三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統及其製備方法和應用的製作方法

2023-12-11 23:30:17 3

三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統，其包括分離膠和濃縮膠。該三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統在蛋白電泳時，尤其是小分子蛋白，如分子量在10kDa左右的蛋白分子，只需要在室溫下就可操作，電泳時間短，一般在120～140V恆壓下電泳2～3小時即可，且染色和脫色時間非常短，一般只需染色1分鐘，脫色10分鐘即可，節約時間，電泳效率大大提高，同時降低了成本。使用該三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統進行小分子蛋白電泳，方法簡單，高效，且解析度高，可清晰的檢測小分子蛋白。此外，本發明還涉及一種三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統的製備方法和應用。
【專利說明】三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物檢測領域，尤其是涉及一種三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統及其製備方法和應用。
【背景技術】
[0002]在機體的生理調節過程中，許多調節因子不僅含量少，而且分子量也很小，在蛋白質的生化分析和基因表達產物的分離純化中，難免會需要檢測某種或某些小分子蛋白質成分，而小分子蛋白成分等的分離純化一直是研究的難點。
[0003]聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)是分離蛋白質的常用生化方法。蛋白質分子在熱變性解聚後與SDS結合形成帶負電的蛋白質-SDS複合物。複合物在電泳中的遷移率取決於蛋白質的分子大小。當使用均勻濃度的SDS-PAGE來分析分子量在15-200kDa的蛋白質時，電泳遷移率與分子量的對數成線性關係。但常規的Tris-甘氨酸-鹽酸系統中電泳分離分子量小於IOka的多肽效果較差。
[0004]傳統的用於分離小分子量蛋白分子的Tricine (N-三(羥甲基)甲基甘氨酸)-SDS-PAGE方法，可檢測分子量在1-1OOkDa的蛋白質。但該方法需配製正負兩極緩衝液和多種丙烯醯胺儲存液，且需置於冰上電泳，電泳時間大於7個小時，染色3小時，脫色24小時，操作繁瑣，耗時長。

【發明內容】

[0005]基於此，有必要提供一種操作簡便的可用於小分子量蛋白分析的三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統及其製備方法和應用。
[0006]一種三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統，包括:
[0007]分離膠，所述分離膠的配製配方是每580 μ L的水中含有792 μ L的質量體積濃度為40%的丙烯醯胺、1.792mL的Tris-HCl緩衝液、32 μ L的質量體積濃度為10%的過硫酸銨以及2μ L的N，N，N, ，Ν,-四甲基乙二胺；以及
[0008]濃縮膠，位於所述分離膠上，所述濃縮膠的配製配方是每870 μ L的水中含有119 μ L的質量體積濃度為40%的丙烯醯胺、182 μ L的Tris-HCl緩衝液、24 μ L的質量體積濃度為10%的過硫酸銨以及1.2μ L的N，N，N' ,N'-四甲基乙二胺；
[0009]所述濃縮膠與所述分離膠的長度比為1:4 ;且所述Tris-HCl緩衝液的配製配方是每60mL水中含有30.2g三羥甲基氨基甲烷，鹽酸調節pH至8.8，加水補至三羥甲基氨基甲烷的濃度為0.302g/mL。
[0010]在其中一個實施例中，所述電泳系統還包括電泳液，所述電泳液的配方是每IL水中含有3.03g的三羥甲基氨基甲烷、4.5g的N-三(羥甲基)甲基甘氨酸和0.5g的十二烷基橫酸納。
[0011]在其中一個實施例中，所述電泳系統還包括2X蛋白樣品加樣緩衝液，所述2X蛋白樣品加樣緩衝液的配製配方是每0.002g考馬斯亮藍G-250與2mL pH為6.8的4XTris-Cl/SDS緩衝液、2.4mL甘油、0.8g的十二烷基磺酸鈉以及0.31g的二硫蘇糖醇溶解混合後用水定容至10mL。
[0012]在其中一個實施例中，所述電泳系統還包括染色液，所述染色液配製配方是每250mL分析純甲醇與50mL分析純乙醇及Ig考馬斯亮藍G-250充分混合後用水定容至500mL。
