一種葡萄無性系品種的育種方法

2023-08-05 06:07:31

專利名稱：一種葡萄無性系品種的育種方法
技術領域：
本發明涉及到果樹育種技術領域，具體指利用現代生物技術(物理誘變)手段獲得葡萄優良無性系品種即一種葡萄無性系品種的育種方法。
背景技術：
葡萄為葡萄科、葡萄屬植物，起源於黑海和地中海沿岸，是分布最廣泛、適應性最強的果樹之一，目前全世界已形成數千個品種。在我國，北起黑龍江，南至海南島，各省市均有栽培。目前國內外對葡萄新品種選育的方法主要有雜交育種、芽變選種，隨著現代生物技術的發展，使用組織培養技術、誘變技術、分子標記技術和轉基因技術等新型育種技術培育新品種已經成為可能，但成功報導的例子甚少。自然界葡萄容易產生芽變，目前栽培中部分優良品種由自然芽變選擇培育成功， 但自然芽變概率較低，利用人工誘變可以大大提高葡萄的變異概率，是選育葡萄優良品種的良好途徑，但是利用人工誘變育種葡萄的方法還鮮有報導。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的狀況，提供一種葡萄無性系品種選育的方法。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案為一種葡萄無性系品種選育的方法，通過人工物理誘變的方式，獲得抗病、早熟、優質的葡萄優良單株，該方法包括育種目標的的確定、育種材料的選取、物理誘變劑量的選擇、苗木的培養、變異單株的篩選、變異性狀的分子鑑別等，具體包括下述步驟(1)育種目標的確定以抗病、早熟、優質為主要育種目標；(2)育種材料的選取一般選擇具有良好經濟性狀(如產量等)但在某些性狀(如成熟期、抗病性等需要改良的形狀)需要改良的品種；誘變種子從品種純正、已經進入盛果期、生長健壯、無病蟲害的植株上採集；具體為當葡萄果實完全成熟(浙江省一般在8 10 月份)，選擇果穗整齊、果粒發育良好的果實採集種子；種子採集後選擇飽滿的種子，用清水反覆衝洗洗淨粘在種子表面的果肉，然後用20%多菌靈1000倍液浸泡15分鐘消毒，再用清水衝洗後在陰涼處晾乾；晾乾的種子以5份沙子(沙子相對溼度60%左右)、1份種子混合後置於4 5°C的冰箱中貯藏；第二年2 3月將種子進行分組，每300粒為一組，分為6 組，其中1組為對照，5組用於輻照處理；(3)物理誘變劑量的選擇通過預備試驗，採用100、150、200、250、300Gy (5組用於
輻照處理，每組對應一組輻射強度)的6tlCo Y射線分別對應五組要輻照處理的種子進行急性輻射，以無輻射處理為對照，劑量率為lOGy/min ；(4)種子的播種種子播種於育苗床上；育苗床基質為體積比6 4的泥炭和穀殼的混合物，基質裝盆前用高壓滅菌鍋進行消毒，育苗基質含有有機質30 45g · kg—1，鹼解氮 100 130mg · kg-1，速效磷 80 95mg · kg-1，速效鉀 200 230mg · kg-1, ρΗ6· O 7· 5 ；苗床底部鋪8 IOcm厚的卵石、再鋪4 6cm厚的沙子，上層鋪25 30cm厚育苗基質；將處理和對照的種子均勻播種於苗床上，行株距IOX IOcm;播種後注意苗床基質相對溼度保持60 70% ；(5)苗木的管理播種後14 15天發芽，當小苗長至5 6葉時定植於大棚設施中；畦寬2. 5m，定植前挖定植溝，定植溝內加疏鬆且已經消毒的土壤，株距0. 5m，大棚內的溫度保持20 25°C，大棚內土壤相對溼度保持60 65%，空氣相對溼度保持65 75%， 培育3 6年後植株開花結果；(6)變異單株的篩選在苗木生長期間，仔細觀測不同處理的生物學、植物學性狀，選擇與對照(對照組苗木)在抗性、植物學和生物學特性等方面有明顯差異的單株；(7)變異性狀的分子鑑別選擇優良單株，採集該優良與對照的幼嫩葉片，利用 ISSR或者SSR標記技術進行變異基因分析；(8)優良單株的區域試驗和推廣通過生物學、植物學性狀以及結果特性的觀測， 結合分子鑑別，獲得優良單株；將該單株進行無性繁殖，選擇不同的區域進行試驗，以明確其適種範圍，並總結適合該單株的一整套栽培措施。上述步驟中育苗基質優選含有有機質38g · kg—1，鹼解氮IlOmg · kg—1，速效磷 87mg · kg-1，速效鉀 237mg · kg-1, ρΗ6· 3。上述步驟中苗床底部優選鋪IOcm厚的卵石、再鋪5cm厚的沙子，上層鋪25cm
