具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽、編碼該蛋白質或多肽的DNA、利用該DNA製造...的製作方法

2023-07-03 01:44:46

專利名稱：具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽、編碼該蛋白質或多肽的 DNA、利用該 DNA製造 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及表現出使與粉碎或切洋蔥等植物時發生的催淚成分的生成有關的1-丙烯次磺酸轉變為催淚成分的作用的蛋白質或多肽、編碼該蛋白質或多肽的DNA(催淚成分合成酶基因)。
本發明的催淚成分合成酶基因可用於例如，控制催淚成分的生成、在使破碎或切斷時發生的催淚成分的量減少的植物的開發中作為材料或交配物等的篩選指標使用、提供用於抑制該酶表達量的信息，實現大量生產該酶、大量生產催淚成分等。
在本說明書中、「催淚成分」指的是Lachrymatory Factor(以下、記為LF)，具體來說，是硫代丙醛-S-氧化物。而所謂具有催淚成分合成酶活性與表現出將催淚成分合成酶的推定底物反-1-丙烯次磺酸轉變為催淚成分的作用，或在蒜氨酸酶存在下具有由存在于洋蔥等的反-S-1-丙烯基-半胱氨酸亞碸(PeCSO)生成催淚成分的作用是同義的。
背景技術：
關於粉碎或切斷洋蔥時發生的催淚成分，到目前為止已報導了許多研究成果，有關存在于洋蔥等的催淚成分(Lachrymatory FactorLF)的形成及其的分解，人們一直認為是S-1-丙烯基-半胱氨酸亞碸(PeCSO)被蒜氨酸酶一分解，就生成催淚成分。即認為蒜氨酸酶作用於上述前體物質PeCSO，經1-丙烯次磺酸不經酶反應就轉變為穩定的催淚成分。
然而，根據本發明人的研究，PeCSO只是被蒜氨酸酶分解，並不產生催淚成分，判明必須有其它酶(催淚成分合成酶)參與。因此，本發明人等不斷進行深入研究，發現存在一種新酶(催淚成分合成酶)，該酶可使上述次磺酸異構化後生成催淚成分，由此可知，上述前駆物質通過該酶的某種作用變成了催淚成分或與此不同的別的風味成分。另外，在對該催淚成分合成酶(催淚性物質合成酶)的製造方法進行開發的同時，也弄清了催淚成分合成酶的理化性質，提出了專利申請(特開平10-295373號公報)。
另外，本發明人等為了闡明在蒜氨酸酶存在下，具有由存在于洋蔥等中的PeCSO生成催淚成分的作用的催淚成分合成酶的構造為目標，不斷進行深入研究，結果在催淚成分合成酶的多個同功酶、其胺基酸序列以及編碼來自洋蔥的該酶的基因序列的闡明中獲得成功，提出了專利申請(國際公開第02/20808號公報)。
這樣的催淚成分合成酶通常也存在於蔥屬(Allium蔥屬)植物，編碼該酶的DNA信息在這些植物等品種開發中可用於基因重組或變異的誘導或交配等，可以在即使粉碎或切斷時也難於產生催淚成分的植物的製作等中起作用。另外在生理活性物質硫代亞磺酸鹽(thiosulfinates)乃至其反應物的生成量增大的植物製作等中也起到作用。
另外，如果利用編碼具有催淚成分合成酶活性的蛋白質的DNA信息，可以通過基因重組技術大量生產該酶，例如，在有效製造在淚缺乏症(乾眼症)等治療有作用的催淚成分的技術開發中也有用。

發明內容
本發明的目的在於提供催淚成分合成酶基因、特別是蔥屬植物中含有的催淚成分合成酶基因。
另外，本發明的目的在於提供具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽、特別是蔥屬植物中含有的具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽。
此外，本發明的目的在於提供通過基因重組技術實現更有效地製造出催淚成分合成酶的同功酶的方法。
另一個目的是提供實現對由催淚成分的前體物質生成催淚成分的酶基因的表達進行抑制的手段。
用於達到上述目的的本發明由以下技術手段構成。
(1)編碼表現出使1-丙烯次磺酸轉變為催淚成分的作用的蛋白質或多肽的DNA。
(2)上述DNA是由序列1、5、7、9、13或15所示鹼基序列構成的或由以下(a)～(c)中任一個構成的DNA。
(a)由在序列1、5、7、9、13或15所示鹼基序列中付加、缺失、或置換1或多個鹼基後的鹼基序列構成的DNA。
(b)在嚴格條件下，可與由序列1、5、7、9、13或15所示鹼基序列構成的DNA進行雜交的DNA。
(c)由與序列1、5、7、9、13或15所示鹼基序列的同源性在60％以上的鹼基序列構成的DNA。
(3)序列25所示的用於屬於蔥屬植物的催淚成分合成酶基因的分離所使用的引物以及使用該引物分離該基因的方法。
(4)含有上述DNA的重組載體。
(5)包含含有上述DNA的重組載體的轉化體。
