高免疫抑制活性的水溶性雷公藤內酯醇衍生物及其應用的製作方法

2023-12-12 04:36:02 1

專利名稱：高免疫抑制活性的水溶性雷公藤內酯醇衍生物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及藥物化學領域，更具體地，本發明涉及具有高免疫抑制活性的水溶性雷公藤內酯醇(triptolide)衍生物，其製備方法和這些衍生物在治療與免疫抑制有關的疾病中的用途。
背景技術：
免疫抑制因子被廣泛應用於治療類風溼性關節炎，哮喘，系統紅斑狼瘡(SLE)，牛皮癬，多重硬皮症，動脈粥樣硬化，腎炎，I-型糖尿病等自動免疫缺陷疾病和與免疫相關的炎症。免疫抑制因子也是目前解決器官移植後異體排斥的最有效治療手段。最常用的免疫抑制因子有硝基咪脞硫嘌呤(azathyopurine)，皮質甾酮(corticosterroids)，氨甲喋呤(methotrexate)，環磷醯胺(cyclophospamide)，6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)，長春新鹼(vincristine)，西樂葆(celebrox)，環孢菌素A(cyclosporine A)，FK506等。但是這些藥物並非都是完全有效，大多數都伴有較高毒性。
免疫抑制的活性與免疫系統地T，B細胞密切相關。T，B細胞分泌產生多種細胞因子。每種細胞因子都有其特定的生理功能，因而其所反映的醫療領域也不盡相同。簡單的檢測某種化合物對T，B細胞的抑制程度來判斷此化合物的免疫抑制活性的高低是不充分的。相反，對T，B細胞的抑制程度目前常被用來檢測一個化合物細胞毒性。例如，同是免疫抑制因子的環孢菌素A和氨甲喋呤抑制的細胞因子不同，環孢菌素A主要抑制白介II(IL-2)，對白介I(IL-I)抑制作用很弱，其主要臨床應用是防止器官移植後異體排斥。而氨甲喋呤對IL-II的抑制作用較弱，但對IL-I有較強的抑制作用，主要用於與免疫抑制有關的炎症，如類風溼性關節炎。雖然目前已發現的細胞因子多達數十種，大多數的細胞因子的生理功能仍然不清楚，但IL-1，IL-2，IL-6，TNF，iNOS等細胞因子在免疫調節中的生理功能以及與治療領域的相關性比較清楚。因此在做動物試驗之前能就化合物對這些細胞因子的作用進行研究，對以後的動物試驗的目標和實驗方案的制定有指導意義。
中國藥用植物雷公藤已被證明具有很強的免疫抑制活性。其粗提物(如市上有售的雷公藤多甙片)已被臨床用於治療類風溼性關節炎，哮喘，系統紅斑狼瘡(SLE)，牛皮癬等自動免疫缺陷疾病。用雷公藤中提取的化合物雷公藤內酯醇(triptolide)做防止器官移植後異體排斥的研究也表明其活性接近於環孢菌素A。雷公藤植物的顯著免疫抑制活性引起國內外相關實驗室的注意，並進行了多方面的研究。其研究領域涉及以下方面
1.從雷公藤植物中分離提純有效的免疫調節化合物。迄今已從雷公藤植物中分離得到100種以上的化合物。如雷公藤內酯醇(triptolide)，16-羥基雷公藤內酯醇，山海棠素(triptophenolide)，雷公藤乙素(tripdiolide)，雷公藤氯內酯醇(tripchorolide)等化合物。其中對雷公藤內酯醇的免疫調節和抗腫瘤活性研究較多。由於雷公藤內酯醇的免疫抑制活性最高，在植物中的含量相對較高，可作結構改造的位點較多，因而得到較廣泛的研究。
2.對有高免疫抑制活性的雷公藤內酯醇作化學結構改造，以降低先導化合物雷公藤內酯醇的毒性。圍繞這方面的研究工作已有如下專利和文章發表美國專利(US Patent)6,150,539，6,004,999，5,972,998，5,962,516，和5,663.335；PCT專利申請WO 00/12483；中國專利CN1027371C，ZL專利號89106941.0。
3.天然產物雷公藤內酯醇的化學全合成Yang D等，有機化學(J.Org.Chem.)2000 Apr.7；65(7)2208-17。
4.用細胞培養法生產天然產物雷公藤內酯醇美國專利US Patent4,328,309。
