擬南芥基因iar1在鐵營養利用及抗旱方面的應用的製作方法

2023-06-14 00:22:56

專利名稱：擬南芥基因iar1在鐵營養利用及抗旱方面的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種擬南芥基因IAR1的應用，尤其涉及一種擬南芥基因IAR1在植物 鐵營養利用及抗旱方面的應用，屬於基因工程技術領域。
背景技術：
鐵是人們最早發現的微量元素，發現至今已有兩千多年的歷史，鐵在地球上現存 的原核生物和真核生物的生命活動中具有不可替代的功能，鐵對於任何生物有機體來說都 是必不可少的礦質營養元素。植物輕度缺鐵會導致葉綠素合成減少，光合速率降低，嚴重缺 鐵時，葉綠素合成停止，新葉變黃，生物量大幅度下降。植物缺鐵不僅影響植物的生長發育， 造成作物減產。植物是人和動物地鐵營養的主要來源，植物缺鐵可動物和人類對鐵的吸收， 從而導致貧血病的發生。 儘管地殼中鐵的豐度很高，但土壤中的鐵由於受土壤溶液的pH值及氧分壓的影 響，幾乎都是以難溶於水的Fe3+形式存在，因此，如果沒有主動的調節機制使植物獲得充足 的鐵，大多數植物便會表現出缺鐵症狀，造成農作物的減產，是限制農業生產。據統計，全世 界約有40%的土壤缺鐵，北美大陸、地中海沿岸、前蘇聯南部、南美的部分地區都嚴重缺鐵。 我國南起四川盆地，北至內蒙古高原，東至淮北平原，西到黃土高原及甘肅、青海、新疆，都 有缺鐵現象的發生。雖然土壤缺鐵只在一定的土類和地區存在，但由於總面積較大，所以植 物缺鐵失綠成為全世界普遍關注的問題，也是植物營養學研究的熱點之一。
研究表明，植物對鐵離子的吸收通過以下兩種方式完成對於雙子葉植物和非禾 本科單子葉植物而言，缺鐵會在根系產生多種生理及形態的變化，如根系Fe3+還原酶活性 的增加，淨質子分泌量的增加，有機酸及酚類物質的分泌；以及產生根尖膨大、根毛增多、根 表產生轉移細胞等，即所謂的機理I ;對於禾本科植物而言，根系對缺鐵的反應為植物鐵載 體(phytosiderophores)釋放量的增加。植物鐵載體對於根系鐵的吸收和跨膜運輸有不可 替代的作用，這一吸收過程被稱為機理II 。 隨著分子遺傳學和功能基因組學技術的發展和進步，人們通過突變體的分析技術 分離得到了一系列與土壤鐵離子吸收有關的基因，如從擬南芥中分離克隆了Fe"還原酶基 因(froh) 、Fe"螯合物還原酶的FR02基因、Fe"轉運蛋白基因IRT1，從豌豆(Pisumsativum) 根中的Fe2+專一轉運蛋白基因Ritl等，這些基因的表達產物，組成了一套鐵離子還原和吸 收體系。 在供鐵充足的條件下，機理I的植物首先通過Fe3+螯合物將溶解性的Fe3+螯合併 還原為Fe"，才能被吸收利用。在缺鐵脅迫的條件下，土壤中溶解性的Fe3+很少，機理I植 物通過激活一種特異的H+-ATPas而使土壤酸化，從而增加鐵的可溶性，才能夠通過根部還 原酶將Fe"螯合和還原。因此，缺鐵條件下，機理I植物吸收鐵的一個前提條件是通過分泌 作用使土壤酸化，增加鐵離子的溶解和吸收；因此，植物根際酸化能力對土壤鐵營養的吸收 和利用起到十分關鍵的作用。雖然已有包括鐵還原和運輸有關的一批基因已經得到克隆和 功能驗證，但是，直接參與調節缺鐵引起的根際酸化的基因至今未見報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種擬南芥基因IAR1在植物鐵營養利用及抗旱方面的應 用。 同時，本發明的目的還在於提供一種擬南芥基因IAR1在培育抗缺鐵和抗旱植物 新品種方面的應用。 為了實現上述目的，本發明的技術方案採用了一種擬南芥基因IARl在植物鐵營 養利用及抗旱方面的應用。所述的基因IARl，其在Genebank中的編號為ATlG70690，該基因的CDS序列全長
為900bp，編碼300個胺基酸的蛋白。 所述的基因參與H202相關植物缺鐵反應過程。 所述基因的序列及其序列的全部或部分開放讀碼框ORF序列的不同應用載體。
