基於CAMTA1基因的與抗結核藥物肝毒性反應相關的SNP標誌物、試劑盒及應用的製作方法

2023-06-14 01:26:11

本發明涉及單核苷酸多態性(snp)標誌物、試劑盒及應用，特別是涉及與抗結核藥物引起的藥物肝毒性反應相關的snp標誌物、試劑盒及應用，屬於生物基因工程領域。
背景技術：
：結核病可謂是傳染病中的一個最大災難——全世界每年會有上百萬人因該病致死，是當前導致發展中國家居民(尤其是兒童)死亡的主要疾病之一。藥物化療是當前治療結核病的主要手段，常用的藥物為異煙肼(isoniazid，inh)、利福平(rifampicin，rfp)、吡嗪醯胺(pyrazinamide，pza)和乙胺丁醇(ethambutol，emb)。雖然藥物化療對於結核病的臨床治療效果較好，但是在治療過程中出現的藥物不良反應(adversedrugreactions，adr)，影響了抗結核治療效果和患者健康。其中，抗結核藥物肝毒性反應(anti-tuberculosisdruginducedhepatotoxicity，atdh)是最嚴重的常見抗結核adr。既往研究認為年齡、體重、性別、合併用藥、營養狀況等因素會影響atdh的發病。隨著遺傳領域中藥物基因組學的發展，單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphism，snp)在揭示個體不同的表型性狀、以及對於環境暴露、藥物治療等因素的不同反應的研究中受到人們的重視，有關snp與atdh個體差異的關係的研究越來越深入，且多聚焦於n-乙醯轉移酶2基因(n-acetyltrangerase2，nat2)。nat2是治療結核病的常用藥物異煙肼(isoniazid，inh)代謝過程中的主要代謝酶。cn106119363a公開了n-乙醯轉移酶2基因(n-acetyltrangerase2，nat2)的7個snp位點(rs1801279、rs1041983、rs1801280、rs1799929、rs1799930、rs1208和rs1799931)的組合可以用於抗結核藥物肝損傷易感基因型檢測。wo2015109608a1公開了nat2的rs1041983、rs1495741snp及其組合與抗結核藥異煙肼、利福平、吡嗪醯胺中任一種或其組合造成的肝損傷相關，並公開了一些包含nat2rs1041983或rs1495741以及xo基因rs2295475或rs1884752snp的組合與藥物肝損傷的相關性。cn106148550a公開了il-6的rs1800796snp位點與異煙肼、利福平、吡嗪醯胺等一線抗結核藥物造成的肝損傷相關。技術實現要素：本發明的目的在於提供尚未公開的、與抗結核藥物肝毒性反應相關的snp標誌物，以準確地分子遺傳標記抗結核藥物引起的藥物肝毒性反應，從而進行分子標記輔助選擇和用藥預測，實現個體化用藥，減少藥物不良反應。本發明的目的還在於提供上述snp標誌物在抗結核藥物肝毒性反應方面非診斷的應用。本發明還提供了一種評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒，用於準確檢測上述與抗結核藥物肝毒性反應相關的snp標誌物，以更加全面、準確評估抗結核藥物肝毒性反應風險。為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：本發明提供了與抗結核藥物肝毒性反應相關的snp標誌物，所述的snp標誌物包括camta1基因的snp位點rs6696544。進一步地，上述snp標誌物與kcne3基因snp位點rs12272502、blnk基因snp位點rs2290714、ppp2r2b基因snp位點rs1031915、flt3基因snp位點rs9319408、vav2基因snp位點rs679106、xo基因snp位點rs1429372和il6基因snp位點rs2069852中一個或多個相組合，以實現更準確地標記抗結核藥物引起藥物肝毒性反應的目的。更進一步地，以上所有情況還可以與nat2基因的與抗結核藥物肝毒性反應相關的snp位點及其組合(如：rs4921914、rs10103029、rs7816847、rs1041983、或rs1495741，或者它們的組合)相組合，可以準確地標記抗結核藥物引起藥物肝毒性反應。上述snp標誌物的特異性擴增引物，該引物分別為：rs6696544的引物序列為seqidno.1和seqidno.2；rs12272502的引物序列為seqidno.4和seqidno.5；rs2290714的引物序列為seqidno.7和seqidno.8；rs1031915的引物序列為seqidno.10和seqidno.11；rs9319408的引物序列為seqidno.13和seqidno.14；rs679106的引物序列為seqidno.16和seqidno.17；rs1429372的引物序列為seqidno.19和seqidno.20；rs2069852的引物序列為seqidno.22和seqidno.23；rs4921914的引物序列為seqidno.25和seqidno.26；rs10103029的引物序列為seqidno.28和seqidno.29；rs7816847的引物序列為seqidno.31和seqidno.32；rs1041983的引物序列為seqidno.34和seqidno.35；rs1495741的引物序列為seqidno.37和seqidno.38。