SiRNA在器官儲存/再灌注溶液中的應用的製作方法

2023-06-14 00:29:06 3

專利名稱：：SiRNA在器官儲存/再灌注溶液中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及在儲存、再灌注和運輸過程中對器官、組織和細胞的保存。更具體來說，本發明涉及使用儲存/再灌注溶液對器官、組織和細胞進行調節，該溶液能夠最小化和/或防止器官、組織和細胞的損傷，從而使器官、組織或細胞可以用於體內移植。總的來說，本發明也涉及了將器官、組織和細胞維持在存活狀態的方法。
背景技術：
：樹突狀細胞(DC)是免疫功能的關鍵控制物，因為它們既能誘導免疫刺激又能誘導免疫抑制。決定DC將是刺激性的還是抑制性的關鍵因素是可溶性的和膜結合的信號的表達。例如，CD80、CD86和IL-12對DC的抑制賦予它們抑制免疫系統活化的能力。另一方面，對DC抑制性信號例如PD-IL的抑制使得DC變成T細胞反應的更有力的激活劑。已經通過抗體阻斷(Goldberg等，TransplInt，1994.7Suppl1:p.S252-4)、反義寡聚核苷酸(Liang等，TransplantProc，2001.33(1-2):p.235)和化學免疫抑制劑(Lagaraine等，2003.75(9Supplm):p.37S-42S)進行了對這些DC衍生信號的操縱。不幸的是，所有這些方法都具有明顯的缺陷，限制了它們進入臨床。最近，已經開發了小幹擾RNA(siRNA)，與其它已知的基因抑制方法相比，它提供了更為有力、特異和持續時間長的基因抑制(Scherr等，CurrMedChem,2003.10(3):p.245-56)。己經證實低濃度的siRNA可以用於沉默DC細胞因子的生產，並調節DC活化T細胞的能力。本申請人:的PCTCA03/00867描述了通過使用siRNA對免疫細胞、包括DC的操縱，以及使用siRNA沉默的DC修飾T細胞反應的方法。組織和器官的移植需要提供活的組織和器官。自體和異體移植受到組織或器官在移植之前該組織或器官可以維持存活的時間的限制。供體器官在低溫條件下(4°C)在特別配製的灌注溶液中進行衝洗和儲存，以便洗掉碎片並減小在運輸過程中的損傷。這些溶液根據它們模擬的生理環境可以被廣義上區分為"細胞外的"和"細胞內的"。所述溶液含有活性成分，所述活性成分在再灌注過程中能夠最小化由低溫引起的細胞膨脹、抑制由缺血導致的酸中毒、最小化細胞外膨脹、最小化自由基損傷並提供ATP再生的底物。美國專利No.5，110，722以及美國專利申請序號2003/0109433和2005/0100876描述了用來得到更好的移植功能的器官儲存溶液。也可以通過加入自由基保護劑、胱天蛋白酶(caspase)抑制劑和血管緊張肽轉換酶抑制劑來調節器官儲存溶液(Baker等，JSurgRes，1999.86(1):p.145-9;McA皿lty等，Cryobiology,1996，33(2):P.217-25;Natori等，LiverTranspl，2003.9(3):p.278-84;Randsbaek等，ScandCardiovascJ,2000192(1):p.31-40)。已經嘗試了通過使用抑制供體輔助刺激分子並增加移植存活率的灌注溶液來嘗試免疫調製(Wekerle等，CurrOpinImmunol,2002.14(5):p.592-600)。已經證實了使用裸反義DNA灌注腎臟移植物能夠抑制細胞內粘附分子-1的表達(Chen等，Transplantation,l卿.68(6):p.880-7)。類似地，通過在器官儲存溶液中添加誘騙寡核苷酸，在心臟同種異體移植物中進行了NF-kB活性的抑制(Vos等，FasebJ，2000.14。)p.592-600)。但是，這兩種方法都需要高濃度的寡核苷酸用於誘導，這導致了邊緣性的療效。美國專利申請公布No.2006/0073127描述了使用選定的RNAi劑來製備用於移植的組織。但是，該方法使用短灌注時間，並且組織的儲存被維持在通常4。C的冷藏溫度下。此外，使用裸siRNA顯示出導致組織中擴散差，因此是無效的。Bradley等(TransplantationProceedings37,233-236,2005)簡單地證明了使用siRNA進行胰島細胞的成像。因此，非常希望能夠提供改進的器官儲存/再灌注溶液以及使用它們的方法，從而有效調節器官、組織和細胞降低免疫識別，進而引起存活率和受體接受程度的改進。發明簡述本發明涉及一種組合物，用於在離體儲存、再灌注和運輸過程中保存器官、組織和/或細胞的存活性，使得器官、組織和/或細胞可以成功用於體內移植。移植可以是自體或異體的。本發明還涉及了使用這樣的組合物以將器官、組織和/或細胞離體維持在可用於移植的存活狀態的方法。本發明還涉及被調節的器官、組織和/或細胞自身。本發明的組合物包含了siRNA，它們被特異性定靶/定向，以使負責器官、組織和/或細胞中存活力喪失和/或細胞損傷或與之有關的基因表達被沉默。在本發明的一些方面中，被定靶的基因是參與凋亡、免疫炎性反應和補體活化的基因。本發明的一個方面是用於將細胞、組織和/或器官維持在存活狀態的組合物。在離體儲存過程和體內再灌注過程中，細胞、組織和/或器官被維持在存活狀態。所述組合物含有一種或多種siRNA，所述siRNA特異性針對其表達與離體組織或器官中存活力喪失或細胞損傷相關的基因。因此，siRNA耙向這些基因的表達。這樣的基因可以包括一種或多種凋亡基因、免疫炎性基因和補體基因，以及這些不同基因的各種組合。本發明的一個方面是用於在離體儲存過程和體內再灌注過程中將細胞、組織和/或器官維持在存活狀態的組合物，該組合物含有siRNA，所述siRNA特異性針對其表達與離體組織或器官中存活力喪失或細胞損傷相關的基因。在本發明的一些方面中，所述組合物是儲存溶液，其允許細胞、組織和/或器官在室溫或冷藏溫度下儲存的時間段比使用現有的臨床接受的溶液所能達到的更長。在本發明的一些方面中，組合物被提供為大約37°C，並含有耙向一種或多種凋亡基因、一種或多種免疫炎性基因和一種或多種補體基因、以及它們的各種組合的siRNA的組合。根據本發明，提供了一種組合物，用於細胞、組織和/或器官在再灌注和離體期間維持存活力，使得細胞、組織和/或器官能夠存活用於移植，該組合物含有靶向一種或多種凋亡基因、免疫炎性基因和補體基因表達的一種或多種siRNA。在本發明的一些方面中，所述組合物還可以含有已知能夠幫助細胞、組織和/或器官離體存活的其它試劑，如後文所述。本發明的另一方面，是在移植前儲存或運輸細胞、組織和/或器官並同時將它們維持在存活狀態的方法。本發明的另一方面，是延遲缺血對器官、組織和/或細胞存活力的有害影響的方法，以及適合於用在這樣的方法中的儲存溶液。本發明的另一方面，是延遲凋亡對器官、組織和/或細胞存活力的有害影響的方法，以及適合於用在這樣的方法中的儲存溶液。本發明的另一方面，是延遲炎症對器官、組織和/或細胞存活力的有害影響的方法，以及適合於用在這樣的方法中的儲存溶液。本發明的還另一方面，是維持器官、組織和/或細胞在從哺乳動物宿主中切除之前的再灌注過程中的存活力的方法。本發明的還另一方面，是改變細胞、組織和/或器官，致使細胞、組織和/或器官在移植前以及移植過程中的儲存和再灌注過程中存活的方法。本發明的另一方面，是在移植前維持組織或器官保持離體存活的方法，包括將組織或器官與特異性針對其表達與離體組織或器官的存活力的喪失或細胞損傷有關的基因的至少一種siRNA相接觸。這樣的基因可以包括一種或多種凋亡基因、免疫炎性基因、補體基因及其組本發明的另一方面，是保護哺乳動物的組織或器官免於缺血和/或再灌注損傷的方法，包括將組織或器官與特異性針對其表達與缺血和/或再灌注損傷有關的基因的至少一種siRNA相接觸。在一些方面，所述siRNA被提供為組合物。在其它方面，siRNA組合物在高於4°〇的溫度下提供，在還有的其它方面，則是在大約37t:的溫度下。本發明的一個方面，是在移植前維持組織、細胞或器官離體維持的存活力的方法，該方法包括將組織、細胞或器官與特異性針對其表達與離體組織、細胞或器官的存活力的喪失或細胞損傷有關的基因的至少一種siRNA相接觸，其中所述接觸在高於大約4'C的溫度下進行。本發明的另一方面是保護哺乳動物的組織、細胞或器官免於缺血和/或再灌注損傷的方法，包括將組織、細胞或器官與特異性針對其表達與缺血和/或再灌注損傷有關的基因的至少一種siRNA相接觸。本發明的另一方面是將細胞、組織或器官儲存在存活狀態下的方法，該方法包括i)將要儲存的細胞、組織或器官與含有siRNA的溶液相接觸；以及ii)在非冷凍狀態下低於環境的溫度下維持細胞、組織或器官與溶液的接觸。本發明的另一方面是將細胞、組織或器官儲存在存活狀態下的方法，該方法包括i)將要儲存的細胞、組織或器官與含有siRNA的溶液相接觸；以及ii)在大約37'C的溫度下維持細胞、組織或器官與溶液的接觸。