同時，本發明的技術方案還採用了一種擬南芥基因IAR1在培育抗缺鐵植物新品 種方面的應用。 所述的IAR1基因及該基因中的部分片斷連接在有關表達載體，以及通過不同的 表達載體轉化獲得相關的轉基因植物。 所述的IAR1基因的部分序列或功能區域片斷構建RNAi抑制表達載體，獲得相應 的轉基因植物。 所述的基因由分析和尋找同源和同功能的基因及其相應載體的構建和轉基因品 系的獲得。 本發明通過用遠紅外成像技術，篩選得到了土壤取鐵敏感擬南芥突變體iarl，克 隆得到了 IAR1基因(atlg70690)，採用GUS組織定位和GFP融合蛋白的細胞定位的方法，分 析IAR1基因的細胞和組織表達特性，構建由CaMV35S啟動子控制的超表達IAR1轉基因植 株，比較分析轉基因植株的表型和IAR1基因可能的生物學功能，從分子水平上植物根際酸 化和植物抗缺鐵反應的關係。 本發明從缺鐵反應敏感擬南芥突變體中克隆堅定了一個可調節缺鐵誘導土壤根 際酸化有關的IAR1基因(atlg70690)，為進一步分析和尋找同功能基因、構建相關基因的 轉化載體和獲得抗缺鐵植物新品種提供了基礎。本發明提供了通過轉基因技術獲得鐵營養 高效利用植株，構建RNAi載體並獲得相應的轉基因植株，分析該轉基因植株的高效利用土 壤鐵營養的特性。IAR1基因編碼一個受體激酶的受體區域，感受並調節植物的缺鐵和反應。 IARl蛋白主要分布在維管系統和細胞膜上，感受土壤中鐵的含量變化和調節根際酸化，影 響和調節植物的抗缺鐵反應。 蛋白作用分析表明，IAR1可特異的與土壤中的鐵離子結合，通過蛋白的氧化還原 狀態，感知鐵離子的含量變化，調節細胞質膜離子通道活性和離子跨膜運輸，調節植物的抗 逆反應。 本發明揭示和分析IAR1基因及其編碼的蛋白的功能，為分析和尋找與植物缺鐵 脅迫相關的根際酸化調節基因和蛋白以及相應的同源基因和蛋白提供了手段和必要的基 礎及前提，比如通過序列比對和結構分析等，同時可通過合成簡併引物獲得同功能基因等； 也可以通過化學合成的方法獲得同功能基因和序列；通過突變的方法增加、減少、替換若干鹼基和胺基酸等；以及依據以上手段獲得相應的轉化載體和獲得相應的轉基因植株等。
本發明通過特定的篩選條件分離得到了缺鐵條件下調節擬南芥鐵吸收有關的根 際酸化基因IAR1， IAR1基因的表達控制擬南芥根際酸化能力和植物對鐵離子的吸收和利 用，影響植物抗缺鐵反應和植物抗旱能力。IAR1基因的功能和作用的分析，為獲得轉基因鐵 高效作物新品系，提高植物的抗旱反應提供了基礎和前提。


圖1為乾旱條件下篩選得到的擬南芥葉片溫度升高突變體iarl (箭頭指示為篩選 得到的iarl突變體)； 圖2為缺鐵條件下，用雌二醇誘導IAR1誘導表達可抑制突變體根的生長；增加擬 南芥根的缺鐵敏感特性(右圖為根生長統計結果)； 圖3為缺鐵條件下，誘導IAR1基因的表達，增加擬南芥突變體生長，引起葉片失綠 和黃化的缺鐵敏感特性； 圖4為缺鐵條件下誘導IAR1基因表達植株喪失根際酸化能力(A處表示酸化程 度)； 圖5為IRA1基因表達可抑制區鐵敏感酵母突變體菌斑Frel、 Ftrl、 Fet3、 Fet4、 Fre2的酸化能力(B處表示酸化程度)。
具體實施方式

實施例1 IAR1突變體的篩選、鑑定以及相關植株對鐵營養的利用和抗旱反應 採用遠紅外成像技術，在乾旱條件先篩選得到擬南芥葉片溫度較高的擬南芥突變
體iarl，克隆得到突變基因IARl為編號為ATlG70690 ;誘導該基因的過量表達，缺鐵培養基
可抑制相應的擬南芥植株根生長受抑制，同時引起植株葉片失綠和黃化的明顯缺鐵症狀。
利用原子吸收方法測定缺鐵誘導條件下，可引起IAR1超表達植株對鐵離子積累量的減少，
引起植物明顯的缺鐵症狀，H202存在條件下。(見圖1) 實施例2 IAR1對缺鐵誘導的根際酸化作用分析 通過構建pCAMBIA1205互補載體獲得的超表達植株，結合T-DAN插入突變和誘導
IAR1超表達植株分析表明，超表達植株在缺鐵培養基上表現出比野生形擬南芥更敏感的缺
鐵症狀，pH顯色劑指示培養基顯色表明，超表達植株缺乏鐵誘導的擬南芥根際酸化能力，表
