檢測β-興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測方法及其試劑盒的製作方法
2023-06-14 13:53:41 3
檢測β-興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測方法及其試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了屬於免疫檢測【技術領域】的檢測β-興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測方法及其試劑盒。該試劑盒包括：β-興奮劑特異性抗體、包被有β-興奮劑特異性抗體的酶標板、β-興奮劑辣根過氧化物酶標記物、克倫特羅標準品、酶標物稀釋液、顯色劑、清洗液、終止液和濃縮樣品稀釋液。本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、高精確度、高準確度、對儀器設備要求低、試劑保存期長、自動化程度高、無放射性同位素汙染等優點，可在動物源性食品及飼料產品檢測中發揮重要作用。
【專利說明】檢測β-興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測方法及其試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬於免疫檢測【技術領域】，具體涉及檢測β-興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測方法及其試劑盒。
【背景技術】
[0002]β興奮劑是一種人和獸醫作為治療哮喘的藥物。在牲畜中超劑量使用可以將牲畜的脂肪組織轉化為肌肉組織，由於能夠顯著改善脂肪率和生產效率，β興奮劑往往被濫用於畜牧養殖生產中。近年來已經有沙丁胺醇、妥布特羅、溴布特羅、克倫特羅、西布特羅、馬布特羅、特布他林中毒的病例報導。
[0003]在β興奮劑中，沙丁胺醇、妥布特羅、溴布特羅、克倫特羅、西布特羅、馬布特羅、特布他林毒性較大，檢測這些物質一般將沙丁胺醇與載體合成抗原或半抗原，免疫動物，獲得多克隆抗體，可與其他β興奮劑有交叉反應，進而也可以檢測其他β興奮劑，但是，目前，尚沒有一種可以同時檢測沙丁胺醇、妥布特羅、溴布特羅、克倫特羅、西布特羅、馬布特羅、特布他林這7種β興奮劑的異性抗體。
[0004]傳統的試劑盒檢測用顯色劑一般將它調配成Α、B兩種液體，當需要顯色時就分別加入A和B液，當混合液與實驗中複合物反應就會產生顯色效果。A液一般由PBS緩衝液、檸檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300、過氧化氫組成，B液一般由PBS緩衝液、檸檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300、硫代硫酸鈉組成；使用時需要將兩種液體按比例混合後才能使用，且兩種液體都需要避光保存，使用起來比較麻煩。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供一種檢測β -興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測試劑盒。
[0006]本發明的目的還在於提供一種檢測β -興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測的方法。
[0007]—種檢測β -興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測試劑盒，該試劑盒包括:β -興奮劑特異性抗體、包被有β_興奮劑特異性抗體的酶標板、β_興奮劑辣根過氧化物酶標記物、克倫特羅標準品、酶標物稀釋液、顯色劑、清洗液、終止液和濃縮樣品稀釋液。
[0008]所述顯色劑為過氧化氫或過氧化脲，鄰苯二胺或四甲基聯苯胺與穩定劑K按體積比5: 5: I混合而成的溶液，穩定劑K、含酶穩定劑AH和酶保護劑均購自美國International Diagostica System 公司。
[0009]所述的酶標物稀釋液為含酶穩定劑AH和酶保護劑KEN的磷酸鹽緩衝液。
[0010]所述的終止液為2mol/L的鹽酸溶液。
[0011 ] 所述的濃縮樣品稀釋液為含I % BSA的5倍濃縮磷酸鹽緩衝液。
