胎腎上腺StAR基因在化學品發育毒性評價中的應用的製作方法

2023-06-14 17:49:26

專利名稱：：胎腎上腺StAR基因在化學品發育毒性評價中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及醫用醫藥
技術領域：
，更具體涉及一種胎腎上腺StAR基因在化學品發育毒性評價中的應用。
背景技術：
：發育毒性是指妊娠動物接觸受試藥物後，子代於出生前、圍產期和出生後所表現的機體結構或功能障礙。這是經濟合作與發展組織(OECD)化學品測試指南No.421(1995年)《生殖/發育毒性篩選試驗》(英文版)對發育毒性的定義，該指南亦被中華人名共和國國家標準-GBT21766-2008化學品生殖/發育毒性篩選試驗方法採用。自上世紀60年代"反應停"事件後，孕期化學品的致畸性危害已受到人們高度的重視。然而，孕期化學品暴露所致功能發育障礙卻往往為人們所忽視。事實上，孕期化學品的功能發育障礙危害更嚴重，這是因為危害的人群更多，它不僅影響了人口素質，而且可帶來系列的家庭和社會問題。如宮內發育遲緩就是一類最常見的孕期化學品暴露所致的發育毒性，它不僅是圍產兒發病和死亡的重要原因，還常伴有出生後體格、智力發育落後，成年後代謝症候群易感性增高，並可遺傳至下一代。因此，建立一種準確客觀的發育毒性評價方法，對於孕婦有效避免接觸有害化學品，控制發育毒性發生率，提高世界人口綜合素質，具有重要的現實指導意義。近年來，隨著科學技術和工業生產的迅猛發展，國內外醫藥領域的發展水平也出現了大幅度的提高。不斷湧現的新藥、特藥給廣大患者帶來了福音，但同時藥品作為一種特殊商品，與人們的身體健康、生命安全息息相關，其發育毒性評價顯得尤為重要。特別是當今大量新生化合品的不斷湧現，其所致的發育毒性發生率有上升趨勢，新藥的發育毒性評價更是重中之重，與人民的用藥安全息息相關。然而，目前國內外普遍採用藥物發育毒性評價方法，即上述提到的0ECD化學品測試指南No.421(1995年)《生殖/發育毒性篩選試驗》，主要通過出生體重來評價藥物的發育毒性，它存在著動物用量大、實驗時間長、實驗操作複雜、檢測指標不靈敏不特異等諸多弊病，大大限制了發育毒性評價工作的效率。因此，尋找新的、靈敏的、早期的發育毒性評價指標已是生殖毒性評價領域迫在眉睫的難題。甾體激素是一類能影響內分泌系統功能的重要因子，對維持正常妊娠、促進胎兒發育有著重要意義。作為機體的重要內分泌器官，腎上腺負責了多種甾體激素的合成。從結構上看，胎腎上腺在孕4-5周已發育成形；從功能上看，早在孕6-8周腎上腺胚基細胞就有生成類固醇的能力，提示胎腎上腺的早期正常發育是決定胎兒成熟和命運的關鍵。StAR基因是腎上腺甾體激素合成的限速酶——甾體合成急性調節蛋白(StAR)基因。前期我們通過全面檢測與外源物代謝相關的I相酶、II相酶和抗氧化酶系統水平，首次提出了發育中的腎上腺不僅是一個重要的內分泌器官，同時也具有重要的外源物代謝器官的性質；在整體和細胞水平證實胎腎上腺的甾體激素合成功能能為多種外源物所幹擾，同時胎腎上腺StAR和P450^表達降低，進一步證實了胎兒宮內發育遲緩的發生與胎腎上腺StAR基因的表達降低存在著相關性(ChenM，etal.Adrenal-mediatedCortisol3disturbanceinnicotine—inducedratintrauterinegrowthretardation.ExpToxicolPatho12007;59(3-4):245;WangH，etal.Fetaladrenalmediatedsteroidogeneticdisturbanceinxenobiotics—inducedintrauterinegrowthretardation.DrugMetabRev2007;39;WangH，etal.Influencesof3-methylcholanthrene，phenobarbitalanddexamethasoneonxenobioticmetabolizing—relatedcytochromeP450enzymesandsteroidogenesisinhumanfetaladrenalcorticalcells.ActaPharmacolSin2006527(8):1093)。基於上述，本發明涉及以胎腎上腺StAR為化學品毒性靶基因，建立基於胎腎上腺StAR基因表達變化的體外評價系統，早期、快速的評價化學品的發育毒性，可以滿足新藥研發和環境衛生評價的多領域需要。
