樹脂。作為優選方案，根據本發明所述的囊泡的製備方法，其中，所述離子交換方法中 採用的離子交換劑為特種樹脂時，其選自下列物質WA-2胺基酸專用樹脂、催化劑樹脂、 WDX-3果汁脫色專用樹脂、WD-6脫色樹脂、WL-XF核用樹脂、WTT脫鐵樹脂、IND90變色樹脂、 D208脫色專用樹脂、D209飲用水除硝酸根樹脂、D309脫色專用樹脂或XDA-7均孔脫色樹脂。作為優選方案，根據本發明所述的囊泡的製備方法，其中，所述離子交換方法中採 用的離子交換劑為陽離子交換樹脂時，其選自下列物質中至少一種001強酸性苯乙烯系 陽離子交換樹脂、111弱酸性丙烯酸系陽離子交換樹脂、112弱酸性丙烯酸系陽離子交換樹 脂、122弱酸性酚醛系陽離子交換樹脂、DOOl大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂、Dlll大 孔弱酸性丙烯酸系陽離子交換樹脂、D390鹽酸除鐵專用樹脂、D401大孔苯乙烯系螯合型離 子交換樹脂、CAT600大孔苯乙烯系強酸催化樹脂大孔強酸氫型陽離子交換樹脂、CAT601大 孔強酸催化樹脂苯乙烯系大孔強酸氫型陽離子交換樹脂、C005催化專用樹脂苯乙烯系凝 膠強酸陽離子交換樹脂、D002-II型耐高溫樹脂、C004生物鹼提取專用樹脂苯乙烯系凝膠 強酸陽離子交換樹脂、C008生物鹼提取專用樹脂苯乙烯系大孔強酸陽離子交換樹脂、B108 胺基酸提取專用樹脂苯乙烯系大孔強酸陽離子交換樹脂、C610硫脲樹脂、C620巰基樹脂、 C700硼選擇性樹脂、C800氨基羧酸樹脂或C900氨基膦酸樹脂，其用量為水化介質中陽離子 所需交換容量的1-1000倍。作為更優選，陽離子交換樹脂用量為水化介質中陽離子所需交 換容量的2-20倍。作為最優選，陽離子交換樹脂用量為水化介質中陽離子所需交換容量的 3-10 倍。作為優選方案，根據本發明所述的囊泡的製備方法，其中，所述離子交換方法中採 用的離子交換劑為陰離子交換樹脂時，其選自下列物質中至少一種201強鹼性季胺I型陰離子交換樹脂、301弱鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂、303弱鹼性苯乙烯系陰離子交換樹 脂、331弱鹼性環氧系陰離子交換樹脂、401螯合性胺羧基離子交換樹脂、D201大孔強鹼性 季胺I型陰離子交換樹脂、D202大孔強鹼性季胺II型陰離子交換樹脂、D301大孔弱鹼性苯 乙烯系陰離子交換樹脂、D302大孔弱鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂、D311大孔弱鹼性丙烯 酸系陰離子交換樹脂、D206耐高溫陰離子交換樹脂、D215大孔丙烯酸系強鹼陰離子交換樹 脂、D363大孔弱鹼陰離子交換樹脂或D204大孔苯乙烯系強鹼性陰離子交換樹脂，其用量為 水化介質中陰離子所需交換容量的1-1000倍。作為更優選，陰離子交換樹脂用量為水化介 質中陰離子所需交換容量的2-20倍。作為最優選，陰離子交換樹脂用量為水化介質中陰離 子所需交換容量的3-10倍。根據本發明所述的囊泡的製備方法，其中所述空白囊泡水化介質中含有可交換 的各種陽離子或者陰離子或者陰陽兩種離子，離子種類可以是一種或者兩種以上，可以是 以任意比例混合的任意濃度。作為優選方案，根據本發明所述的囊泡的製備方法，其中，所述水化介質中陰陽離 子為陽離子包括 Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、NH4+、K+、Fe2+、C2H4 (NH3+) 2、(CH3CH2) 3NH+、H0C2H4NH3+、 (HOC2H4) 3NH\ (HOCH2)6CH3NH2+ 或三羥甲基氨基甲烷；陰離子包括 SO/-、Ρ043\ ΗΡ042\ Η2Ρ04\ Cl_、枸櫞酸根、醋酸根、EDTA4—、六偏磷酸根、三聚磷酸根、焦磷酸根、甘油磷酸根、果糖二磷 酸根、三磷酸腺苷根、植酸根、鄰苯二甲酸根、間苯二甲酸根、對苯二甲酸根、苯甲酸根、間苯 二甲酸根、間苯三甲酸根、乳糖酸根、二巰基丁二酸根、二乙三胺五乙酸根、乙二醇雙(2-氨 基乙基醚)四乙酸根或氨基三乙酸根。