促進周圍神經移植後神經再生的植入式可降解裝置的製作方法
2023-06-14 15:48:11 2
專利名稱：促進周圍神經移植後神經再生的植入式可降解裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及到提供一種促進周圍神經移植後神經再生的植入式裝置，尤其是ー種可降解的促進周圍神經移植後神經再生的裝置。
背景技術：
周圍神經缺損修復與功能重建，是百餘年來世界臨床醫學研究一大難題。隨著社會經濟的快速發展，機械化的程度増加，交通日益發達，人口流動倍增的情況下，周圍神經的損傷就急速地上升。周圍神經損傷均多發於青壯年勞動力，勞動カ的傷殘成為社會發展與家庭沉重的經濟與倫理負擔，制約和阻礙著社會經濟的發展。周圍神經損傷的治療效果不理想，主要難題之ー是沒有合適材料修復神經損傷後出現的缺損。臨床上最常用的移植材料是自體神經，但供體直徑細，可切取的數量非常有限，難以滿足臨床需要，且取材後會造成供區新的神經缺損，出現供區神經瘤形成和相應神經功能障礙等併發症，因此，周圍神經移植材料的研製一直是神經修復領域的重點課題。近年來，不少國家的研究機構和企業投入了大量人力、物力與資金對周圍神經修復材料進行研究。已知作為理想的周圍神經支架材料應能為神經再生提供最佳的理化和生物學微環境，包括(1)良好的生物相容性(無毒性，低免疫原性，無致畸致癌性)和降解性，神經修復後能被機體吸收。(2)具有可塑性和一定的機械強度，可保護再生神經順利通過神經缺損區；(3)具有與所修復神經相似的仿生三維支架結構，支持並引導再生神經的生長；(4)材料的組分與構成有良好的生物相容性；(5)保證神經再生修復所需的營養供應，支架材料內有調節神經細胞生長，分化並促進神經修復和組織再生的神經營養因子，改善神經再生的微環境，提高軸突的再生速度。目前製備的具有良好生物相容性和仿生化的神經移植物技術較為成熟，在國內外已有不少專利申請。如中國專利200910250344. 7使用PLGA、殼聚糖和膠原蛋白生物可降解材料製成的神經再生導管；200910034583. 9則提供一種由聚合物經靜電紡絲方法製備的納米纖維組成的導管狀神經移植物；200910020942. 5則使用I型膠原蛋白、殼聚糖、明膠製成一種高仿真組織工程神經修復材料以及此前本申請的申請人的20041002724. 8組織工程化神經移植物等。然而單一的神經導管不含有任何生物活性物質，僅是神經再生的物理通道，不具備任何生物活性，所以其修復的效果不佳，特別是對於更需要營養物質的長段神經缺損。但是如何保證神經再生修復所需的營養供應，提供具有支持、引導促進神經修復和組織再生的營養物質，改善神經再生微環境，且能形成濃度梯度指導神經軸突導向生長仍是尚未解決的難題。雖然現可通過在神經移植物上種植具有生物學活性的種子細胞，通過其在體內外環境中分化為可分泌促神經生長物質的類許旺細胞(如中國專利 200410027223. 3,200410027224. 8,200410027221. 4,200420045860. 9、200420045859. 6,200420045858. 1,200420045857. 7,200410027222. 9 等)或在支架材料上添加各種神經營養因子，通過化學或生物等構建控釋系統實現局部持續緩慢釋放(如中國專利 200410012856. 