脂蛋白a的酶聯免疫試劑盒及其製備方法與流程
2023-06-14 10:22:16
本發明屬於醫療檢測領域，具體涉及一種用於檢測磷酸化脂蛋白(a)的酶聯免疫試劑盒及其製備方法。
背景技術：
：動脈粥樣硬化(atherosclerosisas)是指有動脈壁增厚、變硬及彈性降低,並以動脈內膜形成粥樣斑塊為特徵的病變。目前對於其發病原因尚未完全確定,可能與年齡、性別、血脂異常、高血壓、吸菸、糖尿病、肥胖、感染等因素有關。高膽固醇濃度,脂蛋白a是as的一個主要的危險因子。脂蛋白(a)是人血漿中的一類特別的脂蛋白顆粒，最早由kareberg於1963年發現，主要由低密度脂蛋白顆粒和富含糖鏈的高度親水的apo(a)組成；其中每個apo(a)分子通過一個二硫鍵和一分子的apob-100共價交聯。apo(a)由三個完全不同的結構組成：未激活的蛋白酶區域、一個拷貝的k5環餅和多拷貝的k4環餅區。研究表明，人血漿中lp(a)濃度的升高與心血管功能的紊亂及腦血管疾病相關，血漿中lp(a)濃度的升高通常預示著早期的冠狀動脈和梗阻風險的增加，同時由於lp(a)基本濃度具有高度的遺傳性，因此，lp(a)是早期冠心病(chd)的重要預示因子，對其進行檢測對於心血管疾病的預測具有重要意義。目前，已知的檢測脂蛋白(a)濃度的方法有免疫比濁法、放射免疫法、螢光免疫測定法等檢測方法，但上述測定方法的操作比較複雜，檢測用時長或者靈敏度較低等缺點，不適合做常規檢測。技術實現要素：本發明的第一方面是提供一種脂蛋白a的酶聯免疫檢測試劑盒，其由以下成分組成：(1)包被有抗脂蛋白a抗體的酶標板；(2)脂蛋白a系列標準品；(3)酶標記抗體溶液；(4)稀釋液；(5)洗滌液；(6)底物液；(7)顯色液；(8)終止液。所述脂蛋白a系列標準品的脂蛋白a含量為：0、10、50、100、200、400和600mg/l的50mmol/lpbs緩衝液，並且每升標準品溶液中含有5gbsa和10g蔗糖。所述酶標記抗體溶液為含5mg/l的hrp標記的抗脂蛋白a抗體、0.5mg/l的甘油單蓖麻油酸酯和0.5mg/l的bsa的50mmol/lpbs緩衝液，ph值為8.0。所述稀釋液為50mmol/l的pbs(ph7.4)緩衝液；所述洗滌液為50mmol/l的pbs(ph7.4)配製的0.05％吐溫20溶液。所述底物液為磷酸-檸檬酸緩衝液(ph7.4)配製的5％過氧化氫溶液，並且溶液中0.1mg/l的焦磷酸二氫鈉；所述顯色液為四甲基聯苯胺(tmb)的甲醇溶液，濃度為0.5mg/ml；所述終止液為3mol/l硫酸。本發明的第二方面是提供所述試劑盒的製備方法，具體步驟如下：(1)包被有抗脂蛋白a抗體的酶標板的製備：a、抗體稀釋:用ph為8.0的50mm的tris-hcl緩衝溶液將抗脂蛋白a單克隆抗體稀釋到10μg/ml，得包被液；b、包被:取微孔板，用洗滌液洗滌3次，加入上述含抗脂蛋白a單克隆抗體的包被液，每孔100μl/孔，4℃孵育12小時；c、封閉:傾去包被液，置於吸水紙上輕拍幾次，去除殘液，加入含重量百分比為0.1％的甘油單蓖麻油酸酯、0.5％的bsa和1％蔗糖的濃度為50mmol/l的tris-hcl封閉液，其ph為8.0，300μl/孔，室溫，1小時；d、真空乾燥，密封，即得包被有抗脂蛋白a抗體的酶標板。