所述的大分子物質是指荷電大分子物質，如蛋白質、 肽類、酶類，更廣泛的含義包括這些物質及其他大分子物質的硫酸酯、磺酸酯或磷酸酯衍生 物，如磷酸化蛋白質，肝素、右旋糖酐硫酸酯、殼聚糖及其衍生物、明膠及其衍生物、琥珀醯 明膠及其衍生物、多糖硫酸酯、低聚巖藻聚糖硫酸酯、木聚糖硫酸酯、海藻酸及其衍生物、透 明質酸及其衍生物。上述囊泡的製備方法中，空白囊泡的洗脫方式包括淋洗、離心或通過離子交換膜 等方式。作為優選，根據本發明所述的製備方法，其中，所述步驟(1)中製備空白囊泡時加 入酸敏、溫敏、光敏或靶向性物質。本發明所述的製備方法中，所述步驟(2)中的囊泡用離子交換劑處理，如將囊泡 通過離子交換樹脂、離子交換膜等即可。為實現本發明的第三個發明目的，發明人提供如下技術方案本發明首先提供上述具內外水相梯度差的囊泡在製備藥物上的應用，其中，所述 應用包括將具內外水相梯度差的囊泡與藥物溶液混合，實現主動載藥後即可獲得藥物制 劑。作為優選，根據本發明上述的應用，其中上述藥物製劑可再用離子交換劑處理。以 除去外水相的游離藥物與緩衝液，如長春瑞濱脂質體，枸櫞酸毒性大，主動裝載後，再用離 子交換樹脂處理，可以除去游離藥物與枸櫞酸等，包封率達到100% (從而可以隨意加入藥 物，調節外水相濃度，調節外水相與內水相的藥物比例、包封率等)，枸櫞酸的毒性降為0。作為優選，根據本發明上述的應用，其中上述的藥物製劑加入海藻糖、蔗糖、乳糖、 甘露醇、葡萄糖、氯化鈉或蛋白質後作凍幹處理。所述藥物製劑包括長春新鹼、米託蒽醌等藥物脂質體，加入海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化鈉、蛋白質等物質進行凍幹，得 到可以室溫儲存的前體脂質體，加水復溶後，包封率大於80%。本發明方法提供的囊泡適用於所有可採用離子梯度法進行包封的藥物。如蒽環類抗腫瘤抗生素，包括鹽酸阿黴素、鹽酸表阿黴素和吡柔比星；長春花屬生 物鹼，包括長春瑞濱、長春新鹼、長春花鹼和長春地辛；喹諾酮類抗生素，如環丙沙星、氟哌 酸、氧氟沙星、依諾沙星、甲氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、氟羅沙星、加替沙星、司帕沙星、莫 西沙星、克林沙星和吉米沙星等。如各種胺基酸、羅丹明B或其類似物、依沙吖啶(利凡諾) 或其類似物、吖啶橙(鹼性橙14、3，6_雙(二甲基氨基)吖啶氯化鋅鹽酸鹽)或其類似物； 5_羥色胺受體拮抗劑，包括昂丹司瓊、託烷司瓊、格拉司瓊、帕洛諾司瓊、雷莫司瓊等。如局部麻醉藥包括鹽酸阿替卡因、普魯卡因(procaine)古柯鹼(cocaine)、利多 卡因(Iidocaine)、麻卡因(marcaine)、卡波卡因(carbocaine)、丙胺卡因(prilocaine) 等；大環內酯類藥物，如阿奇黴素及其鹽。如噻嗎洛爾及其鹽、美託洛爾及其鹽、比索洛爾及其鹽、普萘洛爾及其鹽、索他洛 爾及其鹽、伏立康唑及其鹽等。如荷電大分子物質，RNA幹擾，即核苷酸、DNA脫氧核糖核酸、siRNA、蛋白質、酶、荷 電多糖、甲殼胺、阿拉伯膠、海藻酸、羧甲基纖維素、琥珀明膠；荷電大分子聚合物，如樹枝狀 物質中的PAMAM。其它藥物如曲馬多及其鹽、芬太尼及其鹽、舒芬太尼及其鹽、氨溴索及其鹽、氯諾 昔康及其鹽、甲磺酸二氫麥角鹼、鹽酸川丁特羅(特羅類)、多巴酚丁胺、鹽酸洛哌丁胺、阿 替洛爾酒石酸美託洛爾、氯苯丁胺、麥角胺、PEI (聚乙胺)、表皮生長因子(FGF)、蜂毒肽等。