家蠶BmSpry基因及其應用的製作方法

2023-12-11 22:49:22 5

專利名稱：家蠶BmSpry基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物基因領域，特別是涉及家蠶的控制家蠶對核型多角體病毒 (BmNPV)抗性的關鍵基因。
背景技術：
蠶桑生產是絲綢工業的基礎，在我國很多農村地區，養蠶業是當地經濟的支柱性產業和農民的主要經濟收入來源，蠶絲業每年為蠶農創收上百億元。核型多角體病毒病是蠶業生產上最常見而且危害最嚴重的一類蠶病，引起該病的病原為核型多角體病毒 (BmNPV)，該病的傳染力極強並且難以控制，全國各蠶業主產區經常因為該病的爆發而造成嚴重的經濟損失。由於BmNPV在蠶業生產上危害嚴重，科研工作者對它的病原特性、感染性和抵抗性作了持續深入的研究。目前的研究結果顯示不同的家蠶品種對BmNPV的抵抗性不一樣， 家蠶對BmNPV的抵抗性是由多基因控制的，其中至少有一個是主效基因。對家蠶抗性關鍵基因及其調控序列進行克隆和鑑定，為闡明家蠶抵抗BmNPV的機制，以及培育抗性品種應用於蠶業生產有著重要的理論價值和實踐意義。

發明內容
本發明的目的之一在於提供一段核苷酸序列及其製備方法，該序列為家蠶調控核型多角體病毒抗性的關鍵基因。為實現上述目的，本發明的技術方案為
家蠶BmSpry基因，所述家蠶BmSpry基因的核苷酸序列含有如SEQ ID NO 1所示。進一步，所述家蠶汝基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。所述的家蠶汝基因的製備方法，以家蠶大造品種全蠶或者組織cDNA為模板進行PCR擴增，設計的上遊引物為F 5' - cggtcgtttcgttggagc-3』，設計的下遊引物為R 5，- atttgcgtagaatccaaaatactaac-3，，PCR 反應條件為94°C預變性 4 分鐘，然後 94°C變性 40秒、58 °C退火40秒、72 °C延伸1分鐘，共30個循環，最後72°C延伸10分鐘，得如SEQ ID NO 2所示的家蠶BmSpry基因。本發明的目的之二在於提供家蠶基因的應用，該應用為調控家蠶核型多角體病毒抗性提供了新方法。為實現上述目的，本發明的技術方案為
所述的家蠶基因在調節家蠶型多角體病毒抗性中的應用。本發明的有益效果在於通過對轉基因家蠶敏感系統LI-S進行檢測，克隆得到了一個家蠶抗性關鍵基因徹分iT全長序列，包括213bp的5』非翻譯區序列(5』Untranslated region，5，UTR)、642bp 編碼區序列(Coding sequence，CDS)和 332 bp 的 3，非翻譯區序列 (3』UTR)。徹分^基因表達量降低一半導致家蠶對BmNPV的抵抗性降低了 100倍，本發明克隆和鑑定了一個影響家蠶對BmNPV抗性的關鍵基因。汝基因在培育家蠶抗BmNPV品種的理論研究和生產應用中都具有重要的價值。


圖1為LI-S和正常大造添食不同濃度BmNPV以後的死亡率統計結果。圖2為LI-S外源片段在家蠶基因組和染色體上的插入位點分析。圖3為RT-PCR檢測正常大造和LI-A以及LI-S中BmSpry的表達量。圖4為定量PCR檢測正常大造和LI-A以及LI-S中BmSpry的表達量。圖5為插入位點附近其他基因RT-PCR檢測結果。圖6為BmSpry基因的結構示意圖(上)和全長序列及對應的胺基酸序列(下)。
具體實施例方式實施例1轉基因家蠶LI-S和LI-A的構建
一構建轉基因增量表達載體pBac[IElP- lipase-l-3XP3-EGFPafm] 1用幻招/和/雙酶切載體pBSII-IEl-orf，回收穫得IEl啟動子片段，並把其連入 L4440 載體，用 SV40 引物(SV40 F: 5 『-tgctctagaagatcataatcagccata-3，，SV40 R: 5 '-ggaagatctgcagtgaaaaaaatgctt-S' )hk piggyBac [3Xp3 EGFP afm]中擴增出 SV40 終止信號，由於引物兩端分別加有損a /和勒#酶切位點，以此兩個酶雙酶切把SV40加入已經帶有IEl啟動子的L4440載體，這樣重組載體L4440-IE1P-SV40中既包含IEl啟動子序列，又含有SV40終止信號。2 用 Bmlipase-1 弓丨物(Lipase-1 F: 5 '-ccggaattcatgcctgatggcgagggtgt- 3，， Lipase-I R: 5 '-ctagtctagattagaaaggccaactgctgcc-S') ^C H Φ J cDNA Φ Γ ±1 Bmlipase-I的CDS序列(如SEQ ID NO:3所示)，TA克隆連入pMD19_T simple載體，進行 PCR和酶切檢測確定無誤，並送由上海生物工程有限公司測序做進一步驗證。