(2)酶標記抗體溶液製備：a、將10mghrp溶於1ml蒸餾水中並加入新鮮配製的0.06mol/lnaio41ml,混勻於4℃放置30分鐘；b、加入0.16mol/l乙二醇水溶液1ml，室溫放置30分鐘；c、加入含5mg抗脂蛋白a抗體的水溶液2ml,然後於4℃下，對0.05mol/l碳酸緩衝液(ph9.6)透析過夜；d、吸出透析袋內溶液，加入0.5mlnabh4,4℃下放置2小時；e、滴加等體積飽和(nh4)2so4溶液，4℃下放置30分鐘；f、上述溶液2500rpm離心10分鐘，去除上清液，沉澱用少許0.2mol/lph7.4的pbs溶解，並於4℃下對此緩衝液透析過夜；g、吸出透析袋內溶液，離心除去不溶物，上清液過葡聚糖層析柱，用0.2mol/lph7.4的pbs洗脫，收集洗脫液，即為純化的酶標記抗體；h、將收集的酶標記抗體除菌過濾，配製成酶標記抗體溶液，具體為含5mg/l的hrp標記的抗脂蛋白a抗體、0.5mg/l的甘油單蓖麻油酸酯和0.5mg/l的bsa的50mmol/lpbs緩衝液，ph值為8.0。(3)標準品、稀釋液、洗滌液、底物液、顯色液和終止液，按照本領域常規的溶液配製方法製備。具體實施方式下面將進一步的來舉例說明本發明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發明要求保護的技術方案的舉例說明，並非對這些技術方案的任何限制。本發明的保護範圍以所附權利要求書記載的內容為準。實施例1(1)包被有抗脂蛋白a抗體的酶標板的製備：a、抗體稀釋:用ph為8.0的50mm的tris-hcl緩衝溶液將抗脂蛋白a單克隆抗體稀釋到10μg/ml，得包被液；b、包被:取微孔板，用洗滌液洗滌3次，加入上述含抗脂蛋白a單克隆抗體的包被液，每孔100μl/孔，4℃孵育12小時；c、封閉:傾去包被液，置於吸水紙上輕拍幾次，去除殘液，加入含重量百分比為0.1％的甘油單蓖麻油酸酯、0.5％的bsa和1％蔗糖的濃度為50mmol/l的tris-hcl封閉液，其ph為8.0，300μl/孔，室溫，1小時；d、真空乾燥，密封，即得包被有抗脂蛋白a抗體的酶標板。(2)酶標記抗體溶液製備：a、將10mghrp溶於1ml蒸餾水中並加入新鮮配製的0.06mol/lnaio41ml,混勻於4℃放置30分鐘；b、加入0.16mol/l乙二醇水溶液1ml，室溫放置30分鐘；c、加入含5mg抗脂蛋白a抗體的水溶液2ml,然後於4℃下，對0.05mol/l碳酸緩衝液(ph9.6)透析過夜；d、吸出透析袋內溶液，加入0.5mlnabh4,4℃下放置2小時；e、滴加等體積飽和(nh4)2so4溶液，4℃下放置30分鐘；f、上述溶液2500rpm離心10分鐘，去除上清液，沉澱用少許0.2mol/lph7.4的pbs溶解，並於4℃下對此緩衝液透析過夜；g、吸出透析袋內溶液，離心除去不溶物，上清液過葡聚糖層析柱，用0.2mol/lph7.4的pbs洗脫，收集洗脫液，即為純化的酶標記抗體；h、將收集的酶標記抗體除菌過濾，配製成酶標記抗體溶液，具體為含5mg/l的hrp標記的抗脂蛋白a抗體、0.5mg/l的甘油單蓖麻油酸酯和0.5mg/l的bsa的50mmol/lpbs緩衝液，ph值為8.0。(3)標準品、稀釋液、洗滌液、底物液、顯色液和終止液，按照本領域常規的溶液配製方法製備。所述步驟1和2所採用的抗脂蛋白a抗體為配對的單克隆抗體，所述抗體購自上海康朗生物科技公司。所述脂蛋白a系列標準品的脂蛋白a含量為：0、10、50、100、200、400和600mg/l的50mmol/lpbs緩衝液，並且每升標準品溶液中含有5gbsa和10g蔗糖。所述酶標記抗體溶液為含5mg/l的hrp標記的抗脂蛋白a抗體、0.5mg/l的甘油單蓖麻油酸酯和0.5mg/l的bsa的50mmol/lpbs緩衝液，ph值為8.0。所述稀釋液為50mmol/l的pbs(ph7.4)緩衝液；所述洗滌液為50mmol/l的pbs(ph7.4)配製的0.05％吐溫20溶液。