如生物鹼，包括植物、海洋生物、微生物、真菌及昆蟲來源。這類物質常常可以採用 梯度載藥技術提高包封率。生物鹼一般按化合物結構類型或生物合成途徑進行分類。一些常見的生物鹼結構 類型如下1、異喹啉類生物鹼異喹啉類生物鹼是生物鹼中最大的一類，以異喹啉或四氫異喹啉為母核，根據連 接基團的不同，又可分為九類(1)單異喹啉類生物鹼，如鹿尾草中的降血壓成分鹿尾草 鹼；(2)苄基異喹啉類生物鹼，異喹啉核的1位接有苄基，如阿片中的解痙成分罌粟 鹼；(3)雙苄基異喹啉類生物鹼，兩個苄基異喹啉在酚羥基位置以醚鍵方式相連，如蓮 子芯中的蓮心鹼；(4)阿撲芬類生物鹼，苄基異喹啉類生物鹼的兩個苯環相連組成的四環化合物，如 千金藤鹼；(5)原小櫱鹼類生物鹼，為兩個異喹啉的稠合，如黃連中所含的抗菌成分黃連素；(6)普魯託品類生物鹼，含羰基的小櫱鹼開環化合物，如延胡索中的普魯託品；(7)吐根鹼類生物鹼，異喹啉環帶苯駢喹啉啶環，如吐根中治療阿米巴痢疾的有效 成分吐根鹼；(8) α-萘菲啶類生物鹼，如搏落回中的血根鹼；
(9)嗎啡類生物鹼。2、喹啉類生物鹼喹啉類生物鹼的母核是喹啉環，其中最重要的一類是金雞納生物鹼。3、吡咯烷類生物鹼(1)簡單的吡咯烷生物鹼，如古柯葉中分離出的液體生物鹼古豆鹼、新疆黨參中的 黨參鹼；(2)雙稠吡咯烷類生物鹼，由叔氮稠合兩個吡咯烷而成，如闊葉千裡光中分得的闊 葉千裡光鹼；(3)吲哚裡西定類生物鹼，以叔氮稠合吡咯烷與哌啶環而組成的吲哚裡西定環，如 白牽牛鹼；(4)莨菪烷類生物鹼，由吡咯烷與哌啶駢合而成的雜環，常見的是與有機酸成酯的 阿託品類生物鹼；(5)百部生物鹼，百部根中分離得到的生物鹼大多含有吡咯環，因此也納入吡咯烷 類生物鹼。4、吲哚生物鹼以吲哚環為母核的生物鹼，如治療白血病的高效藥物長春新鹼等。相對明確的生物鹼包括「馬錢子鹼」、「麥角胺和麥角毒」、「左金總生物鹼」、「雷公 藤總生物鹼」、「草烏甲素及其類似生物鹼」、「含雙喹諾裡西啶結構生物鹼」、「八氫吲嗪二醇 生物鹼滷化物鹽」、「批啶並吖啶類生物鹼」、「雙苄基異喹啉類生物鹼及其鹽」、「咔唑生物鹼 類」、「異喹啉生物鹼」、「伊貝總生物鹼」、「海綿分離的細胞毒性生物鹼衍生物」、「咔唑類生 物鹼衍生物及其」、「石蒜屬植物中提取活性生物鹼的方法」、「苯並[C]菲啶和原託品類生物 鹼」、「吳茱萸生物鹼」、「馬齒莧醯胺類生物鹼」、「金不換總生物鹼」、「異喹啉生物鹼」、「夏天 無總生物鹼」、「辛可寧類生物鹼配體」、「鉤吻總生物鹼」、「喹諾裡西啶類生物鹼」、「蠶沙總生 物鹼」、」吡咯雜環生物鹼aldisin的溴代衍生物」、「雪上一枝蒿總生物鹼」、「季胺白屈菜生 物鹼硫代磷酸衍生物」、「烏藥生物鹼」、「黃楊寧」、「環維黃楊星D」、「黃楊生物鹼」、「粉防己 生物鹼」、「雙苄基異喹啉類生物鹼」、「紫金龍總生物鹼」、「罌粟殼生物鹼」、「小檗鹼型生物 鹼」、「兩面針總生物鹼」、「赫替新型二萜生物鹼」、「百部生物鹼」、「荷葉總生物鹼」、「麥角生 物鹼」、「胡椒鹼」、「檳榔鹼」、「檳榔鹼次」、「利血平」、「青藤鹼」、「馬錢子鹼」、「駱駝蓬總鹼及 其單體與衍生物」、「去氫駱駝蓬鹼衍生物類化合物」、「貝母素乙素」、「貝母素甲素」、「延胡索 乙素」、「海洋生物鹼類物質」。多粘菌素B、E、鹽酸魚精蛋白、血紅蛋白、各種細胞因子，如白細胞介素、幹擾素、 表皮生長因子、神經生長因子、胸腺五肽、促紅細胞生成素、糖尿病治療藥物，如瑞格列奈、 磷酸西他列汀、那格列奈、二甲雙胍、唾液酸、溶菌酶(等電點鹼性)、魚精蛋白、玻璃酸、蜂 毒素、蜂毒肽(Melittin)、各種膦酸類藥物(衍生物)及其鹽類，如噻唑磷、替魯膦酸、氯屈 膦酸二鈉、磷黴素氨基丁三醇、乙二胺四甲叉膦酸、依替膦酸鈉；、二亞乙基三胺五亞甲基 膦酸七鈉鹽、2-膦酸基丁烷-1，2，4-三羧酸四鈉、氨基三亞甲基膦酸、帕米膦酸鈉、(3-氨 