哇巴因在增強非小細胞肺癌細胞敏感性中的應用的製作方法

2023-12-11 22:49:07 2

專利名稱：哇巴因在增強非小細胞肺癌細胞敏感性中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及鈉鉀ATP酶抑制 劑哇巴因在逆轉非小細胞肺癌細胞對靶向性抗腫瘤 藥物耐受的新用途。
背景技術：
惡性腫瘤是危害人類健康的重大疾病。江蘇省近幾年開展了以惡性腫瘤為主的全 人口死因回顧性調查，結果顯示男女性第1位死因均為惡性腫瘤，其死亡率佔全部死因的 27. 41 %。資料顯示，2003年江蘇省城市地區位於惡性腫瘤死亡前4位的分別是肺癌、胃癌、 肝癌、食管癌；而農村地區為肝癌、肺癌、食管癌、胃癌。肺癌和胃癌死亡率城市明顯高於農 村。尤其是通過分析1973至2004年幾種主要惡性腫瘤的死亡情況發現，肺癌死亡率大幅 上升，2004年肺癌死亡率是1973年的5. 65倍。由此可見，肺癌已經成為我省惡性腫瘤數一 數二的「殺手」，嚴重威脅著我省人民的生存健康。為什麼在短短的幾十年間，肺癌的發病率及死亡率有如此迅猛的發展趨勢？ 1 : 大樣品調查研究表明肺癌的主要危險因素為吸菸和大氣汙染，而近年來吸菸人數有增加的 趨勢，汽車尾氣和工業廢氣的大量排放，又加重了大氣環境汙染的程度。因此，隨著我省經 濟的發展，城市化、工業化進程的加快，空氣汙染將會越來越嚴重，這將不可避免地導致肺 癌死亡率進一步增加。2:肺癌在早期時往往沒有明顯的症狀，當有症狀被診斷出來時，常常 已經是局部晚期或晚期無法手術切除的情形。一般而言，新診斷的肺癌僅約不到20%的病 人屬於早期可以有機會接受手術切除的病患。而另外80%的晚期肺癌病人則失去了外科手 術根治的最佳時機。3:到目前為止，對肺癌的治療，尤其是晚期肺癌病人缺乏非常有效的治 療幹預手段。臨床上，肺癌通常分為小細胞與非小細胞肺癌兩種類型，總的肺癌病例中，非小細 胞肺癌(包括肺鱗癌，肺腺癌)約佔80%。因此針對非小細胞肺癌的治療研究是攻克肺癌 的一項極其重要的課題，引起了全世界醫學界的廣泛關注。如上所述，雖然手術治療是治療非小細胞肺癌的重要手段，但對絕大部分晚期肺 癌病人來說手術治療並不能有效解決腫瘤轉移的問題。因此對於這些晚期或已經有遠端轉 移的肺癌病人，全身性的化學治療是非小細胞肺癌多學科綜合治療的主要策略之一。尤其 是化療與手術、放射等療法綜合運用能明顯防止癌腫轉移、復發，提高長期生存率。現在，非 小細胞肺癌化療已經初步形成共識，通常採用順鉬加泰索帝、紫杉醇、健擇、諾維本等中的 一種。根據患者的具體情況，選擇不同的組合，可以達到提高療效，降低毒性反應的目的，特 別是出現了一些極具前景的新型靶向藥物，其作用機制與傳統化療藥物不同。傳統化療藥 物屬於細胞毒性藥物，是通過毒性殺死腫瘤細胞，但同時不可避免會傷害正常細胞。而靶向 藥物進入腫瘤細胞後，可以通過特異性作用於腫瘤生長的細胞信號途徑，抑制腫瘤細胞的 增殖、浸潤、轉移，不良反應輕，患者可以很好耐受。在這些靶向藥物中，TRAIL(腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體)越來越受到人 們的關注。TRAIL是由Wiley於1995年檢索EST時首次發現並克隆的，是一種II型糖蛋白，屬於腫瘤壞死因子家族，與相應受體結合後，可以快速誘導細胞發生凋亡。但與其它凋 亡誘導分子顯著不同的是，TRAIL主要殺傷轉化細胞和腫瘤細胞，而正常細胞可以逃逸它的 殺傷作用。