厚育苗基質。上述步驟中播種後苗床基質相對溼度優選保持60%。上述步驟(7)中利用ISSR或者SSR標記技術進行變異基因分析其葡萄最優 ISSR-PCR 的最佳反應體系20μ L PCR 反應體積中，MgC121. 75mmol/L, dNTPsO. 20mmol/L, Taq 聚合酶 1.0U，引物 0. 2ymol/L，10XBuffer 2. 0 μ L, ddH20 13. 2μ L ；PCR反應程序94°C預變性5min，94°C變性45s，50 60°C退火lmin，72°C延伸 1. 5min，進行40個循環，最後72°C延伸7min。)其中引物為利用(AG)8T、(AG)8C、(AG)8C、(GA)8T、(GA)8C、(CT)8Τ、(CT)8Α、 (CT) 8G、(CA) 8Α、(CA) 8G、(TC) 8C、(TC) 8G、(AC)8T、(AC)8C、(AC)8G、(AG)8YT、(AG) 8YA、 (GA) 8YT、(GA) 8YC, (CT) 8RG、(CA) 8RT、(CA) 8RC、(AC)8YT、(AC) 8YA, (AC) 8YG, (GGAGA) 3 等供沈條引物( 條引物同時使用)能擴增出清晰的譜帶且重複性較好。上述步驟(8)所述的無性繁殖如扦插、嫁接等。本發明的優點和有益效果1.本發明成功採用6tlCo Y射線人工誘變，獲得變異概率高、操作安全穩定的葡萄育種。2.本發明的葡萄育種方法，通過確定照射劑量、劑量率、照射後種子的播種環境條件控制、苗木的管理、篩選、變異性狀的分子鑑別、優良單株的區域試驗和推廣等，得到一套完整的抗病、早熟(成熟期可提早10 15天)、優質的葡萄人工誘變育種方法，成功實現了葡萄人工誘變育種。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述(以「鄞紅」葡萄品種誘變選育新品種為例)，但本發明不僅僅局限於以下實施例。實施例以「鄞紅」為例，「鄞紅」為寧波地區推廣的優良品種，屬歐美雜交種，其樹勢強，葉色濃，葉面光滑無毛。一般穗重500 700克。果實橢圓形，平均粒重12克左右。果皮紫紅色，風味濃鬱。寧波地區大棚保護地栽培之成熟期一般為7月底至8月中旬。(1)育種目標的確定以早熟為主要育種目標，其它特性與「鄞紅」相近。(2)育種材料的選取誘變種子從品種純正、已經進入盛果期、生長健壯、無病蟲害的「鄞紅」植株上採集。當葡萄果實完全成熟，浙江省一般在8月中旬左右，選擇果穗整齊、果粒發育良好的果實採集種子，種子採集後選擇飽滿的種子，用清水反覆衝洗洗淨粘在種子表面的果肉，然後用20 %多菌靈1000倍液浸泡15分鐘消毒，再用清水衝洗後在陰涼處晾乾。晾乾的種子用5份沙子(沙子相對溼度60%左右)、1份種子混合後置於5°C左右的冰箱中貯藏；第二年2 3月將種子進行分組，每300粒為一組，分為6組，其中1組為對照 (不進行輻照處理)，5組用於輻照處理。(3)物理誘變劑量的選擇通過預備試驗，採用100、150、200、250、300Gy(即需要
