用於製備l－抗壞血酸和d－異抗壞血酸的微生物方法

2024-01-26 00:14:15

專利名稱：用於製備l－抗壞血酸和d－異抗壞血酸的微生物方法
技術領域：
本發明涉及用以製備L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸及它們的鹽的一種新的微生物方法。更具體地說，本發明涉及採用嗜酸性耐熱微生物，分別從2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸製備L-抗壞血酸或D-異抗壞血酸，或從這些起始物的適合鹽製備相應的鹽的一種新方法。L-抗壞血酸(維生素C)不僅廣泛用於醫療保健也廣泛用於食品、動物飼料如魚料、和化妝品。D-異抗壞血酸主要作為抗氧化劑用於食品添加劑。
通過熟知的Reichstein方法(Helv.Chim.Acta 17，311-328，1934)已從D-葡萄糖生產L-抗壞血酸。在這一多步驟方法中，通過化學方法從中間物2-酮-L-古洛糖酸得到L-抗壞血酸。這一方法用於商業用途已有60餘年，期間有許多化學和技術上的改進以提高達到中間物D-山梨糖醇、L-山梨糖、二丙酮基-L-山梨糖、二丙酮基-2-酮-L-古洛糖酸、2-酮-L-古洛糖酸和2-酮-L-古洛糖酸甲酯，和終產物L-抗壞血酸的每一個步驟的效率。D-山梨糖醇轉化成L-山梨糖是唯一的微生物步驟，其餘都是化學步驟。將二丙酮基-2-酮-L-古洛糖酸轉化成L-抗壞血酸有兩種不同的方法1)去保護以得到2-酮-L-古洛糖酸，隨後用甲醇酯化及鹼催化環化；和2)直接從受保護的或去保護的2-酮-L-古洛糖酸用酸催化環化為L-抗壞血酸。這些轉化過程必須在非水性或少水的反應介質裡進行。無論從環保還是經濟的角度出發，優選用無有機溶劑的反應。
而D-異抗壞血酸從D-葡萄糖經2-酮-D-葡糖酸和2-酮-D-葡糖酸甲酯製備，2-酮-D-葡糖酸本身能從屬於假單胞菌屬的菌株通過發酵產生。
人們投入許多時間和精力來尋找用微生物生產L-抗壞血酸的其它方法。關於用微生物生產L-抗壞血酸的研究大多數集中在中間物2-酮-L-古洛糖酸的生產上，特別是從L-山梨糖(G.Z.Yin等，Sheng Wu HsuehPao.20，246-251，1980；A，Fujiwara等，EP 213 591；T.Hoshino等，US專利4960695；和I.Nogami等，EP 221707)，D-山梨糖醇(A.Fujiwara等，EP213591；T.Hoshino等，US專利5,312,741；M.Niwa等，WO95/23220；和S.F.Stoddard等，WO98/17819)或從D-葡萄糖經2，5-二酮-葡糖酸用單一或混合或重組培養物(T.Sonoyama等，Appl.Environ.Micvobiol.43，1064-1069，1982；和S.Anderson等，科學(Science)230，144-149，1985)生產。然後2-酮-L-古洛糖酸能用上述化學方法轉化為L-抗壞血酸。
最近在美國專利6,022,719(J.C.Hubbs)裡報導過將2-酮-L-古洛糖酸酯轉化成L-抗壞血酸的生物學方法。這份專利裡描述了一種通過2-酮-L-古洛糖酸或其酯與選自蛋白酶、酯酶、脂肪酶和醯胺酶的水解酶催化劑接觸來生產L-抗壞血酸的方法。該專利舉例說明了從2-酮-L-古洛糖酸的酯如2-酮-L-古洛糖酸丁酯形成L-抗壞血酸，而不是從2-酮-L-古洛糖酸自身來形成L-抗壞血酸。例如，該專利公開了，Candida antarticaB脂肪酶在8.6％甲醇中、pH3.1-3.2、38℃時催化從1％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸形成413-530毫克/升2-酮-L-古洛糖酸甲酯而不是L-抗壞血酸的反應。Candida antartica B脂肪酶在酸性pH下對2-酮-L-古洛糖酸，一種α-酮-羧酸，有明顯的酯合成活性，但這種脂肪酶的分子內酯形成可以忽略不計。
除了水解酶反應，酯鍵合成例如蛋白質(氨基酯)，脂肪酸酯(羧基酯)，和核苷酸鏈(磷脂)的酯鍵合成在細胞中的功能活性也是很強的。與水解酶的逆向反應相比，甚至在水相中，該反應仍單方向進行並很少被產物所抑制。這類反應系統需要活化酯如活化的轉移核糖核酸(tRNA)，腺苷三磷酸(ATP)和乙醯輔酶A(acyl-CoA)等的供應，它們在細胞能量轉換代謝中產生。該反應的「體外」重建需要能量供體如ATP的化學計量供應或再生系統，這些能量供體對於商業化生產維生素和精細化學產品如L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸是昂貴的。商業上，利用完整細胞是優選方法之一。
如上所述，2-酮-L-古洛糖酸經2-酮-L-古洛糖酸γ-內酯化學轉化為L-抗壞血酸是一個伴有水分子消除的酸催化反應。該反應的主要原理是羧基酯鍵的形成以在2-酮-L-古洛糖酸分子中提供一個γ內酯環。因此，特別是在水相中，該平衡反應的最終狀態由物理化學條件來確定。通過化學轉化從2-酮-L-古洛糖酸形成L-抗壞血酸的產率甚至在水相中也是可觀的，但對於商業應用則是不夠的。為了花費的有效性和符合環境要求，在水相中或含有低濃度有機溶劑的水相中採用這一方法是非常理想的。因此，對於水相中的生產，期望該化學轉化的某種生物學增強。很明顯，高溫和酸性(低)pH是提高該化學反應效率的理想反應參數。但是，通常，已知這些物理化學條件與在中溫條件下存活的大多數微生物的細胞生活和/或細胞活性是生物學上不相容的。耐熱性或嗜酸性微生物的利用是熟知的，但對熱和酸都耐受的嗜酸性耐熱微生物的應用例子很少。
令人驚奇的是，現在已經發現，在生物學極端條件如高溫和低(酸性)pH值下，通過嗜酸性耐熱微生物能夠有利地在水相中直接將游離酸或鈉、鉀或鈣鹽形式的2-酮-L-古洛糖酸轉化為L-抗壞血酸或適宜的鹽類。還令人驚奇地發現，可以在生物學極端條件下通過嗜酸性耐熱微生物有利地在水相中直接將游離酸或鈉、鉀或鈣鹽形式的2-酮-D-葡糖酸轉化為D-異抗壞血酸或適宜的鹽類。
因此，本發明提供了一種用嗜酸性耐熱微生物從2-酮-L-古洛糖酸或其鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽生產L-抗壞血酸或它的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽，或從2-酮-D-葡糖酸或其鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽生產D-異抗壞血酸或它的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽的方法。