3用損a /和分別雙酶切L4440-IE1P-SV40和Bmlipase-1 T克隆質粒，連接重組後，得到含有增量表達骨架結構(包含啟動子、表達基因序列和終止信號)的L4440-IElP- Bmlipase-l-SV40 重組載體。4 用 ^7/7 / 和 II 分別酶切 pSLfall80fa 載體禾Π L4440- IElP-Bmlipase-l-SV40 重組載體，連接重組後，得 1180- IElP- Bmlipase-l_SV40 重組載體。5用限制性內切酶Asc I分別酶切1180- IElP- Bmlipase-l_SV40及 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]質粒。由於pSLfall80fa載體骨架在多克隆位點兩端都含有一個Asc /位點，切下的增量表達骨架結構便可與經Asc /酶切後5』端去磷酸化的piggyBac 3Xp3 EGFP afm線性片段連接，形成最終的轉基因增量表達載體pBac[IElP-Bmlipase-l-s v40-3XP3-EGFPafm]。上述實驗的完成參見了西南大學陳杰的《增量表達抗病毒蛋白Bmlipase-1的家蠶轉基因系統的建立》一文。二轉基因顯微注射和陽性個體的篩選
1將家蠶大造品種蠶卵浸酸解除滯育以後，放於15°C和80%溼度的黑暗環境中催青直至孵化，將蟻蠶收好置於標準環境中飼養，化蛾以後將雌雄蠶蛾交配4h，拆對後產下的蠶卵為非滯育蠶卵，用於下一步的顯微注射；
2將產下的蠶卵在乾淨的載玻片上排列整齊，在蠶卵產後2h用Eppendorf顯微注射儀將實施例1所得的轉基因增量表達載體pBac [IElP-Bmlipase-l-sv40-3XP3-EGFPafm] 和輔助質粒A3H，一起注射進932粒大造蠶卵中，用無毒膠水封口以後置於25°C、相對溼度 80%的環境中催青孵化，將孵化的510頭GO代蟻蠶用桑葉收集飼養至化蛾；
3 GO代蠶蛾通過自交或回交共獲得32蛾圈Gl代蠶卵，用Olympus 電動宏觀螢光顯微鏡觀察篩選並獲得7個陽性蛾圈，轉化效率為21. 88%。三轉基因系統的抗性檢測
1將實施例2所得的7個陽性蛾圈各自單蛾圈飼養，繼代擴大得到7個轉基因系統Li， 隨機選擇3個轉基因系統進行後續的抗性檢測。2取3個轉基因系統和正常大造品種，在4齡起蠶時期以半致死劑量單頭經口添食BmNPV病毒，4個系統各設置3個重複區，每個重複區100頭蠶，同時每個系統設置3個不攻毒對照區，死亡率統計到化蛾時期；
3攻毒結果顯示3個轉基因系統中有兩個系統(分別命名為LI-A和LI-B)提高了家蠶對BmNPV的抗性(符合我們的預期結果)，但其中一個系統(命名為LI-SWfBmNPV的抗性明顯降低。抗性檢測結果顯示和正常大造系統相比較，轉基因系統LIA—直具有明顯的抗性效果，能降低35%左右的死亡率。LI-S對BmNPV的抵抗性比正常親本低了 100倍左右。 具體為
(1)將LI-A、LI-S和正常大造蠶卵浸酸(鹽酸比重為1.073，溫度為46°C，時間為5分鐘)解除滯育以後，放於25°C和85%溼度的環境中催青10天左右直至孵化，將蟻蠶收好置於標準環境中飼養(溫度25°C，溼度80%)。(2)在四齡起蠶經口添食BmNPV病毒檢測抗性。將新鮮的桑葉切成直徑一釐米的小塊，然後將病原塗抹在切好的桑葉小塊上面，一頭蠶單獨吃一小塊塗抹過病原的桑葉，只有將這小塊桑葉吃完了的蠶才被挑選出來繼續飼養，統計死亡率到化蛾。攻毒數據統計結果(圖1)顯示，在四齡起蠶以IO4多角體/頭經口添食感染BmNPV後，正常親本(大造)和 LI-S的死亡率分別為10%和50%左右；在以IO6多角體/頭經口添食感染BmNPV後，正常親本(大造)和LI-S的死亡率分別為50%和80%左右。和正常親本相比，LI-S對BmNPV的抵抗性降低了 100倍左右。實施例2檢測LI-S中外源片段的插入位點一反向PCR鑑定LI-S外源片段的插入位點