(6)具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽的製造方法，其特徵是對用含有上述DNA重組載體轉化的宿主細胞進行培養，然後對產生在培養基中或細胞中的具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽進行分離。
(7)具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽，包含以下任一個序列(a)序列2、6、8、10、14或16所示的胺基酸序列、(b)在序列2、6、8、10、14或16所示的胺基酸序列中付加、缺失或置換1或多個胺基酸後的胺基酸序列、或
(c)與序列2、6、8、10、14或16所示胺基酸序列的同源性在65％以上的胺基酸序列。
(8)具有抑制mRNA翻譯的功能的核酸分子，該mRNA是具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽的mRNA。
另外，在本發明中，關於以上的技術手段，包括DNA是除去由序列11所示鹼基序列構成的DNA的情形。
另外，在本發明中，關於以上技術手段，包括DNA是除去編碼含有序列12所示胺基酸序列的蛋白質或多肽的DNA的情形。
另外，在本發明中，關於以上技術手段，包括蛋白質或多肽是除去含有序列12所示的胺基酸序列的蛋白質或多肽的情形。
在本發明中，提取蔥屬植物的總RNA，以該總RNA中含有的mRNA為模板通過RT-PCR法合成cDNA，以國際公開第02/20808號公報中已經得到的編碼洋蔥催淚成分合成酶蛋白質或多肽的DNA(序列11)鹼基序列為基礎設計引物，以上述cDNA為模板，通過PCR法有選擇地合成催淚成分合成酶基因。另外，對於通過以來自上述洋蔥的鹼基序列為基礎設計的引物不能有選擇地合成催淚成分合成酶基因的蔥屬植物，設計對其分離有效的其它引物，同樣有選擇地合成該基因。
由PeCSO的蒜氨酸酶的分解物使催淚成分(硫代丙醛-S-氧化物)生成的催淚成分合成酶是與植物風味改質或加工適應性提高有關的重要的成分。因此，在催淚成分合成酶的生產和植物育種領域中，該催淚成分合成酶基因的確定極其有意義。
作為獲得催淚成分合成酶基因的序列的具體方法，例如以下的方法。
(1)(總RNA的提取、cDNA的合成)由各蔥屬植物的總RNA合成cDNA。用於該目的方法只要是本領域技術人員公知的任一方法都可以，例如、在下面敘述的實施例中採用使用RNeasy Plant Mini試劑盒(QIAGEN Cat.no.74903)提取總RNA，使用Ready-To-Go T-Primed First-Strand試劑盒(AmerchamBiosciences code no.27-9263-01)合成cDNA的方法。
(2)(RACE法)通過使用一個以上含有洋蔥催淚成分合成酶基因3′側區域的序列的引物，對該蔥屬植物催淚成分合成酶基因的3′側區域進行PCR擴增，使用一個以上含有洋蔥催淚成分合成酶基因5′側區域序列的引物，對該蔥屬植物催淚成分合成酶基因5′側區域進行PCR擴增，可以確定蔥屬植物的催淚成分合成酶基因序列。作為含有上述洋蔥催淚成分合成酶基因3′側區域的序列的引物，如序列17所示寡核苷酸，作為含有上述洋蔥催淚成分合成酶基因5′側區域的序列的引物，如序列19所示的寡核苷酸，但不限定於這些。
(3)(TA克隆法)對於韭蔥(A.ampeloprasum L.)，只從來自洋蔥催淚成分合成酶基因序列的信息不能得到RACE產物。因此，需要洋蔥、野薤、大蔥3種催淚成分合成酶基因中均序列保守的區域，通過在有義引物中使用以該序列為基礎設計的引物E2/uni/f/298(序列25)，初次實現對該cDNA的3′側區域進行擴增成為可能。上述引物可以作為通用引物，在屬於蔥屬植物的催淚成分合成酶基因的分離中使用(圖5給出了通用引物的區域)。
另外，使用由洋蔥序列設計的引物不能得到擴增產物的結果在5′RACE中也同樣。因此，通過由使用上述E2/uni/f/298得到的韭蔥3′RACE產物的鹼基序列設計引物E2/r/580-Le(序列28)，用作5′RACE法的反義引物，初次實現對該cDNA的5′側區域進行擴增成為可能。
另外，通過使用上述3′側區域的引物E2/uni/f/298，能夠確定韭蔥催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列這一點是新的認識。
本發明催淚成分合成酶基因是編碼表現出將1-丙烯次磺酸轉變為催淚成分的作用的蛋白質或多肽的DNA。