[0013]一種三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統的製備方法，包括如下步驟:
[0014]配製分離膠:對垂直板聚丙烯醯胺凝膠電泳的側板進行壓條封邊後，按照每580 μ L的水中含有792 μ L的質量體積濃度為40%的丙烯醯胺、1.792mL的Tris-HCl緩衝液、32 μ L的質量體積濃度為10%的過硫酸銨以及2 μ L的N，N，N' ,N'-四甲基乙二胺的配方比例將各原料物質混合後加入至膠床中，至所述側板的4/5高度處，立即用水封頂；
[0015]待水與膠出現分界線後，配製濃縮膠:棄去封頂的水，按照每870 μ L的水中含有119 μ L的質量體積濃度為40%的丙烯醯胺、182 μ L的Tris-HCl緩衝液、24 μ L的質量體積濃度為10%的過硫酸銨以及1.2μ L的N，N，N'，Ν'-四甲基乙二胺的配方比例將各原料物質混合後加入至所述分離膠上，灌滿至所述側板的高度，插入電泳梳子，待所述電泳梳子與濃縮膠之間出現縫隙即完成製備；
[0016]其中，所述Tris-HCl緩衝液的配製配方是每60mL水中含有30.2g三羥甲基氨基甲烷，鹽酸調節PH至8.8，加水補至三羥甲基氨基甲烷的濃度為0.302g/mL。
[0017]在其中一個實施例中，所述電泳系統的製備方法還包括電泳液的配製步驟，具體是按照每3.03g的三羥甲基氨基甲烷與4.5g的N-三(羥甲基)甲基甘氨酸及0.5g的十二烷基磺酸鈉的配方比例將各原料物質溶解至IL的水中。
[0018]在其中一個實施例中，所述電泳系統的製備方法還包括2X蛋白樣品加樣緩衝液的配製步驟，具體是按照每0.002g考馬斯亮藍G-250與2mL pH為6.8的4XTris-Cl/SDS緩衝液、2.4mL甘油、0.8g的十二烷基磺酸鈉以及0.31g的二硫蘇糖醇的配方比例將各原料物質混合後，用水定容至10mL。
[0019]在其中一個實施例中，所述電泳系統的製備方法還包括染色液的配製步驟，具體是按照每250mL分析純甲醇與50mL分析純乙醇及Ig考馬斯亮藍G-250的配方比例將各原料物質充分混合後用水定容至500mL,過濾後收集濾液備用。
[0020]一種蛋白質電泳方法，包括如下步驟:
[0021]按照上述任一實施例所述的三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統的製備方法製備所述三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統；
[0022]採用電泳儀進行垂直板三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳，將樣品添加至加樣槽中，在120?140V恆壓電泳2?3小時,待指示蛋白的指示線剛剛超過凝膠電泳的標記位置後停止電泳；
[0023]用配製好的染色液微波染色I分鐘，再在水中微波脫色10分鐘。
[0024]上述三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統在蛋白電泳時，尤其是小分子蛋白，如分子量在IOkDa左右的蛋白分子，只需要在室溫下就可操作，電泳時間短，一般在120?140V恆壓下電泳2?3小時即可，且染色和脫色時間非常短，一般只需染色I分鐘，脫色10分鐘即可，節約時間，電泳效率大大提高，同時降低了成本。使用該三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統進行小分子蛋白電泳，方法簡單，高效，且解析度高，可清晰的檢測小分子蛋白。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為實施例部分的小分子量標記蛋白的電泳結果圖。
【具體實施方式】
[0026]下面主要結合附圖及具體實施例對本發明三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統及其製備方法和應用作進一步詳細的說明。
[0027]—實施方式的三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統包括分離膠和濃縮膠。
[0028]其中，分離膠的配製配方是每580 μ L的水中含有792 μ L的質量體積濃度(本發明所述的質量體積濃度即溶質質量與溶液體積比)為40%的丙烯醯胺、1.792mL的Tris-HCl緩衝液、32 μ L的質量體積濃度為10%的過硫酸銨(AP)以及2 μ L的N，N，N' ,N'-四甲基乙二胺(TEMED)。