體內研究表明，TRAIL可以明顯抑制腫瘤生長，甚至徹底清除腫瘤。TRAIL的這 種腫瘤細胞選擇性殺傷作用使該蛋白在抗腫瘤方面具有很強的開發價值與潛力。但是值得 注意的是，並非所有的腫瘤細胞對TRAIL都具有很強的敏感性。體外研究表明，有些腫瘤 細胞株對TRAIL誘導凋亡作用具有很強的耐受性。這可能與腫瘤細胞表面缺乏TRAIL受 體(DR4，DR5)，或分布有假受體(DcRl，DcR2)，或過度表達一些抗凋亡蛋白如bcl_2，FLIIP， survivin有關。因此TRAIL的抗腫瘤作用因不同的腫瘤類型而異。
研究表明，非小細胞肺癌細胞，如A549對TRAIL有明顯的耐受性，但具體的機理目 前並不清楚。為了充分發揮TRAIL對腫瘤細胞的選擇殺傷作用，有必要尋找新的策略以逆 轉非小細胞肺癌細胞株對TRAIL的敏感性，從而達到運用TRAIL有效治療非小細胞肺癌的 目的。而作為一個理想幹預手段必須具備以下特點1 顯著性增強TRAIL對非小細胞肺癌 細胞的細胞凋亡誘導作用；2 對非小細胞肺癌細胞具有高度的選擇性；即不會對正常細胞 及機體產生較強的非特異性的毒副作用。事實上，雖然有些化療藥物能明顯逆轉非小細胞 肺癌細胞株A549對TRAIL的敏感性，但這些化療藥物本身對腫瘤細胞的選擇性不夠強，因 此常常以造成對正常組織與細胞的損傷為代價。鈉鉀ATP酶是分布於真核生物細胞膜重要的離子轉運泵，通過消耗ATP能量將鈉 離子與鉀離子逆濃度梯度進行跨膜轉運，從而維持細胞膜內外穩定的鈉鉀離子濃度梯度、 細胞膜靜息電位與細胞滲透壓平衡。在興奮性細胞如神經元細胞或心肌細胞中，鈉鉀ATP 酶與動作電位產生、興奮信號傳遞密切相關。在非興奮性細胞如腎小管上皮細胞中，鈉鉀 ATP酶是腎小管對水分、鈉離子進行重吸收、營養物質攝取的關鍵蛋白，對維持機體電解質 平衡、酸鹼平衡、營養物質正常利用發揮至關重要的作用，鑑於此，機體平均1/3ATP能量用 於維持該泵的正常運轉。從天然植物洋地黃中提取的強心苷成分是鈉鉀ATP酶抑制劑與細胞膜鈉鉀ATP酶 α亞基有很強的親合力，結合後通過構象改變抑制鈉鉀ATP酶對Na+，K+離子的轉運能力，具 有多種生物活性。自1785年W. Withering使用紫花洋地黃葉(Digitalis purpurea)治療 水腫以來，至今已經在夾竹桃科、玄參科、十字花科、衛矛科等10幾個科的100多種植物中 發現強心苷，常見的較重要的有洋地黃毒苷(Digitoxin)，異羥基洋地黃毒苷(Digoxin)， 夾竹桃苷(Oleandrin)，烏本苷(ouabain)等。中藥洋地黃類成分長期以來一直用於治療充 血性心力衰竭及節律性障礙等心臟疾病，但同時該類成分也具有明顯的抗腫瘤效果。研究 表明，強心苷如digoxin，oleandrin以及ouabain能誘導多種腫瘤細胞，如淋巴瘤細胞、前 列腺癌細胞、神經膠質瘤細胞的凋亡或壞死，從而具有明顯的抗腫瘤效果。強心苷的這種抗腫瘤作用通常認為是由強心苷的細胞毒性引起的，因此人們對鈉 鉀ATP酶物質是否能用於腫瘤治療產生懷疑。但是越來越多的研究表明，強心苷，如哇巴因 在非毒性劑量下也能顯著性抑制腫瘤細胞的生長和轉移。遵循這樣的思路，我們在前期的 工作中發現鈉鉀ATP酶抑制劑哇巴因能在非毒性劑量(20-150nM)下很顯著性地增強非小 細胞肺癌細胞對TRAIL的敏感性，從而逆轉非小細胞肺癌細胞對TRAIL的耐受性。因此本 研究發明鈉鉀ATP酶抑制劑在抗腫瘤藥物製備中的新用途。

發明內容