發明內容本發明的目的是在於提供了一種胎腎上腺StAR基因在化學品發育毒性評價中的應用。能早期、快速的評價化學品的發育毒性，以滿足新藥研發和環境衛生評價的多領域需要。為了實現上述目的，本發明採用以下技術構建了一種化學品發育毒性的體外評價系統，它包括1)人胎腎上腺細胞體外培養方法；2)化學受試品處理細胞的方式；3)StAR基因表達的檢測方法。應用該系統證實多種外源物(如咖啡因、乙醇和尼古丁等)存在發育毒性，從而在細胞水平證實了這些陽性化學品在整體動物水平已存在的胚胎發育毒性。在本發明的一個優選方案中，具體採用了以下步驟1、基因的來源本實驗中所使用的人胎腎上腺NCI-H295A細胞系(HuangN，etal.Regulationofcytochromeb5genetranscriptionbySp3，GATA_6，andsteroidogenicfactor1inhumanadrenalNCI—H295Acells.MolecularEndocrinology19(8);2020-2034)中具有StAR基因。2、建立人胎腎上腺NCI-H295A細胞系體外培養系統利用人胎腎上腺NCI-H295A細胞系，以含2X胎牛血清，5iig/ml胰島素，5iig/ml轉帖蛋白，5iig/ml亞硒酸鹽的RPMI-1640培養基於37t:，5XC02的孵箱內培養，傳代。待細胞生長至接近融合時，用無血清的RPMI-1640培養基同步化12h。3、化學受試品處理細胞方式；用咖啡因作用於人胎腎上腺NCI-H295A細胞的終濃度分別為100、400和600iiM，作用時間均為48h。然後收集培養基，於低深溫(-78°C—82°C)冰箱保存。4、StAR基因表達的檢測方法從NCBI的Entrez核酸資料庫(EntrezNucleotidesdatabase)中檢索到人類StAR和P450scc的完整cDNA序列，應用引物設計軟體PrimerPremier5.0(PREMIERBiosoftInternational)進行引物設計，然後將設計出的引物輸入BLAST資料庫中進行同源性比較，最終得到特異的引物序列。從所收穫的細胞中，應用RNA抽提試劑盒(RNeasyMiniKit)提取其總RNA，並進行逆轉錄，使其合成cDNA，並測其濃度。從NCBI的Entrez核酸資料庫(EntrezNucleotidesdatabase)中檢索至l認類StAR和P450scc的完整cDNA序列，應用引物設計軟體PrimerPremier5.0(PREMIERBiosoftlnternational)進行引物設計，然後將設計出的引物輸入BLAST資料庫中進行同源性比較，最終得到特異的引物序列，利用得到的引物進行實時定量PCR技術檢測StAR和P450scc的表達變化。5、WesternBlot法檢測StAR和P450scc的蛋白表達抽提組織和細胞總蛋白。BCA法檢測總蛋白濃度，製備SDS-PAGE膠，上樣並電泳後用電轉移儀(美國Bio-Rad)轉移到硝酸纖維素膜上，封閉後加入兔抗StAR或羊抗P450scc抗體、室溫(20°C_25°C)孵育2小時，二抗為HRP-羊抗兔或兔抗羊IgG、室溫(20°C_25°C)孵育2h，ECL化學發光劑作用後在X光膠片上曝光、顯影和定影。結果由計算機凝膠圖像分析系統檢測。6、毒性判斷標準根據StAR表達變化的結果，得到各化學受試品能引起基因表達量50%變化的濃度，即半數有效濃度(EC50)，確定其發育毒性程度。本發明的優點在於1、簡便、快速本發明利用人胎腎上腺NCI-H295A細胞系體外培養系統，通過化學受試品處理後，檢測其StAR基因的表達，即可計算各化學受試品的半數有效濃度(EC5。)，確定其發育毒性程度。其方法簡單、方便、快速，為建立胎兒發育毒性評價系統提供了堅實的^石出。2、早期、特異由於胎StAR基因是胎腎上腺甾體激素合成限速酶P450scc的急性調節蛋白，而甾體激素(如糖皮質激素)能促進胚胎組織發育和功能成熟，因此胎腎上腺早期的正常發育是決定胎兒成熟和命運的關鍵。利用人胎腎上腺NCI-H295A細胞系體外培養系統，通過化學受試品處理後，檢測其StAR基因的表達，可以對化學品的發育毒性進行早期和特異性評價。3、符合"3R(reduction,refinement,r印lacement)原則""3R原則"即實驗動物的減少、優化和替代原則。