基苯基)膦酸、己二胺四亞甲基膦酸鉀鹽、苯膦酸鈉、阿侖膦酸及其鹽類、甲基膦酸(5-乙 基-2-甲基-2-氧代-1，3，2-二氧磷雜環己-5-基)甲基甲基酯、帕米膦酸、2-膦酸丁烷-1， 2,4-三羧酸鈉鹽、己二胺四甲叉膦酸六鉀鹽、2-膦酸丁烷-1，2，4-三羧酸、羥基亞乙基二膦酸四鈉、二己烯三胺五甲叉膦酸、利塞膦酸、氨甲基膦酸、伊班膦酸、利賽膦酸鈉、唑來膦酸、 帕米膦酸鈉、西多福韋；(1-(4_氨基-2-氧代嘧啶-1-基)-3_羥基丙烷-2-基)氧甲基膦 酸、(R)-((l_(((甲基磺醯)氧)甲基)-2_苄氧基乙氧基)甲基)膦酸二乙酯、替魯膦酸 二鈉、乙烯基膦酸、(3-((羥甲基)氨基)-3-羰基丙基)-膦酸二甲酯、2-氨基乙基膦酸、氨 基三甲叉膦酸鈉、福沙吡坦；(3-(((2R，3S)-2-((lR)-l-(3，5-雙(三氟甲基)苯基)乙氧 基)-3-(4-氟苯基)-4-嗎啉基)甲基)-2，5_ 二氫-5-氧代-1H-1，2，4-三唑-1-基)膦 酸。綜合之，即本發明適合於各種單、雙、多陰離子衍生物，如磷酸、硫酸(如SOS)、磺 酸、羧酸衍生物，分子中含有其中一種，或者任意兩種或者兩種以上基團；也適合於各種單、 雙、多陽離子衍生物，分子中含有其中一種，或者任意兩種或者兩種以上基團；兩性離子化 合物。上述藥物並不成為限制本發明的條件，正如本領域的任何技術人員所知，可採用 某種離子梯度法進行包封的藥物都在本發明保護範圍內。其中上述離子梯度法包括但不限於pH梯度法、銨梯度法、醋酸鈣梯度法和細胞 離子載體離子梯度法，所述的細胞離子載體包括奈及利亞菌素、二價陽離子質子交換劑 A23187、離子黴素和拉沙裡菌素。所述離子梯度法原理為通過建立脂質體內外水相質子濃 度差，或建立某種離子梯度差，促使弱酸性或弱鹼性藥物跨膜至內水相，進而滯留其中，維 持高包封率。正如本領域任何技術人員所知的，凡是符合上述原理的離子梯度方法都可採 用本發明的方法除去外水相的緩衝鹽建立離子梯度。本發明還提供上述具內外水相梯度差的囊泡在製備脂質體凝膠上的應用。本發明還提供上述具內外水相梯度差的囊泡在製備磁性脂質體上的應用。本發明還提供上述具內外水相梯度差的囊泡在製備納米粒/納米凝膠上的應用。與現有技術相比，本發明具有以下優點1、離子交換劑質量穩定、價格便宜，易於獲得。2、離子交換劑可再生重複利用(如果在交換容量以下，可以反覆多次使用，無需 再生)，工業化大生產條件成熟。3、本方法具有適用性廣泛(可以選擇不同離子交換劑)，操作方便快捷，易於實 現，耗時短的特點。4、可建立更高的脂質體內外水相梯度差，避免常規梯度建立技術/方法因操作時 間長而導致的梯度差流失，實現更高的包封。5、針對大分子的離子化合物，該方法的除去能力遠遠大於常規透析、超濾、離心等 方法。6、特別適合於高濃度磷脂脂質體。7、快速建立脂質體內外滲透壓梯度，促進水進入脂質體內水相，擴大內水相體積， 提高包封率。8、由於外水相的物質可以很快被除去，甚至可以定量地被除去，因此無需擔憂調 節過頭，從而可以通過外加法來隨意調整為所需PH，如pH8、pH9等，增大跨膜內外梯度，提 高包封率。9、將現有的三瓶裝(「藥物」、「空白脂質體」、「pH調節劑」)脂質體，如MYOCET(阿黴素脂質體)，減少為兩瓶裝(「藥物」、「空白脂質體」)，降低成本的同時，亦會達到縮短生 產時間、簡化操作、減少汙染機會的效果。