作為具有催化使催淚成分前體物質PeCSO轉變為催淚成分的反應的性能的蛋白質，如有蒜氨酸酶和催淚成分合成酶。這些酶存在於由於切斷等物理損傷而生成催淚成分的蔥屬植物洋蔥、大蔥、野薤、韭蔥、亞實基隆蔥(échalot)、大頭蒜、細香蔥等植物中。作為催淚成分合成酶基因如序列1的來自大蔥的DNA、序列5的來自野薤的DNA、序列7的來自亞實基隆蔥的DNA、序列9、13的來自韭蔥的DNA、序列11的來自洋蔥的DNA、序列15的來自大頭蒜的DNA，但不限定於這些。也可以是在上述各個鹼基序列中付加、缺失、或置換1或多個鹼基後的DNA。例如，即使是編碼在對應於上述各個DNA的序列2、6、8、10、12、14以及16所示的胺基酸序列中付加、缺失、或置換1或多個胺基酸後表現出使1-丙烯次磺酸轉變為催淚成分作用的蛋白質或多肽的DNA也可以。
一般都知道在胺基酸序列中，對其功能沒有影響的差別可以存在於株間或近緣種間等，在這些序列間，可觀察到90％以上、或95％以上的胺基酸是一致的。該值通常相當於每100個胺基酸個有10個以下或5個以下胺基酸變異(付加、缺失、置換)。
另外，在本發明的催淚成分純化酶蛋白質中，確定了蔥屬數種植物的催淚成分純化酶基因的序列，由其推定胺基酸序列結果表明即使每100個胺基酸中存在相當於35個的變異，也具有催淚成分純化酶活性，可以容許到胺基酸序列的35％變異。
另外，催淚成分合成酶基因是可與例如上述序列1、5、7、9、13或15所示鹼基序列構成的DNA在嚴格條件下進行雜交的DNA。而上述可進行雜交的DNA中既包括與各序列所示鹼基序列的DNA雜交的DNA，也包括與其互補的DNA。換言之，是由與上述序列1、5、7、9、13或15所示鹼基序列的同源性在60％以上、更好的是在70％以上、最好是在75％以上的鹼基序列構成的DNA。
(鹼基序列的雜交條件)本發明中所謂「嚴格條件」是指序列1、5、7、9、13、15所示的鹼基序列或其一部分與DNA進行特異性雜交，而且不會形成·檢測到非特異性的雜化體形成的條件。明確將嚴格條件數值化是困難的，如果舉一例的話，在使用42℃、30％(v/v)去離子化甲醯胺、0.6M的NaCl、0.04M的NaH2PO4、2.5mM的EDTA、7％的SDS組成的雜交緩衝液的雜交條件下形成雜化體，即使進一步用2×SSC、0.1％的SDS清洗也能維持雜化體的條件。有關核酸的雜交可以參考《分子克隆實驗手冊》Molecular CloningA laboratory manual(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York，USA等。
(鹼基序列的同源性)鹼基序列的同源性象以下那樣進行判定。在對序列間的鹼基的同源性進行判定的前段階進行鹼基序列的比對使用日本DNA資料庫的Internet解析服務的CLUSTAL W 1.81 DDBJ擴展版(算法源於Gene 73，(1988)237-244。CLUSTAL W by DDBJ)(http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology.html)。解析參數直接預設進行(gapdist8、maxdiv40、gapopen15、gapext6.66)。使用得到的比對結果，通過計算ORF內一致的鹼基數的對ORF總鹼基數(除去由於比對產生的gap區域)的百分率，算出ORF內鹼基的同源性。


圖1給出了有關序列1、3、5、7、9、11、13以及15所示的鹼基序列間的鹼基序列同源性。其結果表明，鹼基序列的同源性在序列15(大頭蒜)和序列13(韭蔥)間最低，為78.5％。這樣一來，催淚成分合成酶基因的鹼基序列相互間鹼基同源性高，形成一個家族。而序列3的DNA與序列1的DNA之間表現出99.8％的高同源性，是來自大蔥的DNA。另外關於序列1、3、5、7、9、11、13以及15所示的任一個催淚成分合成酶基因的鹼基序列利用來自BLAST檢索(算法，J.Mol.Biol.Vol.215，(1990)pp.403-410。直接使用解析參數預設設定(Expect10、Word size11、Low complexity filterON))，對登錄GenBank的基因序列進行同源性檢索，在上述催淚成分合成酶基因以外沒有找到表現出高同源性的基因序列(對擬南芥或果蠅、人的基因序列數據的一部分有4％左右的鹼基同源性)。由此可知催淚成分合成酶基因的鹼基序列是與至今為止報導的所有的基因序列沒有親緣關係的完全不同的序列。
而具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽是含有與例如序列2、6、8、10、14或16所示胺基酸序列的同源性為65％以上的胺基酸序列的蛋白質或多肽。