本發明的還另一方面是改變的細胞、組織或器官，其中所述改變的細胞、組織或器官含有被靶向以沉默一種或多種凋亡基因、免疫炎性基因和補體基因的表達的siRNA。在一些方面，細胞、組織和/或器官被離體提供並維持。在其它方面，細胞、組織和/或器官被提供在體內，即移植到適合的哺乳動物受體中。本發明的還另一方面是製備用於移植的組織的方法，該方法包括-將該組織暴露於含有siRNA的組合物，所述siRNA被靶向以沉默一種或多種凋亡基因、免疫炎性基因和補體基因的表達，-將所述暴露維持足以下調所述一種或多種凋亡基因、免疫炎性基因和補體基因的時間。在一些方面，暴露在大約4"C到大約37"C的溫度下進行。在其它方面，所述組織是腎臟。本發明的另一方面是將細胞、組織或器官儲存在存活狀態下的方法，該方法包括i)將要儲存的細胞、組織或器官與組合物相接觸，所述組合物含有至少一種特異性針對其表達與存活力損失或細胞損傷有關的基因的siRNA;以及ii)在從大約低於環境的溫度直到大約37'C的溫度下維持細胞、組織或器官與溶液的接觸。在閱讀了下面的描述後，本發明的其它方面和優點將會清晰。從下面的詳細描述中，本發明的其它特點和優點將變得明顯。但是，應該理解的是，詳細描述和用於表明本發明的實施方案的具體實施例的給出僅僅是為了舉例說明，因為根據詳細描述，對於本領域的專業技術人員來說，在本發明的精神和範圍之內進行的各種改變和修飾將變得顯而易見。現在將參考附圖對本發明的優選實施方案進行更全面的描述圖1顯示了在再灌注後缺血腎臟中RdB基因的表達增加。使用熱局部/再灌注模型使CD1小鼠經歷腎臟缺血損傷。在37'C下將左腎的腎靜脈和動脈夾住25分鐘。然後取出右腎。在夾住實驗後指定的夾住時間點後從腎臟提取RNA。對照是正常小鼠的RNA。RelB的表達通過RT-PCR測定。圖2顯示了在再灌注後缺血的腎臟中Fas基因的表達增加。使用熱缺血/再灌注模型使CD1小鼠經歷腎臟缺血損傷。在37'C下將左側腎臟的腎靜脈和動脈夾住25分鐘。然後取出右腎。在夾住實驗後指定的夾住時間點後從腎臟提取RNA。對照是正常小鼠的RNA。Fas的表達通過RT-PCR測定。圖3顯示了在再灌注後缺血的腎臟中caspaseS基因的表達增加。使用熱缺血/再灌注模型使CD1小鼠經歷腎臟缺血損傷。在37匸下將左腎的腎靜脈和動脈夾住25分鐘。然後取出右腎。在夾住實驗後指定的夾住時間點後從腎臟提取RNA。對照是正常小鼠的RNA。Caspase8的表達通過RT-PCR測定。圖4顯示了在再灌注後缺血的腎臟中caspase3基因的表達增加。使用熱缺血/再灌注模型使CD1小鼠經歷腎臟局部缺血損傷。在37。C下將左腎的腎靜脈和動脈夾住25分鐘。然後取出右腎。在夾住實驗後指定的夾住時間點後，從腎臟提取RNA。對照是正常小鼠的RNA。Caspase3的表達通過RT-PCR測定。圖5顯示了在再灌注後缺血的腎臟中C3基因的表達增加。使用熱缺血/再灌注模型使CD1小鼠經歷腎臟缺血損傷。在37。C下將左腎的腎靜脈和動脈夾住25分鐘。然後取出右腎。在夾住實驗後指定的夾住時間點後從腎臟提取RNA。對照是正常小鼠的RNA。C3的表達通過RT-PCR測定。圖6顯示了在再灌注後缺血的腎臟中C5aR基因的表達增加。使用熱缺血/再灌注模型使CD1小鼠經歷腎臟缺血。在37。C下將左腎的腎靜脈和動脈夾住25分鐘。然後取出右腎。在夾住實驗後指定的夾住時間點後從腎臟提取RNA。對照是正常小鼠的RNA。C5aR的表達通過RT-PCR測定。圖7顯示了在體外使用siRNA對caspase-3基因的沉默。將Caspase3-siRNA表達載體轉染到表達Caspase3的巨噬細胞系中。在基因沉默48小時後，提取總RNA，通過RT-PCR測定基因的表達。圖8顯示了在體外使用siRNA對caspase-8基因的沉默。將Caspase8-siRNA表達載體轉染到表達Caspase8的巨噬細胞系中。在基因沉默48小時後，提取總RNA，通過RT-PCR測定基因的表達。圖9顯示了在體外使用siRNA對RelB基因的沉默。將RelBcDNA和Re舊-siRNA共轉染到巨噬細胞系中。在基因轉染和沉默48小時後，提取總RNA，通過RT-PCR測定基因的表達。證實了合成的siRNA和siRNA表達載體都有力地沉默RelB的表達增加。圖IO顯示了在體外使用siRNA對Fas基因的沉默。將Fas-siRNA表達載體轉染到表達Fas的巨噬細胞系中。在基因沉默48小時後，提取蛋白，通過Western印跡測定Fas的表達。圖11顯示了腎臟中caspase3基因的沉默。對CD1小鼠靜脈內注射50)ig特異性針對caspase3基因的siRNA。在37"下將腎靜脈和動脈夾住25分鐘。在基因沉默48小時後，從腎臟提取總RNA，通過RT-PCR測定Caspase的表達。圖12顯示了腎臟中Fas基因的沉默。對CD1小鼠靜脈內注射50jag特異性針對Fas基因的siRNA。在37'C下將腎靜脈和動脈夾住25分鐘。在基因沉默48小時後，從腎臟提取總RNA，通過RT-PCR測定Fas的表達。圖13A和13B證實了通過免疫炎性基因的沉默防止腎臟中的缺血再灌注損傷。對CD1小鼠靜脈內注射50pg特異性針對單獨或組合的TNFa和RelB基因的siRNA。在基因沉默後，在37。C下將腎靜脈和動脈夾住25分鐘。通過在再灌注後24小時檢測血肌酐(A)和BUN(B)水平來測定腎功能。圖14A和14B證實了通過凋亡基因的沉默防止腎臟中的缺血再灌注損傷。對CD1小鼠靜脈內注射50pg特異性針對單獨或組合的Caspase3、Caspase8和Fas基因的siRNA。在基因沉默後，在37'C下將腎靜脈和動脈夾住25分鐘。通過在再灌注後24小時檢測血肌酐(A)和BUN(B)水平來測定腎功能。圖15A和15B證實了通過組合的基因沉默防止腎臟中的缺血再灌注損傷。對CD1小鼠靜脈內注射50pg特異性針對下列組的siRNA:第一組，caspase3、caspase8禾BFas基因；第二組，TNFoc禾BRelB基因；第三組，C3和C5aR基因；第四組，所有上述基因(S-mix)。在基因沉默後，在37'C下將腎靜脈和動脈夾住25分鐘。通過在再灌注後24小時檢測血肌酐(A)和BUN(B)水平來測定腎功能。圖16證實了基因沉默防止缺血再灌注損傷後小鼠的死亡。對CD1小鼠靜脈內注射50fig特異性針對Caspase3、Caspase8、Fas、C3、C5aR、TNFa和RelB基因的siRNA混合物的混合物。在基因沉默後，在37°C下將腎靜脈和動脈夾住35分鐘。圖17A-D證實了C3和Caspase3基因的體外基因沉默。(C3-17A&17B)L929細胞株使用lipofectamine2000用C3cDNA載體轉染，並與C3siRNA、空載體或無siRNA(對照)共轉染。在轉染後24小時，收穫細胞，提取總RNA。使用RT-PCR(17A)和定量PCR(17B)測定C3禾BGAPDH的轉錄本。(Caspase3-17C&17D)為了沉默Caspase3基因，將L929細胞用Caspase3siRNA、空載體或無siRNA(對照)轉染。在轉染後24小時，使用RT-PCR(17C)和定量PCR(17D)測定Caspase3的表達。圖18A-B證實了C3的體內沉默。(18A)I/R損傷後腎臟中C3和Caspase3基因的表達上調。如實施例部分所述將左腎夾住25分鐘。在夾住後指定的時間點獲取腎臟。通過RT-PCR檢測C3和Caspase3的表達。(18B)將小鼠用50(igC3siRNA和Caspase3siRNA或空載體預處理48小時，然後進行I/R實驗。在I/R後24小時獲取腎臟，使用RT-PCR檢測C3和Caspase3基因的表達。圖19A-D顯示了1/R損傷的腎臟中的組織學變化。按照圖18B中的描述將小鼠用siRNA處理並進行I/R損傷實驗。I/R後24小時獲取腎臟組織並切片，然後用H&E染色。(19A)正常的未鉗夾腎臟；(19B)PBS處理的I/R腎臟；(19C)空載體處理的I/R腎臟；(19D)C3siRNA和Caspase3siRNA處理的I/R腎臟。圖20顯示了使用Caspase3和C3，siRNA保護腎臟免於I/R損傷。a)在1/R損傷實驗之前48小時，靜脈內50mgsiRNA或空載體處理小鼠。在I/R後24小時，採集血液測定BUN和血清肌酐的水平。數據被顯示為平均值士SEM。p值使用Student'st檢驗與PBS處理的對照組相比較。在I/R損傷實驗之前48小時，靜脈內50mgsiRNA或空載體處理小鼠。小鼠的存活率被觀察到1/R損傷後第八天。圖21A-B顯示了腎臟IRI中caspase-3/8的表達增加。(21A)通過RT-PCR檢測的Caspase-3的表達。如材料與方法中所述，將左腎鉗住25分鐘。鉗住後24小時，獲取腎臟，提取總RNA。使用特異性針對caspase-3(21A)和caspase-S(21B)以及GAPDH基因的引物擴增轉錄。