悉生動物肥胖模型的構建方法及其應用的製作方法
2023-06-14 05:30:46 2
專利名稱：悉生動物肥胖模型的構建方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術，特別涉及一種悉生動物肥胖模型的構建方法，及其在篩選參與肥胖發生的微生物、篩選預防和治療肥胖的微生物以及食品、配方、藥物、營養品、保健品、飲料中的應用。
背景技術：
人的身體內生活著大量共生微生物，其地位與作用相當於後天獲得的一個重要「器官」，對人類健康發揮不可替代的作用，作為一個完整的人體，真核細胞僅佔細胞總數的10%，而90%是原核細胞，因此諾貝爾獎獲得者萊德伯格提出人體是由真核細胞與體內共生的原核細胞共同組成的「超級生物體」，共生的微生物種類超過1000種以上，總重量達到1-2公斤，細胞總數約IO14個，是人體自身細胞的10倍，其編碼的基因數量至少是人體自身 基因的100倍。眾所周知，肥胖已經成為現代社會日益嚴重的公共健康問題，然而，到目前為止，腸道菌群參與肥胖、胰島素抵抗等代謝性疾病發生發展的機理還不是很清楚，具體地說就是腸道菌群是代謝性疾病發生的原因還是結果，什麼樣的細菌能夠導致代謝性疾病的發生，什麼樣的細菌能夠改善肥胖、胰島素抵抗等症狀還不是很清楚。
發明內容
本發明的目的之一是，提供新型的悉生動物肥胖模型的建立方法。該方法採用在高脂飲食條件下接種內毒素(LPS)產生菌的方法構建了悉生動物肥胖模型。無菌動物飼餵高脂飲食的同時，接種一種微生物如內毒素產生菌，或其組合物後，該微生物能夠在無菌動物腸道內定植，同時動物表現出肥胖、胰島素抵抗、或慢性炎症等代謝、免疫等系統紊亂的症狀。本發明還提供篩選參與肥胖發生的微生物及其組合物的新方法，為肥胖的治療提供藥物靶點的方法，並可用於進行對肥胖等代謝性疾病有預防和治療作用的微生物、食品、配方、藥物、營養品、保健品、飲料等的篩選和效果評價。為了達到上述目的，本發明採用了以下技術方案一種悉生動物肥胖模型的構建方法，在對無菌動物飼餵脂肪含量不低於5%的高脂飲食的同時，接種一種微生物或其組合物，該微生物或其組合物能夠在無菌動物腸道內定植提供動物模型，動物模型表現出至少一種代謝或免疫系統紊亂的症狀。上述悉生動物肥胖模型的構建方法，其中，所述的代謝或免疫系統紊亂的症狀包括肥胖、胰島素抵抗或慢性炎症。上述悉生動物肥胖模型的構建方法，其中，所述的無菌動物包括小鼠、大鼠、倉鼠、豬、兔子或猴子。上述悉生動物肥胖模型的構建方法，其中，所述的高脂飲食的脂肪含量不低於10%。上述悉生動物肥胖模型的構建方法，其中，所述的微生物包括內毒素產生菌、陰溝腸桿菌B29菌株、陰溝腸桿菌、腸桿菌屬、腸桿菌科、伽馬變形菌綱、變形菌門或革蘭氏陰性菌。上述悉生動 物肥胖模型的構建方法，其中，所述的微生物的16S rRNA基因序列與SEQ ID NO. I的序列的相似性至少為30%、50%、75%或95%。上述悉生動物肥胖模型的構建方法，其中，所述的微生物可為能夠產生內毒素的微生物，產生的內毒素可具有內毒素活性。所使用的微生物可具有內毒素合成基因，內毒素合成基因序列與B29的內毒素合成基因序列相似性至少為30%，50%，75%，或95%。 上述悉生動物肥胖模型的構建方法，其中，接種方法包括灌胃、飼料中添加、飲用水中添加或毛皮塗抹。接種後囷株能夠在動物腸道內定植或者該囷或囷的組合能夠在動物糞便中持續檢出。動物可以出現體重增加、脂肪增加、血脂增加、胰島素抵抗、血清脂多糖結合蛋白、瘦素抵抗、血清炎症水平增加或組織炎性因子表達量增加等。一種參與肥胖發生的微生物或其組合物的篩選方法，是指採用在無菌動物飼餵高脂飲食的同時，接種後能夠在無菌動物腸道內定植，同時動物表現出至少一種代謝或免疫系統紊亂的症狀的微生物作為對照微生物，比較受試微生物或其組合物，如果受試微生物或其組合物與對照微生物具有相似的作用，即表明受試微生物或其組合物可能參與了肥胖發生。上述參與肥胖發生的微生物或其組合物的篩選方法，其中，代謝或免疫系統紊亂的症狀包括肥胖、胰島素抵抗或慢性炎症。