一種棉花病害生物防治方法與流程
2023-12-12 16:05:07 1
本發明涉及棉花病蟲害防治技術領域，尤其涉及一種棉花病害生物防治方法。
背景技術：
植物病害是影響我國農業生產的最主要的因素，對生產生活產生嚴重的威脅。棉花是我國較為重要的經濟作物，但是隨著棉花病害的威脅逐漸增加，帶來了嚴重的經濟損失。全國每年因病害的損失價值達到數十億。棉花的病害的種類多種多樣，無論是在幼苗期、成長期還是成熟期都有相應的病害發生。當棉花的幼苗成株時，在這期間最容易出現的主要是枯萎病和黃萎病。為了減少病害降低經濟損失，農民開始大量的使用化學農藥，雖然得到了一定的效果，但是由於化學農藥的大量使用，對環境產生的汙染也就逐漸嚴重。因此科研人員開始尋一種對人類和環境無害並具良好防治效果的新的植物病蟲害防治策略。
國家知識產權局於2015年8月26日公布的一篇專利申請號為201510191999.7，名稱：一種華南地區棉花苗期的病害防治方法，此專利提出如下技術方案：首先將棉種進行消毒處理，將土壤消毒劑加入消毒後的棉種中並攪拌均勻，將攪拌均勻的棉種播撒在田間，待棉種出苗後及時噴灑農藥。化學防治方法存在如下的技術問題：其一，在防止時期，向棉苗長期噴灑化學藥劑，一方面使病原菌產生了嚴重的抗逆性，導致噴灑的化學藥劑毫無效果，另一方面噴灑的大量化學藥劑汙染了環境，不利於環保；其二，該化學藥劑中含有大量的重金屬，會對土壤和水資源造成重金屬汙染。這兩個問題大大限制了該防治方法的使用範圍，因此，該防治方法難以在棉花病蟲害防治領域推廣和使用。
傳統的防治方法大多是噴灑化學藥劑，雖然達到了一定的效果，但是病原菌產生了嚴重的抗逆性，這樣不但效果沒了而且也嚴重汙染了環境。因此，科研人員開始尋一種對人類和環境無害並具良好防治效果的新的植物病蟲害防治策略。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是提供一種對環境無汙染、防止效果良好且成本低的棉花病害生物防治方法。本發明通過發酵培養甲基營養芽孢桿菌，並結合整體的製備方法來實現對棉花的生物防治，從而不會對環境造成汙染。
為了解決上述技術問題,本發明提供了一種棉花病害生物防治方法，具體步驟如下：
(1)選取籽粒飽滿、純度高的棉種置於45～50℃的水中浸泡3～4h，並上下攪拌均勻，棉種與水的重量比為1：2～3；
(2)將步驟(1)中浸泡完成的棉種撈起晾乾後播種在裝有營養土的盆中，並澆適量的水保持營養土溼潤；
(3)移取50μL的甲基營養芽孢桿菌置於100mL的液體LB培養基中，將LB培養基在轉速為100～200r/min、溫度為35～40℃的條件下，搖床培養20～30h，即得菌懸液；
(4)移取步驟(3)中所製備的菌懸液置於無菌的離心管中，用滅菌後的牙籤蘸取離心管中的菌液在LB平板上「之」字劃線，並將LB平板置於37℃的恆溫培養箱中培養12～20h，即得單菌落；
(5)用接種環挑取步驟(4)中所製備的單菌落置於裝有100～200mL搖瓶發酵培養基的三角瓶中，三角瓶在溫度為37℃的條件下搖床發酵24～36h，即得發酵液；
(6)量取步驟(5)中所製備的發酵液置於離心管中，離心管在轉速為8000r/min的條件下離心20～30min，即得上清液和沉澱，除去沉澱，即得上清液；將上清液用超濾膜過濾，即得甲基營養芽孢桿菌發酵液，備用；
(7)待步驟(2)中棉種發芽後棉苗長至15～20cm時，將步驟(6)中所製備的甲基營養芽孢桿菌發酵液噴灑在棉苗上，其後適量澆水，保持盆土溼潤。
進一步地，所述步驟(2)中營養土的成分為泥炭、椰糠、珍珠巖和控釋肥。
進一步地，所述營養土的體積佔盆容積的3/4。
進一步地，所述步驟(3)中LB培養基的成分及配比：氯化鈉1g、蛋白腖1g、酵母菌0.5g、瓊脂1.7g、去離子水100mL。
進一步地，所述步驟(6)中採用截留分子量為100～120kDa的超濾膜。