顯示的數據代表了對每組5隻動物進行的實驗。圖22A-D顯示了體內對caspase-3/8的沉默。50嗎pRNATU6.1載體含有caSpase-3siRNA或caspase-8siRNA。對照包括空白載體(無siRNA)處理和PBS處理組。基因沉默後48小時，將腎臟鉗住25分鐘。夾住後24小時，獲取腎臟，提取總RNA。通過RT-PCR(22A&22B)以及定量實時PCR(22C&22D)測定caspase-3(22A&22C)和caspase-8(22B&22D)以及GAPDH的轉錄本。圖23A-B顯示了在IRI中siRNA保護了腎功能。將腎蒂鉗住25分鐘。在鉗住前(Oh)和再灌注後24小時(24h)收集血液以測定BUN(23A)和血清肌酐(23B)水平。數據被顯示為平均值士SEM(承p<0.05，caspase-3/8-siRNA處理的小鼠對比未處理的和鉗住的小鼠)。圖24顯示了siRNA防護致命的腎臟缺血。將小鼠用50ngcaspase-3禾P8-siRNA載體或空白載體或PBS靜脈處理，然後鉗住35分鐘。siRNA處理的(n=10)和對照載體處理的(n=10)或PBS對照小鼠的存活率被觀察8天(p<0.05，caspase-3/8siRNA處理的小鼠對比未處理的和鉗住的小鼠)。圖25顯示了RelBsiRNA在體外沉默RelB基因的表達。在用RPMI、轉染試劑、空載體、混合的siRNA和RelBsiRNA處理的L929細胞株中，通過RelB和GAPDH表達的RT-PCR分析了RelBmRNA的沉默。顯示了代表性的樣品。圖26A-B顯示了在體內缺血再灌注後RelB表達的上調，通過RelB和GAPDH表達的RT-PCR測試了來自未處理的小鼠或被夾住25分鐘的小鼠在24小時點時的腎臟組織勻漿液中的RelB沉默效率(26A、B)。siRNA對RelB下調的基因表達。動物按照實施例部分中的描述進行處理。組織來自未處理的動物、用RelBsiRNA處理24小時和48小時的動物。RelB基因表達按照方法中的描述通過RT-PCR評估。結果也表示為與GAPDH相比的變化倍數的平均值+ASD。圖27A-B顯示了在RelBsiRNA沉默後腎功能的改善。按照實施例部分中的描述，小鼠在2天前接受溶於PBS的siRNA(實心條)或僅僅是PBS(斑點條)的單劑流體力學注射。按照指示，在夾住後24小時獲取樣品。(27A)BUN在陽性對照動物(PBS)中增加，但是在siRNA處理的小鼠中減少。(27B)肌酐水平在用PBS注射的小鼠中身高，但在用siRNA處理的組中不高。圖28A-B顯示了siRNA對腎臟缺血損傷的保護。小鼠腎臟經過缺血25分鐘，然後進行24小時的再灌注。腎臟組織在10%中性緩衝的福馬林中固定48小時，然後包埋在石蠟中。(28A)缺血再灌注導致了嚴重的嗜中性白細胞浸潤管狀空泡形成和管型形成。(28B)RelBsiRNA降低了缺血再灌注的損傷。圖29顯示了RelBsiRNA的流體動力學注射保護了小鼠免於致命的腎臟缺血再灌注損傷在35分鐘的腎臟缺血和灌注後的存活率。圖30顯示了從小鼠獲得並保存在本發明的含有針對RelB、Fas、caspase-3、caspase-8、TNFot、C5aR禾卩C3的siRNA的siRNA組合物中的心臟，可以被移植到受體小鼠中並且心臟存活了，而在相比較的對照組中心臟死亡了。心臟從BALB/c小鼠獲得，在本發明的含有UW溶液的siRNA組合物中於4'C保存48小時。體外保存的器官在心臟移植中用作供體。受體是同源種系的BALB/c小鼠。每天監測心跳。對照僅僅保存在UW溶液中。對照器官在使用UW溶液保存48小時後死亡。siRNA處理的心臟一直跳動到試驗結束時(40天)。照片顯示了移植後40天的心臟器官。具體實施例方式本發明涉及能夠維持細胞、組織和/或器官離體的存活力、使得它們可以儲存、運輸並然後用於體內移植的組合物。該組合物含有一種或多種siRNA，其特異性針對靶向選自凋亡基因、免疫炎性基因、補體基因及其組合的基因。靶向siRNA有效地抑制(下調)細胞、組織和器官中被靶向的基因的表達，導致了細胞、組織和器官的存活。本發明還提供了使用這些組合物的方法。有利的是，siRNA是非病毒性的改變基因表達的方法，因此對於被免疫抑制的移植病人來說是優選的。"存活"或"存活的"是指細胞、組織或器官能夠保留原有的功能。因此，細胞、組織或器官能夠以基本上保留其功能的方式被灌注、運輸、然後移植到體內。本文中使用的術語"小幹擾RNA"("siRNA")(在本
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中也被稱為"短幹擾RNA")是指含有大約10到50個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)、能夠指導或介導RNA幹擾的RNA(或RNA類似物)。在一些方面，siRNA含有大約15到30個之間的核苷酸或核苷酸類似物，在其它方面含有大約16到25個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)，在另外一些方面含有大約18到23個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)，在還有一些方面含有大約19到22個之間的核苷酸或(核苷酸類似物)(例如19、20、21或22個核苷酸或核苷酸類似物)。本文中使用的術語siRNA或RNAi試劑的"反義鏈"是指與被靶向沉默的基因的mRNA的大約10-50個核苷酸、例如大約15-30、16-25、18-23或19-22個核苷酸的部分基本上互補的鏈。反義鏈具有與所需的靶mRNA序列足夠互補的序列以指導靶特異性的RNA幹擾(RNAi)，例如足以通過RNAi機制或過程觸發所需的靶mRNA破壞的互補性。術語siRNA或RNAi試劑的"有義鏈"是指與反義鏈互補的鏈。反義和有義鏈也可以被稱為第一或第二鏈，與靶序列具有互補性的第一或第二鏈，以及與所述第一或第二鏈具有互補性的相應第二或第一鏈。指導鏈則是指進入RISC複合物並指導靶mRNA的切割的RNAi試劑的鏈，例如siRNA雙鏈體的反義鏈。術語"指導鏈"在本
技術領域：
中通常與術語"反義鏈"互換使用。"耙基因"是指其表達將被選擇性抑制或"沉默"的基因。這種沉默是通過RNAi途徑或過程切割靶基因的mRNA來實現的。在本發明中，耙基因是其表達與存活力的喪失或細胞損傷有關的基因。這樣的基因選自一種或多種凋亡基因、一種或多種補體基因、一種或多種免疫炎性基因及其組合。本文中使用的術語"灌注"是傾注或通過的行動，特別是指流體通過特定器官的血管。在本發明的具體實施方案中，含有siRNA的流體通過移植組織的脈管系統被灌注。術語"凋亡"或"程序性細胞死亡"是指在發育和其它正常的生物過程中將不想要的或無用的細胞消除的生理過程。凋亡是在正常的生理條件下發生的細胞死亡的模式，細胞在其自身的死亡中是主動的參與者("細胞自殺")。它在正常細胞的更新和組織動態平衡、胚胎發生、免疫耐受的誘導和維持、祌經系統的發育和內分泌依賴性組織萎縮過程中最為常見。凋亡也可以由外部事件或刺激引發，例如在本發明的某些優選實施方案的情況下的缺血損傷。經歷凋亡的細胞顯示出特徵性的形態和生化特點。"基因表達的抑制"是指來自靶基因的蛋白和/或mRNA產物水平的缺乏(或可察覺的減少)。"特異性"是指抑制靶基因而不明顯影響細胞的其它基因的能力。抑制的結果可以通過檢査細胞或生物體的外部性質或通過生物化學技術例如RNA溶液雜交、核酸酶保護、Northern雜交、逆轉錄、使用微陣列的基因表達監測、抗體結合、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、Western印跡、放射免疫分析(RIA)、其它免疫分析和螢光激活的細胞分析(FACS)來證實。正如本領域的專業技術人員所理解的那樣，可以斷言任何類型移植所需和使用的細胞、組織或器官都可以用於本發明。器官的代表性的例子是心臟、肝臟、肺、胰和腎臟，但不限於此。細胞(即胰島細胞)或其它組織(即血管)也包含在本發明的範圍內。簡單來說，"RNA是一種在哺乳動物細胞中用於抑制基因表達的RNA幹擾方法(Bertrand等，2002.BiochemBiophysResCommun296(4):1000-1004)。SiRNA是短的雙鏈RNA分子，大約21-25個鹼基對長，它們與細胞質蛋白相互作用形成細胞內RNAi誘導的沉默複合物(RISC)。RISC使用siRNA的反義鏈結合和切割相關的mRNA序列，然後被非特異性的RNA酶降解。SiRNA在細胞質中發揮作用，與反義寡聚核苷酸相比，實現靶基因的敲除所需要的濃度更低。當獲取器官用於移植時，隨後的缺氧時期，接著是器官的再灌注，都伴隨著顯著的組織損傷，包括內皮細胞凋亡和器質性功能障礙。