雖然雷公藤內酯醇的免疫抑制活性相當高，但由於如下缺點限制了它的臨床應用1.毒性高，其LD50為0.85mg/kg體重，並有生殖毒性。2.水溶解性低，無法作靜脈(iv)注射。3.細胞膜通透性(permeability)低(我們未發表實驗結果)，口服效果不好。
圍繞這些問題，一些實驗室對雷公藤內酯醇的化學結構改造做了一系列工作。其中US Patent 5,962,516中的14-丁二酸酐雷公藤內酯醇提高了水溶解性。US Patent 6,150,539的8-羥基雷公藤內酯醇和PCT專利申請WO00/63212的12-硫氫酸基雷公藤內酯醇都在保持原有化合物活性同時，在降低先導化合物雷公藤內酯醇的毒性方面取得成功。其中12-硫氫酸基雷公藤內酯醇的LD50為74mg/kg體重，其毒性比先導化合物雷公藤內酯醇的LD50為0.85mg/kg體重降低了約87倍。但這些從雷公藤內酯醇衍生而來的類似物的水溶性仍然很低，細胞膜通透性也低。
PCT專利申請WO 02/28862提供了水溶性雷公藤內酯醇衍生物的一些信息。US Patent 6,150,539給出了一些水溶性的雷公藤內酯醇衍生物，但沒有給出這些水溶性的雷公藤內酯醇衍生物的免疫抑制活性實驗數據。目前我們所看到的已發表的資料中具有水溶性好，又有高免疫抑制活性的水溶性的雷公藤內酯醇衍生物仍以US Patent 5,962,516中的14-丁二酸酐雷公藤內酯醇為好，其在抗腫瘤和器官移植中的應用見諸於美國專利(US Patent United States Patent)6,329,148和移植(Transplantation)2000 Nov 27；70(10)1442-7。
發明概述
本發明的第一個方面是提供了三類具有水溶性和免疫抑制活性的新型雷公藤內酯醇衍生物化學結構
第I類雷公藤內酯醇衍生物是
結構式I
其中R1是H，磷酸酯
或亞磷酸酯
。在本發明的第I類化合物中，優選R1是磷酯
，X1和X2是Na。
第II類雷公藤內酯醇衍生物是
結構式II
其中R1是H，含有1-4個碳原子的烷基，或-AC，或-C(＝O)(CH2)nCO2，(其中，n為1-4的整數)，或磷酸酯
，或亞磷酸酯
。X1和X2是Na，或K，或NH4.R2是H，或-SCN或-Cl(或-Br)。在本發明的第II類化合物中，優選R1是磷酸酯
和丁二酸酐[-C(＝O)(CH2)4CO2]，X1和X2是Na，R2是-SCN。
第III類雷公藤內酯醇衍生物是
或
結構式IIIa 結構式IIIb
其中R2是H，或-SCN，或-Cl，或-Br。
本發明的另一個目的是提供合成生產這些水溶性高的雷公藤內酯醇新衍生物的合成方法。具體來說從下述兩種先導化合物製備上述三類水溶性雷公藤內酯醇衍生物的方法(詳細方法見實例1-7)。
第一種先導化合物是雷公藤內酯醇
雷公藤內酯醇(T)
美國專利(US Patent 5,962,516)描述了從雷公藤內酯醇製備14-丁二酸酐雷公藤內酯醇及其鈉鹽的方法，但本專利所發明的磷醯化製備的雷公藤內酯-14-β-磷酸二鈉具有更高的水溶解性。
第二種先導化合物是12-β-硫氰酸基-13-α-羥基雷公藤內酯醇(12-β-thiocyano-13-α-hydroxy triptolide)
12-β-硫氰酸基-13-α-羥基雷公藤內酯醇(T-SCN)
本發明的又一個目的是提供這些水溶性高的雷公藤內酯醇新衍生物免疫抑制活性的分子生物學證據(實施例8，9)。證明了這些雷公藤內酯醇新衍生物顯著抑制了細胞因子IL-1，IL-2，IL-6，iNOS的產生以及顯著抑制了Cox-2的產生。
本發明的又一個目的是提供這些水溶性高的雷公藤內酯醇新衍生物低毒性的動物實驗證據(實施例10)。本發明由T-SCN而製備的水溶性雷公藤內酯醇衍生物的毒性顯著降低，例如12-β-硫氰酸基雷公藤內酯-13-β-14-α-磷酸鈉的LD50為126mg/kg體重，其毒性大大低於雷公藤內酯醇的LD50(0.85mg/kg體重)，而且其免疫抑制活性也相當高。
本發明的又一個目的是提供這些水溶性高的雷公藤內酯醇新衍生物治療自動免疫缺陷疾病的動物實驗證據。例如在對DNC引起小鼠遲發性超敏反應的影響實驗(實施例11)和大鼠棉球肉芽腫法抗炎試驗(實施例12)中WDY系列雷公藤內酯醇新衍生物均有顯著的免疫抑制活性和抗炎活性。


