一種聚多巴胺修飾的maldi靶板的合成方法及其應用的製作方法

2023-06-14 10:06:21 2

一種聚多巴胺修飾的maldi靶板的合成方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於先進納米富集材料與納米【技術領域】，涉及一種表面由聚多巴胺修飾的MALDI靶板的合成和應用。本方法首先將MALDI靶板浸泡在含多巴胺的Tris緩衝溶液中反應24小時，水洗後將多巴胺修飾好的靶板浸泡在硫酸鈦溶液中2小時固定鈦離子。經過修飾的靶板具有極好的親水性及生物相容性，固定其上的鈦離子對磷酸化肽段有富集效果。該方法合成簡單，反應條件溫和，免洗脫，可在高通量MALDI-TOFMS下富集複雜樣品中的磷酸化肽段。
【專利說明】—種聚多巴胺修飾的MALDI靶板的合成方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於先進納米材料與納米【技術領域】,具體涉及一種用於富集磷酸化肽段的聚多巴胺修飾的MALDI靶板的合成方法及其應用。
【背景技術】
[0002]蛋白質磷酸化是最重要也是最普遍的一種蛋白質翻譯後修飾之--,幾乎參與了細胞生命的所有階段，比如細胞生長、分裂、遷移和分化。因此,為了研究這些生物過程,發展出對磷酸化肽段進行系統的鑑定和表徵的方法技術是至關重要的。而質譜(MS)分析技術由於其具有快速和高通量的特點，已成為檢測和表徵磷酸化肽段的重要手段，比如基質輔助雷射電離飛行時間質譜(MMDL-T0F-MS)分析。然而,複雜生物樣品中含有的大量非磷酸化肽會阻礙磷酸化肽的檢測，因此，在MALD1-T0F-MS分析之前對生物樣品中的磷酸化肽段進行選擇性富集是十分必要的。
[0003]很多傳統的脫靶方法，比如固相金屬離子親和色譜( MAC),金屬氧化物親和色譜(MOAC)以及功能化納米材料等,都已經被應用於MALD1-T0F-MS分析前的磷酸化肽選擇性富集。然而，這些方法都存在不可避免的樣品損失，材料的浪費以及樣品可能的汙染等問題。為了避免這些問題，近年來，對MALD1-T0F-MS分析之前的靶上富集技術的研究獲得了大量的關注,包括利用靶上MOAC技術對磷酸化肽的選擇性富集。如盧晉等人合成了空心氧化鋁微球用於靶上選擇性富集磷酸化肽等。然而，由於納米粒子和雷射的相互作用，基於靶上MOAC技術的選擇性 富集會導致質譜離子源的汙染使之受損。因此，發展新的靶上富集技術用於磷酸化肽的選擇性富集是至關重要的。
[0004]大量研究已經證明，多巴胺(DOPA)可以在溫和的條件下在各種物質表面自聚。並且，金屬離子，比如Ti4+等,通過與多巴胺的鄰苯二酚基團結合,可以在溫和的條件下被直接固定在聚多巴胺表面。本發明即是基於此發展了一種創新的靶上IMAC技術，即固定鈦離子的聚多巴胺層修飾的MALDI靶板，應用於磷酸化肽的高選擇性富集並用於直接MALD1-TOF質譜分析。
[0005]本發明中所涉及的固定鈦離子的聚多巴胺修飾的MALDI靶板,富集磷酸化肽時不會造成樣品損失，避免了洗脫的步驟，並且具有很高的選擇性和靈敏度。
[0006]

【發明內容】

[0007]本發明目的在於提供一種表面由聚多巴胺修飾的MALDI靶板的合成方法及其在高通量MALD1-TOF MS下富集複雜樣品中的磷酸化肽段的應用。
[0008]本發明提出的表面由聚多巴胺修飾的MALDI靶板的合成方法，包括以下步驟:
(1)將MALDI靶板浸泡在含有多巴胺的Tris緩衝溶液中，使其靜止其中6_20小時；
(2)將步驟(1)所獲得的靶板用去離子水衝洗幾遍；一般為3-5遍；
(3)將步驟(2)所得的靶板浸泡在含有硫酸鈦的水溶液中2-5小時；(4)將步驟(3)所得的靶板用水衝洗幾次；一般為3-5次；
(5 )最終將修飾好的靶板在真空千燥器中千燥。
[0009]本發明中，多巴胺與硫酸鈦的質量比為I:12.本發明提出的表面由聚多巴胺修飾的MALDI靶板在富集磷酸化鈦中的應用，包括以下步驟:
(1)將修飾好的MALDI靶板用含有乙腈及TFA的緩衝溶液衝洗幾次；一般為3_5次；
(2)將步驟(1)所得的靶板置於室溫下乾燥；
(3)將酶解好的βcasein酶解液用含有乙腈及TFA的緩衝溶液稀釋後點於步驟(2)所得的靶板上；
(4)將步驟(3)所得靶板置於溼盒中進行富集，時間半小時；
(5)將步驟(4)所得靶板用含有乙腈及TFA的緩衝溶液衝洗多次,將非特異性吸附的非磷酸化肽洗脫；
(6)將步驟(5)所得靶板室溫乾燥,點DHB基質,用MALDI分析。
[0010]本發明的有益效果在於:所提供的表面由聚多巴胺修飾的MALDI靶板的合成方法簡單,處理後的材料具有良好的生物相容性和親水性,在富集後的步驟中，避免了洗脫的繁瑣,可以直接對富集到的 肽段在高通量MALD1-TOF MS下進行高靈敏度、高選擇性的分析。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為經過聚多巴胺修飾的MALDI靶板表面的掃描電子顯微鏡照片；
圖2為用修飾聚多巴胺的MALD1:靶板富集β -casein和BSA的混合酶解液(摩爾比1:500)前的質譜信號峰圖；
圖3為用修飾聚多巴胺的MALDI靶板富集β -casein和BSA的混合酶解液(摩爾比I: 500)後的質譜信號峰圖(磷酸化肽段的信號峰用標註)；
圖4為用聚多巴胺修飾的MALDI靶板富集血清樣品中的磷酸化肽段前的質譜信號峰
圖；
圖5為用聚多巴胺修飾的MALDI靶板富集血清樣品中的磷酸化肽段後的質譜信號峰圖(磷酸化肽段的信號峰用標註)。
【具體實施方式】
[0012]下面的實施例是對本發明的進一步說明，而不是限制本發明的範圍。
[0013]實施例1.聚多巴胺修飾的MALD1:靶板的合成
(I)將400mg多巴胺鹽酸鹽分散於200mLTris緩衝液(IOmM, ρΗ=8.5)中。
[0014](2)將MALDI勒!板分別用蒸懼水和乙醇洗漆數次,室溫千燥。
[0015](3)將洗淨的MALDI靶板浸沒在(I)中的多巴胺溶液中室溫反應24小時。
[0016](4)將(3)中獲得的聚多巴胺修飾的靶板用蒸餾水衝洗3次，並浸沒在Ti (SO4)2(100 mM)水溶液中室溫反應2小時。
[0017](5)用(4)中獲得的靶板用蒸餾水衝洗3次,室溫千燥。
[0018]圖1為經過聚多巴胺修飾的MALDI靶板表面的掃描電子顯微鏡照片。多巴胺在聚合反應初期呈現出小球狀，而在聚合反應後期,趨向於形成聚多巴胺膜。膜的厚度與多巴胺溶液的濃度以及反應時間有關。
[0019]實施例2:聚多巴胺修飾的MALDI靶板選擇性富集磷酸化肽，並進行高通量M:ALDI?TF MS 分析
(I)試樣的準備:將BSA或β-casein蛋白溶解於NH4HCO3緩衝液(25mM, pH 8.3)中，並用trypsin (2%，w/w)在37°(:下酶解16小時。酶解後的產物O°C以下保存。血清樣品離心後，取上清液(TC以下保存。