[0012]所述β -興奮劑特異性抗體是以特異免疫原免疫動物製得，所述特異免疫原是將克倫特羅、沙丁胺醇、特布他林、馬布特羅、溴布特羅、妥布特羅和西布特羅通過戊二醛法交聯到載體蛋白上製成。
[0013]所述載體蛋白為多聚賴氨酸、牛血清白蛋白、雞丙種球蛋白、人血丙種球蛋白或卵清蛋白。
[0014]所述動物為兔、鼠或羊。
[0015]9、一種檢測興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測方法，其特徵在於，按照如下步驟進行:
[0016](I)將試劑於盒外充分恢復至室溫,恢復時間為1-5小時；
[0017](2)預先進行編號，標記Btl、標準品和樣品的位置，進行雙孔檢測；
[0018](3)從包被有β -興奮劑特異性抗體的酶標板上取下所需數量的微孔，將
[0019]多餘的微孔重新密封並放回2?8°C保存；
[0020](4)將酶標物、濃縮樣品稀釋液、清洗液根據稀釋倍數用蒸餾水配製成工作液；
[0021](5)在B。孔中加入50 μ L0.0ng/mL標準品溶液，在各標準孔中加入50 μ L的標準品溶液，在各樣品孔中加入50 μ L樣品溶液；
[0022](6)在所有孔中加入100 μ L的酶標物，晃動反應Ι-lOs，室溫下孵育30min ；
[0023](7)倒掉微孔中的液體，在所有微孔中加滿清洗液，用微量移液器在每個微孔中加Λ 100 μ L顯色劑,晃動酶標板使之混勻；
[0024](8)室溫下顯色IOmin,每孔中加入100 μ L終止液,混勻；
[0025](9)在450nm下檢測吸光度,分析計算檢測結果。
[0026]本發明的有益效果:本試劑盒主要採用直接競爭酶聯免疫法可同時定性或定量檢測7種β興奮劑的含量。β_興奮劑特異性抗體採用特製的免疫原免疫大白兔得到，該免疫原通過7種β_興奮劑與載體蛋白採用戊二醛偶聯方法得到。該試劑盒室溫下即可進行檢測，無需保溫37°C。顯色液為混合顯色液，無需分次單獨添加，減少了操作程序。此外，本試劑盒的顯色過程無需避光，直接在室內顯色IOmin即可。全部檢測過程僅需40min。酶標物一凍乾粉形式提供，穩定性更好。另外主要試劑以工作液形式提供，可以減少檢測的操作步驟，為使用者節省時間並降低因操作步驟冗繁造成的誤差。本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、高精確度、高準確度、對儀器設備要求低、試劑保存期長、自動化程度高、無放射性同位素汙染等優點，可在動物源性食品及飼料產品檢測中發揮重要作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1為檢測β -興奮劑的標準曲線。
【具體實施方式】
[0028]下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
[0029]實施例1 β -興奮劑特異性抗體的製備
[0030]克倫特羅、沙丁胺醇、特布他林、馬布特羅、溴布特羅、妥布特羅和西布特羅各取
0.lmol，溶於50ml PBS (0.01mol/L)溶液中，充分溶解後逐滴加入250 μ L25%的戊二醛，反應30min。另稱取多聚賴氨酸(或者牛血清白蛋白，或者雞丙種球蛋白，或者卵清蛋白)，溶於13mL PBS(0.01mol/L)中逐滴加入上述反應液，室溫下攪拌反應3h。
[0031]取50cm的透析袋,於沸水中煮沸5min,再用60°C的去離子水中衝洗3min,保存在4°C的去離子水中備用。
[0032]將人工抗原混合液移入透析袋中，用2x2L的0.0lM pH7.4的PBS緩衝液和2x2L的去離子水透析3天。最後使用凍幹法將透析袋中的液體製成粉末，得到偶聯有7種β-興奮劑的特異免疫原。
[0033]免疫動物選用紐西蘭大白兔，免疫前耳緣靜脈取血5-10mL，作為陰性血清對照。初次免疫將0.5mg的特異免疫原與等量弗氏完全佐劑混合，完全乳化後，採用背部多點皮下注射紐西蘭大白兔，三周後取相同劑量免疫原與弗式不完全佐劑混合後同法進行加強免疫，以後每兩周加強免疫一次，共免疫6次後，血清效價達到很高時，最後一次加強免疫，4d後頸動脈採全血。
[0034]採全血後，3000rpm離心20min，取上層抗血清，與等量甘油混合後保存於_20°C冰箱內。
[0035]將5mL抗血清與等體積的生理鹽水混合後，邊攪拌邊逐滴加入IOmL的飽和硫酸銨。4°C冰箱靜置過夜。第二天，4000rpm離心20min，棄上清。沉澱少量生理鹽水重新溶解後，放入透析袋中於4°C進行透析，以出去殘留的硫酸銨。透析完後冷凍乾燥，得到純化的的β興奮劑特異抗體，與等量甘油混合後_20°C冰箱保存備用。