更具體地，本發明方法是用於從2-酮-L-古洛糖酸或它的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽產生L-抗壞血酸或它的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽，或從2-酮-D-葡糖酸或它的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽產生D-異抗壞血酸或它的鈉鹽鉀鹽或鈣鹽的方法，該方法包括在高溫即大約30℃-大約100℃和酸性pH即1-6的pH下於溶液中，將各自作為游離酸或鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽的2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸，與能夠從2-酮-L-古洛糖酸或它的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽產生和/或促進從2-酮-L-古洛糖酸或其鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽產生L-抗壞血酸或它的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽，或從2-酮-D-葡糖酸或它的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽產生和/或促進從2-酮-D-葡糖酸或或其鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽產生D-異抗壞血酸或它的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽的嗜酸性耐熱微生物的細胞共同孵育，以形成L-抗壞血酸或它的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽，或形成D-異抗壞血酸或它的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽，然後從這種溶液中分離L-抗壞血酸或它的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽，或D-異抗壞血酸或它的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
本發明的進一步實施方案是具有以下特徵、能產生L-抗壞血酸或其鹽或D-異抗壞血酸或其鹽的微生物(a)當採用Genetyx-SV/R軟體程序時，與SEQ ID NOs1、2或3至少98.1％一致的rDNA序列；(b)杆狀形態；(c)寬度為大約0.8微米；(d)不能在厭氧條件下生長；(e)表現出過氧化氫酶活性；(f)其主要的脂肪酸是ω-環己基酸；(g)能在pH3.0和60℃的溫度下生長；(h)不能在下述條件下生長pH溫度3.030℃6.560℃6.530℃(i)能夠(1)從2-酮-L-古洛糖酸或其鹽產生L-抗壞血酸或其鹽，(2)從2-酮-D-葡糖酸或其鹽產生D-異抗壞血酸或其鹽，或(3)分別從2-酮-L-古洛糖酸或其鹽和2-酮-D-葡糖酸或其鹽產生L-抗壞血酸或其鹽和D-異抗壞血酸或其鹽。
為簡潔起見，當應用於「2-酮-L-古洛糖酸」、「2-酮-D-葡糖酸」、「L-抗壞血酸」或「D-異抗壞血酸」時，「或其鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽」或同等表述在下文中將各自主要表述為「或其鹽」。而且，除非對存在的酸或其特定的鹽形式作了明確說明，任何指定濃度的這些酸或它們的鹽形式將以游離酸的形式為基礎來表示，即使鹽形式可能存在。
在本說明書中，術語「耐熱微生物」通常指的是在高於大約55℃的溫度下生長最佳的微生物，術語「嗜酸性微生物」指的是在酸性範圍pH下，特別是低於大約pH6下生長最佳，而在中性範圍pH即大約6-大約8的pH範圍內沒有生長的微生物。因此在本發明的上下文中，術語「嗜酸性耐熱微生物」指的是一種同時具有這兩種性質的微生物，即該微生物在高於大約55℃的溫度和低於大約6的pH下具有最佳生長，而在大約6到大約8的pH範圍內沒有生長。為了本發明的目的，術語「嗜酸性耐熱微生物」也包括嗜酸性耐熱微生物的突變體。
本發明所用術語「生長」是指孵育20小時後能觀察到菌落的形成。本發明所用術語「沒有生長」指的是在孵育20小時後沒有觀察到菌落。
正常情況下，嗜酸性耐熱微生物存在於原核生物中並可從其中分離，分類為古細菌(Archaea)和細菌(Bacteria)下。在古細菌域(domain)中，硫化葉菌屬(Sulfolobus)(T.D.Brock等，Arch Mikrobiol.84，54-68，1972)和熱原體屬(Thermoplasma)(M.DeRosa等，植物化學(Phytochemistry)170，1416-1418，1970)是熟知的嗜酸性耐熱微生物，酸菌屬(Acidanus)(A.H.Segerer等，系統細菌學國際雜誌(Int.J.Syst.Bacteriol.)36，559-564，1986)、硫還原葉菌屬(Desulfurolobus)(W.Zilling等，系統應用微生物學(Syst.AppL.Microbiol.)8，197-209，1986)、生金球菌屬(Metallosphaera)(G.Huber等，系統應用微生物學12，38-47，1989)、Picrophilus屬(C.Schleper等，細菌學雜誌(J.Bacteriol.)177，7050-7059，1995)和棲冥河菌屬(Stygiolobus)(A.H.Segerer等，系統細菌學國際雜誌41，495-501，1991)也都是被報導為古細菌域的嗜酸性耐熱微生物。在細菌域中，Acidimicrobium屬(D.A.Clark等，微生物學(Microbiology)142，785-790，1996)、熱酸菌屬(Acidothermus)(F.Rainey等，FEMS Microbiol.lett.，108，27-30，1993)、硫化桿菌屬(Sulfobacillus)(R.S.Golovacheva等，微生物學47，658-665，1978)和脂環酸桿菌屬(Alicyclobacillus)(G.Darland等，普通微生物學雜誌(J.Gen.Microbiol.)67，9-15，1971；G.Deinhard等，系統應用微生物學10，47-53，1987)均是嗜酸性耐熱微生物。
可以在本發明中使用的嗜酸性耐熱微生物是能夠實現和/或促進從2-酮-L-古洛糖酸或其鹽產生L-抗壞血酸或其鹽，或從2-酮-D-葡糖酸或其鹽產生D-異抗壞血酸或其鹽的任何嗜酸性耐熱微生物。
用於本發明的嗜酸性耐熱微生物能獲自任何類型的天然來源，包括土壤和溫泉，和人工來源，包括經過加工的酸性食品和飲料如果汁和混合的水果/蔬菜汁。
任何特定嗜酸性耐熱微生物所表現出耐受的條件越極端，即溫度越高並且pH值越低(越酸)，則在本發明的方法中越是優選採用該微生物。除對熱和酸耐受外，當在高溫和酸性pH孵育時還對溶液中高濃度，即大約5％-大約20％(w/v)的2-酮-L-古洛糖酸或其鹽或2-酮-D-葡糖酸或其鹽具有耐受性的嗜酸性耐熱微生物，是該方法更為優選採用的。而且，對於有效即快速的細胞的生產，優選具有本發明所描述的需氧和化能有機營養特性的嗜酸性耐熱微生物。
優選的嗜酸性耐熱微生物來源於原核生物，包括細菌和古細菌。更優選的微生物是嗜酸性耐熱細菌。尤其優選的嗜酸性耐熱微生物是屬於脂環酸桿菌屬的細菌。