進一步地，上述snp標誌物的特異性延伸引物的引物序列可以分別為：rs6696544的引物序列為seqidno.3；rs12272502的引物序列為seqidno.6；rs2290714的引物序列為seqidno.9；rs1031915的引物序列為seqidno.12；rs9319408的引物序列為seqidno.15；rs679106的引物序列為seqidno.18；rs1429372的引物序列為seqidno.21；rs2069852的引物序列為seqidno.24；rs4921914的引物序列為seqidno.27；rs10103029的引物序列為seqidno.30；rs7816847的引物序列為seqidno.33；rs1041983的引物序列為seqidno.36；rs1495741的引物序列為seqidno.39。本發明還提供上述snp標誌物在抗結核藥物肝毒性反應方面非診斷的應用，如應用於製備評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒。本發明還提供了一種評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒，用於檢測與抗結核藥物肝毒性反應相關的至少如下的snp標誌物：所述的snp標誌物包括camta1基因的snp位點rs6696544。可選地，該試劑盒含有如下特異性擴增引物序列：所述的snp位點rs6696544的引物序列為seqidno.1和seqidno.2。進一步地，與上述試劑盒所含特異性擴增引物序列相對應的特異性延伸引物序列為：所述的snp位點rs6696544的引物序列為seqidno.3。進一步地，該評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒還用於檢測與抗結核藥物肝毒性反應相關的kcne3基因snp位點rs12272502、blnk基因snp位點rs2290714、ppp2r2b基因snp位點rs1031915、flt3基因snp位點rs9319408、vav2基因snp位點rs679106、xo基因snp位點rs1429372和il6基因snp位點rs2069852中的一個或多個。相應於此檢測，可選地，該試劑盒含有如下特異性擴增引物序列：所述的snp位點rs12272502的引物序列為seqidno.4和seqidno.5；所述的snp位點rs2290714的引物序列為seqidno.7和seqidno.8；所述的snp位點rs1031915的引物序列為seqidno.10和seqidno.11；所述的snp位點rs9319408的引物序列為seqidno.13和seqidno.14；所述的snp位點rs679106的引物序列為seqidno.16和seqidno.17；所述的snp位點rs1429372的引物序列為seqidno.19和seqidno.20；所述的snp位點rs2069852的引物序列為seqidno.22和seqidno.23。相應於此檢測，進一步地，與上述試劑盒所含特異性擴增引物序列相對應的特異性延伸引物序列可以為：所述的snp位點rs12272502的引物序列為seqidno.6；所述的snp位點rs2290714的引物序列為seqidno.9；所述的snp位點rs1031915的引物序列為seqidno.12；所述的snp位點rs9319408的引物序列為seqidno.15；所述的snp位點rs679106的引物序列為seqidno.18；所述的snp位點rs1429372的引物序列為seqidno.21；所述的snp位點rs2069852的引物序列為seqidno.24。更進一步地，該評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒還用於檢測與抗結核藥物肝毒性反應相關的nat2基因snp位點；更進一步地，所述的nat2基因snp位點可以為rs4921914、rs10103029、rs7816847、rs1041983、rs1495741中的一個或者多個。相應於此檢測，可選地，該試劑盒含有如下特異性擴增引物序列：所述的snp位點rs4921914的引物序列為seqidno.25和seqidno.26；所述的snp位點rs10103029的引物序列為seqidno.28和seqidno.29；所述的snp位點rs7816847的引物序列為seqidno.31和seqidno.32；所述的snp位點rs1041983的引物序列為seqidno.34和seqidno.35；所述的snp位點rs1495741的引物序列為seqidno.37和seqidno.38。相應於此檢測，進一步地，與上述試劑盒所含特異性擴增引物序列相對應的特異性延伸引物序列可以為：所述的snp位點rs4921914的引物序列為seqidno.27；所述的snp位點rs10103029的引物序列為seqidno.30；所述的snp位點rs7816847的引物序列為seqidno.33；所述的snp位點rs1041983的引物序列為seqidno.36；所述的snp位點rs1495741的引物序列為seqidno.39。