一種對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療作用的微生物或其組合物的篩選方法，是採用表現出至少一種代謝或免疫系統紊亂的症狀的動物模型，給予一種受試微生物或其組合物後，如果動物的至少一種代謝或免疫系統紊亂的症狀出現好轉，即表明該微生物或其組合物具有對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療的作用。上述對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療作用的微生物或其組合物的篩選方法，其中，所述代謝或免疫系統紊亂的症狀包括肥胖、胰島素抵抗或慢性炎症。上述對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療作用的微生物或其組合物的篩選方法，其中，所述的至少一種代謝或免疫系統紊亂的症狀出現好轉包括肥胖、胰島素抵抗或慢性炎症症狀減輕。上述對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療作用的微生物或其組合物的篩選方法，其中，所述受試微生物包括乳酸菌、雙歧桿菌、丁酸鹽產生菌、革蘭氏陽性球菌或益生菌。上述對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療作用的微生物或其組合物的篩選方法，其中，所述悉生動物肥胖模型出現包括體重下降、脂肪減少、血脂下降、胰島素抵抗好轉、血清脂多糖結合蛋白水平下降、瘦素抵抗症狀減輕、血清炎症水平下降或組織炎性因子表達量下降，即表明該受試微生物對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療的作用。一種對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療作用的服用品的篩選方法，是採用表現出至少一種代謝或免疫系統紊亂的症狀的動物模型，給予一種服用品後，如果動物的至少一種代謝或免疫系統紊亂的症狀出現好轉，即表明該服用品具有對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療的作用。上述對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療作用的服用品的篩選方法，其中，所述的至少一種代謝或免疫系統紊亂的症狀出現好轉包括肥胖、胰島素抵抗或慢性炎症症狀減輕。上述對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療作用的服用品的篩選方法，其中，給予一種受試服用品後，悉生動物肥胖模型出現包括體重下降、脂肪減少、血脂下降、胰島素抵抗好轉、血清脂多糖結合蛋白水平下降、瘦素抵抗症狀減輕、血清炎症水平下降或組織炎性因子表達量下降，即表明該受試服用品對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療的作用。上述對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療作用的服用品的篩選方法，其中，所述的服用品包括食品、配方、藥物、營養品、保健品或飲料。
圖I為B29菌株在高脂飲食無菌小鼠腸道中的定植情況。圖2為B29菌株對高脂飲食無菌小鼠肥胖以及胰島素抵抗表型的影響。圖3為B29菌株對高脂飲食無菌小鼠炎症水平的影響。
具體實施例方式本發明以雄性C57BL/6J小鼠(無菌級)為實施對象例子，採用陰溝腸桿菌菌株B29作為例子進行說明。所述陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B29菌株是指從一個重度肥胖症患者糞便中分離的一種優勢細菌，16S rRNA基因序列分析和生化檢測鑑定其為一種陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)。24隻健康雄性C57BL/6J小鼠(無菌級)，給予正常飼料(NCD，脂肪含量4.62%，每克熱量3.451 ^1))或者高脂飼料(HFD，脂肪含量34. 