在嗜酸性耐熱細菌當中，脂環酸桿菌屬包括了大多數嚴格需氧的、孢子形成、杆狀、化能有機營養細菌。這些微生物起初被定為芽孢桿菌屬。然而，基於16S rRNA基因序列比較的系統發生分析表明，脂環酸桿菌屬屬於芽孢桿菌屬的低G+C革蘭氏陽性譜系中的一個不同的系(J.D.Wisotzkey等，系統微生物學國際雜誌42，263-269，1992)。脂環酸桿菌屬(A.)中三個有效命名的種是酸熱脂環酸桿菌(A.acidocaldarius)(DSM 446T，G.Darland等，普通微生物學雜誌67，9-15，1971)、酸土脂環酸桿菌(A.acidoterrestris)(DSM 3922T，G.Deinhard等，系統應用微生物學10，47-53，1987)和環庚基脂環酸桿菌(A.cycloheptanicus)(DSM 4006T，G.Deinhard等，系統應用微生物學10，68-73，1987)。除了16S rRNA基因的序列比較外，這些微生物最易於區別的特徵是具有ω-環己基脂肪酸(ω-環己基十一酸、ω-環己基十三酸)結構單元、或ω-環庚基脂肪酸(ω-環庚基十一酸、ω-環庚基十三酸)結構單元(L.Albuquerque等，系統進化微生物學國際雜誌(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.)50，451-457，2000)。迄今為止，已從地熱地帶的酸性土壤中及某些非地熱地帶土壤中分離了幾種具有脂環酸桿菌屬特徵的菌株。除了土壤樣品，它們還從許多酸性飲料中作為酸敗細菌被分離(G.Cerny等，Z Lebens Unters Forsch 179，224-227，1984；K.Yamazaki等，生物科學生物技術生物化學(Biosci.Biotech.Biochem.)60，543-545，1996；M.Niwa等，日本專利申請(Kokai)140696/1996)。最近，提出在脂環酸桿菌屬中除了這三個有效命名的物種外存在基因種的廣泛多樣性(A.Hiraishi等，普通應用微生物學雜誌(J.Gen.Appl.Microbiol.)，43，295-304，1997；L.Albuquerque等，系統進化微生物學國際雜誌50，451-457，2000)。
用於本發明的優選嗜酸性耐熱微生物具有如下特徵1)嗜酸性耐熱生長在60℃ pH3.0時20小時後表現出生長，而在30℃ pH3.0、30℃ pH6.5和60℃ pH6.5的所有情況下20小時後均不表現出生長。
2)ω-環己基脂肪酸根據氣相色譜-質譜聯用(GC/MS)分析具有ω-環己基脂肪酸結構單元。
3)16S rRNA的序列相似性對編碼rRNA序列的16S基因的系統發生分析證實脂環酸桿菌屬的定位(allocation)。
如上所述，本發明所用嗜酸性耐熱微生物能從天然或人工來源獲得，或通過商業途徑從培養物保藏處獲得。為從這些天然和人工來源中分離該微生物，將適宜的微生物來源物，例如天然來源物土壤或溫泉，或人工來源物經加工的酸性食品或飲料，在有氧條件下方便地培養在補充了適宜營養物的含水培養基中或固體培養基上。培養便利地在高於大約40℃的溫度和低於大約5的pH下進行，優選在高於大約50℃和pH低於大約4下進行，更優選在高於大約55℃和pH低於大有3.5下進行。儘管培養期隨所用pH、溫度和營養介質而變化，但12小時到幾天的培養期通常將給出滿意的結果。
用於本發明的屬於脂環酸桿菌屬的尤其優選的嗜酸性耐熱微生物是可從德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorgismen undZellkulturen GmbH，DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德國獲得的脂環酸桿菌屬DSM 13652和DSM 13653，從在日本的IwatePrefecture採集的土壤標本中分離的新菌株脂環酸桿菌屬NA-20和NA-21，以及從在日本Kanagawa Prefecture的Kamakura-shi購買的商業酸性飲料，尤其是果汁中分離到的脂環酸桿菌屬FJ-21。
所有五種特別優選的嗜酸性耐熱微生物按布達佩斯條約於2000年8月16日保藏在DSMZ，並被分配了以下保藏號脂環酸桿菌屬DSM 13652脂環酸桿菌屬DSM 13653脂環酸桿菌屬NA-20DSM 13649脂環酸桿菌屬NA-21DSM 13650脂環酸桿菌屬FJ-21DSM 13651以上提到的最後三個嗜酸性耐熱微生物是新的，代表了本發明的又一方面。
如上所述，在本發明中還可以使用以上提到的嗜酸性耐熱微生物的突變物。用於本發明的微生物突變物可以通過誘變劑如用紫外線、X射線、γ射線進行輻射或與亞硝酸鹽或其它適合的誘變物質接觸，處理野生型菌株來誘導。也可以通過從由於自發突變所產生的克隆中分離突變體，這一過程可由技術人員為達到此目的採用已知方法來實現。在專業出版物中已描述過許多這些方法，如1973年日本東京Kodansha Scientific公司出版的Y.Tajima，T.Yoshida和T.Kada所編寫的「化學誘變劑(Chemical Mutagens)」。
而且，還可以使用脂環酸桿菌屬DSM 13652、DSM 13653、NA-20(DSM13649)、NA-21(DSM 13650)或FJ-21(DSM 13651)的生物學上和分類學上均等的培養物。本發明中所述術語「生物學上和分類學上均等的培養物」是指具有如下生物學和分類學特點的培養物-生長需氧並嗜酸耐熱-孢子形成
-細胞形態杆狀-主要脂肪酸ω-環己基脂肪酸-系統發生位置與歸類於脂環酸桿菌屬的菌株如脂環酸桿菌屬DSM13652、脂環酸桿菌屬UZ-1、脂環酸桿菌屬MIH-2、脂環酸桿菌屬KHA-31和酸熱脂環酸桿菌DSM446T最近(在16S rRNA基因的核苷酸序列上有超過90％的一致性)，其中該核苷酸的一致性使用核苷酸序列同源性程序(Genetyx-SV/R，4.0版本，SoftwareDevelopment公司，東京，日本)以及默認條件(待比較的單位大小＝1)來確定。
以上提到的嗜酸性耐熱微生物可以以任何形式使用，尤其是以完整細胞、修飾的細胞或固定化細胞的形式使用。固定細胞的方法是本領域所熟知的(見例如W.M.Fogarty等，微生物酶學和生物技術(MicrobialEnzymes and Biotechnology)，第2版，ELsevier Applied Science，第373-394頁(1983)，和日本專利公開文本61265/1994)。
可以採用下述方法篩選嗜酸性耐熱微生物以評價其對於本發明方法的適用性在含有底物2-酮-L-古洛糖酸或其鹽或2-酮-D-葡糖酸或其鹽並補充了適當營養物的液體培養基中，於適度的有氧條件下，即在不進行強制通氣或劇烈振蕩的有氧孵育下，培養適宜的微生物來源。為了進行該培養，底物2-酮-L-古洛糖酸或其鹽，或2-酮-D-葡糖酸或其鹽的濃度可以是從大約3％(w/v)到大約20％(w/v)，優選從大約4％(w/v)到大約18％(w/v)，更優選從大約5％(w/v)到大約16％(w/v)。可以在pH大約0.5-大約4.0、優選大約1.0-大約3.5、更優選大約1.5-大約3.0，溫度大約45℃-大約90℃、優選大約50℃-大約85℃、更優選大約55℃-大約80℃的條件下，進行該孵育。儘管孵育期隨所用pH、溫度和營養培養基的變化而改變，但大約12個小時到幾天的孵育期通常將取得良好的效果。孵育後，所鑑別的嗜酸性耐熱微生物在本發明方法中的適用性可以通過與無嗜酸性耐熱微生物的「空白」孵育的生產能力相比，其L-抗壞血酸或其鹽、或D-異抗壞血酸或其鹽的生產能力(產物的大量積累)水平來評估，但是優選比空白孵育的生產能力增加2倍以上的生產能力。