具體實施例方式下面結合實施例，更具體地說明本發明的內容。應當理解，本發明的實施並不局 限於下面的實施例，對本發明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發明保護範圍。實施例1處方HSPC 3gCHIgPEG-CHS Ig水化介質300mmol枸櫞酸溶液(pH 4. 00) 100ml。製備空白脂質體稱取處方量的HSPC、CH(膽固醇)、PEG_CHS(PEG分子量為 2000)，55°C，用IOml乙醇溶解膜材，得脂質相；將預熱至55°C的水化介質注入脂質相，孵育 IOmin,製得脂質體初品，再經20000psi高壓均質處理，降低脂質體粒徑至90nm，依次通過 0.8,0. 45,0. 22 μ m的微孔濾膜，即得空白脂質體。建立梯度脂質體根據交換容量計算，1. 2ml (溼視體積)陰離子樹脂(0H-) (717 型陰離子樹脂)即可以完全交換300mmol/L枸櫞酸溶液lml。本實施例採用Iml (溼視體 積)陰離子樹脂(0H-) (717型陰離子樹脂)處理Iml空白脂質體，其pH值為6. 8。主動載藥將得到的梯度脂質體分為二份，一份直接載藥，另外一份用pH = 8. 1的 IOmMPBS(磷酸鹽緩衝液)稀釋一倍後進行載藥。長春新鹼與HSPC的重量比為1 6。結果，直接載藥的包封率為81.6%，而以PH = 8. 1的IOmM磷酸鹽緩衝液(PBS)稀 釋一倍後的梯度脂質體載藥的包封率為95. 2%，即通過增大跨膜內外梯度來提高包封率。本實施例僅需兩瓶，即一瓶「藥物」與一瓶「空白脂質體」，外加一支離子交換樹脂 柱；而歐盟已獲準上市的阿黴素脂質體(MYOCET)為三瓶裝(「藥物」、「空白脂質體」、「pH調 節劑」)，很顯然，本發明降低了生產成本，同時亦縮短生產時間、簡化操作、減少汙染機會。實施例2處方DSPC5g300mM枸櫞酸緩衝液 IOOml(1)、取適量氯仿溶解DSPC ( 二硬脂醯磷脂醯膽鹼)，旋轉蒸發除去氯仿，製備DSPC 膜。以100ml 300mM枸櫞酸緩衝液為水化介質，水化磷脂薄，製備DSPC大單室脂質體(約 610nm)，分別採用氫氧化鈉溶液(常規方法)或氫氧型陰離子交換樹脂(0H-)調節外水相 PH至7，建立pH梯度。氫氧化鈉溶液建立梯度的脂質體記為A，氫氧型陰離子交換樹脂建 立梯度的脂質體記為B。顯微鏡觀察發現，B的粒徑大於A的粒徑，PSS (Particle Sizing Systems)測定結果表明，A與B的粒徑分別為596nm與681nm。(2)、分別在A或B中加入乙醇，室溫密閉攪拌1小時，確保乙醇跨膜平衡。然後超 速離心分離外水相，GC測定，計算包封率。以包封率大小表示內水相體積大小。結果A或B的包封率分別為5. 11 %與8. 26 %，S卩陰離子交換樹脂建立梯度的脂質 體，其內水相體積大。內水相體積大的好處是可以獲得更高的包封率和更大的載藥量。
實施例3處方DSPC3gDSPE-PEG2000 Ig水化介質200mMEDTA銨鹽與10mg/ml透明質酸銨溶液100ml。製備空白脂質體稱取處方量的DSPC、DSPE-PEG2000，55°C，用IOml乙醇溶解膜 材，得脂質相；將預熱至55°C的水化介質注入脂質相，孵育lOmin，製得脂質體初品，再經 20000psi高壓均質處理，降低脂質體粒徑至lOOnm，依次通過0. 8,0. 45,0. 22 μ m的微孔濾 膜，即得空白脂質體。建立梯度脂質體採用三種離子交換劑組成的混合離子交換劑331弱鹼性環氧系陰離子交換樹 脂、122弱酸性酚醛系陽離子交換樹脂及DEAE-纖維素。331弱鹼性環氧系陰離子交換樹脂 與122弱酸性酚醛系陽離子交換樹脂的溼視體積比=2 1 (ν/ν)，混合樹脂的用量為水化 介質中陰陽離子所需交換容量的5倍，DEAE-纖維素與混合樹脂的溼視體積比為1 1。將所得的空白脂質體與混合離子交換劑混合放置Imin後，2000rpm離心4min，得 到梯度脂質體。該梯度脂質體可以主動裝載各種含有氮原子的鹼性化合物，如阿黴素、長春新鹼 (生物鹼)、慶大黴素等，其包封率大於80%，甚至可達100%。而採用超濾法獲得的離子梯 度進行載藥，其包封率小於60 %。實施例4處方DSPC3gDSPE-PEG2000 0 . 