3，200410009429. 3，200610081506. 5，200610150792. 6 等)。雖然使用種子細胞，通過體內或體外誘導成類雪旺細胞，也能分泌有益於神經再生的營養因子，可促進軸突再生和髓鞘形成，但是其分泌神經再生物質具有時效局限性，且幹細胞的治療涉及使用安全性，標準性和倫理學等諸多問題。迄今為止，除了造血幹細胞治療血液病，全世界尚未有任何ー個研究和醫療機構的幹細胞治療得到受理和審評。我國衛生部更是於2009年3月頒布實施的《醫療技術臨床應用管理辦法》中也明確將幹細胞技術歸入「第三類醫療技木」，稱其「涉及重大倫理問題，安全性、有效性尚需經規範的臨床試驗研究進ー步驗證」。因此這種細胞型組織工程離臨床應用距離尚遠。而通過化學或生物等技術方法在支架材料上添加各種神經營養因子，一方面技術要求較高，製作複雜，難以保證神經營養因子的活性，難以標準化穩定生產，另一方面多數只能添加少量的単一神經營養因子，對神經再生的促進的作用相當有限，以致應用受限；因此如何在現有的周圍神經移植物材料包容有多種神經營養因子已是研究的熱點。同時如能在這種材料上進行有定向的濃度梯度分布的，一方面可以保證遠端足夠量的神經營養物質，防止靶器官和肌肉的過快退化和萎縮，另一方面則可以創造ー個各向異性的細胞生長環境，使細胞行為發生取向而實現導向。這對於提高周圍神經移植修復效果將有重要的意義。
發明內容
本發明的目的在於提供一種促進周圍神經移植後神經再生的植入式可降解裝置，該裝置具有簡便、安全、高效的優點，可用於裝載多種促神經再生物質，並將促神經再生物質按照神經遠、近端形成濃度梯度，環繞於周圍神經移植物的周圍，形成有利於周圍神經軸突再生的微環境。本發明所述的ー種促進周圍神經移植後神經再生的植入式可降解裝置，是由兩個対稱的半柱形組件合攏形成的中空的柱形裝置；在所述柱形裝置內分隔成多個獨立的小間室，用於裝載不同濃度的促神經再生物質；所述柱形裝置的兩端是開放的，供周圍神經移植修復材料從一端穿入並從另一端穿出；兩個半柱形組件的間隙通過醫用生物蛋白膠封閉成為封閉的管狀結構；所述半柱形組件是由可降解的生物相容性材料製備的。在本發明所述的裝置內，促神經再生物質圍繞所置入的周圍神經移植修復材料，使得周圍神經移植修復材料周圍富集有多種促神經再生物質，形成有利於周圍神經軸突再生的微環境；通過醫用生物蛋白膠封閉成為管狀結構，可植入體內需要周圍神經修復的地方，作為周圍神經移植物的裝置。而且，由於採用內部分隔狀凹槽的結構，能夠裝載各種膠狀的促神經再生物質，加快軸突再生速度；並可將促神經再生物質按照神經遠、近端形成濃度梯度，對神經生長起到一定的導向作用。根據本發明所述的裝置的進ー步特徵，所述的半柱形組件具有至少40N/mm2的斷裂強度。因此，由這些半柱形組件製成的管狀裝置能夠提供一定機械支持，能維持形狀不容易塌陷，從而保護裝置內周圍神經移植物，防止纖維瘢痕組織長入。根據本發明所述的裝置的進ー步特徵，所述的半柱形組件具有50% 80%之間的孔隙率，以及具有5Mm 50Mm之間的微孔直徑。因此，半柱形組件具有一定的孔隙結構，有利於營養物質的通透，可使毛細血管和纖維組織長入，不妨礙裝置內的周圍移植物獲得血管化，也避免其內所裝載促神經再生物質大量外滲。