圖1本發明的水溶性雷公藤內酯醇衍生物對IL-2的作用(medium空白對照，PHA脂多糖，CsA環胞菌素A)。
圖2本發明的水溶性雷公藤內酯醇衍生物對IL-1，IL-6，iNOS的作用(medium空白對照，PHA脂多糖，CsA環胞菌素A)。
圖3本發明的水溶性雷公藤內酯醇衍生物對HT-29細胞PGE2含量(pg/ml)的影響(對照＝22.93pg/ml，消炎痛(indo)＝1.3pg/ml，WDY4＝4.22pg/ml，WDY7＝4.97pg/ml)。
在以下的12個實施例中將對本發明作詳細說明。實施例112-β-硫氰酸基雷公藤內酯-13-α-14-β-磷酸鈉(以下簡稱WDY1)的製備
在氮氣保護下，三頸瓶中加251mg T-SCN(0.600mmol)，再加入20ml吡啶，加入0.28mlPOCl3(3.000mmol)，最後加入40mgDMAP，密封，室溫反應24小時後，用冰浴冷卻水解，調節PH到8。減壓濃縮至幹，用乙腈溶解樣品，除去無機鹽。TLC檢測正丁醇∶水∶冰醋酸(10∶1∶1)展開，主點為產物點WDY1，含有極少量T-SCN和其它副產物。乙腈溶解，加入2g 75～300目矽膠拌樣，除盡乙腈，75～300目矽膠柱層析分離，正丁醇∶水(20∶1)TLC跟蹤檢測，收集產物點，合併，減壓蒸除溶劑，加少量溶劑用乙醚沉澱，靜置一小時後，過濾得到粉狀固體，用乾燥槍乾燥，收率為75％.水溶解度大於100mg/ml.Rf值為0.24，(正丁醇/水/冰醋酸10∶1∶1)，顯色劑為Kedd’s試劑，呈紫紅色。MS ESI+m/zC21H23NSO8PNa計算值504.0858，測量值504.0857。MS ESI-m/zC21H23NSO8P計算值480.0877，測量值480.0888。IR(KBr)cm-13417，2938，2156，1749，1674，1247，1109，10001HNMR，δppm0.84(3H，s，18-CH3)，1.01(3H，d，J＝6Hz，16-CH3)，1.04(3H，s，17-CH3)，1.34(1H，m，1-αH)，1.46(1H，m，1-βH)，1.80(1m，t，J＝14.4Hz，6-βH)，1.94(1H，m，2-H)，2.13(1H，m，2-H)，2.20(1H，m，6-αH)，2.35(1H，m，15-H)，3.09(1H，m，5-H)，3.51(1H，br，7-H)，3.71(1H，s，12-H)，4.25(1H，br，11-H)，4.61(1H，br，14-H)，4.85(2H，dd，J1＝36Hz，J2＝17.2Hz，19-H)；
13CNMR，δppm15.4(18-C)，17(2-C)，19.2(16-C)，20(17-C)，21.8(6-C)，29.5(1-C)，32.7(15-C)，35.0(10-C)，39(5-C)，55.7(11-C)，56.0，56.2(8-C)，56.7(7-C)，62.5(12-C)，66.0(9-C)，70.8(19-C)，77.5(14-C)，83.7(13-C)，112(SCN)，123(3-C)，163(4-C)，173.6(20-C)。
31PNMR，δppm4.57.實施例212-β-硫氰酸基-13-α-羥基雷公藤內酯-14-β-丁二酸單酯(以下簡稱WDY6)的製備
室溫下，向50ml的三頸瓶中加入80mg12-β-硫氰酸基-13-α-14-β-羥基雷公藤內酯醇(T-SCN)(0.191mmol)，8ml吡啶，加入4ml DMF和24mgDMAP，最後加入3.2g丁二酸酐(3.820mmol)，密封攪拌反應一周後，將反應液倒入冰水中，用二氯甲烷抽提數次，合併二氯甲烷，TLC檢查氯仿∶甲醇(10∶1)，主點為WDY6和極少量未反應的12-β-硫氰酸基-13-α-14-β-羥基雷公藤內酯醇。減壓濃縮，蒸乾溶劑，用H矽膠，氯仿∶甲醇(14∶1)柱層析得純品。收率為90％。Rf0.30。熔點為127-129℃。水溶解度大於30mg/ml。
元素分析C25H29SNO9，計算值％C，57.79。H，5.63。N，2.70。實測值％C，57.66.H，5.91.N，3.05.