(胺基酸序列的同源性)胺基酸序列的同源性象以下那樣進行判定。在對序列間的胺基酸的同源性進行判定的前段階進行的胺基酸序列的比對使用日本DNA資料庫(DNA data bank of Japan，DDBJ)的Internet解析服務的CLUSTAL W 1.81 DDBJ擴展版(算法源於Gene 73，(1988)237-244。CLUSTAL W by DDBJ)(http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology.html)。解析參數直接預設進行(gapdist8、maxdiv40、gapopen10、gapext0.2)。使用得到的比對結果，通過計算一致的胺基酸數對總胺基酸數(除去由於比對產生的gap區域)的百分率，算出胺基酸的同源性。
圖2給出了有關序列2、4、6、8、10、12、14以及16所示各個推定胺基酸序列間的各個推定胺基酸序列間的同源性。其結果表明，推定胺基酸序列的同源性，序列16(大頭蒜)和序列10(韭蔥)間最低，為65.9％。這樣一來，催淚成分合成酶蛋白質等胺基酸序列相互間同源性高，形成一個家族。而序列4的胺基酸序列是對應於上述序列3的來自大蔥DNA的胺基酸序列。
另外，有關序列2、4、6、8、10、12、14以及16所示的任一個催淚成分合成酶基因的推定胺基酸序列來自BLAST檢索(算法源於J.Mol.Biol.Vol.215，(1990)pp.403-410。直接使用解析參數預設設定(Expect10、Word size3、Low complexity filterON))，對登錄在GenBank的胺基酸序列進行同源性檢索，除了催淚成分合成酶基因的推定胺基酸序列之間以外，即使是表現出最高同源性的胺基酸序列同源性也是35％以下的同源性(擬南芥和水稻(イネ)的功能不明基因的推定胺基酸序列)。由此可知催淚成分合成酶基因的推定胺基酸序列是與到目前為止報導的所有胺基酸序列沒有高的親緣關係、差異很大的序列。
通常在編碼具有特定功能或生理活性的蛋白質或多肽的胺基酸序列中，即使是付加、缺失、或置換1個或多個胺基酸，有時也能維持其功能或生理活性的現象，本領域技術人員都廣泛認識到。本發明也包括編碼加上這樣的修飾、而且具有催淚成分合成酶活性的蛋白質的DNA片段。
圖3A～3C給出了上述序列1、3、5、7、9、11、13以及15的鹼基序列的比對數據，圖4A、4B給出了序列2、4、6、8、10、12、14以及16的胺基酸序列的比對數據。圖3A～3C表示從ORF的5′末端開始的約50個鹼基的區域存在著鹼基保守性低的傾向。特別是在韭蔥中，其中的15個鹼基缺失了。另外，人們也知道在洋蔥中存在著翻譯成胺基酸後，來自該區域的肽被除去了的同功酶。而在該區域以外，對於催淚成分合成酶基因的cDNA找不到保守性特別低的區域。
本發明的催淚成分合成酶基因作為使例如控制催淚成分的生成的方法，以這些基因作為指標，對供交配的植物進行選拔的方法，製作降低催淚成分合成酶活性的植物和增大生理活性物質的植物品種的方法，通過基因重組技術大量生產催淚成分合成酶的方法等實現的基因是有用的。
在本發明中，通過RT-PCR由催淚成分合成酶基因的mRNA合成cDNA，確定其有義鏈的序列。反義鏈的序列從根本意義上講是由有義鏈的序列確定的。因此，本發明的DNA包括有義鏈以及反義鏈兩方的序列。即，包括上述具有序列1、3、5、7、9、13以及5的鹼基序列的反義鏈序列的DNA或其片段。
作為本發明的催淚成分合成酶基因的應用例子，如以下給出的例子。
(1)催淚成分合成酶的生產將本發明的催淚成分合成酶基因整合到適當的表達載體，可以製作重組載體。
使用的載體可以在宿主細胞內自我複製，只要是具有可以整合上述DNA、即催淚成分合成酶基因的插入部位，以及可以使該整合DNA在宿主細胞內表達的區域的載體，其種類沒有特別限制。作為表達載體可以使用在穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)基因的序列下遊具有多克隆位點的pGEX-4T-3(Amersham Bioscience公司生產)等。
另外為了促進在整合的生物種中的表達，有時配合整合生物種，改變密碼子，不用說，這些密碼子被改變的DNA也包括在本發明的範圍內。以這樣的胺基酸序列為基礎的基因合成例如可以通過利用DNA自動合成儀，合成的寡核苷酸退火後進行連接等方法適當實施。
另外，就象國際公開第02/20808號公報也闡明的那樣，催淚成分合成酶蛋白質即使付加、缺失1或多個一部分胺基酸，也有可能獲得同樣酶的性質。另外，即使置換一部分胺基酸殘基，結果也有可能獲得同樣酶的性質。這樣的基因改変可以通過使用市售基因部位特異的變異導入試劑盒，或插入合成基因等方法很容易實現。事實上，大蔥、野薤、亞實基隆蔥、韭蔥、大頭蒜中，已經證明即使相互間有一部分胺基酸不同，也可獲得催淚成分合成酶活性。因此，作為整合到載體的催淚成分合成酶基因只要維持同樣酶的性質，即使是其變異體也可以。然後將上述重組表達載體導入宿主細胞，得到轉化體。重組表達載體向宿主細胞的導入可以通過慣用的方法進行。作為這樣的方法，例如感受態細胞法、原生質體法、磷酸鈣共沉澱法、電穿孔法、微注射法、微脂粒融合法等各種方法，可以根據相應的宿主採用任意方法。作為產生本發明催淚成分合成酶的宿主，如大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、麴黴菌等微生物、蠶培養細胞等細胞比較合適。