根據本發明所述的裝置的進ー步特徵，所述的半柱形組件是由以下可降解的生物 相容性材料製成殼聚糖、藻酸鹽、絲素蛋白、纖維素、膠原蛋白、甲殼素、幾丁糖、聚乳酸、聚羥基こ酸、聚羥基丁酸脂、聚已內脂、聚こ醇酸、脂肪族聚酯、聚磷酸酷、聚碳酸酷、聚氨酯及它們的共聚物。根據本發明所述的裝置的進ー步特徵，所述的周圍神經移植修復材料是選自用於周圍神經缺損修復的人工合成材料、天然生物材料或者組織工程神經。根據本發明所述的裝置的進ー步特徵，所述人工合成材料是選自以下可降解的生物相容性材料聚乳酸、聚羥基こ酸、聚羥基丁酸脂、聚已內脂、聚こ醇酸、脂肪族聚酯、聚磷酸酷、聚碳酸酷、聚氨酯及它們的共聚物。 根據本發明所述的裝置的進ー步特徵，所述天然生物材料是選自來源於有活性的自體、去細胞同種異體或去細胞異種生物體的神經、骨骼肌、血管、肌膜管、黏膜、羊膜以及無活性的殼聚糖、藻酸鹽、絲素蛋白、纖維素、膠原蛋白、甲殼素、幾丁糖。根據本發明所述的裝置的進ー步特徵，所述組織工程神經是種植有活性種子細胞的組織工程支架。根據本發明所述的裝置的進ー步特徵，所述的種子細胞是選自許旺細胞、骨髓間充質細胞、脂肪間充質幹細胞、臍帶間充質幹細胞、神經幹細胞或誘導多能幹細胞。根據本發明所述的裝置的進ー步特徵，所述促神經再生物質是選自神經營養因子，如神經生長因子、腦源性神經生長因子、神經營養素家族；神經分裂素，如睫狀神經營養因子、和白細胞介素-6;非神經營養因子，如成纖維細胞生長因子、白細胞抑制因子、類胰島素生長因子、表皮生長因子、膠質源性神經營養因子、血小板源性生長因子、轉化生長因子@ ;或者它們的兩種或兩種以上的組合。這些促神經再生物質可參與周圍神經再生、調節和創傷修復的物質，有保護周圍神經損傷後的神經元及軸突，可促進軸突再生，加快神經修復作用。本發明所述的促進周圍神經移植後神經再生的植入式可降解裝置具有以下特點和優點
(I)提供ー種可裝載促神經再生物質的裝置，作為用於植入的周圍神經移植物的裝置，使得周圍神經移植物周圍富集有多種的神經再生物質，形成有利於周圍神經軸突再生的微環境。(2)所裝載的促神經再生物質種類不受限制，可根據實際使用需要選擇且可有較多容量，突破目前使用各種複雜技術只能在周圍神經移植物添加少量的単一促神經再生物質的限制，同時也減少既往複雜的化學或生物加工過程中對促神經再生物質活性的影響。(3)該裝置內的分隔狀結構可實現促神經再生物質形成濃度梯度，有可能對周圍神經再生的軸突伸展和定向生長有明顯的促進作用。(4)整個製作エ藝簡便、安全、經濟又高效，實現的手段較為簡便，有利於規模化生產和臨床的推廣使用。
具體實施例方式實施例一本發明所述的促進周圍神經移植後神經再生的植入式可降解裝置的製備
製備材料使用以聚(乳酸-羥基こ酸)共聚物(PLGA)。半柱形組件的製備以聚(乳酸-羥基こ酸)共聚物(PLGA)(摩爾比GA LA=20 80)為原材料，將其溶於ニ氯甲烷中，加入粒徑200 300微米的NaCl做致孔劑(PLGA與NaCl質量比1:9)，同時按5%的比例添加賴氨酸作為鹼性調節劑，並混合均勻，將混合物在專用模具中成膜。模具中的混合物在室溫下，通風櫥中自然揮發。96小時後，脫模，取出半柱狀支架，將其移到真空乾燥箱，37°C真空乾燥48小吋。將半柱狀材料浸入裝有去離子水的800ml大燒杯中，每4小時更換一次去離子水。去離子水洗滌96小時後，將半柱狀材料取出，在乾燥箱中37°C乾燥48小吋。然後在真空乾燥箱中，37°C真空乾燥48小吋，即可得到PLGA組件。組件的裝配和使用在所製備的半柱形組件內裝載促神經再生物質，如膠凍狀的神經生長因子(NGF)，並於神經近端處從高到底的濃度轉入不同的小間隔室內，置入一根同種異體去細胞神經修復材料後，將兩個半柱形組件合閉，並使用醫用生物蛋白膠粘合封閉，形成ー種管狀結構，使得同種異體去細胞神經修復材料周圍富集有神經生長因子(NGF)。