IR3435，2970，2152，1745，1673，1157，1022，993。
1HNMR，δppm0.79(3H，d，J＝6.4Hz，16-CH3)，0.89(3H，s，18-CH3)，0.97(3H，d，J＝6.4Hz，17-CH3)，1.29(1H，m，1-αH)，1.44(1H，m，1-βH)，1.83(1m，t，J＝14.4Hz，6-βH)，1.95(1H，m，15-H)，1.99(1H，m，2-H)，2.15(1H，m，2-H)，2.23(1H，m，6-αH)，2.46～2.51(4H，-CH2CH2-)，2.69(1H，m，5-H)，3.52(1H，d，J＝6.4Hz，7-H)，3.96(1H，d，J＝5.2Hz，12-H)，4.03(1H，d，J＝6.03Hz，11-H)，4.53(1H，s，14-H)，4.84(2H，dd，J1＝42Hz，J2＝18.4Hz19-H)；5.53(1H，s，13-OH)，12(1H，br，-COOH)。
13CNMR，δppm14.3(18-C)，15.7(17-C)，16.3(16-C)，16.8(2-C)，22.2(6-C)，28.8～28.9(-CH2CH2-)，29.4(15-C)，30.1(1-C)，35.2(10-C)，39.5(5-C)，50.9(12-C)，57.7(11-C)，59.0(8-C)，62.1(7-C)， 67.1(9-C)，70.6(19-C)，74.2(14-C)，75.6(13-C)，114.0(SCN)，123.5(3-C)，162.2(4-C)，170.8(-CO-)，173.38～173.43(-COOH，20-C)。實施例3雷公藤內酯-14-β-磷酸二鈉(以下簡稱WDY 7)的製法的製備
在氮氣保護下，三頸瓶中加入180mgT(0.500mmol)，10ml吡啶，緩慢滴加0.14ml POCl3(1.50mmol)，滴加完畢，密封反應2～3小時，冰浴冷卻水解，用碳酸氫鈉調節PH＝9，減壓濃縮至幹，用甲醇溶解樣品，除去無機鹽。TLC檢查正丁醇∶水∶冰醋酸(4∶1∶1)，主點為WDY7，含有極少量T以及其它副產物。用正丁醇∶水(15∶2)矽膠柱層析。TLC檢查，合併WDY7，減壓濃縮至幹，用四氫呋喃溶解、乙醚沉澱得到純品167mg，收率為(75％)，Rf值為0.32。水溶解度大於100mg/ml。
MSESI+m/zC20H24O9PNa2計算值485.0956，測定值485.0953.
IR(KBr)cm-13424，2971，2935，2878，1748，1671，1445，1226，1118，1035，975.
1HNMR；δppm0.70(3H，d，J＝7.2Hz，16-CH3)，0.88(3H，d，J＝6.8Hz，17-CH3)，0.96(3H，s，18-CH3)，1.25(1H，m，1-αH)，1.30(1H，m，1-βH)，1.82(1H，t，J＝13.8Hz，6-βH)，1.96(1H，m，2-H)，2.08(1H，m，2-H)，2.13(1H，m，6-αH)，2.21(1H，m，15-H)，2.55(1H，m，5-H)，3.36(1H，m，7-H)，3.83(1H，m，11-H)，4.11(1H，d，J＝11.6Hz，14-H)，4.83(2H，dd，J1＝35.0Hz，J2＝17.4Hz，19-H)。
13CNMR，δppm14.4(18-C)，17.1(2-C)，17.5(16-C)，18.0(17-C)，23.1(6-C)，26.0(15-C)，29.7(1-C)，35.7(10-C)，40.3(5-C)，54.7(12-C)，55.5(11-C)，60.8(7-C)，71.0(19-C)，75(14-C)，123.8(3-C)，163.2(4-C)，174.1(20-C)，61.1，64.2，65.2，65.3(8-C，9-C，13-C)。實施例4雷公藤內酯-14-β-亞磷酸鈉(以下簡稱WDY4)的製法的製備