輻照處理的5組用於輻照處理種子，每組對應一種輻照強度)的6tlCo Y射線處理，以無輻射處理為對照，劑量率為lOGy/min。(4)種子的播種種子(輻照處理和未輻照處理的種子)播種於育苗床上；育苗床基質為體積比6 4的泥炭和穀殼的混合物，基質裝盆前用高壓滅菌鍋進行消毒，基質含有有機質 38g · kg—1，鹼解氮 IlOmg · kg—1，速效磷 87mg · kg—1，速效鉀 237mg · kg—1，ρΗ6· 3。苗床底部一般鋪IOcm左右厚的卵石、再鋪5cm厚左右的沙子，上層鋪育苗基質，約25cm厚。將處理和對照的種子均勻播種於苗床上，行、株距10 X IOcm0播種後注意苗床基質相對溼度保持60%左右。(5)苗木的管理播種後15天左右發芽，當小苗長至5 6葉時定植於大棚設施中。一般畦寬2. 5m，定植前挖定植溝，定植溝內加疏鬆且已經消毒的土壤，株距一般0. 5m, 大棚內的溫度一般保持20 25°C，溫度過高時注意通風，大棚內土壤相對溼度保持60 %左右、空氣相對溼度保持70%左右，一般培育3年後植株開花結果。(6)變異單株的篩選在苗木生長期間，仔細觀測不同處理的生物學、植物學性狀，選擇與對照在抗性、植物學和生物學特性等方面有明顯差異的單株。(7)變異性狀的分子鑑別根據育種目標，選擇成熟期較早且其餘經濟性狀同「鄞紅」相似的優良單株，採集該優良單株與對照組單株的幼嫩葉片，利用ISSR或者SSR標記技術進行變異基因分析；葡萄ISSR-PCR 的反應體系20μ L PCR 反應體積中，MgC121. 75mmol/L, dNIPsO. 20mmol/L，Taq 聚合酶 1. 0U，弓 | 物 0. 2 μ mol/L，IOXBuffer 2. 0 μ L, ddH20 13. 2μ L ；所述PCR反應的反應程序為94°C預變性5min，94°C變性45s，50-60°C退火lmin， 72°C延伸1.5min，進行40個循環，最後72°C延伸7min。採用的引物為(AG)8T、(AG)8C、(AG)8C、(GA)8T、(GA)8C、(CT)8Τ、(CT)8Α、(CT)8G、 (CA) 8Α、(CA) 8G、(TC) 8C、(TC) 8G、(AC)8T、(AC)8C、(AC)8G、(AG)8YT、(AG) 8YA, (GA) 8YT、 (GA) 8YC, (CT) 8RG、(CA) 8RT、(CA) 8RC、(AC)8YT、(AC) 8YA, (AC) 8YG, (GGAGA) 3 共洸條引物，擴增出清晰的譜帶且重複性較好。(D = (A, G，T)，V = (A，C，G)，R = (A, G)，Y = (C，T))(8)優良單株的區域試驗和推廣通過生物學、植物學性狀以及結果特性的觀測， 結合分子鑑別，獲得優良單株。我們以「鄞紅」葡萄誘變，獲得一優良單株，其綜合性狀與「鄞紅」形似，但成熟期比 「鄞紅」可提早15天左右；將該單株進行無性繁殖(如扦插、嫁接)，在寧波地區進行三點二年試驗，試驗結果表明適合寧波地區推廣，並總結了適合該單株的一整套栽培措施。
權利要求
1.一種葡萄無性系品種的育種方法，其特徵在於通過人工物理誘變的方式，獲得抗病、早熟、優質的葡萄優良單株。
2.根據權利要求1所述的一種葡萄無性系品種的育種方法，其特徵在於育種方法的具體步驟包括(1)育種目標的確定以抗病、早熟、優質為主要育種目標；(2)育種材料的選取選擇具有良好經濟性狀但在某些性狀需要改良的品種，誘變種子從品種純正、已經進入盛果期、生長健壯、無病蟲害的植株上採集；當葡萄果實完全成熟， 選擇果穗整齊、果粒發育良好的果實採集種子，種子採集後選擇飽滿的種子，用清水反覆衝洗洗淨粘在種子表面的果肉，然後用20 %多菌靈1000倍液浸泡15分鐘消毒，再用清水衝洗後在陰涼處晾乾；晾乾的種子用5份沙子、1份種子混合後置於4 5°C的冰箱中貯藏；第二年2 3月將種子進行分組，每300粒為一組，分為6組，其中1組為對照，5組用於輻照處理；(3)物理誘變劑量的選擇通過預備試驗，採用100、150、200、250、300Gy的6tlCoγ射線分別對應五組要輻照處理的種子進行急性輻射，以無輻射處理為對照，劑量率為IOGy/ min ；(4)種子的播種種子播種於育苗床上；育苗床基質為體積比6 4的泥炭和穀殼的混合物，基質裝盆前用高壓滅菌鍋進行消毒，育苗基質含有有機質30 45g · kg—1，鹼解氮 100 130mg · kg-1,速效磷 80 95mg · kg-1,速效鉀 200 230mg · kg-1, ρΗ6· 0 7· 5 ；苗床底部鋪8 IOcm厚的卵石、再鋪4 6cm厚的沙子，上層鋪25 30cm厚育苗基質；將處理和對照的種子均勻播種於苗床上，行株距IOXlOcm ；播種後注意苗床基質相對溼度保持 60 70% ；(5)苗木的管理播種後14 15天發芽，當小苗長至5 6葉時定植於大棚設施中； 畦寬2. 