在上述孵育中，除了高溫和酸性pH外，還存在高濃度的底物2-酮-L-古洛糖酸或其鹽、或2-酮-D-葡糖酸或其鹽，即使對嗜酸性耐熱微生物來說，這可能也是一種極端的物理化學條件。為了保持(維持)活細胞狀態，在高溫和酸性pH下對2-酮-L-古洛糖酸或其鹽、或2-酮-D-葡糖酸或其鹽的耐受性可能是用於本發明方法的嗜酸性耐熱微生物的一個重要特性。
本發明方法中採用嗜酸性耐熱微生物的細胞從2-酮-L-古洛糖酸或其鹽產生和/或增強產生L-抗壞血酸或其鹽，或從2-酮-D-葡糖酸或其鹽產生和/或增強產生D-異抗壞血酸或其鹽的孵育在水相溶液中進行。水相溶劑優選單純的水，即沒有添加任何其它的溶劑。然而，如果採用添加溶劑，則優選低級烷醇如甲醇。用於從2-酮-L-古洛糖酸產生和/或增強產生L-抗壞血酸，或從2-酮-D-葡糖酸產生和/或增強產生D-異抗壞血酸(其中這些產物和底物均以游離酸或相應的鈉、鉀或鈣鹽的形式存在)的孵育需要營養物如可同化的碳源、可消化或同化的氮源和無機物、痕量元素、維生素、L-胺基酸以及其它生長促進因子。可以採用D-葡萄糖、蔗糖、D-葡糖酸-δ-內酯、澱粉等作為可同化的碳源。各種有機物或無機物可用作氮源，如酵母抽提物、內膏、蛋白腖、酪蛋白、玉米漿、尿素、胺基酸、硝酸鹽、銨鹽如硫酸銨等。硫酸鎂、磷酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等可用作無機物。而且，可以採用鈣、鎂、鋅、錳、鈷、和鐵的硫酸鹽、鹽酸鹽或磷酸鹽作為微量元素。尤其適合用作無機鹽的是磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵和硫酸錳。而且如果有必要，可以添加常規營養因子或防沫劑，如動物油、植物油或礦物油。
孵育條件可隨所用嗜酸性耐熱微生物的種屬特點而改變。在對於孵育而言是高溫的溫度，即在大約30℃到大約100℃、優選大約40℃到大約95℃、最優選大約55℃到大約95℃的溫度，以及酸性pH，尤其是pH大約1.0-大約6.0、優選大約1.0-大約4.5、最優選大約1.5-大約3.0的條件下，於有氧條件下進行該孵育。通常情況下，大約1-大約100個小時範圍內的孵育期已足夠。
如果適當的話，用於孵育的2-酮-L-古洛糖酸或其鹽、或2-酮-D-葡糖酸或其鹽的適合初始濃度取決於所採用的特定嗜酸性耐熱微生物。然而，通常採用各自基於(等同)游離酸量的大約5％(w/v)到大約20％(w/v)濃度的2-酮-L-古洛糖酸或其鹽、或2-酮-D-葡糖酸或其鹽。
本發明的方法表現出如下特點a)L-抗壞血酸或其鹽的比生產速率例如(在有8％(w/v)的2-酮-L-古洛糖酸底物和2.5g/L的L-抗壞血酸產物時，由NA-21菌株(DSM 13650)於59℃、pH 2.5條件下作用20小時)，L-抗壞血酸的比生產速率估計為大約每小時每毫克粗細胞蛋白產2.3mg L-抗壞血酸。這是以下文實施例7中給出的結果為基礎的。
b)產物抑制本發明中該生產很少被產物L-抗壞血酸或其鹽、或D-異抗壞血酸或其鹽所抑制。本發明方法中的生產可以提供比通過水相可逆轉反應所獲得的更高的轉化產量。
在溶液中形成的L-抗壞血酸或其鹽、或D-異抗壞血酸或其鹽可以採用本領域已知的常規方法來分離和純化。如果產物是各自酸的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽，則如果需要的話可以採用本領域已知的常規方法將該鹽轉化成相應的游離酸。在所有情況下，產物的分離都可以通過基於產物和雜質(包括未轉化的底物)之間在性質上例如可溶性、吸附能力、電化學性質和兩種溶劑中的分布係數上的差異的方法來實現。吸附劑如離子交換樹脂的使用是一個便利的產物分離方法例子。電透析系統的使用是另一個便利的產物分離方法例子。如果產物達不到其隨後應用所需的足夠純度，則可以通過常規方法如重結晶和層析來純化。
L-抗壞血酸可以通過聯合使用具有將2-酮-L-古洛糖酸轉化為L-抗壞血酸或將2-酮-D-葡糖酸轉化為D-異抗壞血酸活性的生物，與具有L-山梨糖/L-山梨糖酮(L-sorbosone)脫氫酶和D-山梨糖醇脫氫酶活性並能將D-山梨糖醇和/或L-山梨糖轉化成2-酮-L-古洛糖酸的生物(見A.Fujiwara等，EP 213 591；T.Hoshino等，美國專利4,960,695；T.Hoshino等，美國專利5,312,741)例如氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)DSM 4025，採用一個容器一步轉化或兩個容器兩步轉化，從L-山梨糖或D-山梨糖醇產生。
D-異抗壞血酸可以通過聯合使用具有將2-酮-L-古洛糖酸轉化為L-抗壞血酸或將2-酮-D-葡糖酸轉化為D-異抗壞血酸活性的生物，與具有D-葡萄糖脫氫酶(Ameyama等，農業生物化學(Agric Biol.Chem.)48851-861，1981)和/或D-葡萄糖酸酯脫氫酶(Shinagawa等，農業生物化學481517-1522，1984)活性並能將D-葡萄糖和/或D-葡糖酸轉化為2-酮-D-葡糖酸的生物例如Gluconobacter Dioxyacetonicus IFO 3271，採用一個容器一步轉化或兩個容器兩步轉化，從D-葡萄糖或D-葡糖酸產生。
以下實施例是對本發明方法的說明而不是旨在以任何方式限制本發明的範圍。
實施例1篩選嗜酸性耐熱微生物A)從土壤樣品中分離在日本Iwate Prefecture的酸性溫泉區域收集的土壤樣品用於此篩選。從0.9％(w/v)氯化鈉溶液中的土壤樣品回收嗜酸性耐熱微生物，並通過將該溶液塗布在573c(pH3.5)瓊脂平板培養基上進行分離，其中所述培養基含有0.1％(w/v)D-葡萄糖、0.13％(w/v)硫酸銨、0.1％(w/v)酵母抽提物、0.15％(w/v)磷酸二氫鉀、0.025％(w/v)七水硫酸鎂、0.007％(w/v)二水氯化鈣和2％(w/v)瓊脂(用6N的硫酸調節pH；D-葡萄糖和瓊脂分開滅菌)。60℃孵育20個小時後，隨機挑取在pH3.5和60℃下生長的單菌落，並通過將其在同樣條件下三次轉移至同樣的瓊脂平板培養基上進行純化。對所獲的分離微生物編號，並指定為屬於「NA」系列。例如，一個這樣的分離微生物被命名為NA-20，另一個命名為NA-21。B)從酸性飲料中分離將各種商業酸性飲料例如果汁產品和混合的水果/蔬菜汁產品用於從其中分離嗜酸性耐熱微生物的實驗。在每種情況中，對1毫升商業產品進行離心，所獲沉澱用1毫升無菌蒸餾水洗滌，得到洗過的沉澱。將沉澱重懸於0.1毫升無菌蒸餾水中，並將該重懸物塗布在573c培養基的瓊脂平板上。然後平板在60℃孵育1到3天以觀察單菌落，通過將它們在同樣條件下三次轉移至相同的瓊脂平板培養基上對其進行純化。對所獲的分離微生物編號，並指定為屬於「FJ」系列。例如，一個這樣的分離微生物被命名為EJ-21。