與現有技術相比，本發明所達到的有益效果：
(1)本發明中使用甲基營養芽孢桿菌進行發酵培養，該菌種對人畜無害、對環境友好、具有較強的抗逆性且繁殖速度快等優點，因此具有良好的應用前景；本發明中甲基營養芽孢桿菌在生長過程中產生的細胞壁降解酶類、細菌素類、抗生素類等抗菌活性物質可以抑制病原微生物活動使其失活，不會對環境造成汙染，有利於環保，因此，該防止方法具有良好的防治效果，從而保證棉苗的健康生長。
(2)本發明中將甲基營養芽孢桿菌發酵液噴灑在棉苗上，該菌種還能產生類似細胞分裂素、植物生長激素等物質，促進棉花的生長，從而提高棉花的產量，增加種植戶的經濟效益。
(3)本發明中採用甲基營養芽孢桿菌進行生物防治，一方面避免了化學藥劑對人畜的危害，另一方促進了環境生態平衡，實現了農業的可持續發展，該防治方法適合在種植領域推廣和使用。
(4)本發明中營養土的成分為泥炭、椰糠、珍珠巖和控釋肥，該營養土具有良好的保肥性、持水性和透氣性以及適合根系生長的pH值，該營養土可以改善土壤理化性狀和微生物環境，促進棉花的正常生長及發育，從而增加種植戶的經濟效益；本發明中採用截留分子量為100～120kDa的超濾膜，採用該超濾膜可以濾去殘餘菌體，從而保證了甲基營養芽孢桿菌發酵液的純度。
綜上所述，本發明中的防治方法對人畜無害，也不會汙染環境，促進了農業的可持續發展，適合在棉花病害防治領域推廣和使用。
具體實施方式
以下實施例僅用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
實施例1
一種棉花病害生物防治方法，具體步驟如下：
(1)選取籽粒飽滿、純度高的棉種置於45℃的水中浸泡3h，並上下攪拌均勻，棉種與水的重量比為1：2；
(2)將步驟(1)中浸泡完成的棉種撈起晾乾後播種在裝有營養土的盆中，並澆適量的水保持營養土溼潤；
(3)移取50μL的甲基營養芽孢桿菌置於100mL的液體LB培養基中，將LB培養基在轉速為100r/min、溫度為35℃的條件下，搖床培養20h，即得菌懸液；
(4)移取步驟(3)中所製備的菌懸液置於無菌的離心管中，用滅菌後的牙籤蘸取離心管中的菌液在LB平板上「之」字劃線，並將LB平板置於37℃的恆溫培養箱中培養12h，即得單菌落；
(5)用接種環挑取步驟(4)中所製備的單菌落置於裝有100mL搖瓶發酵培養基的三角瓶中，三角瓶在溫度為37℃的條件下搖床發酵24h，即得發酵液；
(6)量取步驟(5)中所製備的發酵液置於離心管中，離心管在轉速為8000r/min的條件下離心20min，即得上清液和沉澱，除去沉澱，即得上清液；將上清液用超濾膜過濾，即得甲基營養芽孢桿菌發酵液，備用；
(7)待步驟(2)中棉種發芽後棉苗長至15cm時，將步驟(6)中所製備的甲基營養芽孢桿菌發酵液噴灑在棉苗上，其後適量澆水，保持盆土溼潤。
在本實施例中，所述步驟(2)中營養土的成分為泥炭、椰糠、珍珠巖和控釋肥。
在本實施例中，所述營養土的體積佔盆容積的3/4。
在本實施例中，所述步驟(3)中LB培養基的成分及配比：氯化鈉1g、蛋白腖1g、酵母菌0.5g、瓊脂1.7g、去離子水100mL。
在本實施例中，所述步驟(6)中採用截留分子量為100kDa的超濾膜。
實施例2
一種棉花病害生物防治方法，具體步驟如下：
(1)選取籽粒飽滿、純度高的棉種置於50℃的水中浸泡4h，並上下攪拌均勻，棉種與水的重量比為1：2.5；
(2)將步驟(1)中浸泡完成的棉種撈起晾乾後播種在裝有營養土的盆中，並澆適量的水保持營養土溼潤；
(3)移取50μL的甲基營養芽孢桿菌置於100mL的液體LB培養基中，將LB培養基在轉速為150r/min、溫度為40℃的條件下，搖床培養25h，即得菌懸液；
(4)移取步驟(3)中所製備的菌懸液置於無菌的離心管中，用滅菌後的牙籤蘸取離心管中的菌液在LB平板上「之」字劃線，並將LB平板置於37℃的恆溫培養箱中培養18h，即得單菌落；