[0029]濃縮膠位於分離膠一側。濃縮膠的配製配方是每870 μ L的水中含有119 μ L的質量體積濃度為40%的丙烯醯胺、182 μ L的Tris-HCl緩衝液、24 μ L的質量體積濃度為10%的過硫酸銨以及1.2μ L的N，N，N, ，Ν,-四甲基乙二胺。
[0030]濃縮膠與分離膠的長度比為1:4。
[0031]Tris-HCl緩衝液的配製配方是每60mL水中含有30.2g三羥甲基氨基甲烷，鹽酸調節pH至8.8，加水補至三羥甲基氨基甲烷的濃度為0.302g/mL。
[0032]此外，在本實施方式中，該電泳系統還包括電泳液、2X蛋白樣品加樣緩衝液(本發明所述的「 X 」及前面的數字表示在使用時稀釋相應的倍數)以及染色液。其中，電泳液的配方是每IL水中含有3.03g的三羥甲基氨基甲烷(Tris-base)、4.5g的N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)和0.5g的十二烷基磺酸鈉(SDS)。2X蛋白樣品加樣緩衝液的配製配方是每0.002g考馬斯亮藍G-250與2mL pH為6.8的4X Tris-Cl/SDS緩衝液(在300mL水中溶解91g Tris-base (1.5mol/L),用lmol/L的鹽酸調節pH至6.8,補加水至體積500mL,用
0.45um濾膜過濾溶液，再加入2g質量體積濃度為0.4%的SDS，4°C保存備用，下同)、2.4mL甘油、0.8g的十二燒基磺酸鈉以及0.31g的二硫蘇糖醇(DTT)溶解混合後用水定容至10mL。染色液配製配方是每250mL分析純甲醇與50mL分析純乙醇及Ig考馬斯亮藍G-250充分混合後用水定容至500mL。
[0033]此外，本實施方式還提供了一種三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統的製備方法，包括如下步驟:
[0034]配製分離膠:對垂直板聚丙烯醯胺凝膠電泳的側板進行壓條封邊後，按照每580 μ L的水中含有792 μ L的質量體積濃度為40%的丙烯醯胺、1.792mL的Tris-HCl緩衝液、32 μ L的質量體積濃度為10%的過硫酸銨以及2 μ L的N，N，N' ,N'-四甲基乙二胺的配方比例將各原料物質混合後加入至膠床中，至側板的4/5高度處，立即用水封頂；
[0035]待水與膠出現分界線後，配製濃縮膠:棄去封頂的水，按照每870 μ L的水中含有119 μ L的質量體積濃度為40%的丙烯醯胺、182 μ L的Tris-HCl緩衝液、24 μ L的質量體積濃度為10%的過硫酸銨以及1.2μ L的N，N，N'，Ν'-四甲基乙二胺的配方比例將各原料物質混合後加入至分離膠上，灌滿至側板的高度，插入電泳梳子，待電泳梳子與濃縮膠之間出現縫隙即完成製備。
[0036]進一步，本實施方式的電泳系統的製備方法還包括電泳液、2X蛋白樣品加樣緩衝液及染色液的配製步驟。
[0037]其中，電泳液的配製是按照每3.03g的三羥甲基氨基甲烷與4.5g的N-三(羥甲基)甲基甘氨酸及0.5g的十二烷基磺酸鈉的配方比例將各原料物質溶解至IL的水中。
[0038]2 X蛋白樣品加樣緩衝液的配製是按照每0.002g考馬斯亮藍G-250與2mL pH為
6.8的4XTris-Cl/SDS緩衝液、2.4mL甘油、0.8g的十二烷基磺酸鈉以及0.31g的二硫蘇糖醇的配方比例將各原料物質混合後，用水定容至10mL。
[0039]染色液的配製是按照每250mL分析純甲醇與50mL分析純乙醇及Ig考馬斯亮藍G-250的配方比例將各原料物質充分混合後用水定容至500mL,過濾後(如用濾紙過濾)收集濾液備用。
[0040]進一步，本實施方式還提供了一種蛋白質電泳方法，包括如下步驟:
[0041]步驟一:按照上述三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統的製備方法製備三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統。
[0042]步驟二:採用電泳儀進行垂直板三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳，將樣品添加至加樣槽中，在120?140V恆壓電泳2?3小時，待指示蛋白的指示線剛剛超過凝膠電泳的標記位置後停止電泳。
[0043]步驟三:用配製好的染色液微波染色I分鐘，再在水中微波脫色10分鐘。