本發明著重利用人胎腎上腺NCI-H295A細胞系體外培養系統，能減少實驗動物數，指標特異，部分代替動物實驗，所以符合"3R原則"。4、應用領域廣泛本發明可廣泛應用於如生物代謝、新藥研發、衛生毒理學研究、疾病預防和診斷等領域。圖1:尼古丁(1-100iiM)對人胎腎上腺細胞StAR和P450scc基因表達的影響圖2:尼古丁(1-100iiM)對人胎腎上腺細胞StAR和P450scc蛋白表達的影響圖3:可替寧(1-100iiM)對人胎腎上腺皮質細胞StAR和P450scc蛋白表達的影響圖4:尼古丁(100iiM)、咖啡因(400iiM)和乙醇(100iiM)對NCI-H295A細胞StAR和P450scc基因mRNA水平的影響圖5:尼古丁(100iiM)、咖啡因(400iiM)和乙醇(100iiM)對NCI-H295A細胞StAR蛋白表達水平的影響。具體實施例方式下面結合具體實施例子，進一步闡述本發明。實施例1尼古丁和可替林對人胎腎上腺StAR和P450scc表達的影響—、試劑來源尼古丁和可替寧購自美國Sigma公司；TrizolReagent和HiBindTMPCR產物回收試劑盒為美國Omega公司生產；實驗所用引物由上海生工生物工程技術有限公司合成；逆轉錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；實時定量RT-PCR試劑盒為日本Takara公司產品；SybrGreenI染料購自上海捷瑞生物工程有限公司；DMEM/F_12培養基為美國Gibico公司產品；I型膠原酶為美國Invitrogen公司生產；DNA酶I(DNaseI)購自北京華美生物工程公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；StAR及P450scc多克隆抗體為美國SantaCruzBiotechnology產品；羊抗兔及兔抗羊二抗和ECL試劑盒為美國PierceBiotechnology產品；HRP標記的GAPDH抗體購自上海康成生物工程公司。二、實驗方法(1)基因的來源本實驗中利用人胎腎上腺NCI-H295A細胞系(HuangN，etal.Regulationofcytochromeb5genetranscriptionbySp3，GATA-6，andsteroidogenicfactor1inhumanadrenalNCI-H295Acells.MolEndocrinol.2005;19(8):2020-34)，細胞中具有StAR基因。(2)建立人胎腎上腺NCI-H295A細胞系體外培養系統利用人胎腎上腺NCI-H295A細胞系，以含2X胎牛血清、5iig/ml胰島素，5iig/ml轉鐵蛋白、5yg/ml亞硒酸鹽的RPMI-1640培養基於37°C，5%C02孵箱內培養，傳代。待細胞生長至接近融合時，用無血清的RPMI-1640培養基同步化12h。(3)總RNA提取和cDNA合成6孔板的每孔細胞加入lmLRNA-SolvReagent，按試劑說明書中操作步驟提取RNA，要求0D260/0D280的比值在1.82.0之間。取總RNAliig按操作說明書合成cDNA，反應體系20iil，包括5X緩衝液4iil，dNTPliU，01igodTPrimer1yl，M-MLV逆轉錄酶0.5yl，Rnase抑制劑0.5yl，用二乙基焦碳酸酯(DEPC)水補足。42°C15min，95。C2min進行逆轉錄，合成好的cDNA置於低深溫(-78。C-82。C)冰箱保存備用。(4)引物設計從NCBI的Entrez核酸資料庫(EntrezNucleotidesdatabase)中檢索到人類StAR、P450scc及對照人類13-actin的完整cDNA序列，應用引物設計軟體PrimerPremier5.0(PREMIERBiosoftInternational)進行引物設計，然後將設計出的引物輸入BLAST資料庫中進行同源性比較，最終得到特異的引物序列。引物序列、目的片段長度和反應條件見表1。表l.引物序列和PCR條件tableseeoriginaldocumentpage6tableseeoriginaldocumentpage7(5)實時定量PCR標準品的製備將待測基因的PCR產物用膠回收試劑盒進行純化，然後按IO倍梯度稀釋即可得到標準品，用於做實時定量PCR的標準曲線。(6)螢光定量分析採用RG-3000實時定量PCR儀(澳大利亞Corbett公司)進行檢測。