實施例2篩選用於從2-酮-L-古洛糖酸製備L-抗壞血酸的NA-和FJ-系列分離微生物通過以下活細胞反應系統進行從2-酮-L-古洛糖酸製備L-抗壞血酸的篩選。LM101型培養基、礦物質混合物[MM]、維生素混合物[VM]和胺基酸混合物[AM]的組成列於下表1。
表1表1a培養基(鹽基質)
a加入2-酮-L-古洛糖酸鈉一水化物後，用6N硫酸調節pH值b加入2-酮-L-古洛糖酸後，用6N氫氧化鉀調節pH值。表1b 表1c 表1d 將按實施例1中所述分離的NA和EJ系列嗜酸性耐熱微生物培養在573c瓊脂平板培養基上(pH3.5，60℃，15個小時)，然後接種在含有0.25％(w/v)D-葡萄糖的LM101c-plus[「plus」意為補充了MM(×1濃度)、VM(×0.1濃度)和AM(×0.01濃度)]培養基中。在試管中有氧培養(60℃，8小時)後，離心收集所獲細胞，重懸於LM101c鹽基質中(660納米處的光密度[OD660]為大約25)用作菌種細胞。按最終OD660為0.2的量將細胞接種在0.8毫升含6％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸鈉一水化物和0.2％(w/v)D-葡萄糖的LM101c-plus培養基(pH2.5)中。在59℃適度通氣條件下孵育所獲細胞反應混合液；將頂端帶有一個針孔(0.65毫米)的試管(2.0毫升微試管，Eppendorf，德國)在旋轉振蕩(120rpm，半徑為45毫米)下孵育。通過HPLC分析確定L-抗壞血酸的產量YMC-PackPolyamine II柱(ID.4.6×150毫米；YMC公司，日本)，在264納米處，流動相溶劑含70％(v/v)乙腈和15mM磷酸二氫銨，流速為1.5毫升/分鐘。按孵育期間減少的重量估計經蒸發丟失的水量，並加入補償的水量以保持原體積。經過23個小時的培養後，與「有氧空白」和「厭氧對照」兩個對照值比較每種菌株的L-抗壞血酸產量「有氧空白」是採用相同的培養基和條件但不接種細胞時所得到的L-抗壞血酸產量，「厭氧對照」是在一個帶氬氣的密閉微試管中採用相同的培養基但不接種細胞時所得到的L-抗壞血酸產量。作為篩選結果，選擇NA-20、NA-21和FJ-21菌株作為有效的L-抗壞血酸生產株；它們分別產生1.07、1.19和1.23克/升L-抗壞血酸。有氧空白和厭氧對照中L-抗壞血酸的量分別是0.10和0.30克/升。
除了用1.2％(w/v)2-酮-D-葡糖酸代替6％(w/v)2-酮L-古洛糖酸鈉一水化物作為底物外，按以上所述在相同條件下，用2-酮-D-葡糖酸(含有1.5mol/mol H2O的半鈣鹽(hemicalcium salt)，SIGMA化學公司，St.Louis，MO，USA)進行活細胞反應。L-異抗壞血酸的產量採用相同的HPLC分析方法確定。在培養23個小時後NA-21菌株產生0.051克/升D-異抗壞血酸。有氧空白和厭氧對照中D-異抗壞血酸的量均檢測不到(低於0.001克/升)。
實施例3所分離的微生物的分類所分離的三種微生物NA-20、NA-21和FJ-21是需氧、形成孢子的杆狀細菌，下表2中總結了這些分離物的表型特徵。
表2
a在573c瓊脂平板上生長20個小時這些微生物在pH3.0/60℃經20小時後表現出生長，但在pH3.0/30℃、pH6.5/30℃和pH6.5/60℃ 20小時後均未表現出生長。因此將它們定性為嗜酸性耐熱芽孢桿菌組細菌。脂肪酸的GC/MS分析表明，這三種分離的微生物的主要成分和所調查的作為對照的酸熱脂環酸桿菌DSM466T是一樣的，這提示ω-環己基脂肪酸是這三種分離微生物和酸熱脂環酸桿菌DSM 466T的主要成分。用16S rRNA基因試劑盒(PE AppliedBiosystems，USA；對於NA-20，NA-21和FJ-21菌株分別是SEQ ID NOs1、2和3)測定這些分離的微生物的16S rRNA基因序列，並用於BLAST檢索程序(分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)215，403-410，1990；核酸研究(Nucleic Acids Res.)25，3389-3402，1997)。採用核苷酸序列同源性程序(Genetyx-SV/R，4.0版本，Software Development公司，東京，日本)和默認條件(待比較的單位大小＝1)進行的序列相似性分析表明，這些分離的微生物在種系發生上可能屬於脂環酸桿菌屬。下表3顯示了這些分離的微生物和參考菌株(包括三種類型的菌株)之間16S rRNA基因序列中的兩兩序列一致性水平(％)。
表316S rRNA基因的一致性(％)
NA-20和NA-21的16S rRNA序列相互之間(99.7％)，以及和脂環酸桿菌屬UZ-1、MIH-2、KHA-31的序列(普通應用微生物學雜誌(J.Gen.Appl.Microbiol.)43，295-304，1997)以及脂環酸桿菌屬DSM 13652的序列(99.0-99.6％)之間最為相似。FJ-21的序列與酸熱脂環酸桿菌DSM446T、NA-20和NA-21的最相似(98.1-98.3％)。根據這些結果，將這三種分離的微生物歸於脂環酸桿菌屬，並分別命名為脂環酸桿菌屬NA-20、NA-21和EJ-21。
在如實施例2中所述的相同篩選條件下，脂環酸桿菌屬DSM 13652和13653分別從2-酮-L-古洛糖酸鈉一水化物產生0.91和0.95克/升L-抗壞血酸。
實施例4碳源/能源和通氧的影響在實施例2中所述的L-抗壞血酸製備方法中，採用含有0.2％(w/v)D-葡萄糖和6％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸鈉一水化物的培養基來維持細胞的生活。對採用脂環酸桿菌屬NA-21進行的該製備，代替D-葡萄糖加入D-葡糖酸-δ-內酯
、蔗糖
或可溶性澱粉[1％(w/v)]，結果導致幾乎同樣的L-抗壞血酸產量，但不加碳源/能源則不會導致超過有氧空白的額外產量(見表4)。
表4
a13個小時後從6％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸鈉一水化物產生的產量。
在實施例2中描述的L-抗壞血酸製備方法中，為了細胞的存活，在適度有氧條件下進行該製備。採用脂環酸桿菌屬NA-21，比較在有氧和厭氧條件下實施該方法的結果。處於一個完全密閉的微試管中的相同反應混合液在用氬氣氣化後用作厭氧條件下的系統。有氧條件在38小時內都給出近線性的產量產生，而厭氧條件甚至在15個小時後也未使該生產成為可能(見表5)。
表5有氧條件下L-抗壞血酸的產生(克/升)
厭氧條件下L-抗壞血酸的產生(克/升)
實施例5採用NA-21菌株或其衍生物製備L-抗壞血酸。