[0044]上述三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統在蛋白電泳時，尤其是小分子蛋白，如分子量在IOkDa左右的蛋白分子，只需要在室溫下就可操作，電泳時間短，一般在120?140V恆壓下電泳2?3小時即可，且染色和脫色時間非常短，一般只需染色I分鐘，脫色10分鐘即可，節約時間，電泳效率大大提高，同時降低了成本。使用該三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統進行小分子蛋白電泳，方法簡單，高效，且解析度高，可清晰的檢測小分子蛋白。
[0045]以下為具體實施例部分:
[0046]1、溶液配製
[0047](I) 2.5M Tris-HCl 緩衝液:
[0048]稱取30.2g三羥甲基氨基甲烷溶解到60mL的雙蒸水中，用鹽酸調節pH到8.8，用雙蒸水補足溶液體積至100mL，4?8°C保存。
[0049](2)電泳液:
[0050]稱取3.03g三羥甲基氨基甲烷、4.5g Tricine及0.5g十二烷基磺酸鈉溶解到IL的雙蒸水水中配製溶液，4?8°C保存備用。
[0051](3) 2X蛋白樣品加樣緩衝液:
[0052]稱取0.002g考馬斯亮藍G-250後，分別加入2mL pH為6.8的4XTris_Cl/SDS緩衝液、2.4mL甘油、0.8g SDS及0.31g DTT，用雙蒸水定容至10mL，均勻分裝_20°C保存備用。
[0053](4) 10% 過硫酸銨(AP):
[0054]稱取Ig AP加入到IOmL雙蒸水中，於4?8°C保存備用。
[0055](5)染色液:[0056]稱取250mL分析純甲醇及50mL分析純乙醇加到Ig考馬斯亮藍G-250中，用雙蒸水定容至500mL,充分混勻,濾紙過濾後室溫保存備用。
[0057]2、改進的 Tricine-SDS-PAGE 膠的製備
[0058](I)分離膠的製備:
[0059]對垂直板聚丙烯醯胺凝膠電泳的玻璃板進行壓條封邊後，吸取580 μ L雙蒸水、792 μ L質量體積濃度為40%丙烯醯胺、1.792mL Tris-HCl緩衝液、32 μ L上述配製的10%ΑΡ以及2μ L TEMED於50ml燒杯中，立即混勻，用ImL槍緩緩加入至兩玻璃板間的膠床中，至膠板的4/5處，立即用水封頂，20分鐘後觀測水與膠是否出現分界線，出現後配製濃縮膠。
[0060](2)濃縮膠的製備:
[0061]棄去封頂的水，吸取870 μ L雙蒸水、119 μ L質量體積濃度為40%丙烯醯胺、182 μ LTris-HCl緩衝液、24μ L上述配製的10%ΑΡ以及1.2μ L TEMED於50ml燒杯中，立即混勻，用Iml槍緩緩加入兩玻璃板間的膠床中，灌滿膠板，插入十孔電泳梳子，20分鐘後觀察梳子與濃縮膠間出現縫隙即可。
[0062]3、低分子量蛋白Marker電泳
[0063]採用電泳儀(天能)進行垂直板聚丙烯醯胺凝膠電泳，點5μ L低分子量蛋白Marker樣,用配製的電泳緩衝液電泳，120?140V恆壓電泳2?3h,待指示線剛剛超過凝膠電泳系統的紅色膠條即終止電泳。
[0064]3)染色脫色
[0065]用配好的染色液微波染色lmin，清水微波脫色lOmin，結果如圖1所示(圖中數字單位kDa),可以清晰的檢測到低分子量標記蛋白Marker條帶。
[0066]以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對本發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保護範圍。因此，本發明專利的保護範圍應以所附權利要求為準。
【權利要求】
1.一種三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統，其特徵在於，包括: 分離膠，所述分離膠的配製配方是每580 μ L的水中含有792 μ L的質量體積濃度為40%的丙烯醯胺、1.792mL的Tris-HCl緩衝液、32 μ L的質量體積濃度為10%的過硫酸銨以及2yL的Ν，Ν，Ν,，Ν,-四甲基乙二胺；以及 濃縮膠，所述濃縮膠的配製配方是每870 μ L的水中含有119 μ L的質量體積濃度為40%的丙烯醯胺、182 μ L的Tris-HCl緩衝液、24 μ L的質量體積濃度為10%的過硫酸銨以及1.2μ L的N，N，N' ,N'-四甲基乙二胺； 所述濃縮膠與所述分離膠的長度比為1:4 ;且所述Tris-HCl緩衝液的配製配方是每60mL水中含有30.2g三羥甲基氨基甲烷，鹽酸調節pH至8.8，加水補至三羥甲基氨基甲烷的濃度為0.302g/mL。