5m，定植前挖定植溝，定植溝內加疏鬆且已經消毒的土壤，株距0. 5m，大棚內的溫度保持20 25°C，大棚內土壤相對溼度保持60 65%，空氣相對溼度保持65 75%，培育 3 5年後植株開花結果；(6)變異單株的篩選在苗木生長期間，仔細觀測不同處理的生物學、植物學性狀，選擇與對照在抗性、植物學和生物學特性方面有明顯差異的單株；(7)變異性狀的分子鑑別選擇優良單株，採集該優良與對照的幼嫩葉片，利用ISSR或者SSR標記技術進行變異基因分析；(8)優良單株的區域試驗和推廣通過生物學、植物學性狀以及結果特性的觀測，結合分子鑑別，獲得優良單株；將該單株進行無性繁殖，選擇不同的區域進行試驗，以明確其適種範圍，並總結適合該單株的一整套栽培措施。
3.根據權利要求2所述的一種葡萄無性系品種的育種方法，其特徵在於所述步驟 (4)中育苗基質含有有機質38g · kg—1，鹼解氮IlOmg · kg—1，速效磷87mg · kg—1，速效鉀 237mg · kg-1, pH6. 3。
4.根據權利要求2所述的一種葡萄無性系品種的育種方法，其特徵在於所述步驟中苗床底部鋪IOcm厚的卵石、再鋪5cm厚的沙子，上層鋪25cm厚育苗基質。
5.根據權利要求2所述的一種葡萄無性系品種的育種方法，其特徵在於所述步驟中播種後苗床基質相對溼度保持在60%。
6.根據權利要求2所述的一種葡萄無性系品種的育種方法，其特徵在於所述步驟(7)中利用ISSR或者SSR標記技術進行變異基因分析其葡萄ISSR-PCR的反應體系為20μ LPCR 反應體積中，MgCl2L 75mmol/L，dNTPs 0. 20mmol/L, Taq 聚合酶 1. 0U，引物 0. 2 μ mol/L, IOXBuffer 2. 0 μ L, ddH20 13. 2 μ L0
7.根據權利要求6所述的一種葡萄無性系品種的育種方法，其特徵在於所述PCR反應的反應程序為94°C預變性5min，94°C變性45s，50 60°C退火lmin，72°C延伸1. 5min， 進行40個循環，最後72°C延伸7min。
8.根據權利要求6所述的一種葡萄無性系品種的育種方法，其特徵在於所述的引物為(AG)8T、(AG)8C、(AG)8C、(GA) 8T、(GA) 8C、(CT) 8Τ、(CT) 8Α、(CT) 8G、(CA) 8Α、(CA) 8G、 (TC) 8C、(TC) 8G、(AC)8T、(AC)8C、(AC)8G、(AG)8YT、(AG) 8YA, (GA) 8YT、(GA) 8YC, (CT) 8RG、 (CA) 8RT、(CA) 8RC、(AC)8YT、(AC) 8YA, (AC) 8YG, (GGAGA) 3 共 26 條引物。
9.根據權利要求2所述的一種葡萄無性系品種的育種方法，其特徵在於步驟(8)所述的無性繁殖為扦插或嫁接。
全文摘要
本發明公開一種葡萄無性系品種的育種方法，其特徵在於通過人工物理誘變的方式，獲得抗病、早熟、優質的葡萄優良單株。具體為育種目標確定→採集飽滿成熟的種子→物理誘變——劑量100-300Gy的60Coγ射線、以劑量率為10Gy/min→種子播種→3～6年苗木培育→單株選擇通過生物學、植物學性狀、經濟特性等的觀測選擇→變異性狀的基因分析→優良單株區域試驗→栽培措施總結→推廣。本發明的方法獲得的優良單株具有抗病、早熟、優質等優點。
文檔編號A01H1/04GK102524055SQ201210005630
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者吳月燕, 崔鵬, 王忠華 申請人:浙江萬裡學院