[0020](2)點靶:將修飾過的靶板用50%乙腈和0.1%TFA水溶液(v/v)衝洗三次，分別將β -casein酶解液，β -casein與BSA酶解液的混合液及處理過的血清用50%乙腈和
0.1%TFA水溶液(v/v)稀釋至不同濃度；吸取I μ L稀釋後的酶解液點於修飾後的MALDI靶板上，室溫下置於溼盒中富集30分鐘；用50%乙腈和0.1%TFA水溶液(v/v)衝洗上樣的靶板點以除去非特異性吸附的非磷酸化肽段；取I μ L的基質DHB (20mg/inL, 50%乙腈及1%H3PO4)點於上樣層上並在室溫下置於空氣中自然風乾。
[0021](3)質譜分析:通過富集前後的對比圖可以看到,富集前，由於各樣品中的磷酸化肽受到非磷酸化肽的抑制,使得磷酸化肽無法被成功檢測到。經過聚多巴胺修飾的MALDI靶板富集後,磷酸化肽可以成功地被質譜檢測到，且非磷酸化肽的峰幾乎看不到,磷酸化肽的峰佔據主導地位。該結果成功地說明了聚多巴胺修飾的靶板可以應用與複雜生物樣品的磷酸化肽的富集中。
[0022]圖2』圖3分別為用修飾聚多巴胺的MALDI靶板富集β -casein和BSA的混合酶解液(摩爾比1:500)前後的質譜信號峰圖(磷酸化肽段的信號峰用標註)。通過圖中的對比可以看到，富集前，由於混合酶解液中的磷酸化肽受到非磷酸化肽的抑制,使得磷酸化肽無法被成功檢測到。經過聚多巴胺修飾的MALDI靶板富集後，6條磷酸化肽可以成功地被質譜檢測到，並以高信噪比佔據主導地位。
[0023]圖4,圖5分別為用聚多巴胺修飾的MALD1:靶板富集血清樣品中的磷酸化肽段前的質譜信號峰圖(磷酸化肽段的信號峰用標註)。通過圖中的對比可以看到，富集前，由於血清樣品中的磷酸化肽受到非磷酸化肽以及無機鹽的抑制，使得磷酸化肽無法被成功檢測到。經過聚多巴胺修飾的MALDI靶板富集後,4條磷酸化肽可以被成功地檢測到，並以高信噪比佔據主導地位。
【權利要求】
1.表面由聚多巴胺修飾的MALDI靶板的合成方法,其特徵在於包括以下步驟: (1)將MALDI靶板浸泡在含有多巴胺的Tris緩衝溶液中，使其靜止其中6_20小時； (2)將步驟(I)所獲得的靶板用去離子水衝洗幾遍； (3)將步驟(2)所得的靶板浸泡在含有硫酸鈦的水溶液中2-5小時； (4)將步驟(3)所得的靶板用水衝洗幾次； (5)最終將修飾好的靶板在真空乾燥器中乾燥。
2.根據權利要求1所述的表面由聚多巴胺修飾的MALDI靶板的合成方法，其特徵在於多巴胺與硫酸鈦的質量比為1:12。
3.一種如權利要求1所述的表面由聚多巴胺修飾的MALD1:靶板在富集磷酸化肽中的應用,其特徵在於包括以下步驟: (1)將修飾好的MALDI靶板用含有乙腈及TFA的緩衝溶液衝洗幾次； (2)將步驟(I)所得的靶板置於室溫下乾燥； (3)將酶解好的βcasein酶解液用含有乙腈及TFA的緩衝溶液稀釋後點於步驟(2)所得的靶板上； (4)將步驟(3)所得靶板置於溼盒中進行富集，時間半小時； (5)將步驟(4)所得靶板用含有乙腈及TFA的緩衝溶液衝洗多次,將非特異性吸附的非磷酸化肽洗脫； (6)將步驟(5)所得靶板室溫乾燥,點DHB基質,用MALDI分析。
【文檔編號】G01N27/64GK103969325SQ201410220479
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月23日 優先權日:2014年5月23日
【發明者】史辰漪, 鄧春輝 申請人:復旦大學