這種局部缺血/再灌注(I/R)損傷可能參與部分由轉錄因子NF-kB及其亞基RelB控制的炎性反應、凋亡途徑通過例如caspase的活化、補體系統的激活以及免疫炎性基因例如Fas和TNF-a基因的活化。本發明是基於使用siRNA來靶向那些可以導致用於移植的細胞、組織和/或器官不能存活和存活力降低的那些基因的表達。這些基因可以包括例如凋亡基因、免疫炎性基因和補體基因及其組合。本發明提供了含有一種或多種凋亡基因、一種或多種免疫炎性基因、一種或多種補體基因及其組合的組合物，以及使用這樣的組合物的方法。以這種方式，提供了更有效的方法，更有效地將組織/細胞維持在存活狀態，以提高移植的成功率。在本發明的一些方面中，適合的凋亡基因可以包括但不限於caspase3基因、caspase8基因和fas基因。適合的免疫炎性基因可以包括但不限於TNF-a基因和RelB基因。適合的補體基因可以包括但不限於C3和C5aR。本領域的專業技術人員也可以理解的是，如果需要，可以使用siRNA靶向基因的組合。本領域的技術人員將會容易地理解哪些參與凋亡、免疫炎性的其它基因和參與啟動凝結的基因可以被用於本發明的組合物中。本領域的技術人員也將會容易地理解能夠用於本發明的短基因序列，在本文的實施例部分中列舉了其中的一些，僅作為代表性的例子而不意味著限制。此外，用於本發明的凋亡基因的代表性例子顯示在表1中，用於本發明的補體基因的代表性例子顯示在表2中。本領域的技術人員可以獲得這些基因的序列用於本發明組合物以及方法中的siRNA。現在，本發明在一個實施方案中，使用已接受的小鼠缺血/再灌注(I/R)損傷系統模型，證實了用特異性靶向一種或多種上述與組織損傷反應有關的基因的siRNA來灌注經受I/R損傷的器官，減少了這些基因的表達，從而防止了組織損傷的狀況並提高了器官的存活力。在本發明的該實施方案中，儘管I/R損傷在對照組中產生了腎損傷，但在siRNA處理過的腎臟中已經證實維持了良好的腎功能。這表明了本發明的方法和組合物提供了改善的存活力。當經歷缺血和再灌注的器官被維持在37'C時，即比通常用於移植器官的條件(通常維持在低溫下)嚴酷得多的條件下，觀察到了基因表達的抑制。正如本領域的技術人員所了解的那樣，本發明可以應用於細胞、組織或器官。適合的器官可以是但不限於心臟、肝臟、肺臟、胰臟和腎臟。在本發明的一些方面，SiRNA的投送是在獲取器官的過程中或始終(例如通過所述器官的脈管系統用藥)以及從器官分離可移植的細胞的過程中或始終進行的。siRNA組合物和方法可用於器官獲取過程的幾種情況中l)獲取前在死亡供體中通過靜脈內灌注；2)在包裝以運輸之前通過器官灌注；和/或3)在細胞培養中。更具體來說，可以通過在供移植的獲取之前或獲取之後用選定的siRNA進行處理，來保護組織或器官免於細胞損傷。例如，可以使用本發明的siRNA組合物對組織或器官再灌注所需的時間；簡單地將組織或器官在本發明的siRNA組合物中浸泡和儲存所需的時間；或者組織或器官可以再灌注並浸泡和儲存在本發明的siRNA組合物中。當然，正如本領域的專業技術人員所了解的那樣，這也適用於細胞。在本發明的實施方案中，組織或器官在獲取前用siRNA溶液灌注。所需器官的灌注可以長達例如大約30或60分鐘，如本領域的專業技術人員所了解的那樣。然後將獲取的灌注過的組織或器官儲存在siRNA溶液中，根據組織或器官的類型，這種儲存可以長達大約24小時或48小時，正如本領域的專業技術人員所了解的那樣。這樣，本發明的siRNA可以用於各種方法中以防止細胞的凋亡、延長組織和器官的壽命、防止和/或最小化缺血損傷、以及幫助防止組織/器官的排斥，這是因為組織/器官處於存活狀態中從而提供了較少的有害自身免疫反應。本發明的組合物可以用於各種溫度，包括大約2-4"C的冷藏溫度到大約37"C的體溫，這是本領域的專業技術人員早就了解的。本發明的組合物的使用可以利用已知用於再灌注和浸泡並儲存組織、細胞和器官的標準程序來進行。在本發明的特定方面，所述組合物和方法在超過4"C直到約37°C或更高的溫度下有效，並且仍然能夠有效抑制/防止/最小化對細胞、組織和器官的缺血損傷。這是特別有利的，因為不需要擔心將組織或器官保持冷藏以用於移植。本發明的siRNA組合物通過用含有siRNA的適合的生理溶液灌注和/或浸泡離體組織、器官或細胞，來施用於器官或組織或細胞(Hamar,P.，等，ProcNatlAcadSci2004;101:41)。例如，可以使用可商購的器官儲存溶液，例如但不限於Collins溶液、(UW)-溶液、組氨酸-色氨酸-酮戊二酸(HTK)溶液、ViaSpan(細胞內)和Celsior溶液(細胞外)(Muhlbacher等，1999，TransplantProc31(5):2069-2070)。此外，其它已知的添加劑也可以與本發明的siRNA組合用於組合物中。這樣的添加劑可以包括例如但不限於超氧化物歧化酶和其它自由基清除劑(Baker等，1999,JSurgRes86(1):145-149;McAnulty禾卩Huang1996,Cryobiology33(2):217-225;McLaren禾口Friend2003,TransplInt16(10):701-708)、21-氨基類固醇(lazaroids)、抗凋亡劑(El-Gibaly等，2004，Hepatology39(6):1553-1562;Natori等，2003，LiverTranspl9(3):278-284)、！丐通道阻斷齊U(Arnault等，2003,Transplantation76(l):77-83)、細胞間粘附分子-1抑制劑(Stepkowski等，1998,Transplantation66(6):699-707;Chen等，1999,Transplantation68(6):880-887)、己酮可可豆鹼(Randsbaek等，2000,ScandCardiovascJ34(2):201-208)以及它們的組合。siRNA可以用於各種策略中來沉默選定的基因。例如，可以使用下面的4種策略1)使用商業上預先合成的"siRNA池"(DharmaconInc)，由21個鹼基對的寡核苷酸組成，同時靶向靶基因的位點例如RelB基因的4個位點(圖1)，顯示出大於75%的基因沉默效能；2)使用帶有polIII啟動子的siRNA表達載體(pSUencer,Ambionlnc)，其驅動髮夾RNA表達以形成雙鏈RNA，用作內源表達的siRNA。通過克隆技術可以製備大量的沉默子-siRNA，用於體外(圖2)和體內基因沉默；3)使用siRNA表達盒(SEC)，它作為PCR產物被產生，由側翼帶有啟動子和終止子序列的髮夾siRNA模板組成(圖3)。一旦SEC被轉染到細胞中，髮夾siRNA從PCR產物表達並導致基因沉默(圖4)。SEC的優點在於它極富時間效率的事實，能夠在許多候選序列中快速篩選出最有潛力的siRNA;4)使用SEC載體。由於SEC收率低，因此有效的SEC隨後必須被克隆到病毒或非病毒載體中(圖5)。當然，正如本領域的專業技術人員所悉知的那樣，其它的策略也包含在本發明的範圍內。根據具體的耙基因或基因組合以及投送的siRNA劑量，可以獲得靶基因功能的部分或完全喪失。例如靶細胞的基因表達可以減小或喪失至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%或以上。抑制基因表達是指靶基因的蛋白和/或mRNA產物水平的缺少(或可察覺的降低)。特異性是指抑制靶基因而對細胞的其它基因沒有明顯影響的能力。抑制的結果可以通過檢查細胞或生物體的外部性質(如下面實施例中所述)或通過生物化學技術例如RNA溶液雜交、核酸酶保護、Northern雜交、逆轉錄、使用微陣列的基因表達監測、抗體結合、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、Western印跡、放射免疫分析(RIA)、其它免疫分析和螢光激活的細胞分析(FACS)來證實。siRNA可以以各種形式施用於組織或器官或細胞，例如(1)作為裸siRNA寡核苷酸；(2)摻入到siRNA表達載體中，該表達載體驅動髮夾RNA表達以形成雙鏈RNA，用作內源表達的siRNA。例如，可以使用pSilencer2.0-U6(AmbionInc.AustinTX)構建siRNA表達載體。特定的siRNA插入寡核苷酸應該按照用戶說明書設計。寡聚核苷酸含有19mer的特異性針對mRNA耙的髮夾序列、將兩個互補結構域分隔開的環序列、兩個3'-末端突出的核苷酸和多聚胸腺嘧啶核苷尾用於終止轉錄、以及5'單鏈突出端用於以BamHl和HindIII連接到pSilencer中。編碼有義和反義髮夾siRNA的寡核苷酸被退火，作為插入片段，如在Shi,Y.,(2003)，TrendsGenet"v.19，pp.9-12中所述；(3)作為siRNA表達盒(SEC)的形式，它作為PCR產物被產生，由兩側帶有啟動子和終止子序列的髮夾siRNA模板以及組成，如Castanotto等，(2002)，Rna,v.8，pp.1454-60中描述的那樣。