可選地，該試劑盒還可以包括相應pcr技術所需的常用試劑，如dntps，mgcl2，雙蒸水，taq酶等，這些常用試劑是本領域技術人員熟知的，另外還可以有標準品和對照(如確定基因型的標準品和空白對照等)。綜上所述，本發明的技術方案提供了尚未被公開的與抗結核藥物肝毒性反應相關的基於camta1基因snp標誌物，從而準確地分子遺傳標記抗結核藥物引起的藥物肝毒性反應；此外，將上述未公開的snp標誌物應用於評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒中，從而準確地進行檢測，以及分子標記輔助選擇和用藥預測，實現個體化用藥，減少藥物不良反應。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。實施例1研究對象說明：本發明的研究對象是：2005-2014年在首都醫科大學附屬北京兒童醫院住院治療、年齡在0-16歲間的中國漢族結核病患兒(均是在患兒和家長知情同意的前提下)；並且，他們完全滿足以下3個標準：①臨床診斷為結核病；②以標準化療劑量及方案接受抗結核化療時間超過2周；③基礎肝腎功能正常。其中，結核病診斷標準是：根據美國胸科協會制定的《成人和兒童結核病診斷和分級標準》和中華醫學會兒科學分會呼吸學組制定的《兒童肺結核的臨床診斷標準和治療方案(試行)》進行結核病診斷。結核病臨床診斷標準具體為：①活動性結核病接觸史；②ppd試驗陽性；③抗結核治療有效；④排除其他疾病；滿足①至④中的任意2項，並具有典型臨床症狀和影像學證據，臨床診斷為結核病。atdh判斷標準是：滿足以下4項中任意1項即可診斷為atdh：①血清alt含量>(2×uln)；alt代表丙氨酸氨基轉移酶；血清alt相應的uln＝40iu/l；②血清dbil含量>(2×uln)；dbil代表直接膽紅素；血清dbil相應的uln＝6.8μmol/l；③血清ast含量、血清alp含量和血清tbil含量均>(1×uln)，且其中n1項>(2×uln)，n1≥1；ast代表天門冬氨酸氨基轉移酶，alp代表鹼性磷酸酶，tbil代表總膽紅素；血清ast相應的uln＝40iu/l，血清alp相應的uln＝220iu/l，血清tbil相應的uln＝19.0μmol/l；④滿足標準a和標準b：標準a：血清alt含量、血清dbil含量、血清ast含量、血清alp含量和血清tbil含量，上述5項中的n2項>(1×uln)，n2≥1；標準b：具有如下肝毒性疑似症狀之一：皮膚鞏膜黃染、肝區不適、噁心、嘔吐、厭食、發熱、皮疹、瘙癢等肝毒性疑似症狀。atdh入組標準：①atdh發生在抗結核化療開始後；②排除外病毒感染、新生兒黃疸、肝腎基礎疾病及其他疾病引起的atdh；③結核藥減量或停用後，atdh症狀減輕；④排除其他藥物致atdh的可能性。滿足①至④四項者即可診斷為atdh。對照組入組標準：抗結核化療後，肝功能仍正常者。本實施例1中，使用全基因組關聯分析(gemone-wideassociationstudy，gwas)對大樣本數據進行了篩選。其中，基於上述研究對象標準，將385例結核病患兒分成atdh組和非atdh對照組，atdh組77例，對照組308例。1、關於gwas全基因組晶片：gwas全基因組晶片數據來自於前期的中國漢族人群結核病易感研究，通過質控分析，最終得到了691388個snp位點的分型結果。晶片執行情況如下：1)gwas晶片類型：illumina公司humanomnizhonghua-8beadchip；2)gwas晶片的數據分析方法：plink軟體。晶片共得到900，015個snp位點的分型結果，經過檢出率、hardy-weinberger平衡(hwe)、樣本親緣關係以及主成分分析等質控，最終得到691388個snp位點用於後續分析。(1)檢出率標準設定和hwe分析：snp分型數據需符合以下標準，才能納入後續分析：樣品檢出率＞99％、snp位點檢出率＞95％、對照組hwe的p值＞0.0001和最小等位基因頻率＞0.01。除此之外，採用genomestudiov3.0(illumina)軟體進行snp位點散點圖的篩查，捨棄聚類不良的snp位點。(2)樣本親緣關係分析：為明確個體間是否有血緣關係，採用血緣同源(ibd)等位基因的概率分布進行分析。在分析中發現，病例組和對照組分別有一對樣本ibd的pi-hat＞0.05，因此，對具有血緣關係的病例和對照及其相對應的對照和病例樣本給予刪除。另外，我們隨機選擇15個樣本進行重現性的檢測，其基因分型吻合率為99.99％，證明：晶片檢測結果穩定，snp位點基因分型數據可靠。(3)主成分分析：整合千人基因組計劃中非洲人(yri)、歐洲人(ceu)，日本人(jpt)、中國北方人(chb)和中國南方人(chs)的數據以及我們晶片數據，並對整合數據進行主成分分析，確保晶片檢測的病例和對照組樣本具有中國人群的遺傳特徵，遺傳背景一致。(4)對於晶片的數據進行人群分層分析：為研究樣本的人群分層情況，進行膨脹係數(λgc)的分析。