9%,每克熱量5. 21kcal,購買於美國New Brunswick實驗研究飼料公司(D12492,Research Diets, Inc. , New Brunswick, NJ))。小鼠處理方法動物飼養的光周期為12小時黑暗/光照循環(光照從上午6:30開始)，溫度為22±3°C。6-10周齡的無菌小鼠隨機分為4組(每組6隻)，處理如下(I)NCD+LB組該組小鼠灌胃一次無菌LB培養基O. 1ml，飼餵正常飲食；(2)NCD+B29組該組小鼠灌胃一次B29菌株懸液O. Iml (細胞數為102)，飼餵正常飲食；(3)HFD+LB組該組小鼠灌胃一次無菌LB培養基O. 1ml，飼餵高脂飲食；(4)HFD+B29組該組小鼠灌胃一次B29菌株懸液O. Iml (細胞數為102)，飼餵高脂飲食。實驗進行16周。動物每籠3_4隻飼養，每周測量一次體重。每組動物直到處死前一直飼養在各自的隔離包內，提供無菌飼料以及無菌水，並定期檢測無菌隔離包是否有雜菌汙染。實驗過程中，對小鼠體重、脂肪墊重量、胰島素敏感性以及炎性水平等進行監測。實施例一陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B29菌株的分離及鑑定對肥胖人群的腸道菌群分析發現大部分重度肥胖患者的腸道菌群結構都嚴重失衡，比如，一位極端肥胖志願者(26歲，男性，漢族，體重174. 9kg，BMI 58. 78kg/m2)的腸道菌群結構中腸肝菌屬的比例高達35% (16S rRNA基因克隆文庫分析)，同時，體檢數據也表明該志願者患有嚴重的代謝症候群。該志願者經歷了為期23周的營養幹預(組成全糧、藥食同源食品和益生元)，9周後該志願者的體重下降了 30. 1kg，23周後下降了 51. 4kg，代謝綜合症的各項症狀也得到好轉。腸道菌群分析顯示，該志願者的腸道菌群中腸桿菌屬的比例在飲食幹預9周後下降為I. 8 %，而23周後已經無法檢測到該菌屬。根據「序列引導分離」的方法，使用LB培養基(Luria-Bertani，配方見下)培養基在37°C下.從該志願者糞便樣品中的腸桿菌屬菌株進行了分離，得到分離菌株中豐度最高的一種類型，命名為B29菌株。對B29菌株進行16S rRNA基因全長測序分析,經比對發現其與陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)具有 99%的相似性(GenBank accession no. AB244457),通過 VITEK 2 革蘭氏陰性菌鑑定卡(GN card, bioMerieux, Marcy IrEtoIlef France)對該菌株進行的生化鑑定結果也表明其有98%的可能性屬於陰溝腸桿菌(參見表I)。使用LPS 提取試劑盒(iNtRON Biotechnology Co. , Seoul, Korea)對菌株 B29 的LPS進行提取，並用內毒素檢測試劑盒LAL(ACC，USA)對其進行內毒素活性水平進行檢測，結果表明菌株B29的內毒素活性水平為4. 45 X IO6EU mg^LPS,同大腸桿菌055: B5的內毒素活性水平相當。為了能對陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B29菌株進行特異性檢測,用利福平抗性菌株篩選法篩選出一株能夠抵抗500 μ g/ml利福平的B29菌株。將該B29菌株接種·入LB培養基，37°C振蕩培養12h，所得菌液即可用於構建動物模型。LB培養基(Luria-Bertani)配方如下胰蛋白腖(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L，氯化鈉(NaCl) 10g/L，pH 7.4。LB 固體培養基IL 液體培養基，力口15g瓊脂粉，在溫度降下之前倒好板。表I.米用 Vitek 2ID-GN 系統對陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae) B29 菌株進行生化鑑定