明IAR1可能通過調節擬南芥根際酸化調節植物的鐵營養的利用。 實施例3 基因的表達及定位分析 通過培養基缺磷、缺鋅、缺銅、缺鈣、缺錳等分析表明，IAR1基因對缺鐵具有轉移的 反應特性；通過半定量PCR分析表明，IAR1基因的表達可被培養基缺鐵所抑制，調節植物的 缺鐵誘導的根際酸化反應；通過PCR擴增IAR1基因的啟動子並構建相應的GUS載體獲得相 應的轉基因植株分析表明，IAR1基因主要在擬南芥的根部和葉片的維管表達。
實施例4
酵母表達試驗IAR1基因功能分析 選用酵母表達體系，pYES2-IARl酵母表達載體。把基因轉到突變體和野生型酵母 中，其中以轉空載體的為對照。4天後看突變酵母的生長情況。圖5所示，從上到下的酵母菌 株分別是Frel、Ftrl、Fetl、Fet2、Fre2的突變體和WT。結果是點在YPD加半乳糖誘導目的 基因表達的固體培養基中，轉pYES2-IARl和轉pYES2空載體對酵母的表型基本沒有差異。 點在YPD加8mMBPDS和半乳糖固體培養基中，轉pYES2-IARl在Frel、 Fet2和WT中酵母顏 色變紅，轉PYES2空載體到Frel和Fet2突變酵母中沒有此表型，轉pYES2-IARl和轉pYES2 空載體到酵母Ftrl、 Fetl、 Fre2、中基本沒有差異，也沒有酵母株變紅的表型，表明IAR1可 能與植物高親和性鐵利用有關。同時利用PH顯色劑指示培養基顯色表明，轉pYES2-IARl 表達載體的酵母菌株可以抑制酵母菌斑的酸化能力。
實施例5 蛋白的原核表達及其表達蛋白的鐵離子結合分析 為研究IAR1基因的表達蛋白和可能的蛋白的相互作用，先構建pGEX-2TK-At218 載體，轉化到大腸桿菌中誘導融合蛋白的表達，獲得GST-IAR1融合蛋白；通過微量熱滴定 ITC和螢光淬滅滴定技術分析表明，原核表達IAR1蛋白可以和鐵離子結合引起蛋白的熵和 蛋白微結構的變化，感受培養基的鐵離子濃度的變化。
權利要求
一種擬南芥基因IAR1在鐵營養利用及抗旱方面的應用。
2. 根據權利要求1所述的擬南芥基因IAR1在鐵營養利用及抗旱方面的應用，其特徵 在於所述的基因IARl，其在Genebank中的編號為ATlG70690，該基因的CDS序列全長為 900bp，編碼300個胺基酸的蛋白。
3. 根據權利要求1擬南芥基因IAR1在鐵營養利用及抗旱方面的應用，其特徵在於所 述的基因參與H202相關植物缺鐵反應過程。
4. 根據權利要求1所述的應用，其特徵在於含有所述基因的序列及其序列的全部或 部分開放讀碼框ORF序列的不同應用載體。
5. —種擬南芥基因IARl在培育抗乾旱和缺鐵植物新品種方面的應用。
6. 根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述的IARl基因及該基因中的部分片斷 連接在有關表達載體，以及通過不同的表達載體轉化獲得相關的轉基因植物。
7. 根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述的IAR1基因的部分序列或功能區域 片斷構建RNAi抑制表達載體，獲得相應的轉基因植物。
8. 根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述的基因由分析和尋找同源和同功能 的基因及其相應載體的構建和轉基因品系的獲得。
全文摘要
本發明涉及一種擬南芥基因IAR1在鐵營養利用及抗旱方面的應用。本發明的缺鐵條件下調節擬南芥鐵吸收有關的根際酸化基因IAR1，IAR1基因的表達控制擬南芥根際酸化能力和植物對鐵離子的吸收和利用，影響植物抗缺鐵反應和植物抗旱能力。IAR1基因的功能和作用的分析，為獲得轉基因鐵高效作物新品系，提高植物的抗旱反應提供了基礎和前提。
文檔編號A01H5/00GK101781660SQ200910064139
公開日2010年7月21日 申請日期2009年1月21日 優先權日2009年1月21日
發明者丁鵬, 劉浩, 安國勇, 宋純鵬, 張霖, 王棚濤, 王紅霞, 趙孝亮 申請人:河南大學