反應體系25ii1，包括PCR反應液混合物(PremixExTaqTM)12.5ii1，cDNA2ii1，Forwardprimer禾口Reverseprimer各0.5u1，20XSYBRGreenI0.5u1，用二乙基焦碳酸酯(DEPC)水補足。(7)數據計算本實驗採用標準曲線相對定量法對待測基因的mRNA表達水平進行計算。應用Rotor-Gene6.0軟體(CorbettResearch公司)通過標準曲線計算出樣品的mRNA表達相對量V值，將待測基因的V值與同一樣本外參基因GAPDH的V值相比(Rv=V待測/VGAPDH)，所得比值Rv代表樣本待測基因mRNA的相對表達量。(8)Westernblot法檢測StAR和P450scc的蛋白表達常規用RI-PA+PMSF抽提組織和細胞總蛋白。BCA法檢測總蛋白濃度，製備SDS-PAGE膠(包括12%濃度分離膠和4%濃度濃縮膠)，上樣並電泳後用電轉移儀(美國Bio-Rad)轉移到硝酸纖維素膜上，封閉後加入兔抗StAR或羊抗P450scc抗體(工作濃度為1:100)、室溫(20°C25°C)孵育2h，二抗為HRP-羊抗兔或兔抗羊IgG(工作濃度為1:5000)、室溫(20°C25°C)孵育2h，ECL化學發光劑作用後在X光膠片上曝光、顯影和定影。結果由計算機凝膠圖像分析系統檢測。(9)數據處理與統計方法實驗數據多以Mean士SD表示，均數的組間比較採用單因素方差分析(One-wayANOVA)，率的組間比較採用x2檢驗，P<0.05表示差異具有顯著性。三、實驗結果(1)尼古丁對人胎腎上腺細胞StAR和P450scc基因和蛋白表達的影響如圖1和圖2所示，不同濃度尼古丁處理原代分離培養孕中末期人胎腎上腺細胞24h後，其細胞中StAR和P450scc的mRNA和蛋白表達量均明顯降低，並呈現一定的濃度依賴性，其中100yM尼古丁組的mRNA表達量分別下降至正常對照組的30.4%(P<0.05)和39.2%。(2)可替寧對人胎腎上腺皮質細胞StAR和P450scc表達的影響從圖3發現，不同濃度可替寧(1、10和100iiM)處理胎腎上腺細胞24h後，其細胞中StAR和P450scc的蛋白表達量均呈現濃度依賴性降低。實施例2尼古丁、咖啡因和乙醇對人胎腎上腺NCI-H295A細胞StAR和P450scc表達影響—、試劑來源尼古丁、咖啡因購自美國Sigma公司；實驗所用引物由IntegratedDNATechnologies公司合成；RNA抽提試劑盒(RNeasyMiniKit)購自Qiagen公司；逆轉錄試劑盒(SuperscriptIIRNaseHReverseTranscriptaseKit)和PCR試劑盒購自7Invitrogen公司；RPMI1640培養基、胎牛血清購自Invitrogen公司；胰島素、轉鐵蛋白和亞硒酸鹽(1ST)購自sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Biorad公司；鼠抗StAR抗體購白abeam公司；P-tubulin抗體為SantaCruzBiotechnology產品；AlexaFluor680山羊抗鼠螢光二抗購自RocklandImmunochemicals公司。—、實驗方法(1)基因的來源本實驗中建立的人胎腎上腺NCI-H295A細胞系(HuangN，etal.Regulationofcytochromeb5genetranscriptionbySp3，GATA-6，andsteroidogenicfactor1inhumanadrenalNCI-H295Acells.MolEndocrinol.2005;19(8):2020-34)中具有StAR基因。(2)人胎腎上腺NCI-H295A細胞的培養NCI-H295A細胞系以含2%胎牛血清、5yg/ml胰島素、5iig/ml轉鐵蛋白、5yg/ml亞硒酸鹽的RPMI-1640培養基於37°C，5%C02的孵箱內培養，傳代。待細胞生長至接近融合時，用無血清的RPMI-1640培養基同步化12h。尼古丁、咖啡因和乙醇作用於細胞的終濃度分別為100、400和100iiM，作用時間均為48h。然後收集培養基，於低深溫(_78°C-82°C)冰箱保存。(3)總RNA提取和cDNA合成按照RNeasyMiniKit說明書中操作步驟提取RNA，並測謹濃度。取總謹1iig按SuperscriptIIRNaseHReverseTranscriptaseKit操作說明書合成cDNA，並測其濃度，置於低深溫(_78°C-82°C)冰箱保存備用。