實施例ニ 本發明所述的促進周圍神經移植後神經再生的植入式可降解裝置的製備
製備材料為殼聚糖。半柱形組件的製備取350 mg的殼聚糖溶於3 mg/ml醋酸溶液10ml，抽真空靜置12 h，將殼聚糖溶液注入專用模具中。將注模的樣品順軸向緩慢浸入深低溫冷淋劑(液氮)中，進行梯度冷淋。將10 cm長的膠原蛋白-殼聚糖懸濁液的矽膠管冰凍體裁剪成2. Ocm短節段放置於預冷的鋁盤中，放入Alphal-2型冷凍乾燥機，在-60°C、100 m torr條件下凍幹24 h。在冷凍乾燥機的真空環境中，冷凍支架中的溶劑冰晶發生升華，得到具有微孔結構的組件。真空狀態下升溫至0°C保持6 h，再繼續升溫至22°C保持30 60 min，解除真空，升至常溫，即可製得乾燥成形的殼聚糖組件。組件的裝配和使用在所製備的半柱形組件內裝載促神經再生物質，如膠凍狀的睫狀神經營養因子(CNTF)，並於神經近端處按從高到底的濃度轉入不同的小間隔室內，置入一根聚已內脂製備的神經導管後，將兩個半柱形組件合閉，並使用醫用生物蛋白膠粘合封閉，形成ー種管狀結構，使得周圍神經修復材料周圍富集有睫狀神經營養因子(CNTF)。實施例三本發明所述的促進周圍神經移植後神經再生的植入式可降解裝置的製備
製備材料為股原蛋白。半柱形組件的製備稱取膠原蛋白150mg溶於0. 05mmol/L冰醋酸溶液，4で條件下攪拌90min (18000r/min),負壓抽真空後於4 °C冰箱中過夜，充分混合成凝膠狀懸池液後將其注入專用模具中成型，並以2X10_5m/S的速度進入冷凝劑中後，將其放入預冷的鋁盤中，於_40°C、IOOmtorr條件中凍幹48h，製得乾燥成型的膠原蛋白組件。組件的裝配和使用組件的裝配和使用在所製備的半柱形組件內裝載促神經再生物質，如膠凍狀的膠質源性神經營養因子(GDNF)，並於神經近端處按從高到底的濃度轉入不同的小間隔室內，置入ー根以許旺細胞為種子細胞、去細胞神經為支架的組織工程神經後，將兩個半柱形組件合閉，並使用醫用生物蛋白膠粘合封閉，形成ー種管狀結構，使得該組織工程神經修復材料周圍富集有膠質源性神經營養因子(GDNF)。上述實施例一至三中所採用的專用模具為半柱狀結構(如不鏽鋼棒或玻璃管)，半柱狀凹面有n片分隔形成n+1層結構(n=l, 2, 3......),半徑為I 5mm,長度可任意控制，直徑和長度主要是根據所要修復的神經長度和直徑決定，壁厚0. 2 1mm。具體使用時，可不同濃度的膠凍狀促神經再生物質按照順序注入兩個半柱狀的不同凹槽內，然後將周圍神經移植物(如去細胞同種異體神經修復材料等)置於促神經再生物質表面，然後將兩個半柱狀組件合閉，兩組間的空隙使用醫用生物蛋白膠塗擦，乾燥後可完全閉合。使得現有周圍神經移植物周圍富集有多種的神經再生物質，用於周圍神經缺損移植修復用材料，以提高修復效果。根據與上述實施例類似的實驗，本領域技術人員可以採用其他生物可降解的相容性材料來製備半柱形組件，例如藻酸鹽、絲素蛋白、纖維素、甲殼素、幾丁糖、聚羥基丁酸脂、聚已內脂、聚こ醇酸、脂肪族聚酯、聚磷酸酷、聚碳酸酷、聚氨酯及它們的共聚物。