簡單來說，SEC是使用沉默子表達試劑盒(Ambionlnc，AustinTX)產生的。按照用戶說明書設計用於前體SEC的有義和反義髮夾siRNA模板寡核苷酸。寡核苷酸含有19-mer特異性針對mRNA靶的髮夾序列、將兩個互補結構域分隔開的環、兩個3'-末端突出的核苷酸。簡單來說，進行了兩個PCR反應，使用啟動子元件(小鼠U6)作為模板、啟動子PCR引物和基因特異性的有義和反義寡核苷酸產生前體SEC。第一個PCR產物被用作第二個PCR的模板。進行了第三個PCR以在5'末端修飾核苷酸，並編碼EcoRI和HindIII限制性位點(圖1)。在PCR中使用Taq聚合酶(InvetregeneInc.);以及(4)摻入到載體中的SEC。一旦鑑定到有效的SEC，將SEC用MunI(與EcoRI相容)禾卩HindIII位點克隆到pVP22中，如同Paul(2003),Mol.Ther,v.7，pp.237-247中描述的那樣。本文描述的任何上述形式的siRNA都可對哺乳動物應用使用並施用，包括動物和人類。至於組合物中使用的siRNA的量，在動物例如小鼠中可以每次注射使用大約1-50微克，這足以在體內使基因沉默。溶液中每種不同的siRNA大約可達0.2到100pg/mlsiRNA可以用於衝洗和儲存心臟和腎臟器官。這包括了其間的任何範圍。劑量方案可以按照本領域技術人員所了解的使用。劑量方案可以在數分鐘、數小時或數天的時期內完成，並可以使用各種劑量的siRNA。當然，用於組合物的siRNA的量可以根據具體的組織或器官類型及其大小而變化，這可以被本領域的技術人員容易地確定。因此，本文提供的範圍是指導，事實上可以更大。siRNA可以被直接導入細胞(即細胞內)、組織、器官、同種異體移植物或生物體；也可以細胞外導入到腔、間隙空間、生物體的循環中，口服導入，或可以通過將細胞、組織、器官、同種異體移植物或生物體浸泡在含有siRNA的溶液中來導入。膽汁或膽管系統、血管或血管外循環、血液或淋巴系統、以及腦脊液是可以導入siRNA的位點。在本發明的某些實施方案中，siRNA通過灌注被提供給移植組織(例如器官)。上面的公開內容對本發明進行了一般性描述。參考下面具體的實施例可以獲得更完整的理解。描述這些實施例的目的僅僅是為了說明，並不打算限制本發明的範圍。形式變換和等同替換被視為情況可能提示或賦予了方便。儘管在本文中使用了特定的術語，但這些術語的目的是描述性的而不是為了限制。表l凋亡基因的例子基因家族tableseeoriginaldocumentpage27基因符號:tableseeoriginaldocumentpage27tableseeoriginaldocumentpage28tableseeoriginaldocumentpage29tableseeoriginaldocumentpage30沒有被批准的符號的基因tableseeoriginaldocumentpage30表2tableseeoriginaldocumentpage30Clq:y鏈C1QG1p34.1-p36.3C8:a鏈C8Alp32C8:卩鏈C8Blp32C4結合蛋白:ot鏈C4BPAlq32(a)C4結合蛋白:(3鏈C4BPBlq32(a)補體受體1(CD35)CR1lq32(a)補體受體2(CD21)CR2lq32(a)衰退加速因子(CD55)DAFlq32(a)膜輔助因子蛋白(CD46)MCPlq32(a)因子HHFlq32(a)因子IIF4q25C6C65p13(b)C7C75pl3(b)C9C95pl3(b)C2C26p21.3(c)因子BBF6p21.3(c)C4A(同種型)C4A6p21.3(c)C4B(同種型)C4B6p21.3(c)C8:-連C8G9q22.3-q32C5C59q33結合甘露糖的凝集素MBL10qll.2-q21穿孔素PRF110q22表面活性蛋白Al和A2SFTPA1，A210q22-q23表面活性蛋白DSFTPD10q22-q23膜反應性溶解的抑制物(MIRL，CD59)CD5911pl3Cl抑制物C1NH11qll-ql3.1ClrC1R12pl3ClsCIS補體受體3:a鏈二a-M整合蛋白ITGAM(CR3A，CD11A)玻連蛋白(S-蛋白)VTNC3C3C5a受體lC5R1白細胞粘附分子:卩鏈=(3-2整合蛋白ITGB2(LCAMB,CD18)備解素PFC腳註(a)補體活化調節物(RCA)基因簇(b)膜攻擊複合物(MAC)基因簇(c)III類MHC補體基因簇實施例下面的實施例被用來舉例說明本發明的各種實施方案，而並非旨在限制發明的範圍。使用的一般性方法缺血方案1)通過腹膜內施用氯胺酮結合吸入安氟醚使小鼠(25-30g)麻醉。2)通過在動物底下放置暖墊(37°C)將小鼠的體溫保持恆定。3)使用腹中線切開，用無創傷血管鉗將左腎蒂阻斷長達35分鐘。阻斷後，將0.8ml預熱(37°C)的鹽水放置在腹腔中，將腹部用浸溼了無菌鹽水的棉花蓋住。4)取下鉗子後，觀察腎臟1分鐘以觀察指示血液重新流動的顏色變化。然後取下對側腎臟，將傷口以兩層封閉。對照小鼠進行同樣的手術操作，除了不使用血管鉗。5)在再灌注24小時後將小鼠處死；通過下腔靜脈收集血液樣品；12pl316pll.217qll19pl3.3-pl3.219ql3.3-ql3.421q22.3Xpll.4-p11.2然後獲取左腎以評估腎損傷。siRNA注射1)對於全身性注射來說，合成的siRNA(在0.8-1mlPBS中)被快速注射(在10秒內)到尾側靜脈或陰莖靜脈之一中。為了使尾靜脈膨脹，在用乙醚麻醉5±1秒的情況下將尾部浸泡在溫水中(50-55°C)。2)對於局部注射來說，從中線剖腹術中可以看到左側腎蒂。在主動脈左側進行腎血管上方的最小製備以插入阻斷鉗。夾住主動脈和腔靜脈，用30號針頭刺入腎靜脈，以注射0.1ml含有siRNA的PBS。將針頭在原地保持5秒鐘，然後緩慢取出，同時用鑷子夾住一點Avitene壓迫腎靜脈30秒。然後將Avitene留在原地。在左腎蒂被阻斷進行缺血後立即取下主動脈和腔靜脈鉗。用於灌注研究中沉默指定基因的siRNA:Caspase3基因GATCTATCTGGACAGTAGT:AAGCTCTTCTTCCCTCCCTAAAAGTGCAAGTGCAAACCAGACAAGACAACCAACTAGTGGTGCGGAATCGAGAGCAAACGAACTGTGCAAGACTTCCTAAAGAGCACACTGTATGTGGTATTAACaspase8基因Fas基因TNF-a基因RelB基因C3基因C5aR基因使用的一般性方法(圖17-20)C3禾口Caspase3siRNA的設計選擇耙序列5'-CTGTGCAAGACTTCCTAAAGA-3'(特異性針對C3)和5'-GGATCTATCTGGACAGTAGTT-3'(特異性針對Caspase3)。含有有義和反義耙序列和環序列的寡核苷酸被合成、退火、並構建到pRNAT-U6.1/NeosiRNA表達載體中，該載體具有cGFP基因和驅動siRNA表達的U6啟動子(Genescript,Piscataway，NJ)。C3和Caspase3基因的體外沉默使用lipofectamine2000(Invitrogen)將L929細胞用C3siRNA或Caspase3siRNA轉染。單獨的載體和混雜的(無義的)siRNA被用作陰性對照。簡單來說，將細胞鋪在12孔板中(每個孔2xlS個細胞)，使其生長過夜，達到90%匯合。將細胞用2ngC3siRNA、Caspase3siRNA或陰性對照siRNA質粒在減少血清的培養基中轉染5小時，然後在完全培養基中孵育24小時。在轉染後24小時從被轉染的細胞中提取RNA。腎臟I/R損傷模型6-8周齡的CDl小鼠通過腹膜內注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(20mg/kg)進行麻醉，並置於加熱的墊子上以便在手術中維持它們的體溫。在腹部切開之後，鈍性分離腎蒂，將微血管鉗(RobozSurgicalInstrument,Washington,DC)放置在左腎蒂上25分鐘。在該過程中，動物用溫暖的鹽水保持水分並在恆定的溫度下(37°C)。在缺血25分鐘後取下鉗子。將右腎切除。腎功能的評估在缺血後24小時，從下腔靜脈獲得血液樣品。由倫敦衛生科學中心(LondonHealthSciencesCentre)的中心實驗室測定血清肌酐水平和血尿素氮(BUN)，以監測腎功能。組織學檢測在缺血24小時後，從小鼠切下腎臟，將組織切片固定在10%福馬林中，然後使用標準技術進行處理，用於組織學檢査。福馬林組織被包埋在石蠟中，用H&E對5nm的切片進行染色。這些切片由病理學家以盲法模式進行檢査。檢査了皮質和髓質中的組織學變化。