權利要求
1.一種悉生動物肥胖模型的構建方法，其特徵在於在對無菌動物飼餵脂肪含量不低於5%的高脂飲食的同時，接種一種微生物或其組合物，該微生物或其組合物能夠在無菌動物腸道內定植提供動物模型，動物模型表現出至少一種代謝或免疫系統紊亂的症狀。
2.根據權利要求I所述的悉生動物肥胖模型的構建方法，其特徵在於所述的代謝或免疫系統紊亂的症狀包括肥胖、胰島素抵抗或慢性炎症。
3.根據權利要求I所述的悉生動物肥胖模型的構建方法，其特徵在於所述的無菌動物包括小鼠、大鼠、倉鼠、豬、兔子或猴子。
4.根據權利要求I所述的悉生動物肥胖模型的構建方法，其特徵在於所述的高脂飲食的脂肪含量不低於10%。
5.根據權利要求I所述的悉生動物肥胖模型的構建方法，其特徵在於所述的微生物包括內毒素產生菌、陰溝腸桿菌B29菌株、陰溝腸桿菌、腸桿菌屬、腸桿菌科、伽馬變形菌綱、變形菌門或革蘭氏陰性菌。
6.根據權利要求I所述的悉生動物肥胖模型的構建方法，其特徵在於所述的微生物的16S rRNA基因序列與SEQ ID NO. I的序列的相似性至少為75%。
7.根據權利要求I所述的悉生動物肥胖模型的構建方法，其特徵在於所述的微生物的16S rRNA基因序列與SEQ IN NO. I的序列的相似性至少為95%。
8.根據權利要求I所述的悉生動物肥胖模型的構建方法，其特徵在於所述的微生物能夠產生內毒素。
9.根據權利要求8所述的悉生動物肥胖模型的構建方法，其特徵在於所述的內毒素具有內毒素活性。
10.根據權利要求I所述的悉生動物肥胖模型的構建方法，其特徵在於所述的動物模型表現出代謝症候群症狀。
11.根據權利要求I所述的悉生動物肥胖模型的構建方法，其特徵在於所述的動物模型表現出肥胖。
12.根據權利要求I所述的悉生動物肥胖模型的構建方法，其特徵在於接種微生物後，動物模型出現體重增加、脂肪增加、血脂增加、胰島素抵抗、血清脂多糖結合蛋白、瘦素抵抗、血清炎症水平增加或組織炎性因子表達量增加。
13.根據權利要求I所述的悉生動物肥胖模型的構建方法，其特徵在於無菌動物飼餵脂肪含量不低於5%的高脂飲食的時間至少為4周。
14.根據權利要求I所述的悉生動物肥胖模型的構建方法，其特徵在於接種方法包括灌胃、飼料中添加、飲用水中添加或毛皮塗抹。
15.根據權利要求I所述的悉生動物肥胖模型的構建方法，其特徵在於接種後微生物或其組合物能夠在動物腸道內定植或者該微生物或其組合物能夠在動物糞便中持續檢出。
16.一種參與肥胖發生的微生物或其組合物的篩選方法，其特徵在於採用在無菌動物飼餵高脂飲食的同時，接種後能夠在無菌動物腸道內定植，同時動物表現出至少一種代謝或免疫系統紊亂的症狀的微生物作為對照微生物，比較受試微生物或其組合物，如果受試微生物或其組合物與對照微生物具有相似的作用，即表明受試微生物或其組合物可能參與了肥胖發生。
17.如權利要求16所述的篩選方法，其特徵在於代謝或免疫系統紊亂的症狀包括肥胖、胰島素抵抗或慢性炎症。
18.如權利要求16所述的篩選方法，其特徵在於所述的無菌動物包括小鼠、大鼠、倉鼠、豬、兔子或猴子。
19.如權利要求16所述的篩選方法，其特徵在於高脂飲食的脂肪含量不低於5%。
20.如權利要求16所述的篩選方法，其特徵在於所述的對照微生物包括陰溝腸桿菌B29菌株、陰溝腸桿菌、腸桿菌屬、腸桿菌科、伽馬變形菌綱、變形菌門或革蘭氏陰性菌。
21.如權利要求16所述的篩選方法，其特徵在於所述的對照微生物的16SrRNA基因序列與SEQ ID NO. I的序列的相似性至少為75%。
22.如權利要求16所述的篩選方法，其特徵在於所述的對照微生物的16SrRNA基因序列與SEQ ID NO. I的序列的相似性至少為95%。
23.如權利要求16所述的篩選方法，其特徵在於所述的對照微生物能夠產生內毒素。
24.如權利要求23所述的篩選方法，其特徵在於所述的內毒素具有內毒素活性。
25.如權利要求16所述的篩選方法，其特徵在於所述的受試微生物包括陰溝腸桿菌、腸桿菌屬、腸桿菌科、伽馬變形菌綱、變形菌門或革蘭氏陰性菌。
26.如權利要求16所述的篩選方法，其特徵在於所述的受試微生物能夠產生內毒素。