取20 μ g實施例1提及的LI-S的基因組在37°C用湯e//Jl切過夜，酶切產物純化後用Solution I (購買自TaKaRa)進行連接，以自連產物為模板，用轉座子特異的引物進行 PCR 擴增(pb-left F: 5 '-atcagtgacacttaccgcattgaca-3，，pb-left R: 5 '-tgacgagct tgttggtgaggattct-3')，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然後94°C變性40秒、54°C退火40秒、72 °C延伸2分鐘，共30個循環，最後72°C延伸10分鐘；PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑑定並回收，然後與PMD19-T載體連接，連接反應在T4 DNA連接酶作用下，16°C過夜連接，然後轉化DH5ci感受態細胞，獲得陽性克隆後送往上海生工生物技術有限公司測序。將測序結果在家蠶基因組資料庫中進行比對，結果(圖2)顯示外源片段插入在nsCafl898的12392322處，其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示，其距離最近的上遊基因35. 8Kb，距離最近的下遊基因14. 6Kb。二 LI-S外源片段插入位點的再次確定
根據反向PCR的結果和家蠶基因組序列，設計兩對引物對插入位點再次進行檢測 (LlS-Pb-l F :5'-acaagcacgcctcacgg-3', R :5'_tacaacaagcaaacatagcga_3' ；LIS_Pb_2 F 5' - taccgcattgacaagcac-3，, R 5' _actcgatatgcctgctcc_3，),每對弓丨物的上遊弓丨物在插入的載體序列上，下遊引物在家蠶基因組上。以LI-S基因組為模板，用LIS-Pb-I和 LIS-Pb-2兩對引物進行PCR擴增，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然後94°C變性40 秒、52 °C退火40秒、72 °C延伸35秒，共30個循環，最後72°C延伸10分鐘。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，發現擴增出目地條帶，將目的條帶回收連接轉化，挑取陽性克隆測序。測序結果顯示反向PCR的結果是正確的，LI-S的外源片段確實插入在家蠶基因組nscaf 1898的 12392322 處(圖 2)。實施例3檢測LI-S外源片段插入位點附近基因的表達量變化情況
在家蠶基因組資料庫中下載插入位點附近的基因序列和對應的EST序列，結果顯示在距離插入位點150kb範圍內，插入位點上遊基因BGI000882、BGI001264、BGI001265 (上述基因詳見家蠶基因組資料庫)有EST證據，插入位點下遊基因BGI000879、BGI001266、 BGI001267、BGI001268、BGI001269 (上述基因詳見家蠶基因組資料庫)有EST證據。 選擇上述基因設計檢測引物(BGI001266QRT F 5' -cgtgaaggcgctgttctacca-3，，R 5，-gcggcgggactagataatactgg-3，；其他基因檢測引物略)。插入位點下遊距離最近的基因為BGI001266基因。通過RT-PCR進行檢測，RT-PCR 的反應條件為94°C預變性4分鐘，然後94°C變性40秒、58°C退火40秒、72°C延伸30秒， 共30個循環，最後72°C延伸10分鐘。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果發現除了 LI-S中BGI001266基因表達量降低以外(圖3)，其他基因的表達量在LI_A、LI_S和正常大造中沒有區別(圖5)；定量PCR的結果顯示，和正常大造和LI-A相比，LI-S中BGI001266 的表達量降低了一半(圖4)。LI-A外源片段插入在家蠶基因組12號染色體的nsCaf2987 上(TTACAGCGACTTAAACTTCTTTAA-piRRyBac-TTAAAGTTGCTATTTTCATCAG)，LI-A 插入位點附近的基因表達量沒有受到影響。由於LI-S和LI-A唯一的區別就是外源片段在家蠶基因組上的插入位點不一樣，所以，LI-S對BmNPV病毒抵抗性大幅降低是由外源片段的插入導致 BGI001266表達量降低引起的。實施例4克隆BGI001266基因全長序列