通過採用脂環酸桿菌屬NA-21，檢查從6％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸鈉一水化物進行的L-抗壞血酸製備。按實施例2所述的相同方法製備菌種細胞。按最終OD660為0.2的量將細胞接種在0.8毫升含有6％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸鈉一水化物和0.1％(w/v)D-葡萄糖的LM101c-plus(pH2.5)培養基中。在適度有氧條件下59℃孵育所獲細胞反應混合物；將頂端帶有針孔(0.65毫米)的試管旋轉振蕩(120rpm，45毫米半徑)孵育。由脂環酸桿菌屬NA-21.所產生的L-抗壞血酸產量線性持續了38小時，達到2.23克/升L-抗壞血酸。生產能力明顯比有氧空白和厭氧對照更為有效(見表6)。
表6OD660
pH
n.d.未測定L-抗壞血酸的產量(克/升)
通過常規突變，之後進行下述篩選步驟，從原始菌株脂環酸桿菌屬NA-21先後得到2個衍生物MA-10和MB-6。紫外輻射後，從原始菌株選擇對更高濃度的2-酮-L-古洛糖酸具有耐受性的菌株MA-10(在60℃pH2.5時從10％(w/v)明顯提高了大約1％(w/v))。隨後，在用N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍處理後，從MA-10選擇到對更高溫度具有耐受性的菌株MB-6(在11％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸和pH2.5時從60℃明顯提高了大約2℃)。通過上述相同的活細胞反應，在62℃和pH2.5下採用11％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸和含有0.5倍濃度的LM101d鹽基質、0.25％(w/v)D-葡萄糖、0.1倍濃度的MM、0.05倍濃度的VM和0.005倍濃度的AM的培養基，比較原始菌株、MA-10和MB-6的L-抗壞血酸生產能力。在第23個小時原始菌株、MA-10和MB-6分別生產2.02、2.22和2.80克/升L-抗壞血酸。有氧空白和厭氧對照分別生產1.63和1.94克/升L-抗壞血酸。
實施例6採用細胞和D-葡萄糖補料從8％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸製備L-抗壞血酸通過採用脂環酸桿菌屬NA-21，檢查採用細胞和D-葡萄糖補料從8％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸進行的L-抗壞血酸製備。按實施例2所述的相同方法製備菌種細胞。按最終OD660為0.25的量將細胞接種在0.8毫升含有8％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸和0.15％(w/v)D-葡萄糖的LM101d-plus(pH2.5)培養基中。在適度有氧條件下59℃孵育所獲細胞反應混合物；將頂端帶有針孔(0.65毫米)的試管旋轉振蕩(120rpm，45毫米半徑)孵育。作為點補料，在第24小時供應菌種細胞和D-葡萄糖(分別是0.25 OD660和0.15％(w/v)終濃度)。由脂環酸桿菌屬NA-21產生的L-抗壞血酸產量在47個小時之前線性持續增長，達到3.70克/升L-抗壞血酸(見表7)。
表7L-抗壞血酸的產量(克/升)
n.d.未測定另一方面，厭氧對照的產量在大約80個小時之後達到最大，約為2.5g/L L-抗壞血酸。
實施例7在有L-抗壞血酸時從8％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸進行的L-抗壞血酸製備通過採用脂環酸桿菌屬NA-21，檢查在有0-4.5克/升L-抗壞血酸時從8％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸進行的L-抗壞血酸製備。按實施例2所述的相同方法製備菌種細胞。按最終OD660為0.25的量將細胞接種在0.8毫升含有0.1倍濃度的MM而不是1倍濃度的MM以及8％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸和0.20％(w/v)D-葡萄糖的LM101d-plus(pH2.5)培養基中。在適度有氧條件下59℃孵育所獲細胞反應混合物；將頂端帶有針孔(0.65毫米)的試管旋轉振蕩(120rpm，45毫米半徑)孵育20小時。在第0小時(生產前)，向上述培養基加入0.0、1.1、2.3或4.5克/升L-抗壞血酸(產物)。脂環酸桿菌屬NA-21的生產能力在有和無該產物時近乎相同。另一方面，厭氧對照的生產能力逐漸被存在的較高濃度的該產物所抑制(見表8)。
表8來自0.0克/升的起始L-抗壞血酸
來自1.3克/升的起始L-抗壞血酸
來自2.5克/升的起始L-抗壞血酸
來自4.6克/升的起始L-抗壞血酸
*淨產量是指第20小時所積累的L-抗壞血酸量減去第0小時加入的L-抗壞血酸量。
序列表110Roche Vitamins AG120用於製備L-抗壞血酸和D-異抗壞血酸的微生物方法130脂環酸桿菌屬NA20，21，FJ21 16S nuc140141150EP Application No. 00118059.51512000-08-231603170PatentIn Ver. 2.121012111529212DNA213脂環酸桿菌屬220221rRNA222(1)..(1529)223NA-20的部份16SrRNA基因序列4001agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60gggtctcttc ggaggccagc ggcggacggg tgaggaacac gtgggtaatc tgcctttcag 120gccggaataa cgcccggaaa cgggcgctaa tgccggatac gcccgcgagg aggcatcttc 180ttgcggggga aggcccaatt gggccgctga gagaggagcc cgcggcgcat tagctngttg 240gcggggtaac ggcccaccaa ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gaccggccac 300actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa 360tgggcgcaag cctgacggag caacgccgcg tgagcgaaga aggccttcgg gttgtaaagc 420tctgttgctc ggggagagcg gcatggggga tggaaagccc catgcgagac ggtaccgagt 480gaggaagccc cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa aacgtagggg gcgagcgttg 540tccggaatca ctgggcgtaa agggtgcgta ggcggtcgag caagtctgga gtgaaagtcc 600atggctcaac catgggatgg ctttggaaac tgcttgactt gagtgctgga gaggcaaggg 660gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaataccagt ggcgaaggcg 720ccttgctgga cagtgactga cgctgaggca cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat 780accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaggtgt tggggggaca caccccagtg 840ccgaaggaaa cccaataagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa 900ggaattgacg ggggcccgca caagcagtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 960gaaccttacc agggcttgac atccctctga cacnctcaga gatgaggggt cccttcgggg 1020cagaggagac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttcagt 1080cccgcaacga gcgcaaccct tgacctgtgt taccagcgcg ttgaggcggg gactcacagg 1140tgactgccgg cgtaagtcgg aggaaggcgg ggatgacgtc aaatcatcat gcccctgatg 1200tcgtgggcta cacacgtgct acaatgggcg gaacaaaggg aggcgaagcc gcgaggcgga 1260gcgaaaccca aaaagccgct cgtagttcgg attgcaggct gcaactcgcc tgcatgaagc 1320cggaattgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1380acaccgcccg tcacaccacg agagtcggca acacccgaag tcggtgaggt aacccctnng 1440gggagccagc cgccgaaggt ggggtcgatg attggggtga agtcgtaaca aggtagccgt 1500accggaaggt gcggctggat cacctcctt 152921022111529212DNA213脂環酸桿菌屬220221rRNA222(1)..(1529)223NA21的部份16SrRNA基因4002agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60gggtctcttc ggaggccagc ggcggacggg tgaggaacac gtgggtaatc tgcctttcag 120gccggaataa cgcccggaaa cgggcgctaa tgccggatac gcccgcgagg aggcatcttc 180ttgcggggga aggcccaatt gggccactga gagaggagcc cgcggcgcat tagctngttg 240gcggggtaac ggcccaccaa ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gaccggccac 300actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa 360tgggcgcaag cctgacggag caacgccgcg tgagcgaaga aggccttcgg gttgtaaagc 420tctgttgctc ggggagagcg gcatggggga tggaaagccc catgcgagac ggtaccgagt 480gaggaagccc cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa aacgtagggg gcgagcgttg 540tccggaatca ctgggcgtaa agggtgcgta ggcggtcgag caagtctgga gtgaaagtcc 600atggctcaac catgggatgg ctttggaaac tgcttgactt gagtgctgga gaggcaaggg 660gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaataccagt ggcgaaggcg 720ccttgctgga cagtgactga cgctgaggca cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat 780accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaggtgt tggggggaca caccccagtg 840ccgaaggaaa cccaataagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa 900ggaattgacg ggggcccgca caagcagtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 960gaaccttacc agggcttgac atccctctga caccctcaga gatgaggggt cccttcgggg 1020cagaggagac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttcagt 1080cccgcaacga gcgcaaccct tgacctgtgt taccagcgcg ttgaggcggg gactcacagg 1140tgactgccgg cgtaagtcgg aggaaggcgg ggatgacgtc aaatcatcat gcccctgatg 1200tcctgggcta cacacgtgct acaatgggcg gaacaaaggg aggcgaagcc gcgaggcgga 1260gcgaaaccca aaaagccgct cgtagttcgg attgcaggct gcaactcgcc tgcatgaagc 1320cggaattgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1380acaccgcccg tcacaccacg agagtcggca acacccgaag tcggtgaggt aaccccttag 1440gggagccagc cgccgaaggt ggggtcgatg attggggtga agtcgtaaca aggtagccgt 1500accggaaggt gcggctggat cacctcctt 152921032111495212DNA213脂環酸桿菌屬220221rRNA222(1)..