經測定，這些半柱形組件具有至少40N/mm2的斷裂強度，因此，能夠提供一定機械支持，保護裝置內周圍神經移植物，能維持形狀不容易塌陷，防止纖維瘢痕組織長入。同吋，這些半柱形組件具有50% 80%的孔隙率，以及需5Mm 50Mm之間的微孔直徑，因此具有一定的孔隙結構，有利於營養物質的通透，可使毛細血管和纖維組織長入，不妨礙裝置內的周圍移植物獲得血管化，也避免其內所裝載促神經再生物質大量外滲。 在周圍神經缺損修復實驗中，置入本發明所述的裝置內的周圍神經移植修復材料可選自用於周圍神經缺損修復的人工合成材料、天然生物材料或者組織工程神經。所述人工合成材料是選自以下可降解的生物相容性材料聚乳酸、聚羥基こ酸、聚羥基丁酸脂、聚已內脂、聚こ醇酸、脂肪族聚酯、聚磷酸酷、聚碳酸酷、聚氨酯及它們的共聚物。所述天然生物材料是選自來源於有活性的自體、去細胞同種異體或去細胞異種生物體的神經、骨骼肌、血管、肌膜管、黏膜、羊膜以及無活性的殼聚糖、藻酸鹽、絲素蛋白、纖維素、膠原蛋白、甲殼素、幾丁糖。所述組織工程神經是種植有活性種子細胞的組織工程支架。所述的種子細胞是選自許旺細胞、骨髓間充質細胞、脂肪間充質幹細胞、人臍帶間充質幹細胞、神經幹細胞和誘導多能幹細胞等可能對周圍神經再生有益的活性並用於構建組織工程神經的種子細胞。置入本發明所述的裝置內的促神經再生物質可選自神經營養因子，如神經生長因子、腦源性神經生長因子、神經營養素家族；神經分裂素，如睫狀神經營養因子、和白細胞介素_6 ;非神經營養因子，如成纖維細胞生長因子、白細胞抑制因子、類胰島素生長因子、表皮生長因子、膠質源性神經營養因子、血小板源性生長因子、轉化生長因子3 ;或者它們的兩種或兩種以上的組合。這些促神經再生物質可參與周圍神經再生、調節和創傷修復的物質，有保護周圍神經損傷後的神經元及軸突，可促進軸突再生，加快神經修復作用。實施例四本發明所述的促進周圍神經移植後神經再生的植入式可降解裝置用於獼猴橈神經長段缺損的修復實驗。在獼猴上臂橈神經深支起點以上Icm切取4cm長橈神經造成5cm長神經缺損，對神經端端進行標記，試驗組使用實施例一所製備的植入式可降解裝置進行修復，自體神經移植組使用相應長度的自體神經修復，去細胞神經移植組使用相應長度的單純同種異體去細胞神經修復。術後克式針(直徑I. 5_)固定肘關節屈135°。動態觀察8月，並進行組織形態學、電生理學和行為學的評價。術後各組動物存活良好，實驗組傷ロ癒合良好，未發現局部紅腫、積液、破潰，實驗動物未出現不良反應。術後8個月各組動物均恢復了伸腕功能，試驗組伸腕動作幅度與自體神經移植組相當，優於去細胞神經移植組；神經電生理檢測均可發現神經動作電位存在，並發現試驗組的神經刺激閾值與自體神經組相當，低於去細胞神經組，最大振幅和神經傳導速度與自體神經組無顯著性差異，但優於去細胞神經組；組織學檢測顯示在試驗組和自體神經移植組中，可見大量陽性染色的許旺細胞和神經纖維， 神經纖維排列整齊、規則，而去細胞神經組神經移植體遠段S-IOO蛋白和神經微絲蛋白免疫組化染色見有少量的陽性染色許旺細胞和神經纖維且排列雜亂。上述結果顯示了根據本發明所述的植入式可降解裝置進行修復獼猴橈神經長段缺損是可行有效，且優於傳統的單純同種異體去細胞神經。
權利要求