5g水化介質含有10mg/ml低分子肝素鈉的200mM硫酸銨溶液100ml。空白脂質體製備方法同實施例3。建立梯度脂質體方法同實施例3，除去外水相的低分子肝素鈉與硫酸銨，建立梯度，得到梯度脂質 體。離子交換劑可以採用陰陽離子混合柱，具體配比如下。OOl強酸性苯乙烯系陽離子交換 樹脂/201強鹼性季胺I型陰離子交換樹脂/D202大孔強鹼性季胺II型陰離子交換樹脂/ DEAE-纖維素，溼視體積比=1 2 1 1 (ν/ν/ν/ν)；或者採用OOl強酸性苯乙烯系陽離 子交換樹脂/111弱酸性丙烯酸系陽離子交換樹脂/301弱鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂/ D201大孔強鹼性季胺I型陰離子交換樹脂，溼視體積比=1 0.5 1 1 (ν/ν/ν/ν)；或 者採用DOOl大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂/201強鹼性季胺I型陰離子交換樹脂/ D215大孔丙烯酸系強鹼陰離子交換樹脂，溼視體積比=1 1 1 (ν/ν/ν/ν)。其用量為水 化介質中所需交換容量的2-20倍均可。載藥將柔紅黴素溶液(3mg/ml)加入上述空白脂質體中，60°C孵育30分鐘，主動裝載藥 物，得到包封率大於90%的柔紅黴素脂質體(記為A)，4°C冰箱放置。另外，以常規透析法建立梯度脂質體，取空白脂質體，以截留分子量為10萬的透 析膜、透析介質為等滲蔗糖溶液透析5小時；更換透析介質，透析2小時；再次更換透析介 質，透析2小時，建立梯度，得到梯度脂質體。載藥同法操作，包封率為39. 2% (記為B)，4°C冰箱放置。結果A放置10天未產生沉澱，包封率仍大於90% ；而B的穩定性很差，放置1天 後產生沉澱產生，包封率為38.6%。同理可以將海藻酸銨與磷酸銨組合包入囊泡/脂質體中；或者可以將其它多離子 化合物與小分子硫酸銨(二乙胺、三乙胺等銨鹽)、磷酸銨(二乙胺、三乙胺等銨鹽)、檸檬 酸胺(二乙胺、三乙胺等銨鹽)、琥珀酸銨(二乙胺、三乙胺等銨鹽)、穀氨酸銨(二乙胺、 三乙胺等銨鹽)(DNA、RNA、siRNA，RNAi、蛋白質、羧甲基纖維素、琥珀明膠、酶、荷電多糖、甲 殼胺、阿拉伯膠、透明質酸等物質中兩種或者兩種以上物質包入囊泡內，建立複合型梯度囊 泡，主動載藥，包封率均大於80%。裝載的藥物可以是各種生物鹼等物質。實施例5離子交換樹脂除去外水相枸櫞酸可以降低毒性處方阿黴素0. 5gEPC3g膽固醇 Ig以適量乙醇溶解EPC與膽固醇，300mM枸櫞酸緩衝液(pH4. 0) IOOml水化，微射流處
理，製備空白脂質體。比較兩種調節pH方法。A組常規方法(三瓶裝，已經獲準上市的MY0CET)，採用 碳酸鈉調節PH至7裝載阿黴素；B組本發明方法(兩瓶裝)，採用陰離子交換樹脂(氫氧 型)除去外水相枸櫞酸，同時調節pH = 7. 0。兩種方法的包封率均大於90%。毒性試驗隨機將20隻小鼠分為2組，每組10隻，按照6mg/kg劑量靜脈注射A組 與B組，連續注射3次，觀察15天內生存情況。結果A組死亡6隻，B組僅死亡2隻。同樣可以製備其他藥物脂質體，如長春新鹼、長春瑞濱、阿克拉黴素、米託蒽醌、枸 櫞酸舒芬太尼脂質體，特別是製備高濃度脂質體(脂質濃度大於10% (g/ml))，可以實現肌 肉注射緩釋，降低刺激性。實施例6處方DPPC3gCHIgDSPE-PEG5000 0. IgDSPE-PEG2000 0 . 3gDSPE-PEGicicici 0. 2g水化介質含有不同濃度右旋糖酐硫酸酯的100mmol/LNH4EDTA溶液100ml。