(5)用接種環挑取步驟(4)中所製備的單菌落置於裝有150mL搖瓶發酵培養基的三角瓶中，三角瓶在溫度為37℃的條件下搖床發酵30h，即得發酵液；
(6)量取步驟(5)中所製備的發酵液置於離心管中，離心管在轉速為8000r/min的條件下離心25min，即得上清液和沉澱，除去沉澱，即得上清液；將上清液用超濾膜過濾，即得甲基營養芽孢桿菌發酵液，備用；
(7)待步驟(2)中棉種發芽後棉苗長至20cm時，將步驟(6)中所製備的甲基營養芽孢桿菌發酵液噴灑在棉苗上，其後適量澆水，保持盆土溼潤。
在本實施例中，所述步驟(2)中營養土的成分為泥炭、椰糠、珍珠巖和控釋肥。
在本實施例中，所述營養土的體積佔盆容積的3/4。
在本實施例中，所述步驟(3)中LB培養基的成分及配比：氯化鈉1g、蛋白腖1g、酵母菌0.5g、瓊脂1.7g、去離子水100mL。
在本實施例中，所述步驟(6)中採用截留分子量為110kDa的超濾膜。
實施例3
一種棉花病害生物防治方法,具體步驟如下：
(1)選取籽粒飽滿、純度高的棉種置於50℃的水中浸泡4h，並上下攪拌均勻，棉種與水的重量比為1：3；
(2)將步驟(1)中浸泡完成的棉種撈起晾乾後播種在裝有營養土的盆中，並澆適量的水保持營養土溼潤；
(3)移取50μL的甲基營養芽孢桿菌置於100mL的液體LB培養基中，將LB培養基在轉速為200r/min、溫度為40℃的條件下，搖床培養30h，即得菌懸液；
(4)移取步驟(3)中所製備的菌懸液置於無菌的離心管中，用滅菌後的牙籤蘸取離心管中的菌液在LB平板上「之」字劃線，並將LB平板置於37℃的恆溫培養箱中培養20h，即得單菌落；
(5)用接種環挑取步驟(4)中所製備的單菌落置於裝有200mL搖瓶發酵培養基的三角瓶中，三角瓶在溫度為37℃的條件下搖床發酵36h，即得發酵液；
(6)量取步驟(5)中所製備的發酵液置於離心管中，離心管在轉速為8000r/min的條件下離心30min，即得上清液和沉澱，除去沉澱，即得上清液；將上清液用超濾膜過濾，即得甲基營養芽孢桿菌發酵液，備用；
(7)待步驟(2)中棉種發芽後棉苗長至20cm時，將步驟(6)中所製備的甲基營養芽孢桿菌發酵液噴灑在棉苗上，其後適量澆水，保持盆土溼潤。
在本實施例中，所述步驟(2)中營養土的成分為泥炭、椰糠、珍珠巖和控釋肥。
在本實施例中，所述營養土的體積佔盆容積的3/4。
在本實施例中，所述步驟(3)中LB培養基的成分及配比：氯化鈉1g、蛋白腖1g、酵母菌0.5g、瓊脂1.7g、去離子水100mL。
在本實施例中，所述步驟(6)中採用截留分子量為120kDa的超濾膜。
實驗結果
以實施例1所製備的甲基營養芽孢桿菌發酵液，做藥效總結如下：
1、病例選擇
選取感染棉花立枯病、棉花黃萎病的棉苗200株，將200株棉苗分為對照組100株和實驗組100株。
2、藥物選擇
對照組在棉苗長至15～20cm時，向感染棉花立枯病、棉花黃萎病的棉苗噴灑70％甲基託布津可溼性粉劑，觀察棉苗的生長狀況，並做好相關記錄。
實驗組在棉苗長至15～20cm時，向感染棉花立枯病、棉花黃萎病的棉苗噴灑噴灑實施例1中製備的甲基營養芽孢桿菌發酵液，觀察棉苗的生長狀況，並做好相關記錄。
3、判斷標準
0級：棉苗恢復正常。
1級：1～2片葉子局部發病。
2級：子葉及1～2片真葉局部發病。
3級：真葉發病或脫落僅剩新葉。
4級：棉苗枯死。
4、結果
對照組中有15株棉苗恢復正常，50株棉苗真葉發病，35株棉苗枯死；實驗組中61株棉苗恢復正常，30株棉苗的葉子局部發病，9株棉苗枯死。
以上結果顯示，本實施例1製備的甲基營養芽孢桿菌發酵液對棉花立枯病、棉花黃萎病均有良好的防止效果且防止效果達到91％，該防止方法對環境無汙染，適合在種植領域推廣和應用。
綜上所述，上述實施方式並非是本發明的限制性實施方式，凡本領域的技術人員在本發明的實質內容的基礎上所進行的修飾或者等效變形，均在本發明的技術範疇。