2.如權利要求1所述的三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統，其特徵在於，還包括電泳液，所述電泳液的配方是每IL水中含有3.03g的三羥甲基氨基甲烷、4.5g的N-三(羥甲基)甲基甘氨酸和0.5g的十二烷基磺酸鈉。
3.如權利要求1所述的三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統，其特徵在於，還包括2X蛋白樣品加樣緩衝液，所述2X蛋白樣品加樣緩衝液的配製配方是每0.002g考馬斯亮藍G-250與2mL pH為6.8的4XTris_Cl/SDS緩衝液、2.4mL甘油、0.8g的十二烷基磺酸鈉以及0.31g的二硫蘇糖醇溶解混合後用水定容至10mL。
4.如權利要求1所述的三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統，其特徵在於，還包括染色液，所述染色液配製配方是每250mL分析純甲醇與50mL分析純乙醇及Ig考馬斯亮藍G-250充分混合後用水定容至500mL。
5.一種三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺`凝膠電泳系統的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟: 對垂直板聚丙烯醯胺凝膠電泳的側板進行壓條封邊後，按照每580 μ L的水中含有792 μ L的質量體積濃度為40%的丙烯醯胺、1.792mL的Tris-HCl緩衝液、32 μ L的質量體積濃度為10%的過硫酸銨以及2μ L的N，N，N'，Ν'-四甲基乙二胺的配方比例將各原料物質混合後加入至膠床中，至所述側板的4/5高度處，立即用水封頂； 待水與膠出現分界線後，棄去封頂的水，按照每870 μ L的水中含有119 μ L的質量體積濃度為40%的丙烯醯胺、182 μ L的Tris-HCl緩衝液、24 μ L的質量體積濃度為10%的過硫酸銨以及1.2μ L的N，N，N'，Ν'-四甲基乙二胺的配方比例將各原料物質混合後加入至所述分離膠上，灌滿至所述側板的高度，插入電泳梳子，待所述電泳梳子與濃縮膠之間出現縫隙即完成製備； 其中，所述Tris-HCl緩衝液的配製配方是每60mL水中含有30.2g三羥甲基氨基甲烷，鹽酸調節PH至8.8，加水補至三羥甲基氨基甲烷的濃度為0.302g/mL。
6.如權利要求5所述的三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統的製備方法，其特徵在於，還包括電泳液的配製步驟，具體是按照每3.03g的三羥甲基氨基甲烷與4.5g的N-三(羥甲基)甲基甘氨酸及0.5g的十二烷基磺酸鈉的配方比例將各原料物質溶解至IL的水中。
7.如權利要求5所述的三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統的製備方法，其特徵在於，還包括2 X蛋白樣品加樣緩衝液的配製步驟，具體是按照每0.002g考馬斯亮藍G-250與2mL pH為6.8的4X Tris-Cl/SDS緩衝液、2.4mL甘油、0.8g的十二烷基磺酸鈉以及0.31g的二硫蘇糖醇的配方比例將各原料物質混合後，用水定容至10mL。
8.如權利要求5所述的三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統的製備方法，其特徵在於，還包括染色液的配製步驟，具體是按照每250mL分析純甲醇與50mL分析純乙醇及Ig考馬斯亮藍G-250的配方比例將各原料物質充分混合後用水定容至500mL，過濾後收集濾液備用。
9.一種蛋白質電泳方法，其特徵在於，包括如下步驟: 按照如權利要求5~8中任一項所述的三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統的製備方法製備所述三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳系統； 採用電泳儀進行垂直板三甲基甘氨酸聚丙烯醯胺凝膠電泳，將樣品添加至加樣槽中，在120~140V恆壓電泳2~3小時，待指示蛋白的指示線剛剛超過凝膠電泳的標記位置後停止電泳； 用配製好的染色液微波 染色I分鐘，再在水中微波脫色10分鐘。
【文檔編號】G01N27/416GK103884763SQ201410098646
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月14日 優先權日:2014年3月14日
【發明者】李燕, 孫紅賓 申請人:中國科學院合肥物質科學研究院