在氮氣保護下，25ml的三頸瓶中加入200mg T(0.556mmol)和20ml吡啶後，緩慢滴加0.10mlPCl3(1.149mmol)，待加料完畢，停止通入氮氣，密封反應1小時後，將反應瓶用冰水浴冷卻，向反應液中緩慢加入飽和碳酸氫鈉溶液水解，並將PH值調節至8。將溶劑減壓蒸乾後，加入氯仿/甲醇(5/2)溶解，除去無機鹽。TLC檢查正丁醇∶水∶冰醋酸(4∶1∶1)，WDY4為主要點，含少量其它副產物。用H矽膠22克，氯仿∶甲醇(5∶2)柱層析。TLC檢查，合併產物，減壓蒸除溶劑，再少量洗脫液溶解後，乙醚沉澱得到純品70mg，收率50％，Rf值為0.46，顯色劑為Kedd’s試劑，呈紫紅色。水溶解度大於100mg/ml。
IR(KBr)cm-13424，2965，2365，1750，1627，1226，1028，972。
1HNMR，δppm0.74(3H，d，J＝7.2Hz，16-CH3)，0.90(3H，d，J＝6.8Hz，17-CH3)，0.94(3H，s，18-CH3)，1.25(1H，m，1-αH)，1.32(1H，m，1-βH)，1.80(1H，t，J＝14.2Hz，6-βH)，1.94(1H，m，2-H)，2.10(1H，m，2-H)，2.20(1H，m，6-αH)，2.33(1H，m，15-H)，2.59(1H，m，5-H)，3.29(1H，m，7-H)，3.52(1H，d，J＝3.2Hz，11-H)，3.82(1H，d，J＝3.2Hz，12-H)，4.03(1H，d，J＝12.4Hz，14-H)，4.83(2H，m，19-H)，6.7(1H，d，J＝595.6Hz，P-H)。
13CNMR，δppm13.9(18-C)，16.7(2-C)，17.0(16-C)，17.5(17-C)，22.8(6-C)，26.3(15-C)，29.2(1-C)，35.3(10-C)，40.1(5-C)，54.3(12-C)，54.9(11-C)，60.4(7-C)，70.3(19-C)，73.(C-14，d，J＝22.8Hz)，123.2(3-C)，162.5(4-C)，173.2(20-C)，63.5，64.5，64.6(8-C，9-C，13-C)。
31PNMR，δppm1.34(d，JP-H＝599Hz)。實施例512-β-氯雷公藤內酯-13-α-14-β-磷酸鈉(以下簡稱WDY2)的製備
在氮氣保護下，三頸瓶中加入108mg T(0.3mmol)，30ml吡啶和39mgDMAP後，滴加1.5ml POCl3(16.37mmol)，待加料完畢，停止通入氮氣，密封室溫反應24小時，冰浴冷卻水解，用飽和碳酸氫鈉調節PH＝8，減壓濃縮至幹，用四氫呋喃溶解樣品，除去無機鹽。TLC檢查正丁醇∶水∶冰醋酸(10∶1∶1)，主點為WDY2，含有極少量T和其它副產物。所得樣品用矽膠正丁醇∶水(15∶2)柱層析。TLC檢查，合併WDY2，濃縮蒸乾，用少量四氫呋喃溶解、乙醚沉澱得到純品115.2mg，收率80％，Rf值為0.33，顯色劑為Kedd’s試劑，呈紫紅色。水溶解度大於100mg/ml。
元素分析C20H23O7ClPNa計算值％C49.96，H4.82，實測值％C49.75，H4.43。
IR(KBr)cm-13428，2930，1741，1634，1244，1023，582
1HNMR，δppm0.78(3H，d，J＝6.8Hz，16-CH3)，0.96(3H，d，J＝6.8Hz，17-CH3)，1.0(3H，s，18-CH3)，1.36(1H，m，1-αH)，1.38(1H，m，1-βH)，1.89(1H，m，6-βH)，2.06(1H，m，2-H)，2.16(1H，m，15-H)，2.21(1H，m，2-H)，2.39(1H，m，6-αH)，3.05(1H，d，J＝12.8Hz，5-H)，3.54(1H，d，J＝2.4Hz，12-H)，3.86(1H，d，J＝2.8Hz，11-H)，4.44(1H，s，14-H)，4.63(1H，s，7-H)，4.83(2H，m，19-H)。
13CNMR，δppm15.0(18-C)，16.8(16-C)，17.6(2-C)，18.0(17-C)，28.5(6-C)，28.9(15-C)，29.9(1-C)，37.0(10-C)，37.5(5-C)，53.4(12-C)，57.8(11-C)，63.7(7-C)，70.7(19-C)，74.6(14-C)，124.0(3-C)，163.3(4-C)，173.5(20-C)，61.8，61.9，62.9，81.4(8-C，9-C，13-C)。