1.一種促進周圍神經移植後神經再生的植入式可降解裝置，其特徵在於所述裝置是由兩個對稱的半柱形組件合攏形成的中空的柱形裝置；在所述柱形裝置內分隔成多個獨立的小間室，用於裝載不同濃度的促神經再生物質；所述柱形裝置的兩端是開放的，供周圍神經移植修復材料從一端穿入並從另一端穿出；兩個半柱形組件的間隙通過醫用生物蛋白膠封閉成為封閉的管狀結構；所述半柱形組件是由可降解的生物相容性材料製備的。
2.根據權利要求I所述的裝置，其特徵在於所述的半柱形組件具有至少40N/mm2的斷裂強度。
3.根據權利要求I所述的裝置，其特徵在於所述的半柱形組件具有50% 80%之間的孔隙率，以及需在5Mm 50Mm之間的微孔直徑。
4.根據權利要求I所述的裝置，其特徵在於所述的半柱形組件是由以下可降解的生物相容性材料製成的殼聚糖、藻酸鹽、絲素蛋白、纖維素、膠原蛋白、甲殼素、幾丁糖、聚乳酸、聚羥基こ酸、聚羥基丁酸脂、聚已內脂、聚こ醇酸、脂肪族聚酯、聚磷酸酷、聚碳酸酷、聚氨酯及它們的共聚物。
5.根據權利要求I所述的裝置，其特徵在於所述的周圍神經移植修復材料是選自用於周圍神經缺損修復的人工合成材料、天然生物材料或者組織工程神經。
6.根據權利要求5所述的裝置，其特徵在於所述人工合成材料是選自以下可降解的生物相容性材料聚乳酸、聚羥基こ酸、聚羥基丁酸脂、聚已內脂、聚こ醇酸、脂肪族聚酯、聚磷酸酯、聚碳酸酷、聚氨酯及它們的共聚物。
7.根據權利要求5所述的裝置，其特徵在於所述天然生物材料是選自來源於同種或異種天然生物組織，包括有活性的自體、去細胞同種異體或去細胞異種生物體的神經、骨骼肌、血管、肌膜管、黏膜、羊膜以及無活性的殼聚糖、藻酸鹽、絲素蛋白、纖維素、膠原蛋白、甲殼素、幾丁糖。
8.根據權利要求5所述的裝置，其特徵在於所述組織工程神經是種植有活性種子細胞的組織工程支架。
9.根據權利要求8所述的裝置，其特徵在幹所述的種子細胞是選自許旺細胞、骨髄間充質細胞，脂肪間充質幹細胞，臍帶間充質幹細胞，神經幹細胞或誘導多能幹細胞。
10.根據權利I所述的裝置，其特徵在幹所述促神經再生物質是選自神經營養因子，如神經生長因子、腦源性神經生長因子、神經營養素家族；神經分裂素，如睫狀神經營養因子、和白細胞介素_6 ;非神經營養因子，如成纖維細胞生長因子、白細胞抑制因子、類胰島素生長因子、表皮生長因子、膠質源性神經營養因子、血小板源性生長因子、轉化生長因子^ ;或者它們的兩種或兩種以上的組合。
全文摘要
本發明涉及一種促進周圍神經移植後神經再生的植入式可降解裝置。本發明所述的植入式可降解裝置，是由兩個對稱的半柱形組件合攏形成的中空的柱形裝置；在所述柱形裝置內分隔成多個獨立的小間室，用於裝載不同濃度的促神經再生物質；所述柱形裝置的兩端是開放的，供周圍神經移植修復材料從一端穿入並從另一端穿出；兩個半柱形組件的間隙通過醫用生物蛋白膠封閉成為封閉的管狀結構；所述半柱形組件是由可降解的生物相容性材料製備的。本發明所述的植入式可降解裝置具有簡便、安全、高效的優點，可用於裝載多種促神經再生物質，並將促神經再生物質按照神經遠、近端形成濃度梯度，環繞於周圍神經移植物的周圍，形成有利於周圍神經軸突再生的微環境。
文檔編號A61F2/02GK102836016SQ201110164968
公開日2012年12月26日 申請日期2011年6月20日 優先權日2011年6月20日
發明者劉小林, 朱慶棠, 鄭燦鑌 申請人:中山大學附屬第一醫院