λgc為1.017，說明我們很好地削減了人群分層對於結果的影響。2、使用上述gwas全基因組晶片對大樣本進行數據分析：1)對於晶片的數據進行相關性分析：對上述385例atdh病例及對照樣本的snp位點分型結果進行了數據調取。採用plink軟體對385例atdh和非atdh對照兒童的691388個snp位點進行基因型比較分析，採用年齡性別對數據進行矯正，並結合離散關聯決策算法對數據進行驗證，得到snp位點與atdh易感相關性的結果。選取的atdh關聯snp位點or值和p值如表1所示：表1：atdh關聯snp位點or值和p值snp位點基因or值(95％ci)p值rs6696544camta12.412(1.612-3.611)1.87e-05rs12272502kcne32.228(1.494-3.324)8.63e-05rs2290714blnk2.281(1.535-3.391)4.54e-05rs1031915ppp2r2b2.197(1.479-3.263)9.7e-05rs9319408flt32.832(1.455-5.51)2.18e-03rs679106vav22.938(1.779-4.852)2.56e-05rs1429372xo1.821(1.231-2.693)2.68e-03rs2069852il61.540(1.053-2.254)2.62e-02rs4921914nat23.544(2.289-5.489)1.42e-08rs10103029nat23.589(2.296-5.611)2.09e-08rs7816847nat23.408(2.188-5.307)5.82e-08rs1041983nat23.434(2.236-5.273)1.73e-08rs1495741nat23.522(2.277-5.446)1.52e-08從表1中可以看出，檢測結果共涉及9個基因的13個snp位點。其中，camta1基因snp位點rs6696544、kcne3基因snp位點rs12272502、blnk基因snp位點rs2290714、ppp2r2b基因snp位點rs1031915、flt3基因snp位點rs9319408、vav2基因snp位點rs679106、xo基因snp位點rs1429372、il6基因snp位點rs2069852、以及nat2基因snp位點rs4921914、rs10103029和rs7816847，均為首次發現與抗結核藥物肝毒性反應相關的snp位點。實施例2：研究對象說明詳見實施例1。本實施例2中，針對實施例1中所獲得的13個snp位點，另外選取582例樣本(與上述實施例1中的385例無重合)(atdh組122例，非atdh對照組460例)，進行質譜驗證。1、實驗步驟：1)引物設計及合成：根據snp位點序列信息，使用引物設計軟體assaydesign3.1設計pcr反應和單鹼基擴展引物，並交由生物公司合成。各snp位點對應的引物見表2。其中，forwardprimer為上遊引物，reverseprimer為下遊引物，extendedprimer為延伸引物。表2：實施例1中所獲得的13個snp位點所對應的引物：2)dna提取：使用成品化試劑盒，提取血樣、組織、細胞、唾液中的dna。使用nanodrop2000儀器進行od值檢測，1.25％瓊脂糖凝膠電泳檢測，dna質檢合格，轉移至96孔板，-20℃儲存備用。3)系統基因分型步驟：①pcr擴增反應：聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，pcr)用於擴增位於兩端已知序列之間的dna區域。每個pcr循環，反應混合體系都在模板變性、引物退火和引物延伸三種不同溫度下依序溫育。該過程可使用一種可編程序的溫度熱循環儀而達到自動化。②產物鹼性磷酸酶處理：在pcr反應結束後，將pcr產物用sap(shrimpalkalinephosphatase，蝦鹼性磷酸酶)處理，以去除體系中游離的dntps。③單鹼基延伸反應：在鹼性磷酸酶處理結束後，進行單鹼基延伸反應，反應體系總體積9μl。④樹脂純化：⑤晶片點樣：採用massarraynanodispenserrs1000點樣儀，將樹脂純化後的延伸產物移至spectrochipbioarray上。⑥質譜檢測及數據輸出：將點樣後的spectrochip晶片使用maldi-tof質譜儀分析，檢測結果使用typer4.0軟體獲取原始數據及基因分型圖，檢查數據文件的完整性和正確性，將結果保存並進行分析。以上①至⑥均為本領域質譜檢測的常規方法，這裡不再冗述。2、多位點聯合風險評估：採用以or值作為權重的遺傳風險評分(oddsratioweightedgeneticriskscore，or-grs)方法對以上582例樣本進行多位點風險計算。該方法大致可以分為兩步：a)所有snp位點的or值*突變基因數量，然後求和，即：公式中，g表示一組遺傳易感位點風險等位基因數的集合向量(gi表示第i個遺傳易感位點的風險等位基因的數量)；b)對所有樣本的求和數值計算敏感性和特異性，繪製roc曲線，並計算曲線下面積，即：auc值。有關or-grs的原理和評分方法具體參見文獻「遺傳風險評分的原理與方法」(王鋮，戴俊程，孫義民，謝蘭，潘良斌，胡志斌，沈洪兵，2015，[j].