製備空白脂質體稱取處方量的HSPC、CH(膽固醇)、DSPE_PEG5_、DSPE-PEG2000, DSPE-PEGic^SSt:,用IOml乙醇溶解膜材，得脂質相；將預熱至55°C的水化介質注入脂質 相，孵育30min，製得脂質體初品，再經20000psi高壓均質處理，降低脂質體粒徑至lOOnm， 依次通過0. 8,0. 45,0. 22 μ m的微孔濾膜，即得空白脂質體。離子交換方法建立梯度取空白脂質體，與混合樹脂(採用四種離子交換劑，732 陽離子交換樹脂、CM-纖維素、717陰離子交換樹脂、DEAE-纖維素，其混合比例為溼視體積 1:1:1: 2v/v)混合放置5min後，在2000rpm下離心4min，建立梯度，得到梯度脂質體 (記為B組)。
單獨採用732型陽離子樹脂除去外水相銨離子，不除去右旋糖酐硫酸酯(記為A 組)。載藥將梯度脂質體與4mg/ml鹽酸伊立替康(Irinotecanhydrochloride， CPT-11)溶液按照藥脂比1 5(w/w)混合，於60°C下載藥lOmin，得到鹽酸伊立替康脂質 體，包封率均大於90%。體外釋放將脂質體裝入截留分子量為10萬的透析袋中，以10mMPBS(pH5. 3)為釋 放介質，考察30分鐘釋放包封率。結果見表1。表1體外釋放結果
權利要求
一種具內外水相梯度差的囊泡，其特徵在於，所述囊泡通過採用離子交換方法單獨或與其它方法結合除去空白囊泡水化介質中的陽離子、陰離子、陰陽離子和/或荷電大分子物質後獲得。
2.如權利要求1所述的囊泡，其特徵在於，所述其它方法包括透析法、超濾法。
3.如權利要求1所述的囊泡，其特徵在於，所述離子交換方法中採用的離子交換劑為 特種樹脂時，其選自下列物質中一種WA-2胺基酸專用樹脂、催化劑樹脂、WDX-3果汁脫色 專用樹脂、WD-6脫色樹脂、WL-XF核用樹脂、WTT脫鐵樹脂、IND90變色樹脂、D208脫色專用 樹脂、D209飲用水除硝酸根樹脂、D309脫色專用樹脂或XDA-7均孔脫色樹脂。
4.如權利要求1所述的囊泡，其特徵在於，所述離子交換方法中所採用的離子交換劑 為陽離子交換樹脂或離子交換膜，當離子交換劑為陽離子交換樹脂時，其選自下列物質中 至少一種001強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂、111弱酸性丙烯酸系陽離子交換樹脂、112 弱酸性丙烯酸系陽離子交換樹脂、122弱酸性酚醛系陽離子交換樹脂、DOOl大孔強酸性苯 乙烯系陽離子交換樹脂、Dlll大孔弱酸性丙烯酸系陽離子交換樹脂、D390鹽酸除鐵專用樹 脂、D401大孔苯乙烯系螯合型離子交換樹脂、CAT600大孔苯乙烯系強酸催化樹脂大孔強酸 氫型陽離子交換樹脂、CAT601大孔強酸催化樹脂苯乙烯系大孔強酸氫型陽離子交換樹脂、 C005催化專用樹脂苯乙烯系凝膠強酸陽離子交換樹脂、D002-II型耐高溫樹脂、C004生物 鹼提取專用樹脂苯乙烯系凝膠強酸陽離子交換樹脂、C008生物鹼提取專用樹脂苯乙烯系 大孔強酸陽離子交換樹脂、B108胺基酸提取專用樹脂苯乙烯系大孔強酸陽離子交換樹脂、 C610硫脲樹脂、C620巰基樹脂、C700硼選擇性樹脂、C800氨基羧酸樹脂或C900氨基膦酸 樹脂，其用量為水化介質中陽離子所需交換容量的1-1000倍。
5.如權利要求1所述的囊泡，其特徵在於，所述離子交換方法中採用的離子交換劑為 陰離子交換樹脂時，其選自下列物質中至少一種201強鹼性季胺I型陰離子交換樹脂、301 弱鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂、303弱鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂、331弱鹼性環氧系 陰離子交換樹脂、401螯合性胺羧基離子交換樹脂、D201大孔強鹼性季胺I型陰離子交換 樹脂、D202大孔強鹼性季胺II型陰離子交換樹脂、D301大孔弱鹼性苯乙烯系陰離子交換 樹脂、D302大孔弱鹼性苯乙烯系陰離子交換樹脂、D311大孔弱鹼性丙烯酸系陰離子交換樹 脂、D206耐高溫陰離子交換樹脂、D215大孔丙烯酸系強鹼陰離子交換樹脂、D363大孔弱鹼 陰離子交換樹脂或D204大孔苯乙烯系強鹼性陰離子交換樹脂，其用量為水化介質中陰離 子所需交換容量的1-1000倍。