通過培養象上述那樣得到的轉化體，可以使催淚成分合成酶生產在培養物中。然後利用眾所周知的方法對其進行分離，純化，可以穩定獲得催淚成分合成酶。
(2)抑制基因表達的手段(具有抑制催淚成分合成酶蛋白質或多肽的mRNA翻譯功能的核酸分子)催淚成分合成酶在生成催淚成分上作為必需因子通過本發明人的研究已證實(特開平10-295373號公報)。因此，如果抑制該酶的作用，當然就不生成催淚成分了。
以抑制催淚成分生成為目的的各種研究迄今一直在進行，這些研究為了減少蒜氨酸酶底物S-1-丙烯基-半胱氨酸亞碸(PeCSO)的蓄積量，在將含有硫成分的肥料減少等栽培方法上動了腦筋，雖然可以通過將蒜氨酸酶鈍化達到了目的，但還不是維持品質上的解決對策。
因此，在製作品質高、抑制催淚性的蔥屬植物上，抑制由編碼催淚成分合成酶基因的轉錄到翻譯的方法是非常有用的，這在酶的基因序列闡明後方可開始實施。
對於抑制催淚成分合成酶基因表達的方法可以使用本領域技術人員都知道的各種方法。其中基因表達的抑制包括基因轉錄的抑制、向蛋白質的翻譯的抑制。要有效抑制基因的表達，對蔥屬植物的內在的催淚成分合成酶的mRNA翻譯進行抑制是有效果的。
作為針對上述那樣目標的技術，如熟知的通過導入基因與內源性催淚成分合成酶mRNA的全長或一部分雜交，使雙鏈RNA形成，使得以下的翻譯不發生的反義鏈法；以及通過導入基因預先使酶全序列、或其一部分序列生成雙鏈RNA，使得內源性催淚成分合成酶mRNA被分解的現象發生的RNAi法。另外，通過導入基因使得催淚成分合成酶有義鏈或類似序列的全長或其一部分過量表達，利用與該基因存在同源性的基因可抑制表達的共抑制方法也有效。
即，只要是通過這些機制等使內源性mRNA的功能喪失的核酸分子，不管其長度，以及單鏈還是雙鏈、有無與催淚成分合成酶基因的雜交都沒關係，全部有效。而核酸分子的長度在18個核苷酸以上是合適的，最好是在22個核苷酸以上。反過來說，這樣的核酸分子之所以可以設計或實施是由於催淚成分合成酶的基因序列已闡明，考慮到可以將該序列作為基礎的緣故。
本發明中使用的有義、反義核苷酸的序列最好是與進行轉化的植物帶有的內源性基因(或其相同基因)或與其一部分互補的序列，只要是能有效抑制基因表達的，即使完全不互補的也可以。例如，優選由含有從本發明DNA序列中選出來的一個以上的DNA轉錄的RNA，或者是與由催淚成分合成酶基因、其上遊的調節序列、以及其間的DNA序列轉錄的RNA進行雜交的序列。而該RNA無論是單鏈還是雙鏈都可以。
(核酸分子抑制內源性mRNA翻譯的效果的鑑定)某種核酸分子是否抑制內源性的催淚成分合成酶的mRNA翻譯，有效的方法是對導入基因使該核酸分子翻譯為RNA的植物組織的催淚成分合成酶活性或該酶蛋白質量進行測定，直接確認效果。如果催淚成分合成酶活性降低，或該酶蛋白質量降低，通過導入的核酸分子，出現內源性mRNA的翻譯被抑制的現象，由此可以判定導入的核酸分子的有效性。
例如，催淚成分合成酶活性可以通過向不含有從蒜提取的該酶的蒜氨酸酶和蒜氨酸酶的底物PeCSO的反應體系中加入測定對象的植物組織提取物，對產生的催淚成分(LF)用HPLC等測定。更具體講，轉化的植物是否存在催淚成分合成酶活性，可以根據下面實施例所述的國際專利申請PCT/JP01/07465記載的方法進行確認。
另外，催淚成分合成酶蛋白質量減少的判定可以使用以該酶作為抗原做成的該酶的抗體的蛋白質印跡(Western Blotting)法。即，可以是將從測定對象的植物組織提取的級分經SDS-PAGE(SDS-聚丙烯醯胺電泳法)分級後、印跡於PVDF膜上，用催淚成分合成酶抗體有選擇地進行檢測的通常進行的蛋白質印跡(Western Blotting)法。催淚成分合成酶的標準蛋白質可以使用從各種蔥屬植物提取、純化的蛋白質，也可以使用以酶的DNA序列為基礎，在大腸桿菌等表達獲得的重組催淚成分合成酶。酶活性的測定以及催淚成分合成酶的蛋白質量的測定方法不限於這裡給出的一般的方法，可以使用任一種方法。
(2-1)利用反義鏈RNA不生成催淚成分的植物的生產將本發明的具有催淚成分合成酶基因的反向互補鏈序列的DNA導入蔥屬植物，使反義鏈RNA在植物內表達，可以抑制催淚成分合成酶基因的表達。反義鏈RNA由於帶有對來自催淚成分合成酶基因的mRNA互補的鹼基序列，通過與該mRNA形成鹼基對，抑制作為最終產物的催淚成分合成酶蛋白質的合成。在本發明中可以使用的反義鏈RNA是可以與可翻譯成催淚成分合成酶的mRNA進行特異雜交的寡核苷酸。