中華流行病學雜誌，36(10):1062-1064)。相關snp位點組合的auc值的結果如下：1)根據上述方法計算出來的camta1基因snp位點rs6696544的auc值，以及它與其它7個基因snp位點中至少一個相組合的auc值，如表3所示。其中，所述的其它7個基因snp位點分別為kcne3基因位點rs12272502、blnk基因位點rs2290714、ppp2r2b基因位點rs1031915、flt3基因位點rs9319408、vav2基因位點rs679106、xo基因位點rs1429372和il6基因位點rs2069852。表3中的方案分別為：方案1：camta1基因snp位點rs6696544；方案2：camta1基因snp位點rs6696544與其他7個snp位點中的任意一個位點組合；方案3：camta1基因snp位點rs6696544與其他7個snp位點中的任意二個位點組合；方案4：camta1基因snp位點rs6696544與其他7個snp位點中的任意三個位點組合；方案5：camta1基因snp位點rs6696544與其他7個snp位點中的任意四個位點組合；方案6：camta1基因snp位點rs6696544與其他7個snp位點中的任意五個位點組合；方案7：camta1基因snp位點rs6696544與其他7個snp位點中的任意六個位點組合；方案8：camta1基因snp位點rs6696544與所有其他7個snp位點的組合。表3中示出的是針對每個組合方案所測的最大auc值(表3中auc值上帶有max下標的組合)、最小auc值(表3中auc值上帶有min下標的組合)，以及若干位於最大值和最小值之間的、隨機抽取的組合的auc值。表3：camta1基因snp位點、以及其與其它7個snp位點組合的auc值：從表3中可以看出，camta1基因的snp位點與其他基因snp位點組合的auc值高於單獨camta1基因的snp位點的auc值，為更準確地評估抗結核藥物引起藥物肝毒性反應的風險提供了可能性。2)上述相關snp位點組合的auc值的結果1)中所有情況與nat2基因snp位點rs1495741、rs4921914、rs10103029、rs7816847和rs1041983中一個或者多個組合的auc值，如表4所示。表4中的方案分別為：方案1：上述結果1)中的方案1與nat2基因snp位點rs1495741、rs4921914、rs10103029、rs7816847和rs1041983中一個相組合；方案2：上述結果1)中的方案1與nat2基因snp位點rs1495741、rs4921914、rs10103029、rs7816847和rs1041983中多個相組合；方案3：上述結果1)中的方案2-7所涵蓋的所有組合與nat2基因snp位點rs1495741、rs4921914、rs10103029、rs7816847和rs1041983中一個或者多個相組合。表4中示出的是針對每個組合方案所測的最大auc值(表4中auc值上帶有「max」下標的組合)、最小auc值(表4中auc值上帶有「min」下標的組合)，以及若干位於最大值和最小值之間的、隨機抽取的組合的auc值。表4：以上所有情況與nat2基因位點組合的auc值：從表4中可以看出，在camta1基因的snp位點及其與其他基因snp位點組合的基礎上，加入nat2基因的snp位點進行組合，能夠使auc值提高，為更進一步準確地評估抗結核藥物引起藥物肝毒性反應風險提供了可能性。3)比較例：比較例見表5。表5中示出的是本發明所檢測出的nat2基因的5個與抗結核藥物肝毒性反應相關的snp位點各自及其組合的auc值，以及nat2基因的snp位點與xo基因和/或il6基因的snp位點的組合的auc值。表5：作為比較例的auc值：比較表3中camta1基因snp位點rs6696544和表5中nat2基因的各snp位點的auc值可以看出，camta1基因snp位點rs6696544的auc值大於大部分表5中所示的nat2基因的auc值，說明它可以作為snp標誌物準確地標記抗結核藥物肝毒性反應。進一步地，比較表3中的方案6-8與表5的auc值的比較中可以看出，當組合方案是camta1基因snp位點rs6696544與其他7個snp位點中的至少任意五個位點的組合(表3中的方案6-8)時，其auc值明顯優於比較例(表5)中的組合方案的auc值，從而表明，這些方案可以實現更準確地評估抗結核藥物肝毒性反應風險的目的。更進一步地，從表4中的方案與表5的auc值的比較中可以看出，在表3中方案2-8所涵蓋的所有組合的基礎上，再與nat2基因位點rs1495741和/或rs1041983組合(即表4中的方案2)而形成的組合中，部分組合可以達到更高的auc值，表明表4中的方案能夠更準確地評估抗結核藥物引起藥物肝毒性反應風險。實施例3：本實施例3中，製作評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒，用於檢測camta1基因的snp位點rs6696544。