[0036]實施例2 β -興奮劑抗血清效價的測定
[0037]採用直接ELISA法進行測定。酶標反應板包被β興奮劑特異抗體、洗滌、封閉，並以同樣的稀釋度的陰性血清為對照，第I行I至12孔依次加入倍比稀釋的β興奮劑過氧化物酶結合物，均為IOOuL/孔，22-23°C溫育10分鐘；再加入辣根過氧化物酶(ARP)底物IOOuL/孔，經過10分鐘孵育，終止反應後測定OD45tl值。抗體的OD450值與相同稀釋度的陰性血清OD45tl值之比大於2的最大稀釋度定為β興奮劑特異抗體的效價。經測定β興奮劑特異抗體的效價為1000。
[0038]實施例3棋盤滴定法確定抗體包被濃度和酶標抗原工作濃度
[0039]通過棋盤滴定法對IC5tl值、最大吸光度值和樣品添加回收率的比較，確定抗體的包被濃度和酶標抗原的工作濃度。
[0040]表1最大吸光度值(0D值)比較
【權利要求】
1.一種檢測β-興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於，該試劑盒包括:β-興奮劑特異性抗體、包被有β-興奮劑特異性抗體的酶標板、β-興奮劑辣根過氧化物酶標記物、克倫特羅標準品、酶標物稀釋液、顯色劑、清洗液、終止液和濃縮樣品稀釋液。
2.根據權利要求1所述一種檢測興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於，所述顯色劑為過氧化氫或過氧化脲，鄰苯二胺或四甲基聯苯胺與穩定劑K按體積比5:5:1混合而成的溶液。
3.根據權利要求1所述一種檢測興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於，所述的酶標物稀釋液為含酶穩定劑AH和酶保護劑KEN的磷酸鹽緩衝液。
4.根據權利要求1所述一種檢測興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於，所述的終止液為2mol/L的鹽酸溶液。
5.根據權利要求1所述一種檢測β-興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於，所述的濃縮樣品稀釋液為含1% BSA的5倍濃縮磷酸鹽緩衝液。
6.根據權利要求1所述一種檢測興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於，所述β -興奮劑特異性抗體是以特異免疫原免疫動物製得，所述特異免疫原是將克倫特羅、沙丁胺醇、特布他林、馬布特羅、溴布特羅、妥布特羅和西布特羅通過戊二醛法交聯到載體蛋白上製成。
7.根據權利要求6所述一種檢測β-興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於，所述載體蛋白為多聚賴氨酸、牛血清白蛋白、雞丙種球蛋白人血丙種球蛋白、或卵清蛋白。
8.根據權利要求6所述一種檢測β-興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於，所述動物為兔、鼠或羊。
9.一種檢測β_興奮劑類的一步法酶聯免疫檢測方法，其特徵在於，按照如下步驟進行: (1)將試劑於盒外充分恢復至室溫，恢復時間為1-5小時； (2)預先進行編號，標記Β0、標準品和樣品的位置，進行雙孔檢測； (3)從包被有β_興奮劑特異性抗體的酶標板上取下所需數量的微孔，將 多餘的微孔重新密封並放回2?8°C保存； (4)將酶標物、濃縮樣品稀釋液、清洗液根據稀釋倍數用蒸餾水配製成工作液； (5)在BO孔中加入50μ L0.0ng/mL標準品溶液，在各標準孔中加入50 μ L的標準品溶液，在各樣品孔中加入50 μ L樣品溶液； (6)在所有孔中加入100μ L的酶標物，晃動反應Ι-lOs，室溫下孵育30min ； (7)倒掉微孔中的液體，在所有微孔中加滿清洗液，用微量移液器在每個微孔中加入.100 μ L顯色劑,晃動酶標板使之混勻； (8)室溫下顯色IOmin,每孔中加入100μ L終止液,混勻； (9)在450nm下檢測吸光度，分析計算檢測結果。
【文檔編號】G01N33/544GK103592434SQ201310091146
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年3月21日 優先權日:2013年3月21日
【發明者】徐華莉, 李亮, 張明洲, 王旻子, 魏建良, 程曄 申請人:杭州迪恩科技有限公司