(4)引物設計及PCR分析從NCBI的Entrez核酸資料庫(EntrezNucleotidesdatabase)中檢索到人類StAR和P450scc的完整cDNA序列，應用引物設計軟體PrimerPremier5.0(PREMIERBiosoftInternational)進行引物設計，然後將設計出的引物輸入BLAST資料庫中進行同源性比較，最終得到特異的引物序列。並採用PCRxEnhancerSystem進行分析。引物序列、目的片段長度和反應條件見表2。表2.引物序列和PCR條件GenesForwardprimerReverseprimerProduct(bp)AnnealingStARTGAGCAGAAGGGTGTCATCAGGCGCAGGTGGTTGGCAAAATC18659°C，30sP450sccATGCTGGAGGAAGTAGTGAACCCGCGTGCCATCTCATACAAGTGC37259°C，30s(5)Westernblot法檢測StAR蛋白的表達常規用RIPAbuffer抽提細胞總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度，製備SDS-PAGE膠(包括10%濃度分離膠和4%濃度濃縮膠)，上樣並電泳後用電轉移儀(美國Bio-Rad)轉移到PVDF膜上，封閉後加入鼠抗StAR抗體(1:1000)4。C過夜，TBST漂洗三次後，加入二抗(1:5000)室溫(20。C25。C)避光孵育lh。漂洗3次後由Odysseyinfraredimagingsystem(LI-C0R，Biosciences,NE，USA)掃描得到圖像。8(1)尼古丁、咖啡因和乙醇對NCI-H295A細胞StAR和P450scc基因mRNA水平的影響如圖4所示，尼古丁、咖啡因和乙醇處理NCI-H295A細胞48h後，細胞中StAR和P450scc的mRNA表達量均降低。(2)尼古丁、咖啡因和乙醇對NCI-H295A細胞StAR蛋白表達水平的影響如圖5所示，尼古丁、咖啡因和乙醇處理NCI-H295A細胞48h後，其細胞StAR蛋白的表達量均降低。權利要求一種胎腎上腺StAR基因在化學品發育毒性評價中的應用，其步驟為A、人胎腎上腺細胞體外培養；B、化學受試品處理細胞；C、StAR基因表達的檢測。2.如權利要求1所述的一種胎腎上腺StAR基因在化學品發育毒性評價中的應用，其特徵在於人胎腎上腺細胞體外培養是利用人胎腎上腺NCI-H295A細胞系，以含2%胎牛血清，5g/ml胰島素，5g/ml轉帖蛋白，5g/ml亞硒酸鹽的RPMI-1640培養基於37°C，5%C02的孵箱內培養，傳代，待細胞生長至接近融合時，用無血清的RPMI-1640培養基同步化12h。3.如權利要求l所述的一種胎腎上腺StAR基因在化學品發育毒性評價中的應用，其特徵在於化學受試品處理細胞是用咖啡因作用於人胎腎上腺NCI-H295A細胞的終濃度分別為100、400和600M，作用時間均為48h，然後收集培養基，於低深溫-78t:—82t:冰箱保存。4.如權利要求l所述的一種胎腎上腺StAR基因在化學品發育毒性評價中的應用，其特徵在於StAR基因表達的檢測是從所收穫的細胞中，應用RNA抽提試劑盒提取其總RNA，並進行逆轉錄，使其合成cDNA，並測其濃度。從NCBI的Entrez核酸資料庫中檢索到人類StAR和P450scc的完整cDNA序列，應用引物設計軟體PrimerPremier5.0進行引物設計，然後將設計出的引物輸入BLAST資料庫中進行同源性比較，最終得到特異的引物序列，利用得到的引物進行實時定量PCR技術檢測StAR和P450scc的表達變化。全文摘要本發明公開了一種胎腎上腺StAR基因在化學品發育毒性評價中的應用。本發明構建了一種化學品發育毒性的體外評價系統，它包括1)人胎腎上腺細胞體外培養方法；2)化學受試品處理細胞的方式；3)StAR基因表達的檢測方法。應用該系統證實多種外源物存在發育毒性，從而在細胞水平證實了這些陽性化學品在整體動物水平已存在的胚胎發育毒性。能早期、快速的評價化學品的發育毒性，以滿足新藥研發和環境衛生評價的多領域需要。文檔編號C12Q1/68GK101712980SQ20081019719公開日2010年5月26日申請日期2008年10月8日優先權日2008年10月8日發明者徐丹,梁賅,汪暉,王婷婷,陳曼申請人:武漢大學