該試劑盒含有所需檢測snp位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，snp位點rs6696544的特異性擴增引物序列為seqidno.1和seqidno.2；其特異性延伸引物序列為seqidno.3；該試劑盒還包括相應pcr技術所需的常用試劑：(如dntps，mgcl2，雙蒸水，taq酶等，另外還可以有標準品和對照(如確定基因型的標準品和空白對照等)。例如：本實施例3中的試劑盒試劑包括：dntps(25mm)，mgcl2(25mm)，primermix(500nm)，hotstartaq(5u/μl)，雙蒸水。擴增反應體系包括：1.85μl雙蒸水，0.1μldntp(25mm)，0.325μlmgcl2(25mm)，1μlprimermix(500nm)，0.625μlpcrbuffer(1.25x)，0.1μlhotstartaq(5u/μl)，加入1μl模板dna進行pcr擴增反應。pcr擴增的反應條件：94℃變性5min；94℃20s，57℃30s，72℃1min，45個循環；72℃延伸3min。在pcr反應結束後，將pcr產物用sap(shrimpalkalinephosphatase，蝦鹼性磷酸酶)處理，以去除體系中游離的dntps。延伸反應體系：0.041μliplex酶(1x)，0.94μlprimermix，0.619μl雙蒸水，0.2μliplexterminationmix(1x)，0.2μliplexbufferplus(0.222x)，7μlsap處理後pcr產物。延伸反應條件：94℃變性30s；94℃5s；52℃5s，80℃5s，40個循環；72℃延伸3min。純化後產物使用sequenommassarray系統進行基因分型。或者，pcr擴增的反應體系的組成如下(50μl):基因組dna0.50ng、上遊引物30pmol、下遊引物30pmol、2×taqplantinumpcrmastermix25μl和去離子水。2×taqplantinumpcrmastermix購自天根生化科技(北京)有限公司，貨號kt204。pcr擴增的反應條件：94℃變性5min；94℃20s，57℃30s，72℃1min，45個循環；72℃延伸3min。將pcr擴增產物進行測序。上述pcr反應體系、反應條件和後續的基因分型及評估方法，可以根據本領域公知常識或者慣用技術手段進行變化或者替換。該試劑盒的價值在於：評估抗結核藥物引起的藥物肝毒性反應的風險，從而進行分子標記輔助選擇和用藥預測，實現個體化用藥，減少藥物不良反應。實施例4：本實施例4中，製作評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒，用於檢測camta1基因的snp位點rs6696544與kcne3基因snp位點rs12272502、flt3基因snp位點rs9319408、xo基因snp位點rs1429372和il6基因snp位點rs2069852的組合。相應地，該試劑盒的試劑含有以上所需檢測基因snp位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，所需檢測基因snp位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物分別如下：rs6696544的特異性擴增引物序列為seqidno.1和seqidno.2；其特異性延伸引物序列為seqidno.3；rs12272502的特異性擴增引物序列為seqidno.4和seqidno.5；其特異性延伸引物序列為seqidno.6；rs9319408的特異性擴增引物序列為seqidno.13和seqidno.14；其特異性延伸引物序列為seqidno.15；rs1429372的特異性擴增引物序列為seqidno.19和seqidno.20；其特異性延伸引物序列為seqidno.21；rs2069852的特異性擴增引物序列為seqidno.22和seqidno.23；其特異性延伸引物序列為seqidno.24。相應的pcr反應體系和反應條件與實施例3基本相同。實施例5：本實施例5中，製作評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒，用於檢測camta1基因的snp位點rs6696544與kcne3基因snp位點rs12272502、blnk基因snp位點rs2290714、ppp2r2b基因snp位點rs1031915、vav2基因snp位點rs679106、flt3基因snp位點rs9319408、il6基因snp位點rs2069852和nat2基因snp位點rs4921914和rs1495741。