31PNMR，δppm2.96。實施例612-β-硫氰酸基-13-α-羥基雷公藤內酯-14-β-磷酸二鈉(以下簡稱WDY3)的製備
在氮氣保護下，三頸瓶中加41.9mgT-SCN(0.100mmol)，再加入5ml吡啶，加入8mgDMAP，最後加入0.018mlPCl3(0.200mmol)，密封，室溫反應，加入0.065ml對甲氧基苄醇(0.520mmol)，室溫反應十分鐘後，加入0.200ml 30％H2O2室溫反應半小時後，用冰浴冷卻並加入飽和NaHCO3水解。減壓濃縮至幹，用乙酸乙酯溶解樣品，除去無機鹽，用飽和氯化鈉水溶液洗滌數次，並用無水硫酸鈉乾燥後，減壓濃縮至幹，用乙腈溶解轉移到塑料試管中，再加入0.300ml HF(48％)反應72小時，TLC檢測正丁醇∶水∶冰醋酸(4∶1∶1)展開，主點為產物點，含有極少量T-SCN和其它副產物。乙腈溶解加入2g 75～300目矽膠拌樣，除盡乙腈，75～300目矽膠柱層析分離，正丁醇∶水(15∶2)，TLC跟蹤檢測，收集產物點，合併，減壓蒸除溶劑，加少量溶劑用乙醚沉澱，靜置一小時後，過濾得到粉狀固體，用乾燥槍乾燥，Rf值為0.24，(正丁醇/水/冰醋酸4∶1∶1)，顯色劑為Kedd’s試劑，呈紫紅色。產物水溶解度大於100mg/ml。實施例712-β-硫氰酸基雷公藤內酯-13-α-羥基-14-β-亞磷酸鈉和12-β-硫氰酸基雷公藤內酯-14-β-羥基-13-α-亞磷酸鈉(以下簡稱WDY5)
在三頸瓶中加80mgT-SCN(0.191mmol)，再加入8ml吡啶，攪拌溶解，再加入8ml醋酐，在室溫下密封反應一周，然後於40℃反應10小時後，將反應液倒入冰水中，用二氯甲烷萃取三次並合併二氯甲烷，用飽和NaHCO3三次，再用飽和NaCl水溶液洗滌至中性，最後用無水Na2SO4乾燥24小時，減壓蒸餾濃縮除去溶劑得粗品TLC檢查，氯仿∶甲醇(10∶1)，乙醯化T-SCN為主點，含少量T-SCN。丙酮溶解，加入0.5克矽膠拌樣，矽膠柱層析，氯仿∶甲醇(15∶1)洗脫，TLC檢查，收集乙醯化T-SCN餾分，得70mg。在氮氣保護的三頸瓶中，將70mg乙醯化T-SCN溶於2ml吡啶中，再加入0.1mlPCl3，在室溫下密封反應30分鐘後，冰水冷卻，水解，並加入40ml二氯甲烷，用水洗兩次、合併水相的60ml，TLC檢查，正丁醇∶水∶冰醋酸(4∶1∶1)，基本無雜質。向上述60ml水溶液中加入40ml飽和Na2CO3水溶液，室溫下水解18小時，用稀H2SO4中和使PH＝7，減壓蒸餾除水，乙醇除鹽，TLC檢查，正丁醇∶水∶冰醋酸(10∶1∶1)，產物點明顯，但有較多雜質點。用氯仿∶甲醇(4∶1)，矽膠柱層析得WDY5。Rf值為0.54。產物水溶解度大於100mg/ml。實施例8WDY系列化合物對細胞因子IL-1，IL-2、IL-6以及iNOS的作用
細胞因子，前列腺素類以及一氧化氮均為免疫系統的重要介質，且表達在許多與自動免疫缺陷症和炎症疾病相關的組織和細胞中。為了研究藥物對這些炎症介質生成的抑制作用，應用實時逆轉錄多聚酶鏈反應定量檢測了IL-1，IL-2，IL-6以及iNOS mRNA表達水平，這些炎症因子是由LPS或PHA刺激大鼠脾臟淋巴細胞而誘導產生。環孢菌素A和WDY4完全抑制了LPS或PHA誘導的IL-2mRNA表達(圖1)，WDY-4也完全抑制IL-6和iNOS的mRNA表達(圖2)。而環孢菌素A對這兩種因子的作用較弱。WDY1和WDY6的免疫抑制活性也很好，動物試驗結果顯示這兩種化合物的毒性很低。提示本發明及其衍生物在治療自動免疫缺陷症和炎症疾病的有效作用。實驗方法
按照標準方法從Lewiz大鼠中獲得脾細胞，並將其接種於6孔培養板內，細胞密度為1×106/ml。向培養細胞內加入適當濃度的化合物，在37℃預培養15分鐘再加入1μg/ml LPS(Sigma產品)或1μg/ml PHA(Sigma產品)，在37℃，5％CO2條件下培養2小時，用Qiagen公司的RNA製備試劑盒提取脾細胞總RNA。