另外，以除去上述鹼基序列的比對數據中保守性低的區域的部分鹼基序列為基礎可以設計反義鏈RNA序列。催淚成分合成酶基因在保守性低的區域以外由於在所有蔥屬植物中鹼基序列被保存的傾向強，所以也可以進行使由大蔥催淚成分合成酶基因序列的反向互補鏈設計的反義鏈RNA在洋蔥內表達的所謂不同植物間的轉用。
反義鏈RNA靶部位由於基因不同而各種各樣，不存在所說的哪一個部位都可以的共有序列。然而，一般來說，ATG起始位點等可以作為靶部位的候補。另外，最近，由於有數種用於設計靶部位和反義鏈RNA的計算機解析軟體(HYB simulator等)正在銷售，利用這些軟體，也可以設計反義鏈RNA。而反義鏈RNA的長度最好在18～23mer以上、GC含量最好在50％以上。
另外，除了上述反義鏈RNA法之外，也可以使用整合有義鏈的方法以及RNAi(RNA幹擾，RNA interferense)法。上述有義、反義核苷酸的序列最好是與進行轉化的植物帶有的內源性基因(或其相同基因)或其一部分互補的序列，只要是有效抑制基因表達，即使完全不互補的也可以。
作為使上述反義鏈RNA在植物內發揮功能的方法，例如將cDNA反向整合到在真核生物表達的啟動子的下遊後，導入宿主細胞使反義鏈RNA合成的方法。
作為導入外來基因的方法可以使用利用土壤桿菌的轉化方法，以及通過直接導入的轉化法。
而在象上述那樣抑制了催淚成分合成酶基因表達的植物中，由於1-丙烯次磺酸沒有轉變為催淚成分，所以硫代亞磺酸鹽的生成量增大。洋蔥的主要氣味成分硫代亞磺酸酯被確認在體內具有抗哮喘作用，而在體外，也是環氧合酶(cyclooxygenase)和5-脂氧酶(5-lipooxygenase)的抑制劑(Wagner，H.，Dorsch，W.，Bayer，T.，Breu，W.和Willer，F.，Antiasthmatic effects of onionsinhibition of5-lipoxygenase and cyclooxygenase in vitro by thiosulfinates and″Cepaenes″.Prost.Leuk.Essential Fatty Acids 39，59-62(1990))。另外有報導說硫代亞磺酸鹽可以轉變為二硫化物(disulfides)、三硫化物(trisulfides)，這些化合物都具有使血液中脂質降低(Adamu，I.，Joseph，P.K.和Augusti，K.T.，Hypolipidemic action of onion andgarlic unsaturated oils in sucrose fed rats over a two-month period.Experientia 38，899-901(1982))、抑制血小板凝集作用(Ariga，T.，Oshiba，S.和Tamada，T.，Platelet aggregation inhibitor in garlic.Lancet 1，150-151(1981)以及Makheja，A.N.和Bailey，J.M.，Antiplatelet constituents of garlic and onion.Agents Actions 29，360-363(1990))。因此，製作上述硫代亞磺酸鹽乃至其反應物生成量增大的轉化植物也是有可能的。
(3)催淚成分合成酶蛋白質的大量生產作為整合cDNA的質粒如來自大腸桿菌的pBR322(Gene，2，95(1977))、pBR325(Gene，4，121(1978)、來自枯草桿菌的pUB110(Biochemical and Biophysical Research Communication)，112，678(1983))等，其它的只要是可保持在宿主內複製的質粒無論哪一種都可以使用。作為整合到質粒的方法，通常都是製備載體與插入片段的摩爾比為1∶1至1∶10的混合液，用T4連接酶進行處理的方法(細胞工學別冊、生物實驗提示(バイオ実験イラストレイテツド)(2)基因解析基礎、p78、秀潤社)。這樣獲得的質粒導入到適當的宿主、例如埃希氏(Escherichia)屬菌、芽孢桿菌(Bacillus)屬菌等。
作為上述埃希氏(Escherichia)屬菌的例子，如大腸桿菌(大腸埃希氏菌，Escherichia coli)(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.60，160(1968))等。作為上述芽孢桿菌屬菌如枯草桿菌(枯草芽孢桿菌，Bacillus subtilis)MI114(Gene，24，255(1983))等。作為轉化方法如氯化鈣法(Biochemical and Biophysical ResearchCommunication，49，1568(1972))等。從這樣得到的轉化體中使用眾所周知的方法、例如菌落雜交法(Gene，10，63(1980))以及DNA鹼基序列確定法(Proc.Natl.Acad.Sci.74，560(1977))等選出需要的菌落。這樣操作後，可以得到克隆的保持含有編碼催淚成分合成酶鹼基序列的DNA的載體的微生物。