通過逆轉錄(RT)-PCR和定量PCR測量腎臟C3和Caspase3的mRNA水平使用Trizol(Invitrogen)從腎臟和細胞中提取總RNA。使用寡-dT引物和逆轉錄酶(Invitrogen)對總RNA進行逆轉錄。用於擴增鼠的C3、Caspase3禾卩GAPDH的引物如下C3，5'-CCCTgCCCCTTACCCCTTCATTC-3'(正向)禾口5'-CGTACTTGTGCCCCTCCTTATCTG-3'(反向)；Caspase3，5'-CGGGGTACGGAGCTGGACTGT-3'(正向)和5'-AATTCCGTTGCCACCTTCCTGTT-3'(反向)；以及GAPDH，5'陽tgatgacatcaagaaggtggtgaa-3'(正向)禾口5'-tgggatggaaattgtgagggagat-3'(反向)。PCR反應在下述條件下進行95°C30秒，58°C30秒，然後72°C30秒(30個循環)。實時PCR反應使用SYBRGreenPCRMaster混合物(Stratagene)和100nM與RT-PCR序列相同的基因特異性的正向和反向引物進行。PCR反應條件是95°C10分鐘，95°C30秒，58°C1分鐘和72°C30秒(40個循環)。統計學分析數據被表示為平均值士SEM。組之間的統計學比較使用Student'st檢驗進行。統計學重要性被定義為p<0.05。使用的一般性方法(圖21-24)Caspase-3禾卩caspase-8siRNA的設計選擇caspase-3基因和caspase-8基因的靶序列。合成含有特異性針對caspase-3序列的寡核苷酸(有義TCTATCTGGACAGTAGTTTTTTTTCCAAA-3'5'-AGCTTTTGGAAAAAAA反義TAGTTGG-3')禾卩caspase-8(GATCCGACCTTTAAGGAGCTTCATTTCAAGAGAATGAAGCTCCTTAAAGGTCTTTTTTGGAAA-3'，反義5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCG-3')，並進行退火。通過將退火的DNA寡核苷酸對插入到用BamHI禾口HindIII(Genescript，Piscataway,NJ)消化的pRNAT-U6.1/NeosiRNA表達載體中，構建在小鼠U6啟動子和cGFP基因控制下表達髮夾siRNA的Caspase-3siRNA禾Bcaspase-8siRNA載體。caspase-3禾Pcaspase-8基因的體外沉默使用lipofectamine2000將L929細胞用caspase-3/8siRNA轉染。單獨的載體和混雜的(無義的)siRNA被用作陰性對照。簡單來說，將細胞鋪在24孔板中(每個孔lxlS個細胞)，使其生長過夜，達到90%匯合。將細胞用2嗎caspase-3/8siRNA或陰性對照siRNA質粒在減少血清的培養基中轉染5小時，然後在完全培養基中孵育24小時。製備總RNA用於隨後的分析。RelBSiRNA的製備RelBsiRNA寡聚物由Welgen，Inc合成。通過限制性位點將siRNA克隆到pQuiet載體中。RdB基因的體外沉默使用lipofectamine2000(Invitrogen)將L929細胞用RelBsiRNA轉染。單獨的載體和混雜的(無義的)siRNA被用作陰性對照。簡單來說，在培養24小時後使用TRIzol提取RNA用於逆轉錄酶PCR(RT-PCR)。用於體內研究的動物CD1小鼠從TheJackson實驗室(BarHarbor,ME)購買。將小鼠維持在特定的無病原條件下。所有的小鼠都是雄性的，6到10周齡。所有的試驗都按照動物委員會指南的護理和使用指導(GuidefortheCareandUseofonAnimalsCommitteeGuidelines)進行。SiRNA注射在腎臟IRI前48小時，將siRNAs(50溶於1mlPBS中)或1mlPBS快速注射(在IO秒鐘內)到一條尾部靜脈中。為了使尾靜脈膨脹，將尾巴浸泡在溫水中或用燈加熱。腎臟IRI模型稱重25-27g的小鼠通過腹膜內注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)進行麻醉，並置於加熱的墊子上以在手術中維持它們的體溫。腹部切開之後，鈍性分離腎蒂，將微血管鉗(RobozSurgicalInstrument,Washington,DC)放置在左腎蒂上25分鐘。在該過程中動物用溫暖的鹽水良好保持水分並在恆定的溫度下(37°C)。選擇缺血的時間為25分鐘，以獲得具有最小的血管血栓形成的可逆的缺血ARF模型，以避免動物死亡。在取下鉗子後，觀察左腎1分鐘以看到指示血液重新流動的顏色變化，然後切下對側腎臟。然後將切口縫合，使動物恢復，允許自由進食和進水。在再灌注後24小時從下腔靜脈收集血液，並獲取左腎用於分析。對於存活觀察實驗來說，按照同樣的方式進行手術，只是缺血(鉗住)的時間是35分鐘。腎功能的評估在(缺血前)和缺血後24小時後從下腔靜脈獲得血液樣品。由倫敦衛生科學中心(LondonHealthSciencesCenter)的中心實驗室使用SYNCHRONLX系統(BeckmanCoulter,Inc.)測定血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Cr)水平。通過定量實時PCR測量腎臟RelBmRNA水平使用TRIzol(LifeTechnologies,Gaithersburg，MD)從細胞或腎臟分離總RNA。用於RelBRT-PCR的引物是有義CCCCTACAATGCTGGCTCCCTGAA，反義CACGGCCCGCTCTCCTTGTTGATT。使用eppendorf循環儀(Mastercyclergradient)進行RT-PCR。所有的反應都是在50pl反應體積中按照製造商的說明進行的。PCR參數的組成為在42"C逆轉錄50分鐘，然後進行30個循環的PCR:94°C30秒，58°C30秒和72'C30秒。在100伏下運行凝膠電泳，然後在紫外燈下觀察結果。樣品還進行基因表達的實時PCR。腎臟形態學變化的評估在缺血後24小時，從小鼠切下腎臟，將組織切片固定在10%福馬林中，並使用標準技術進行處理以用於組織學檢査。福馬林組織被包埋在石蠟中，用H&E對5nm的切片進行染色。這些切片由病理學家以盲法模式檢查。使用設計用於評估梗死、管狀空泡形成和管型形成程度的半定量尺度，在根據涉及的傷口面積的5點尺度上，為皮質和髓質中組織學變化的百分數打分，如下0，正常腎臟；0.5，<10%;1，10-25%;2，25-50%;3，50-75%;和4，75-100%。病理學家通過對5個視野中的每個高倍視野(x400)中嗜中性細胞進行計數，然後將嗜中性細胞的數量平均，來定量評估嗜中性細胞浸潤。統計學分析統計學比較使用雙側Student'st檢驗進行。存活率通過Kaplan-Meier檢驗進行分析。使用的一般性方法(圖25-29)動物稱重25-27g的6周齡的雄性CD1(CharlesRiver)小鼠在使用前被飼養在我們大學的實驗室中。所有的步驟都按照動物委員會的護理和使用指南(GuidefortheCareandUseonAnimalCommittee)所設定的準則進行。細胞系細胞lL929和巨噬細胞被用在我們的實驗中，用於檢測siRNA的沉默效能。為了分析siRNA的沉默效能，我們通過使用Lipofectamine2000(Invitrogen)將siRNA轉染到L929細胞蓋中，然後用tTRIzol提取RNA用於逆轉錄酶PCR(RT-PCR)。SiRNA的製備和注射TNFasiRNA由公司(Invitrogen)合成。將該TNFasiRNA構建到pSilence載體或pRNATU6.1載體中。對於流體動力學注射來說，將siRNA(50|ig溶於1mlPBS)或1mlPBS快速注射(在10秒鐘內)到一條尾部靜脈中。為了使尾靜脈膨脹，將尾巴浸泡在溫水中或用燈加熱。缺血方案小鼠(25-27g)通過腹膜內施用氯胺酮/甲苯噻嗪(100mg/kg和10g/kg)進行麻醉。通過在動物的下面放置暖墊使其體溫保持恆定。使用腹中線切開術，使用微動脈瘤鉗(InternationalFineSciencceTools,Inc.CA)將左腎臟動脈和靜脈阻斷25或35分鐘，同時取下右腎。阻斷後，將0.5ml預溫熱(37°C)的鹽水放置在腹腔中，將腹部關閉。在取下鉗子後，再觀察腎臟1分鐘以看到指示血液重新流動的顏色變化。縫合後，將被切口的小鼠放回籠子中。假處理小鼠經過同樣的手術程序，只是不使用微動脈瘤鉗。在24小時時將小鼠處死，通過下腔靜脈收集血液樣品。對於存活實驗來說，在所有存活的動物沒有生病的跡象之後對動物觀察幾天。腎功能的評估由我們的中心實驗室使用SYNCHRONLX系統(BeckmanCoulter,Inc.)