按照廠商(Perkin Elmer applied Biosystems)提供的ABI TaqMan檢測試劑盒說明進行RT-PCR實驗，在包含2mM脫氧核苷酸混合物，100mMDTT，40單位RNase抑制劑，50ng隨機引物，15單位Thermoscript逆轉錄酶的反應體系中將脾細胞mRNA(1μg)逆轉錄為互補DNA(cDNA)，反應條件為25℃，10分鐘，48℃，45分鐘，90℃，5分鐘，然後冷卻至4℃。用TaqMan PCR技術在ABI 7700序列檢測器上測定了IL-1、IL-2、IL-6、iNOS和親環素的表達水平，反應體系包括1×TaqMan Universal MasterMix，900nM正向(上遊)和反向(下遊)引物，200nM TaqMan探針，加入50nM引物和探針，熱循環條件為95℃，15分鐘，60℃，1分鐘，共進行40個循環。用相關標準曲線計算目的mRNA和親環素的mRNA表達產量。結果見圖1和圖2。實施例9用PGE2酶活性法檢測本發明對COX-2的抑制作用
用Cayman公司PGE2EIA試劑盒檢測了本發明對COX-2催化花生四烯酸生PGE2的影響。將適當密度的HT-29人結腸癌細胞接種在含10％小牛血清和適量青、鏈黴素的RPMI 1640培養液中，待次日細胞貼壁後換用新的培養液並加入本發明(WDY4和WDY7，10ug/ml)，以消炎痛(100ug/ml)作為陽性對照，不加藥物為陰性對照。藥物作用24小時後，棄去舊培養液，並用PBS洗滌兩次，加入1ml包含40μM花生四烯酸(AA)的無血清培養基，37℃作用30分鐘，收集上清，按試劑盒操作說明進行衍生化過夜，並檢測和計算PGE2的生成量，結果見附圖3。實施例10WDY1靜脈注射LD50結果
WDY1用水配製，設5個劑量組(150，135，122，109，98mg/kg體重)，每組10隻昆明種小鼠(動物合格證號川實動管第99-30號)，雌雄各半，尾靜脈注射(iv)，確定WDY1的急毒LD50為126mg/kg體重。實施例11WDY對DNC引起小鼠遲發性超敏反應的影響
原理二硝基氟苯(dinitrofluorobenzene，DNEB)為半抗原，將其溶液塗抹於腹壁皮膚後，與皮膚蛋白結合成全抗原，由此刺激TLC增殖成致敏淋巴細胞。4-7天後將其再次塗抹於皮膚，可使局部產生遲髮型變態反應(水腫)，一般在抗原攻擊後24-48小時達高峰，故於此時測定局部腫脹。
評定檢測藥物對細胞免疫的作用外，還常被採用製備細胞免疫功能增高和低下模型。遲髮型超敏反應是致敏機體在抗原攻擊24-48小時後發生的組織損傷。高峰期測定組織腫脹度可代表遲髮型超敏反應強度。1.試驗材料
試藥WDY1、WDY6、WDY7均系類白色粉末，臨用前用生理鹽水配成所需濃度。
動物昆明種小鼠110隻，動物合格證號川實動管第99-30號。
試劑2，4二硝基氯苯(DNCB)，批號20000101，由上海試劑一廠生產。臨用前用丙酮配成50％、2％、0.5％和0.15％幾種濃度。2.試驗方法根據中國衛生部頒發新藥(西藥)臨床前研究指導原
則的抗炎免疫藥物藥效學指導原則設計.
劑量設置按下表1進行分組和給藥
表1
致敏每隻小鼠背部脫毛一小塊，用微量注射器將50％的DNCB丙酮溶液2μl滴於裸露的皮膚上，致敏動物。
給藥致敏當日即按上表開始給藥，每天一次，連續十天(其中WDY7是隔日給藥)。
激發給藥後第十天，每隻小鼠腹部脫毛三處，大小約為d＝1cm，分別用2％、0.5％、0.15％的DNCB丙酮溶液各20μl滴於裸露的三處皮膚上，激發動物。
評價指標於激發後24h、48h、72h觀察動物三處皮膚的反應，按下表進行計分，取三處皮膚計分之和作為評價指標，與對照組比較。
附表2皮膚反應強度的判斷標準
級別(計分) 皮膚反應
0 完全無反應
0.5稍有顏色改變或皮疹
1.0顏色改變明顯(黃或紅色)，但無隆起或水腫
2.0顏色改變明顯(黃或紅色)，且有隆起或水腫
3.0紅腫且稍有壞死
4.0壞死，結痂3.試驗結果
表3實施例12WDY1、WDY6、WDY7抗炎試驗(棉球肉芽腫法)
原理棉球植入大鼠體內引起結締組織增生，這種肉芽增生與臨床上某些炎症後期病理改變相似，用於評定藥物抗結締組織增殖作用。比較用藥組與陰性對照組肉芽腫重量的差異，各用藥組抑制率，經比較有顯著性差異，則認為該藥對該炎症模型有抗炎作用。陽性藥為氫化可的松。1.實驗材料