然後從該微生物分離質粒。作為分離法如鹼法(Nucleic AcidsResearch，1513(1979))等。上述克隆的含有編碼催淚成分合成酶的鹼基序列的質粒可以直接利用或根據要求用限制性內切酶切出。被克隆的基因連接在適於表達的載體中啟動子的下遊後可以得到表達型載體。
作為載體如來自大腸桿菌的質粒(例如pBR322)、來自枯草桿菌的質粒(例如pUB110)、來自酵母的質粒(例如pSH19)或λ噬菌體等噬菌體以及逆轉錄病毒、牛痘病毒等動物病毒等。該基因可以在其5′末端含有翻譯起始密碼子ATG，而在3′末端含有翻譯終止密碼子TAA、TGA、或TAG。另外使該基因的5′末端結合在編碼已知蛋白質的基因的3′末端，作為融合蛋白質表達時，不是必須要翻譯起始密碼子。另外為了使該基因表達，在其上流連接啟動子。作為本發明使用的啟動子只要是適合於基因表達，對應於宿主的啟動子可以使用任一種。另外轉化時的宿主為埃希氏菌屬菌時，最好是trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子等，當宿主為芽孢桿菌屬菌時，最好是SPO1啟動子、SPO2啟動子、penP啟動子等，宿主為酵母時最好是PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子等。特別是當宿主埃希氏菌屬菌時，啟動子最好是lac啟動子。在宿主為動物細胞時是來自SV40的啟動子、逆轉錄病毒的啟動子等，特別是來自SV40的啟動子最好。
用含有這樣構建的DNA的載體製造轉化體。作為宿主如埃希氏菌屬菌、芽孢桿菌屬菌、酵母、動物細胞等。作為述埃希氏菌屬菌、芽孢桿菌屬菌的具體例子如與上述同樣的菌。作為上述酵母如釀酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)AH22R等。作為動物細胞如猴細胞COS-7、Vero、中國倉鼠細胞CHO等。經這樣操作，可以得到用含有DNA的載體轉化的轉化體。
作為一個例子，對宿主為埃希氏菌屬菌、芽孢桿菌屬菌的轉化體進行培養時，培養使用的培養基，液體培養基合適，其中可以含有該轉化體生育所必需的碳源、氮源、無機物等。
作為培養埃希氏菌屬菌時的培養基，例如LB培養基或SOC培養基(細胞工學別冊 生物指南(バイオイラストレイテツド)1.分子生物學實驗的基礎、P98-99、秀潤社)最好。其中，根據需要為了使啟動子有效地發揮作用，可以加入例如異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)那樣的試劑。宿主為埃希氏菌屬菌時，培養通常於15～43℃下進行3～24小時，根據需要，也可以加上通氣或攪拌。宿主為芽孢桿菌屬菌時，培養通常在約30～40℃下進行約6～24小時，根據需要，也可以加上通氣或攪拌。對宿主為酵母的轉化體進行培養時，作為培養基如バ一クホルダ一最小培養基(Proc.Natl.Acad.Sci..77，4505(1980))。培養基的pH最好調整到約5～8。培養通常於20℃～35℃下進行約24～72小時，根據需要，也可以加上通氣或攪拌。對宿主為動物細胞的轉化體進行培養時，作為培養基如含有約5～20％的胎牛血清的MEN培養基(Science 122，501(1952)DMEM培養基(Virology，8，396(1959))等。pH最好是約6～8。培養通常於約30℃至40℃下進行約15小時至60小時，根據需要，可以提高二氧化碳濃度。
從上述培養物分離純化催淚成分合成酶蛋白可以通過例如下面的方法進行。當從培養菌體或細胞提取催淚成分合成酶蛋白時，可以適當採用培養後、通過眾所周知的方法收集菌體或細胞，然後懸浮於含有鹽酸胍等蛋白變性劑的緩衝液中，通過超聲波、溶菌酶以及(或凍融)破碎菌體或細胞後，通過離心分離，得到催淚成分合成酶蛋白的方法等。要從上述上清液純化催淚成分合成酶蛋白，可以將眾所周知的分離、純化方法適當組合進行純化。作為這些眾所周知的分離、純化方法例如利用鹽析或溶劑沉澱法等利用溶解性的方法、透析法、凝膠過濾法等利用分子量的差別的方法、離子交換層析等利用電荷差別的方法、親和層析等利用特異親和性的方法、反相高效液相層析等利用疏水性的差別的方法等。
如上所述，本發明的催淚成分合成酶基因可以作為在篩選、酶或蛋白質的生產、轉化植物的生產等中的基因工程的工具廣泛運用。這樣的場合下，本發明的催淚成分合成酶基因在蔥屬植物相互之間，鹼基序列類似性高。因此，例如來自大蔥的DNA不能說只能應用於與大蔥有關係的技術中，可以將基因在植物間相互轉用。