6.如權利要求1所述的囊泡，其特徵在於，所述水化介質中陽離子包括Ca2+、Mg2+、 Mn2+、Cu2+、NH4+、K+、Fe2+、C2H4(NH3+)2、(CH3CH2) 3NH+、HOC2H4NH3+、(HOC2H4) 3NH+、(HOCH2) 6CH3NH2+或 三羥甲基氨基甲烷；陰離子包括S042—、P043—、HP042-、H2POp Cl—、枸櫞酸根、醋酸根、EDTA4—、六 偏磷酸根、三聚磷酸根、焦磷酸根、甘油磷酸根、果糖二磷酸根、三磷酸腺苷根、植酸根、鄰苯 二甲酸根、間苯二甲酸根、對苯二甲酸根、苯甲酸根、間苯二甲酸根、間苯三甲酸根、乳糖酸 根、二巰基丁二酸根、二乙三胺五乙酸根、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸根或氨基三乙 酸根；荷電大分子物質包括蛋白質、肽類、酶類，以及這些物質或其他大分子物質的硫酸酯、 磺酸酯或磷酸酯衍生物，如磷酸化蛋白質，肝素、右旋糖酐硫酸酯、殼聚糖及其衍生物、明膠 及其衍生物、琥珀醯明膠及其衍生物、多糖硫酸酯、低聚巖藻聚糖硫酸酯、木聚糖硫酸酯、海 藻酸及其衍生物、透明質酸及其衍生物。
7.權利要求1-6任何一項所述囊泡的製備方法，其特徵在於，包括下述步驟(1)製備空白囊泡；(2)將(1)得到的空白囊泡用離子交換劑處理，然後洗脫處理即可得到具內外水相梯度差的囊泡。
8.如權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，所述步驟(1)中製備空白囊泡時加入酸 敏、溫敏、光敏或靶向性物質。
9.權利要求1-6任一所述囊泡在製備藥物上的應用，其特徵在於，所述應用包括將具 內外水相梯度差的囊泡與藥物溶液混合，實現主動載藥後即可獲得藥物製劑。
10.如權利要求9所述的應用，其特徵在於，所述藥物製劑再用離子交換劑處理。
11.如權利要求9所述的應用，其特徵在於，所述的藥物製劑加入海藻糖、蔗糖、乳糖、 甘露醇、葡萄糖、氯化鈉或蛋白質後作凍幹處理。
12.如權利要求9所述的應用，其特徵在於，所述藥物為能採用離子梯度法進行包封的 藥物，其中所述離子梯度法包括PH梯度法、銨梯度法、醋酸鈣梯度法和細胞離子載體離子 梯度法。
13.權利要求1-6任一所述囊泡在製備脂質體凝膠上的應用。
14.權利要求1-6任一所述囊泡在製備磁性脂質體上的應用。
15.權利要求1-6任一所述囊泡在製備納米粒/納米凝膠上的應用。
全文摘要
本發明屬於藥物製劑領域，首先公開一種具內外水相梯度差的囊泡，所述囊泡採用離子交換方法或與透析法或超濾法結合處理空白囊泡獲得，本發明還提供所述囊泡的製備方法和應用，即先製備空白囊泡，然後將得到的空白囊泡用離子交換劑處理，最後洗脫處理即可得到具內外水相梯度差的囊泡。本發明所製備的囊泡可與藥物溶液混合，實現主動載藥後即可獲得藥物製劑。所得的製劑可進一步進行離子交換處理或凍幹處理。本發明提供的囊泡具備更高的內外水相梯度差，能實現囊泡離子梯度載藥，並獲得更高包封率；製備方法簡單，成本低。並能較好在應用於脂質體凝膠、磁性脂質體、納米粒/納米凝膠的製備。
文檔編號A61K9/00GK101991536SQ20091001306
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月11日 優先權日2009年8月11日
發明者宋陽, 張小飛, 楊強, 鄧意輝, 馬豔鈴, 黃微葳 申請人:瀋陽藥科大學