27.如權利要求26所述的篩選方法，其特徵在於所述的內毒素具有內毒素活性。
28.如權利要求16所述的篩選方法，其特徵在於所述的接種方法包括灌胃、飼料中添力口、飲用水中添加或毛皮塗抹。
29.如權利要求16所述的篩選方法，其特徵在於接種後微生物或其組合物能夠在動物腸道內定植或者該微生物或其組合物能夠在動物糞便中持續檢出。
30.如權利要求16所述的篩選方法，其特徵在於接種微生物後，動物出現體重增加、脂肪增加、血脂增加、胰島素抵抗、血清脂多糖結合蛋白、瘦素抵抗、血清炎症水平增加或組織炎性因子表達量增加。
31.一種對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療作用的微生物或其組合物的篩選方法，其特徵在於採用表現出至少一種代謝或免疫系統紊亂的症狀的動物模型，給予一種受試微生物或其組合物後，如果動物的至少一種代謝或免疫系統紊亂的症狀出現好轉，即表明該微生物或其組合物具有對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療的作用。
32.如權利要求31所述的篩選方法，其特徵在於所述代謝或免疫系統紊亂的症狀包括肥胖、胰島素抵抗或慢性炎症。
33.如權利要求31所述的篩選方法，其特徵在於所述的至少一種代謝或免疫系統紊亂的症狀出現好轉包括肥胖、胰島素抵抗或慢性炎症症狀減輕。
34.如權利要求31所述的篩選方法，其特徵在於所述受試微生物包括乳酸菌、雙歧桿菌、丁酸鹽產生菌、革蘭氏陽性球菌或益生菌。
35.如權利要求31所述的篩選方法，其特徵在於接種受試微生物後，所述悉生動物肥胖模型出現包括體重下降、脂肪減少、血脂下降、胰島素抵抗好轉、血清脂多糖結合蛋白水平下降、瘦素抵抗症狀減輕、血清炎症水平下降或組織炎性因子表達量下降，即表明該受試微生物對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療的作用。
36.一種對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療作用的服用品的篩選方法，其特徵在於採用表現出至少一種代謝或免疫系統紊亂的症狀的動物模型，給予一種服用品後，如果動物的至少一種代謝或免疫系統紊亂的症狀出現好轉，即表明該服用品具有對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療的作用。
37.如權利要求36所述的篩選方法，其特徵在於所述的至少一種代謝或免疫系統紊亂的症狀出現好轉包括肥胖、胰島素抵抗或慢性炎症症狀減輕。
38.如權利要求36所述的篩選方法，其特徵在於給予一種受試服用品後，悉生動物肥胖模型出現包括體重下降、脂肪減少、血脂下降、胰島素抵抗好轉、血清脂多糖結合蛋白水平下降、瘦素抵抗症狀減輕、血清炎症水平下降或組織炎性因子表達量下降，即表明該受試服用品對代謝或免疫系統紊亂的症狀有預防和治療的作用。
39.如權利要求36或38所述的篩選方法，其特徵在於所述的服用品包括食品、配方、藥物、營養品、保健品或飲料。
全文摘要
本發明提供了一種悉生動物肥胖模型的構建方法及其應用。該方法採用在高脂飲食條件下接種內毒素(LPS)產生菌的方法構建了悉生動物肥胖模型。無菌動物飼餵高脂飲食的同時，接種一種微生物如內毒素產生菌，或其組合物後，該微生物能夠在無菌動物腸道內定植，同時動物表現出肥胖、胰島素抵抗、慢性炎症等代謝、免疫等系統紊亂的症狀。本發明還涉及篩選參與肥胖發生的微生物及其組合物，為肥胖的治療提供藥物靶點的方法；篩選對肥胖等代謝性疾病有預防和治療作用的微生物的方法，為肥胖的治療提供新的方法；本發明可以用於進行對肥胖等代謝性疾病有預防和治療作用的食品(配方)、藥物、營養品、保健品、飲料等的篩選和效果評價。
文檔編號A01K67/02GK102792919SQ20121028092
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月8日 優先權日2012年8月8日
發明者趙立平, 費娜 申請人:上海交通大學, 完美(中國)有限公司