本發明的目的是提供鈉鉀ATP酶抑制劑在抗腫瘤藥物製備中的新用途，即作為抗腫瘤增敏劑，該增敏劑能能顯著逆轉非小細胞肺癌細胞對TRAIL耐受性。本發明公開了哇巴因在增強非小細胞肺癌細胞對腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導 配體(TRAIL)敏感性中的應用。基於上述應用，哇巴因可作為治療非小細胞肺癌的增敏劑，與TRAIL聯合使用用 於非小細胞肺癌的治療。哇巴因也可以與TRAIL —起製成藥物組合物，從而在製備治療非小細胞肺癌的藥 物中應用。上述所說的應用中，哇巴因的劑量為(20-150nM)。本發明中經實驗顯示，哇巴因能顯著性提高非小細胞肺癌細胞膜DR4與DR5mRNA 的表達量，上調DR4與DR5可能是哇巴因增強TRAIL誘導的A549細胞凋亡的重要手段。在 毒性實驗中顯示，在明顯誘導A549細胞凋亡的情況下，TRAIL+哇巴因對正常細胞無明顯的毒性。通過細胞水平與裸鼠實驗，表明TRAIL與哇巴因的藥物組合能使非小細胞肺癌細 胞凋亡率接近90%，體內抗腫瘤實驗結果表明這兩種藥的組合使肺癌抑制率達到70%以 上。因此哇巴因除了具有強心利尿的傳統藥理作用外，尚能作為效果很好的抗腫瘤增敏劑。


圖1 哇巴因增強非小細胞肺癌細胞A549對TRAIL的敏感性圖2 哇巴因劑量依 賴性地增強非小細胞肺癌細胞A549對TRAIL的敏感性圖3 哇巴因聯用TRAIL對非小細胞 肺癌細胞A549核碎裂圖4 哇巴因聯用TRAIL對非小細胞肺癌細胞A549caSpaSe3活性激 活圖5 哇巴因選擇性增強非小細胞肺癌細胞對TRAIL的敏感性圖6 哇巴因上調A549細 胞表面死亡受體DR4與DR5mRNA表達水平圖7 哇巴因上調A549細胞表面死亡受體DR4與 DR5分布圖8 哇巴因與TRAIL聯用抑制裸鼠接種A549腫瘤生長曲線圖9 哇巴因與TRAIL 聯合應用抑制裸鼠接種A549腫瘤生長圖。
具體實施例方式實驗材料哇巴因、DAPI、PI、DEPC、Trizol購自Sigma公司，A549非小細胞肺癌細 胞株購自ATCC公司。DMEM細胞培養液、胰酶購自美國Hyclone公司。caSpaSe3檢測試劑盒 購自Biovision公司。EGFP-Armexin V為南京大學醫藥生物技術國家重點實驗室表達。流 式細胞儀FACS Calibur (美國Becton Dickson公司)，DR4與DR5抗體購自美國Milipore 公司，半乾半溼法蛋白質轉膜儀(美國Biorad公司)，DNA凝膠電泳儀(南京大學電子設備 廠)。逆轉錄體系dNTP、oligo(dT)18、RNase inhibitor、逆轉錄酶、PCR試劑盒均購自Takara 公司。瓊脂糖凝膠、EB購自南京大治生物公司。LipOfectamineTM2000購自美國Invitrogen 公司。實施例一 Armexin V/PI流式細胞儀法檢測TRAIL與哇巴因聯用致A549細胞凋 亡非小細胞肺癌細胞A549於DMEM+10%胎牛血清培養液中培養，培養條件為37°C，5% CO2 的溼潤無菌環境。細胞長至80%-90%融合時，用PBS洗滌2次，0.25%胰酶消化。按細胞量6X IO4/孔接種於24孔細胞培養板中。