所述底物液為磷酸-檸檬酸緩衝液(ph7.4)配製的5％過氧化氫溶液，並且溶液中0.1mg/l的焦磷酸二氫鈉；所述顯色液為四甲基聯苯胺(tmb)的甲醇溶液，濃度為0.5mg/ml；所述終止液為3mol/l硫酸。實施例2試劑盒靈敏度測定分別配製脂蛋白a標準品不同濃度的pbs緩衝液，濃度分別為0.1、0.2、0.5、1和2mg/l，採用實施例1製備的試劑盒進行檢測，以對照緩衝液作為空白對照，具體檢測方法如下：a)抗原-抗體反應：在包被酶標板的微孔中分別加入50μl標準品溶液和稀釋液，37℃水浴保溫50分鐘。清洗緩衝液洗板操作5次。b)將hrp標記的抗脂蛋白a抗體溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保溫50分鐘。重複洗板操作5次。c)顯色反應：每孔依次加入底物溶液，顯色液各50μl，37℃水浴保溫20分鐘，每孔再加入50μl反應終止液結束反應。d)比色：用酶標儀在450nm測定od值並記錄。e)製作標準曲線：以標準品濃度為橫坐標，標準品測定的od值為縱坐標，作出標準曲線；計算標準曲線回歸係數r2，當r2＞0.99時本次測定有效；計算脂蛋白a標準品與空白對照的比值，當比值大於2時，說明試劑盒可以測定該濃度的脂蛋白a標準品，最低濃度即為試劑盒的靈敏度，平行試驗五次取平均值，具體結果如下：標準品吸光度(od)空白對照吸光度(od)0.1mg/l0.0450.0170.5mg/l0.2290.012結果表明本發明實施例1製備的試劑盒其靈敏度可以達到0.1mg/l。實施例3試劑盒穩定性考察將實施例1製備的試劑盒在20℃分別放置6個月和12個月後，按照實施例2的方法測定試劑盒的靈敏度以及標準品各濃度的吸光度，並對數據進行回歸分析，計算r2值。本實施例中對比例設定如下：對比例1：試劑盒的製備方法同實施例1，區別僅在於酶標記抗體溶液為含5mg/l的hrp標記的抗脂蛋白a抗體和1mg/l的bsa的50mmol/lpbs緩衝液，ph值為8.0。對比例2：試劑盒的製備方法同實施例1，區別僅在於酶標記抗體溶液為含5mg/l的hrp標記的抗脂蛋白a抗體、0.5mg/l的吐溫20和0.5mg/l的bsa的50mmol/lpbs緩衝液，ph值為8.0。對比例3：試劑盒的製備方法同實施例1，區別僅在於酶標板製備過程中，步驟c的封閉液組成為含1％的bsa和1％蔗糖的濃度為50mmol/l的tris-hcl。對比例4：試劑盒的製備方法同實施例1，區別僅在於酶標板製備過程中，步驟c的封閉液組成為含0.1％的甘油單蓖麻油酸酯和2％蔗糖的濃度為50mmol/l的tris-hcl。具體結果如下：另外，在4℃下保存36個月後，試劑盒靈敏度及線性良好，與剛製備的試劑盒無明顯差別。實施例4應用本發明實施例1製備的酶聯免疫定量檢測試劑盒的質量檢測精密度：隨機抽取50盒不同批次試劑盒，用同一份動脈粥樣硬化患者血清按說明書操作步驟進行重複測定。計算每次測定結果，求出均值、sd和變異係數cv。精密度試驗結果顯示批間cv小於2％；結果如下：平均值sd批間cv正常血清217.4mg/l1.30.59％高脂血清489.2mg/l5.21.06％本
發明內容僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技術方案中所記載的技術特徵可以與任意的一個或多個技術方案相組合，這些經組合而得到的技術方案也在本申請保護範圍內，就像這些經組合而得到的技術方案已經在本發明公開內容中具體記載一樣。當前第1頁12