測量血清中的血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)。RT-PCR使用TRIzol(LifeTechnologies,Gaithersburg，MD)從細胞或腎臟分離總RNA。使用eppendorf循環儀(Mastercycler梯度)進行RT-PCR。所有的反應都是在50反應體積中按照製造商的說明進行的。PCR參數的組成為在42"C的逆轉錄50分鐘，然後進行30個循環的PCR:94°C30秒，58°C30秒和72。C30秒。在100伏下進行凝膠電泳，然後在紫外燈下觀察結果。腎臟形態學變化的評估從小鼠手術切下之後，腎臟被冠狀切片，固定在10%甲醛中，並包埋在石蠟中。用H&E對切片(5pm)進行染色。在顯微鏡下對一個全深度的冠狀切片進行檢查。使用5點尺度對皮質髓質交界處損傷的腎小管的百分數進行估計。RelB免疫組織化學在脫去石蠟並重新水化後，將腎臟的石蠟切片用3%的過氧化氫孵育15分鐘以猝滅內源的過氧化物酶活性。在微波20分鐘後，將切片在含有5%正常小鼠血清的清洗緩衝液中封閉30分鐘。將切片與用PBSl:lOO稀釋的倉鼠抗小鼠FasmAb(BDPharmingen)在室溫孵育1小時。在用PBS清洗後，將切片與生物素化的小鼠抗倉鼠Ig、然後與結合了辣根過氧化物酶的鏈親和素(LSAB檢測試劑盒，DAKO)孵育。在PBS中進一步清洗後，染色用二氨基聯苯胺(DAB)顯影，然後將載玻片用蘇木精輕微復染。對照玻片用倉鼠IgG代替第一抗體進行染色。在單個腎小管中，Fas免疫染色出現在所有上皮細胞中或完全不出現。盲法評價連續5個觀察視野(放大x200)中陽性腎小管的百分數。組織學計分在腎臟缺血後取出腎臟，在10%福馬林中固定，用於組織學檢查。將組織包埋在石蠟中，用H&E對切片進行染色。從盲法分析計算出平均值，使用分值O，無損傷；0.5，<10%;1，10-25%;2，25-50%;3，50-75%;以及4，75-100%。通過對5個視野(x400)中嗜中性細胞的數量進行計數來評估嗜中性細胞浸潤。統計學分析統計學比較使用雙側Student'st檢驗進行。存活率通過Kaplan-Meier檢驗進行分析。用於TNF-a的一般性方案被relBsiRNA沉默的TNF-a基因為了觀察體外基因沉默的結果，用載體relBsiRNA轉染L929細胞。24小時後收集細胞並製備RNA。通過RT-PCR測定，relBmRNA在L929中的表達降低了。接下來測定了在缺血再灌注損傷後，注射TNF-asiRNA是否能夠沉默被上調的TNF-a表達。首先觀察IRI後TNF-a的表達。在IRI後24小時和48小時，TNF-a的表達增加了，在腎臟中最高表達是在48小時時。然後通過單次流體動力學注射將載體siRNA(50fig)投送到尾靜脈中。在24小時和48小時後，取出腎臟並製成勻漿液。製備RNA和cDNA，並進行RT-PCR。結果顯示在用siRNA處理後reffi的表達降低了。siRNA處理改善了腎功能基因沉默的結果表明siRNA能夠阻斷NF-KB途徑。證實了TNFa能夠防止腎臟在缺血後的損傷。BUN和肌酐由我們的中心實驗室測量。在夾住25分鐘後，BUN和肌酐的水平與未處理的對照小鼠相比明顯增加了。如果與陽性對照組相比，BUN水平降低了30%。但是肌酐含量顯著降低了。形態學變化接下來觀察了腎臟的病理學變化。腎臟病理學通過H&E(蘇木精)染色來確定，其在缺血的腎臟中隨著TNFot表達的沉默而明顯降低了。由於腎臟中TNFa的表達和缺血損傷被抑制的情況，小鼠的死亡率得到了改善。接下來證明了TNFasiRNA在小鼠中能夠提供嚴重缺血的保護，在嚴重缺血中左腎蒂被鉗住35分鐘，並且對側腎臟被移除。在鉗住之前48小時，通過流體動力學尾靜脈注射向小鼠注射了鹽水、載體siRNA和TNFa.siRNA。11隻通過流體動力學尾靜脈注射接受鹽水的小鼠中的10隻在5天內死於急性腎衰竭。但是，10隻用TNFgsiRNA注射的小鼠中的8隻存活了(對照空載體P<0.01，對照鹽水PO.01)。實施例(圖1-16)實施例1如上所述，將CD1小鼠的左腎靜脈和動脈在37t:鉗住25分鐘。在再灌注24或48小時後取出被處理的腎臟。時間點是從鉗住時計算的。從用TRIzol試劑(GibcoBRL)按照製造商的說明分離的IDO-沉默的、無義siRNA沉默的或假轉染的B16F10細胞中提取總RNA。通過RT-PCR測定RelB基因的表達。使用RNAPCR試劑盒(GibcoBRL)，用提供的寡d(T)16引物來合成第一鏈cDNA。1(imol逆轉錄反應產物用於後面的PCR反應。用於RelB的引物位於RelB-siRNA靶序列兩側，並使用了GAPDH(內部陰性對照)引物。使用的PCR條件如下94°C30秒，58°C30秒，以及72°C30秒(30個循環)。使用凝膠電泳在1.5。/。瓊脂糖凝膠中通過用溴化乙錠染色使PCR產物可見(Hill,J.A.,Ichim,T.E.,Kusznieruk,K.P.，Li,M.，H腿g,X"Yan,X.，Zhong，R.，Cairns,E.，Bell,D.A.，禾口Min，W.P.2003.ImmunemodulationbysilencingIL-12productionindendriticcellsusingsmallinterferingRNA.(在樹突狀細胞中通過使用小幹擾RNA沉默IL-12的產生來進行免疫調節)JImmunol171:691-696)。正如在圖1中看到的那樣，在腎臟缺血後RelB的表達增加了。實施例2按照實施例1中的描述對CD1小鼠進行處理，在再灌注O、2、12和24小時後，通過RT-PCR測定被處理的腎臟中Fas基因的表達。如在圖2中看到的那樣，Fas的表達在缺血後增加了。實施例3按照實施例1中的描述對CD1小鼠進行處理，在再灌注0、2、12、24或48小時後測定被處理的腎臟中caspase8基因的表達。如在圖3中看到的那樣，caspase8的表達在缺血後增加了。實施例4按照實施例1中的描述對CD1小鼠進行處理，並測定了caspase3和GAPDH基因的表達。圖4顯示了在再灌注後0、2和24小時時caspase3:GAPDH表達的比率。實施例5按照實施例1中的描述對CD1小鼠進行處理，在再灌注24和48小時後測定被處理的腎臟中C3基因的表達。圖5顯示了C3基因的表達在缺血後增加了。實施例6按照實施例1中的描述對CD1小鼠進行處理，在再灌注24和48小時後測定被處理的腎臟中C5aR基因的表達。圖6顯示C5aR的表達在缺血後增加了。實施例7圖7顯示了在巨噬細胞系中Caspase3基因的體外沉默。簡單來說，將細胞鋪在12孔板中(每個孔2xlS個細胞)，使其在l或2ml不含抗生素的完全培養基中生長過夜。將4嗎含有Caspase3-siRNA的質粒與10(ilLipofectamine2000試劑在250|il最適的減少血清的培養基中(Invitrogen)在室溫孵育20分鐘。然後將混合物加到生長到90%-95%匯合的細胞培養物中。孵育4小時後加入等體積的補充有20%FCS的RPMI1640。24到48小時後，收穫轉染的細胞，通過RT-PCR檢測Caspase基因的表達。(M0=巨噬細胞)實施例8將實施例7中的巨噬細胞按照實施例7中的描述用表達caspase8-siRNA的載體轉染。轉染後48小時，提取總RNA,通過RT-PCR測定caspase8基因的表達。1、2、3和4代表了不同的siRNA。圖8顯示了在處理過的細胞中caspase8的表達降低了。實施例9將實施例7中的巨噬細胞按照實施例7中描述的方法用RelBcDNA和RelB-siRNA共轉染。轉染後48小時，提取總RNA，通過RT-PCR測定RelB基因的表達。siRNA池是幾種靶向同樣基因但是不同位點的siRNA的混合物，並且siRNA載體是含有SEC序列或在本申請中描述的髮夾siRNA序列的載體。所有的泳道都是DC細胞。如在圖9中所見，RelB的表達被siRNA池和siRNA載體降低了。實施例10如上所述用Fas-siRNA在表達Fas-siRNA的載體中轉染表達Fas的巨噬細胞。轉染後48小時，提取蛋白，通過Western印跡測定Fas的表達。如在圖10中所見，在Fas-siRNA處理的細胞中蛋白的水平降低了。siRNA1、3、4和5是耙想Fas基因的不同siRNA序列。實施例11將50ng特異性針對caspase3基因的siRNA靜脈內注射到CD1小鼠中。然後按照實施例1中的描述鉗住左腎靜脈和動脈。在注射siRNA後48小時，獲取左腎，提取總RNA，通過RT-PCR測定caspase3的表達。實施例12按照實施例11中的描述處理CD1小鼠，除了注射特異性針對Fas基因的siRNA外。圖12顯示了在siRNA處理後Fas基因的表達降低了。從左到右為對照1-3和小鼠1-5。