待細胞貼壁生長完全後，加入藥物分別為 TRAIL10ng/ml, TRAIL 10ng/ml+哇巴因 ΙΟΟηΜ，TRAIL 20ng/ml, TRAIL 20ng/ml+哇巴因 IOOnM, TRAIL 50ng/ml, TRAIL 50ng/ml+哇巴因 ΙΟΟηΜ，TRAIL lOOng/ml, TRAIL100ng/ml+ 哇巴因 ΙΟΟηΜ，TRAIL 200ng/ml, TRAIL 200ng/ml+哇巴因 ΙΟΟηΜ，TRAIL400ng/ml, TRAIL 400ng/ml+哇巴因ΙΟΟηΜ，每組3個孑L (圖1)，或分別為TRAIL100ng/ml+哇巴因ΙΟηΜ，哇巴 因 10nM，TRAIL 100ng/ml+哇巴因 20nM，哇巴因 20nM，TRAIL100ng/ml+哇巴因 30nM，哇巴因 30nM, TRAIL 100ng/ml+ 哇巴因 50nM，哇巴因 50nM，TRAIL100ng/ml+ 哇巴因 ΙΟΟηΜ，哇巴因 ΙΟΟηΜ，每組3個孔(圖2)。
細胞經藥物處理12h後收集，用預冷PBS洗2遍，加入EGFP標記的Armexin V(2 μ L)，冰上孵育20min，迅速加入PI (1 μ g/mL)，於流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況， Annexin V(+)/PI(_)為早期凋亡細胞。結果採用Armexin V/PI雙染法考察A549細胞對TRAIL的敏感性，發現只有在使 用TRAIL達到400ng/ml時，才使得A549細胞有輕微的細胞凋亡發生，表明該細胞對TRAIL 並不敏感(圖1)。同樣，哇巴因在使用濃度到IOOnM時，本身對腫瘤細胞具有輕微的細胞 凋亡作用(圖2)，但是兩藥的聯用能極顯著性地增強A549細胞對細胞凋亡的敏感性，從 圖1中可知，在哇巴因使用濃度為IOOnM時，TRAIL能劑量依賴性地增強A549細胞凋亡，在 TRAIL使用濃度達到lOOng/ml時，已經能使細胞凋亡達到75%以上，表明TRAIL與哇巴因 組合是很有前景的藥物組合。同樣地，從圖2中可知，當TRAIL使用濃度為lOOng/ml時，哇 巴因也能劑量性地增強A549細胞凋亡。實施例二螢光顯微鏡法檢測TRAIL與哇巴因聯用致A549細胞核碎裂非小細胞肺 癌細胞A549於DMEM+10%胎牛血清培養液中培養，培養條件為37°C，5% CO2的溼潤無菌環 境。細胞長至80%-90%融合時，用PBS洗滌2次，0.25%胰酶消化。按細胞量IX IO5/孔 接種於6孔細胞培養板中。培養板中預先放置滅菌過的蓋玻片面，待細胞貼壁生長至60% 時，加入藥物處理，分別為對照組、TRAIL 100ng/ml, TRAIL 100ng/ml+哇巴因50nM，TRAIL lOOng/ml,TRAIL 100ng/ml+哇巴因50nM，每組重複3個孔(圖3)。處理12h後，將載玻片 取出，冷PBS洗滌2次，滴加DAPI (1 μ g/ml)數滴後於螢光顯微鏡上觀察，拍片。結果DAPI是一種常見的細胞核染料，能摻入到核DNA中，在激發光作用下，呈現 藍色核，通過觀察發現(圖3)，單用哇巴因50nM與TRAILlOOng/ml時，細胞核相對完整，沒 有明顯的細胞凋亡核碎裂，但是當TRAIL與哇巴因聯用時，細胞核破碎明顯，進一步表明哇 巴因能增強A549細胞對TRAIL的敏感性。實施例三TRAIL與哇巴因對caspasd水解酶活性的影響非小細胞肺癌細胞A549 於DMEM+10%胎牛血清培養液中培養，培養條件為37°C，5% CO2的溼潤無菌環境。細胞長 至80% -90%融合時，用PBS洗滌2次，0. 25%胰酶消化。按細胞量6 X IO4/孔接種於24 孔細胞培養板中。