動物Wister大鼠110隻，雄性，體重200-250g。試藥WDY1、WDY6、WDY7。陽性樣品氫化可的松。2.實驗方法根據中國衛生部頒發新藥(西藥)臨床前研究指導原則的抗炎免疫藥物藥效學指導原則設計。
110隻動物在戍巴妥鈉ip30mg/kg麻醉下，右腹下植入消毒幹棉球20mg，第二天按表1分組給藥，末次給藥後24小時，處死大鼠，剝離棉球，剃除脂肪組織，放入60℃烤箱中烘烤1小時，取出棉球稱重，將稱得的重量減去原棉球重量20mg，作為腫脹程度並以mg/100g體重表示，同時用藥組與對照組進行比較。3.實驗結果
表4WDY1、WDY6、WDY7抗炎試驗(棉球肉芽腫法)結果
平均肉芽腫(X± 腫脹抑
給藥鼠數劑量次數 組別
途徑(只) SD，折成 制
mg/100g) 率(％)-- 對照組iv 9 68.0±39.940mg/kg×8 氫化可Po 9 39.3±22.242.2
的松2.5mg/kg×8 WDY iv 8 36.5±11.246.35mg/kg×8WDY1 iv 9 36.9±9.9 45.710mg/kg×8 WDY1 iv 9 27.7±6.2 59.32.5mg/kg×8 WDY6 iv 8 39.0±18.242.65mg/kg×8WDY6 iv 9 36.0±11.847.110mg/kg×8 WDY6 iv 8 34.7±10.249.00.025mg/kg WDY7 iv(隔 8 39.8±9.5 41.50.06mg/kg× WDY7 iv(隔 8 30.2±4.6 55.60.125mg/kg WDY7 iv(隔 9 29.4±6.1 56.8
如表4所示氫化可的松組與對照組比較，其棉球肉芽腫重量明顯小於對照組。WDY1、WDY6、及WDY7均有明顯抗棉球肉芽腫的作用。三樣品高中劑量及WDY1低劑量其棉球芽腫與對照組比較均顯著的減小，且有一定的正量效關係。
權利要求
1.一種雷公藤內酯醇衍生物，其結構式為
結構式I
其中R1是H，或磷酸酯
或亞磷酸酯
，X1和X2是Na，或K，或NH4。
2.製備權利要求1所述的化合物的方法，包括將先導化合物雷公藤內酯醇與三氯氧磷，三氯化磷，或其它磷酯醯滷、磷酸酯、亞磷酯醯滷、亞磷酸酯等化合物反應的步驟。
3.一種雷公藤內酯醇衍生物，其結構式為
結構式II
其中R1是H，或含有1-4個碳原子的烷基，或-C(＝O)(CH2)nCO2，其中，n為1-4的整數，或磷酸酯
，或亞磷酸酯
X1和X2是Na，或K，或NH4，R2是H，或-SCN或-Cl，或-Br。
4.製備權利要求3所述的化合物的方法，包括將第二種先導化合物12-β-硫氰酸基-13-α-羥基雷公藤內酯醇酯化和磷酯化的步驟。
5.一種雷公藤內酯醇衍生物，其結構式為
或
結構式IIIa 結構式IIIb其中R2是H，或-SCN，或-Cl，或-Br。
6.製備權利要求5所述的化合物的方法，包括將第二種先導化合物12-β-硫氰酸基-13-α-羥基雷公藤內酯醇與三氯氧磷或其它磷酯醯滷、磷酸酯，亞磷酸酯等化合物反應，或者將第一種先導化合物雷公藤內酯醇與三氯氧磷或其它磷酯醯滷、亞磷酯醯滷等化合物反應的步驟。
7.權利要求1，3，和5中任一項的化合物在製備作為免疫抑制劑或者抗炎劑的藥物中的用途。
8.根據權利要求7的用途，其中所述的免疫抑制劑或者抗炎劑用於治療那些與淋巴T，B細胞生長，細胞因子IL-1，IL-2，IL-6，iNOS的產生，以及Cox-2的產生有關的疾病。
9.根據權利要求8的用途，其中所述的疾病是自動免疫缺陷疾病和炎症。
10.根據權利要求11的用途，其中所述的疾病是類風溼性關節炎，哮喘，系統紅斑狼瘡，牛皮癬，多重硬皮症，動脈粥樣硬化，I-型糖尿病，腎炎。
全文摘要
本發明提供了下列具有免疫抑制活性的水溶性雷公藤內酯醇(triptolide)衍生物，其結構式分別為I，II，IIIa，IIIb，其中R1和R2的定義見說明書中的權利要求書部分；製備結構式I，II，IIIa，IIIb的化學合成方法；以及這些化合物在治療自動免疫缺陷疾病和與免疫抑制相關的炎症中的應用。
文檔編號C07D493/22GK1483731SQ0213068
公開日2004年3月24日 申請日期2002年9月18日 優先權日2002年9月18日
發明者王大元, 譚鴻, 孔焱 申請人:成都達遠藥物有限公司, W&K國際公司