實施例13CD1小鼠靜脈注射特異性針對TNFa和/或RelB基因的siRNA(組合中每種siRNA各50ng)，然後按照實施例1中的描述進行左腎缺血。通過在再灌注後24小時測量血肌酐和BUN水平來確定腎功能。圖13顯示，當使用同時針對TNFoc和RelB基因的siRNA時，缺血後的腎功能被保護為接近正常。實施例14CD1小鼠靜脈注射特異性針對凋亡基因caspase3、caspase8和Fas的siRNA，或分別或組合，並按照實施例1中的描述進行左腎缺血。在再灌注後24小時確定腎功能。如圖14中所見，單獨沉默caspase3或caspase8保護了缺血後的腎功能。最有效的是使用靶向caspase3、caspase8禾口Fas的siRNA的混合物。實施例15按照實施例13中的描述處理CD1小鼠，不同之處在於使用下列的siRNA組合組合1:caspase3、caspase8禾口Fas;組合2:TNFa禾卩RelB;組合3:C3和C5aR;組合4(S-mix):所有的混合物l、2和3的siRNA。圖15顯示了所有的siRNA組合對缺血後腎功能的良好保護。實施例16CD1小鼠靜脈注射50)ig特異性針對caspase3、caspase8、Fas、C3、C5aR、TNFa禾PRelB基因的siRNA混合物或鹽水(對照)，並通過在37。C下夾住腎靜脈和動脈35分鐘使左腎缺血。在再灌注後跟蹤小鼠的存活，結果顯示在圖16中。所有siRNA處理的小鼠在再灌注後8天仍然存活，而所有的對照小鼠在再灌注後5天都死亡了。儘管在這裡已經詳細描述了本發明的優選實施方案，但本領域的專業技術人員將會了解到，可以對其進行改變而不背離本發明的精神或隨附的權利要求的範圍。權利要求1.在離體儲存過程中和體內再灌注過程中將細胞、組織和/或器官維持在存活狀態的組合物，所述組合物包含特異性針對其表達與離體組織或器官的存活力喪失或細胞損傷有關的基因的siRNA。2.權利要求1中的組合物，性基因、補體基因及其組合。3.權利要求2中的組合物，C3spas68、fas及其組合o4.權利要求2中的組合物，RelB及其組合。5.權利要求2中的組合物，其組合。其中所述基因選自凋亡基因、免疫炎其中所述凋亡基因選自Caspase3、其中所述免疫炎性基因選自TNF-a、其中所述補體基因選自C3、C5aR及6.權利要求2-5任一項的組合物，其中所述組合物包含特異性針對Caspase3、Caspase8、Fas、C3、C5aR、TNFa禾口RelB的siRNA。7.權利要求2-5任一項的組合物，其中所述組合物包含特異性針對caspase3、caspase8禾口Fas的siRNA。8.權利要求2-5任一項的組合物，其中所述組合物包含特異性針對TNFa禾卩RelB的siRNA。9.權利要求2-5任一項的組合物，其中所述組合物包含特異性針對C3禾PC5aR的siRNA。10.權利要求i中的組合物，其中所述組合物以大約4t:直到大約37。C的溫度提供。11.權利要求10中的組合物，其中所述組合物以37'C提供。12.權利要求1到11任一項的組合物，其中所述組合物還包含可商購的器官儲存溶液。13.權利要求1到12任一項的組合物，其中所述組合物還包含添加劑，所述添加劑選自自由基清除劑、21-氨基類固醇、抗凋亡劑、鈣通道阻滯劑、分子間粘附分子-1抑制劑、己酮可可鹼及其組合。14.權利要求1到13任一項的組合物，其中所述siRNA的提供量多達大約100|ug/ml。15.在移植前維持離體組織、細胞或器官的存活力的方法，所述方法包括將組織、細胞或器官與特異性針對其表達與離體組織、細胞或器官的存活力喪失或細胞損傷有關的基因的至少一種siRNA相接觸，其中所述接觸在高於大約4'C的溫度下進行。16.保護哺乳動物的組織、細胞或器官免於缺血和/或再灌注損傷的方法，包括將組織、細胞或器官與特異性針對其表達與缺血和/或再灌注損傷有關的基因的至少一種siRNA相接觸。17.權利要求15或16中的方法，其中siRNA特異性針對選自凋亡基因、免疫炎性基因、補體基因及其組合的基因。18.權利要求17中的方法，其中所述凋亡基因選自caspase-3、caspase-8、fas及其組合。19.權利要求17中的方法，其中所述免疫炎性基因選自TNF-a、RelB及其組合。20.權利要求17中的方法，其中所述補體基因選自C3、C5aR及其組合。21.權利要求18到20任一項的方法，其中所用的siRNA基因是Caspase3、Caspase8、Fas、C3、C5aR、TNF-a和RelB。22.權利要求17到21任一項的方法，其中所述組合物包含特異性針對caspase3、caspase8禾卩Fas的siRNA。23.權利要求17到21任一項的方法，其中所述組合物包含特異性針對TNFa禾BRelB的siRNA。24.權利要求17到21任一項的方法，其中所述組合物包含特異性針對C3和C5aR的siRNA。25.權利要求15到24任一項的方法，其中所述siRNA的提供量為每種所述siRNA多達大約100(ig/ml。26.將細胞、組織或器官儲存在存活狀態的方法，所述方法包括i)將要儲存的細胞、組織或器官與包含特異性針對其表達與存活力喪失或細胞損傷有關的基因的至少一種siRNA相接觸；以及ii)在從大約低於環境直到大約37'C的溫度下維持所述細胞、組織或器官與溶液的接觸。27.權利要求26中的方法，其中使用siRNA的組合。28.權利要求26或27中的方法，其中所述基因選自凋亡基因、免疫炎性基因、補體基因及其組合。29.權利要求28中的方法，其中所述凋亡基因選自caspase-3、caspase-8、fas及其組合。30.權利要求28中的方法，其中所述免疫炎性基因選自TNF-a、RelB及其組合。31.權利要求28中的方法，其中所述補體基因選自C3、C5aR及其組合。32.權利要求28到31任一項的方法，其中所用的siRNA基因是Caspase3、Caspase8、Fas、C3、C5aR、TNF-a和RelB。33.權利要求28到32任一項的方法，其中所述組合物包含特異性針對caspase3、caspase8禾卩Fas的siRNA。34.權利要求28到32任一項的方法，其中所述組合物包含特異性針對TNFa禾卩RelB的siRNA。35.權利要求28到32任一項的方法，其中所述組合物包含特異性針對C3和C5aR的siRNA。36.權利要求15到35任一項的方法，其中所述siRNA的提供量為每種所述siRNA多達大約100ng/ml。37.權利要求15到36任一項的方法，其中所述方法在高達大約37'C的溫度下進行。38.權利要求15到37任一項的方法，其中所述組合物還包含可商購的器官儲存溶液。39.權利要求15到38任一項的方法，其中所述組合物還包含添加劑，所述添加劑選自自由基清除劑、21-氨基類固醇、抗凋亡劑、鈣通道阻滯劑、分子間粘附分子-1抑制劑、己酮可可鹼及其組合。40.使用權利要求1中的組合物製備的離體改變的細胞、組織或器官，其中所述改變的細胞、組織或器官包含被靶向以沉默一種或多種凋亡基因、免疫炎性基因和補體基因的表達的siRNA的組合。41.權利要求40中的細胞、組織和/或器官，其中所述凋亡基因選自caspase-3、caspase-8、fas及其組合。42.權利要求40中的細胞、組織和/或器官，其中所述免疫炎性基因選自TNF-ot、RelB及其組合。43.權利要求40中的細胞、組織和/或器官，其中所述補體基因選自C3、C5aR及其組合。44.權利要求40中的細胞、組織和/或器官，其中所述siRNA基因是Caspase3、Caspase8、Fas、C3、C5aR、TNF-a禾BRelB。45.權利要求40到44任一項的細胞、組織和/或器官，其中所述基因包含特異性針對caspase3、caspase8和Fas的siRNA。46.權利要求40到44任一項的細胞、組織和/或器官，其中所述基因包含特異性針對TNFa禾nRelB的siRNA。47.權利要求40到44任一項的細胞、組織和/或器官，其中所述基因包含特異性針對C3和C5aR的siRNA。48.權利要求15、16或26中的方法，其中所述器官選自心臟、肺臟、腎臟、肝臟和胰臟。49.權利要求48中的方法，其中所述器官是腎臟。50.權利要求1中的組合物，其中所述細胞、組織和/或器官選自心臟、肺臟、腎臟、肝臟和胰臟。全文摘要本發明涉及使用包含siRNAs的儲存/再灌注溶液對器官、組織和細胞進行調節，所述siRNAs特異性針對其表達與存活力喪失或細胞損傷有關的基因。在儲存/再灌注溶液中存在siRNAs最小化和/或防止了器官、組織和細胞的損傷，從而使得器官、組織和細胞可以用於體內移植。本發明也一般性涉及了使用儲存/再灌注溶液將器官、組織和細胞維持在存活狀態的方法。文檔編號A61P37/02GK101341246SQ200680043316公開日2009年1月7日申請日期2006年9月20日優先權日2005年9月20日發明者閔衛平申請人:倫敦健康科學中心研究公司