相應地，該試劑盒的試劑含有以上所需檢測基因snp位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，所需檢測基因snp位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物分別如下：rs6696544的特異性擴增引物序列為seqidno.1和seqidno.2；其特異性延伸引物序列為seqidno.3；rs12272502的特異性擴增引物序列為seqidno.4和seqidno.5；其特異性延伸引物序列為seqidno.6；rs2290714的特異性擴增引物序列為seqidno.7和seqidno.8；其特異性延伸引物序列為seqidno.9；rs1031915的特異性擴增引物序列為seqidno.10和seqidno.11；其特異性延伸引物序列為seqidno.12；rs679106的特異性擴增引物序列為seqidno.16和seqidno.17；其特異性延伸引物序列為seqidno.18；rs9319408的特異性擴增引物序列為seqidno.13和seqidno.14；其特異性延伸引物序列為seqidno.15；rs2069852的特異性擴增引物序列為seqidno.22和seqidno.23；其特異性延伸引物序列為seqidno.24；rs4921914的特異性擴增引物序列為seqidno.25和seqidno.26；其特異性延伸引物序列為seqidno.27；rs1495741的特異性擴增引物序列為seqidno.37和seqidno.38；其特異性延伸引物序列為seqidno.39。相應的pcr反應體系和反應條件與實施例3基本相同。實施例6：本實施例6中，製作評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒，用於檢測camta1基因的snp位點rs6696544與kcne3基因snp位點rs12272502、blnk基因snp位點rs2290714、ppp2r2b基因snp位點rs1031915、vav2基因snp位點rs679106、flt3基因snp位點rs9319408、xo基因snp位點rs1429372、il6基因snp位點rs2069852、以及nat2基因snp位點rs4921914。相應地，該試劑盒的試劑含有以上所需檢測基因snp位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，所需檢測基因snp位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物分別如下：rs6696544的特異性擴增引物序列為seqidno.1和seqidno.2；其特異性延伸引物序列為seqidno.3；rs12272502的特異性擴增引物序列為seqidno.4和seqidno.5；其特異性延伸引物序列為seqidno.6；rs2290714的特異性擴增引物序列為seqidno.7和seqidno.8；其特異性延伸引物序列為seqidno.9；rs1031915的特異性擴增引物序列為seqidno.10和seqidno.11；其特異性延伸引物序列為seqidno.12；rs679106的特異性擴增引物序列為seqidno.16和seqidno.17；其特異性延伸引物序列為seqidno.18；rs9319408的特異性擴增引物序列為seqidno.13和seqidno.14；其特異性延伸引物序列為seqidno.15；rs1429372的特異性擴增引物序列為seqidno.19和seqidno.20；其特異性延伸引物序列為seqidno.21；rs2069852的特異性擴增引物序列為seqidno.22和seqidno.23；其特異性延伸引物序列為seqidno.24；rs4921914的特異性擴增引物序列為seqidno.25和seqidno.26；其特異性延伸引物序列為seqidno.27。相應的pcr反應體系和反應條件與實施例3基本相同。實施例7：本實施例7中，製作評估抗結核藥物肝毒性反應風險的試劑盒，用於檢測camta1基因的snp位點rs6696544與kcne3基因snp位點rs12272502、blnk基因snp位點rs2290714、ppp2r2b基因snp位點rs1031915、vav2基因snp位點rs679106、flt3基因snp位點rs9319408、il6基因snp位點rs2069852、以及nat2基因snp位點rs4921914和rs1495741。相應地，該試劑盒的試劑含有以上所需檢測基因snp位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物的試劑，其中，所需檢測基因snp位點的特異性擴增引物和特異性延伸引物分別如下：rs6696544的特異性擴增引物序列為seqidno.1和seqidno.2；其特異性延伸引物序列為seqidno.3；rs12272502的特異性擴增引物序列為seqidno.4和seqidno.5；其特異性延伸引物序列為seqidno.6；rs2290714的特異性擴增引物序列為seqidno.7和seqidno.8；其特異性延伸引物序列為seqidno.9；rs1031915的特異性擴增引物序列為seqidno.10和seqidno.11；其特異性延伸引物序列為seqidno.12；rs679106的特異性擴增引物序列為seqidno.16和seqidno.17；其特異性延伸引物序列為seqidno.18；rs9319408的特異性擴增引物序列為seqidno.13和seqidno.14；其特異性延伸引物序列為seqidno.15；rs2069852的特異性擴增引物序列為seqidno.22和seqidno.23；其特異性延伸引物序列為seqidno.24；rs4921914的特異性擴增引物序列為seqidno.25和seqidno.26；其特異性延伸引物序列為seqidno.27；rs1495741的特異性擴增引物序列為seqidno.37和seqidno.38；其特異性延伸引物序列為seqidno.39。