加入藥物處理，分別為對照組、TRAIL100ng/ml，TRAIL 100ng/ml+哇巴因 50nM, TRAIL lOOng/ml, TRAIL 100ng/ml+ 哇巴因 50nM，每組重複 3 個孔(圖 4)。處理 12h 後，將細胞用胰酶消化後，加入FITC標記的DEVD. fmk 1_2 μ 1，於冰上孵育30min後，PBS洗 2遍，流式細胞儀分析FITC螢光強度。結果當細胞處於凋亡狀態時，會引起CaSpaSe3的激活，從而使細胞中諸多蛋白 質發生非選擇性切割，最終使細胞走向凋亡。採用流式細胞儀方法考察TRAIL與哇巴因對caspase3水解酶活性的影響，底物為FITC-DEVE. fmk。其基本原理在於當細胞內caspase3 酶激活時，會切割FITC-DEVD. fmk，從而使細胞內螢光能在488nm激發光激發下被檢測到 (圖4)。結果與免疫螢光相符，在單用TRAIL或哇巴因情況下，細胞內caSpaSe3酶激活不 明顯，但是兩藥的聯用，細胞內caspasd被激活。實施例四毒性實驗HEK293與A549細胞分別於DMEM+10 %胎牛血清培養液中培養， 培養條件為37°C，5% CO2的溼潤無菌環境。細胞長至80% -90%融合時，用PBS洗滌2次， 0.25%胰酶消化。按細胞量5X IO3/孔接種於96孔細胞培養板中。加入藥物TRAIL IOOng/ ml+哇巴因IOOnM處理0，8，12，24，48h，每組重複3個孔(圖5)，處 理12h後，收集細胞，按 實施例一檢測A549與HEK293細胞凋亡。結果為考察TRAIL與哇巴因的聯用增效作用是否對正常細胞具有毒性副作用。 本研究比較TRAIL100ng/ml+哇巴因(IOOnM)在正常細胞株(HEK293)及腫瘤細胞株(A549) 上的細胞毒性差異。結果見圖5，在明顯誘導A549細胞凋亡的情況下，TRAIL+哇巴因對正 常細胞無明顯的毒性，這些數據說明TRAIL+哇巴因對腫瘤具有明顯的選擇性，是具有開發 前景的治療方案。實施例五哇巴因對A549細胞DR4與DR5mRNA與蛋白質表達的影響1、細胞mRNA的 提取所有物品均提前用DEPC處理並滅菌。非小細胞肺癌細胞A549於DMEM+10%胎牛血清 培養液中培養，培養條件為37°C，5% CO2的溼潤無菌環境。細胞長至80% -90%融合時，用 PBS洗滌2次，0.25%胰酶消化。按細胞量1X105/孔接種於6孔細胞培養板中。鋪細胞 於6孔板，等細胞長到80% -90%後，加藥(分別為哇巴因0，50，100，200nM)，處理12h後 收集細胞，PBS洗滌一次。加入ImL TRIZ0L，用槍吹打至細胞完全溶解，室溫放置5min。加 入200 μ L的氯仿，振蕩15s後放置2-3min，2-8°C 12000g離心15min。吸取上層，轉移到幹 淨印pendorf管中，加入500μ L異丙醇，放置10min，2_8°C下12000g離心lOmin，可見RNA 沉澱。棄上清，加入lmL75%乙醇洗滌沉澱，7500g離心5min，在空氣中晾乾RNA沉澱，加入 30 μ L DEPC處理的DDW溶解。2.、逆轉錄PCR採用20 μ L逆轉錄體系，將提取的模板RNA約1 μ g與 5Xbuffer4μ L, dNTP(IOmM)2 μ L, oligo(dT) 18(10 μ mol/L)1 μ L,RNase Inhibitorl μ L，逆 轉錄酶1 μ L混勻後30°C水浴lOmin，42°C水浴30min，98°C水浴lOmin。取等量的cDNA做模 板做 PCR 擴增，採用 20 μ L PCR 反應體系:DDW15. 