在家蠶基因組資料庫中下載該基因的EST序列，根據家蠶基因組序列和該基因的 EST 序列，設計引物克隆該基因(BGI001266qc F 5' -cggtcgtttcgttggagc-3，，R :5，-atttgcgtagaatccaaaatactaac-3，)。以家蠶大造品種5齡3天幼蟲cDNA為模板進行PCR 擴增，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然後94°C變性40秒、58°C退火40秒、72°C延伸 1分鐘，共30個循環，最後72°C延伸10分鐘。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，發現擴增出目地條帶，將目的條帶回收連接轉化，挑取陽性克隆測序。測序結果顯示我們克隆了 BGI001266的1190bp全長序列，如SEQ ID NO:2所示， 包括 213bp 的 5，UTR、642bp CDS (如 SEQ ID NO: 1 所示)和 332 bp 的 3，UTR。該基因的GC含量高達71. 5%，有兩個外顯子，編碼區序列(Coding sequence，CDS)位於第2外顯子上面。LI-S外源片段的插入位點距離該基因有14. 6Kb。生物信息學分析發現該基因具有一個Spry的結構域，我們將其命名為iMST/T。在 NCBI站點上用BLAST完成序列同源性分析，結果沒有發現該基因的報導，說明BmSpry基因是一個新基因。BmSpry的全長序列以及對應的胺基酸序列如圖6所示。查閱相關文獻報導(Hong Joo Kim. Modulation of signalling by Sprouty: a developing story. (J) NATURE REVIEWS. 2004; Mark A. Lemmon. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. (J) Cel1. 2010; Susumu Katsuma. ERK- and JNK-Dependent Signaling Pathways Contribute to Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus Infection. (J) J Virol. 2007)，我們發現Spry基因是MAPKs信號傳導通路上遊的一個負調控因子，BmNPV感染家蠶後利用MAPKs信號通路來進行複製增殖，當用抑制劑分別抑制家蠶細胞中MAPKs信號傳導通路的ERK和JNK蛋白後，家蠶細胞中的病毒含量明顯減少。在LI-S系統中，由於外源片段插入到BmSpry基因上遊，可能破壞了汝aS^f基因的調控序列，從而導致的表達量降低一半，導致對MAPKs信號通路的抑制能力減弱。 當BmNPV感染家蠶後，病毒能更加容易的利用該信號通路進行複製增殖，最終導致家蠶對 BmNPV的抵抗性嚴重降低。所以，BmSpry基因是控制家蠶對BmNPV的抵抗性的關鍵基因。最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和範圍。
權利要求
1.家蠶汝基因，其特徵在於，所述家蠶汝基因含有如SEQID NO: 1所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的家蠶徹分^基因，其特徵在於，所述家蠶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.權利要求1所述的家蠶基因的製備方法，其特徵在於以家蠶大造品種全蠶或者組織cDNA為模板進行PCR擴增，設計的上遊引物為F 5' - cggtcgtttcgttggagc-3'， 設計的下遊引物為R 5' - atttgcgtagaatccaaaatactaac-3，，PCR反應條件為94°C預變性 4分鐘，然後94°C變性40秒、58 °C退火40秒、72 °C延伸1分鐘，共30個循環，最後72 °C延伸 10分鐘，得如SEQ ID N0:2所示的家蠶汝基因。
4.權利要求1所述的家蠶基因在調節家蠶核型多角體病毒抗性中的應用。
全文摘要
本發明涉及生物基因領域，特別是涉自於家蠶的控制家蠶對核型多角體病毒(BmNPV)抗性的關鍵基因，所述家蠶BmSpry基因含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；其以家蠶cDNA為模板進行PCR擴增而得，其在調節家蠶型多角體病毒抗性中的應用；BmSpry基因表達量降低一半導致家蠶對BmNPV的抵抗性降低了100倍，本發明克隆和鑑定一個影響家蠶對BmNPV抗性的關鍵基因；BmSpry基因在培育家蠶抗BmNPV品種的理論研究和生產應用中都具有重要的價值。
文檔編號C12N15/10GK102392025SQ20111037830
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月24日 優先權日2011年11月24日
發明者夏慶友, 徐漢福, 王根洪, 程廷才, 蔣亮, 金盛凱, 陸改 申請人:西南大學