相應的pcr反應體系和反應條件與實施例3基本相同。以上所述實施例僅為本發明各技術特徵的任意組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特徵所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特徵的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的範圍。以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保護範圍。因此，本發明專利的保護範圍應以所附權利要求為準。sequencelisting北京光大隆泰科技有限責任公司基於camta1基因的與抗結核藥物肝毒性反應相關的snp標誌物、試劑盒及應用39patentinversion3.5130dna人工引物序列1acgttggatgtgcgcctgcaacgagtttac30230dna人工引物序列2acgttggatgcctcatcctctaggatgagc30318dna人工引物序列3cgagtttacaggcaagag18430dna人工引物序列4acgttggatgccaaagcaagcagtcttttc30530dna人工引物序列5acgttggatggacatagggagactgtctca30619dna人工引物序列6ggtgactgagtgatgtgag19730dna人工引物序列7acgttggatgcgacctgcacaaacatatac30830dna人工引物序列8acgttggatgtatttctgagcctgccagag30917dna人工引物序列9tacactactcagtcccc171030dna人工引物序列10acgttggatgctccttgagttgagcattac301130dna人工引物序列11acgttggatggcacacctacatttaaagtc301219dna人工引物序列12ccatgttacagacaaatgc191330dna人工引物序列13acgttggatgctcatcaacagtgcataacg301430dna人工引物序列14acgttggatggaaataccaccttacacctg301526dna人工引物序列15ggtttctgtcatctttttataatagc261629dna人工引物序列16acgttggatgtatctgtccgcggcgcact291730dna人工引物序列17acgttggatgtcttcctcactgtgccattc301815dna人工引物序列18cagggcgcagggagt151930dna人工引物序列19acgttggatgtcatacacctgagcatacgg302030dna人工引物序列20acgttggatgatgtctcattctggcccaag302121dna人工引物序列21cccaggggcagttctcacatc212230dna人工引物序列22acgttggatgcttccagctgggtgacttag302330dna人工引物序列23acgttggatgacgtcatttaaccccagcac302425dna人工引物序列24ctataaattacttagtcttccacaa252530dna人工引物序列25acgttggatgcccagacttcagtgtgcaag302630dna人工引物序列26acgttggatgcagtgcccgcttgctttttc302720dna人工引物序列27agtcagtgtgcaagaataca202830dna人工引物序列28acgttggatgactgtcccatttaagtccag302930dna人工引物序列29acgttggatgagtgtttgtccgagacgatg303023dna人工引物序列30cctccgtccagaatttgttagcc233130dna人工引物序列31acgttggatggaatacagttcagccaagtc303230dna人工引物序列32acgttggatgtaaaggtgcttctggcaagg303318dna人工引物序列33gaagccaagtcttttgcc183428dna人工引物序列34acgttggatggtggtgtctccaggtcaa283528dna人工引物序列35acgttggatggttcgaggttcaagcgta283625dna人工引物序列36ggtgttacaatcctcccataaaaat253730dna人工引物序列37acgttggatgggccctgaagctactgtgaa303830dna人工引物序列38acgttggatgaggagcctctctcaggaaag303919dna人工引物序列39aagctactgtgaatgccca19當前第1頁12