2 μ L, IOXTaq buffer2. 5 μ L, dNTP2 μ L, Mg2+2 μ L，上遊引物 1 μ L，下遊引物 1 μ L，cDNA 模板 1 μ L，Taq polymeraseO. 3 μ L。PCR 條 件94°C熱變性4min後；94°C變性40s，55°C退火40s，72°C延伸40s (循環數為20-45個)； 最後72°C延伸7min。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，EB顯色。3、流式細胞儀檢測細胞膜DR4與DR5分布非小細胞肺癌細胞A549於DMEM+10%胎 牛血清培養液中培養，培養條件為37°C，5% CO2的溼潤無菌環境。細胞長至80% -90%融 合時，用PBS洗滌2次，0. 25%胰酶消化。按細胞量IX 105/孔接種於6孔細胞培養板中。 收集藥物處理後細胞，PBS洗滌2遍後，加入含2% BSA的PBS預包被30min後，洗滌，加入 4μ 1 DR4或DR5抗體，孵育Ih後，洗滌，加入FITC標記二抗孵育lh，PBS洗滌2次後，加入 1 μ g/ml PI後，流式細胞儀檢測細胞FITC的螢光強度。結果TRAIL死亡受體是決定腫瘤細胞對TRAIL是否有敏感性的重要因素，本研究 發現哇巴因能顯著性提高A549細胞內DR4與DR5mRNA的表達量(圖6)。對細胞膜DR4與DR5包被特異性抗體及FITC標記的二抗後，流式細胞儀技術分析細胞膜DR4與DR5的表達情況(圖7)，結果顯示哇巴因能顯著性增加細胞膜表面DR4與DR5的分布。
實施例六哇巴因聯用TRAIL用藥的體內抗腫瘤作用取指數生長期的A549細胞，經 胰酶消化後，用PBS洗2遍。將每隻100 μ LlO7個Α549細胞皮下注射到7周齡的裸鼠右側 背部皮下，一周後形成原位腫瘤，將小鼠分成4組，每組8隻。然後開始治療，分別用PBS、 哇巴因2 μ g/只、TRAILlOOyg/只、哇巴因/TRAIL聯合治療組進行裸鼠腹腔注射，每天注 射一次，共治療15次。從開始治療後每三天測量腫瘤大小，並按下列公式計算腫瘤體積 0. 5236 X Ll X (L2)2，其中Ll為腫瘤長軸，L2為腫瘤短軸。開始治療後第25天，處死小鼠， 進行數據分析。結果接種A549細胞於裸鼠形成人源肺癌實體瘤，由於正常情況下，A549 低表達TRAIL受體DR4與DR5，對TRAIL誘導凋亡作用具有很強的抵抗性，所以單用TRAIL 抗腫瘤效果並不顯著。而通過TRAIL與哇巴因聯合治療異體接種A549負瘤裸鼠，顯示出明 顯的治療效果，腫瘤體積顯著小於其他三組(圖8，9)。
權利要求
哇巴因在增強非小細胞肺癌細胞對腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體敏感性中的應用。
2.哇巴因作為治療非小細胞肺癌的增敏劑。
3.哇巴因在製備治療非小細胞肺癌的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及鈉鉀ATP酶抑制劑哇巴因在逆轉非小細胞肺癌細胞對靶向性抗腫瘤藥物耐受的新用途。具體是哇巴因可作為治療非小細胞肺癌的增敏劑，與TRAIL聯合使用用於非小細胞肺癌的治療。
文檔編號A61K38/17GK101869574SQ201010235528
公開日2010年10月27日 申請日期2010年7月24日 優先權日2010年7月24日
發明者馮速, 華子春, 殷武 申請人:南京大學