(1495)223FJ-21的部份16SrRNA基因序列4003aggacgaacg ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga gcggacctct tctgaggtca 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aagcaacgcg aagaacctta ccagggcttg 960acatccctct gacgggtgca gagatgcacc ttcccttcgg ggcagaggag acaggtggtg 1020catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttca gtcccgcaac gagcgcaacc 1080cttgacctgt gttaccagcg cgntanggcg gggactcaca ggtgactgcc ggcgtaagtc 1140ggaggaaggc ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctga tgtcctgggc tacacacgtg 1200ctacaatggg cggtacaaag ggaggcgaag ccgcgaggcg gagcgaaacc caaaaagccg 1260ctcgtagttc ggattgcagg ctgcaactcg cctgcatgaa gccggaattg ctagtaatcg 1320cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380cgagagtcgg caacacccga agtcggtgag gtaaccccga aaggggagcc agccgccgaa 1440ggtggggtcg atgattgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtaccggaa ggtgc 149權利要求
1.用於從2-酮-L-古洛糖酸或其鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽產生L-抗壞血酸或其鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽，或從2-酮-D-葡糖酸或其鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽產生D-異抗壞血酸或其鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽的方法，包括在大約30℃至大約100℃的溫度和大約1至大約6的pH條件下於溶液中將各自為游離酸或其鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽形式的2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸與嗜酸性耐熱微生物細胞一起孵育，以形成L-抗壞血酸或D-異抗壞血酸或它們的適合鹽，然後從該溶液中分離所述的L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸或它們的適合鹽。
2.根據權利要求1的方法，其中該嗜酸性耐熱微生物是從原核生物分離的。
3.根據權利要求2的方法，其中從其中分離到該嗜酸性耐熱微生物的原核生物被歸類為細菌。
4.根據權利要求3的方法，其中該嗜酸性耐熱微生物屬於脂環酸桿菌屬細菌。
5.根據權利要求4的方法，其中脂環酸桿菌屬的該嗜酸性耐熱微生物是脂環酸桿菌屬DSM 13652、DSM 13653、NA-20(DSM 13649)、NA-21(DSM13650)或FJ-21(DSM 13651)或它們各自的突變體。
6.根據權利要求4的方法，其中脂環酸桿菌屬的該嗜酸性耐熱微生物是具有脂環酸桿菌屬DSM 13652、DSM 13653、NA-20(DSM 13649)、NA-21(DSM 13650)或FJ-21(DSM 13651)的鑑別特徵的生物學和分類學上均等的培養物。
7.根據權利要求1-6之任意一項的方法，其中所述溶液含有水作為溶劑。
8.根據權利要求1-7之任意一項的方法，其中所述孵育在有氧條件下進行。
9.根據權利要求1-8之任意一項的方法，其中所述孵育在有氧條件下並存在營養物時進行。
10.根據權利要求1-9之任意一項的方法，其中在所述溶液中底物2-酮-L-古洛糖酸、2-酮-D-葡糖酸或它們各自的鈉、鉀或鈣鹽的濃度，基於游離酸的量，是從大約5％(w/v)到大約20(w/v)，優選從大約10％(w/v)到大約15％(w/v)。
11.根據權利要求1-10之任意一項的方法，其中所述孵育在大約40至大約95℃、優選大約55至大約95℃的溫度下進行。
12.根據權利要求1-11之任意一項的方法，其中所述孵育在大約1.0至大約4.5、優選大約1.5至大約3.0的pH時進行。
13.脂環酸桿菌屬NA-20(DSM 13649)、脂環酸桿菌屬NA-21(DSM13650)和脂環酸桿菌屬FJ-21(DSM 13651)。
14.產生L-抗壞血酸或其鹽或D-異抗壞血酸或其鹽的具有以下特徵的微生物a.當採用Genetyx-SV/R軟體程序時，與SEQ ID NOs1、2或3至少98.1％一致的rDNA序列；b.杆狀形態；c.寬度為大約0.8微米；d.不能在厭氧條件下生長；e.表現出過氧化氫酶活性；f.其主要的脂肪酸是ω-環己基酸；g.能在pH3.0和60℃的溫度下生長；h.不能在下述條件下生長pH 溫度3.030℃6.560℃6.530℃i.能夠(1)從2-酮-L-古洛糖酸或其鹽產生L-抗壞血酸或其鹽，(2)從2-酮-D-葡糖酸或其鹽產生D-異抗壞血酸或其鹽，或(3)分別從2-酮-L-古洛糖酸或其鹽和2-酮-D-葡糖酸或其鹽產生L-抗壞血酸或其鹽和D-異抗壞血酸或其鹽。
全文摘要
本發明提供用於從2－酮－L－古洛糖酸或2－酮－D－葡糖酸或它們各自的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽製備L－抗壞血酸或D－異抗壞血酸或它們各自的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽的方法,該方法涉及在大約30℃－大約100℃的溫度和大約1－大約6的pH條件下於溶液中將各自為游離酸或其鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽形式的2－酮－L－古洛糖酸或2－酮－D－葡糖酸與嗜酸性耐熱微生物細胞一起孵育,以形成L－抗壞血酸或D－異抗壞血酸或它們的適合鹽,然後從該溶液中分離所述產物。L－抗壞血酸(維生素C)被廣泛應用於醫療保健和食品、動物飼料如魚料和化妝品中。D－異抗壞血酸主要作為抗氧化劑用作食品添加劑。
文檔編號C12R1/01GK1351171SQ01125728
公開日2002年5月29日 申請日期2001年8月23日 優先權日2000年8月23日
發明者淺倉光, 星野立夫, 晉如聖子 申請人:羅切維他命股份公司