附圖的簡要說明圖1表示序列1、3、5、7、9、11、13以及15所示的各個鹼基序列間的鹼基序列同源性。
圖2表示序列2、4、6、8、10、12、14以及16所示的各個推定胺基酸序列間的推定胺基酸序列同源性。
圖3A表示序列1、3、5、7、9、11、13以及15的鹼基序列的比對數據。
圖3B表示序列1、3、5、7、9、11、13以及15的鹼基序列的比對數據(圖3A的續)。
圖3C表示序列1、3、5、7、9、11、13以及15的鹼基序列的比對數據(圖3B的續)。
圖4A表示序列2、4、6、8、10、12、14以及16的胺基酸序列的比對數據。
圖4B表示序列2、4、6、8、10、12、14以及16的胺基酸序列的比對數據。(圖4A的續)。
圖5表示就E2/uni/f/298區域和其前後10鹼基的區域，給出了對應於通用引物E2/uni/f/298序列的序列一覽。
圖6表示E2-AF、E3-AC以及E2-AA的cDNA製作以及亞克隆的步驟。
圖7表示表達質粒的構建和轉化體的製作步驟。
具體實施例方式
實施例1(來自大蔥的催淚成分合成酶基因)(1)總RNA的提取用液氮將新鮮的大蔥(A.fistulosum L.)瞬間冷凍後，用木槌敲碎。將敲碎的冷凍材料放入到經乾熱滅菌的乳缽中，用乳棒研磨成粉狀。將100mg的成為粉狀的冷凍材料按照RNeasy Plant Mini試劑盒(QIAGEN Cat.no.74903)的程序進行處理，得到總RNA。
得到的總RNA的產量是13μg。
(2)cDNA的合成以得到的總RNA為材料，使用Ready-To-Go T-PrimedFirst-Strand試劑盒(Amercham Biosciences code no.27-9263-01)，按照試劑盒附帶的程序，以5′末端銜接序列附帶的寡(dT)(序列30)作為引物進行逆轉錄，合成1st strand cDNA。
(3)利用3′RACE法進行該cDNA的3′側區域的擴增為了解析目的基因(cDNA)3′區域的鹼基序列，以表1的組成進行3′RACE實驗。通過(2)得到的1st strand cDNA具有在5′末端帶有銜接序列的構造。因此，為了要通過PCR由1st strand cDNA只使目的cDNA擴增，使用由洋蔥催淚成分合成酶基因(序列11)的3′側區域的序列設計的ACE02f引物和與銜接序列互補的NotI引物進行PCR。
有義鏈(ACE02f)5′-TGG AGG GTC CTG AGC ACA AG-3′(序列17)反義鏈(NotI)5′-TGG AAG AAT TCG CGG CCG CAG-3′(序列18)
表1

PCR條件如下。
①94℃、9分→②94℃、1分→③54℃、1分→④72℃、1分→⑤72℃、5分→⑥4℃、保持反覆進行②～④45次。
PCR後的反應液進行2％瓊脂糖凝膠電泳(溴化乙錠檢測)，判定有無目的大小的PCR產物。
(4)通過5′RACE法進行該cDNA的5』側區域的擴增為了解析目的基因(cDNA)的5』區域的鹼基序列，用表2的組成進行5′RACE實驗。5』RACE實驗是用5』RACE System forAmplification of cDNA Ends，Version 2.0(InVirtogen life technologiesCat.no.18374-058)實施。
對(2)得到的1st strand cDNA進行RNaseH處理，變成單鏈cDNA後，在其3′末端使用末端轉脫氧核苷轉移酶(以下TdT)付加核苷酸均聚物(dC的聚合物)。以付加了PolyC的cDNA為模板，使用在3′末端帶有與PolyC序列互補序列的銜接引物(AAP)和由洋蔥催淚成分合成酶基因的5′側區域的序列設計的引物(ACE02r)進行PCR，由5′末端付加了dC的聚合物的1st strand cDNA只擴增目的cDNA。
有義鏈(AAP)5′-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGIIGG GII GGG IIG-3′(序列19)反義鏈(ACE02r)5′-CTC TTC GAT TTT CTG ACC TAT CTCAGT AGC-3′(序列20)表2

PCR條件如下。
①95℃、10分→②94℃、1分→③55℃、1分→④72℃、1分→⑤72℃、7分→⑥4℃、保持反覆進行②～④步驟40次。
PCR後的反應液進行2％瓊脂糖凝膠電泳(溴乙錠檢測)，判定有無目的大小的PCR產物。
(5)通過3′RACE法、5′RACE法得到擴增產物的鹼基序列解析和全長序列的確定以及胺基酸序列的推定對得到的3′RACE產物、5′RACE產物直接測序，進行鹼基序列解析。對3′RACE產物的鹼基序列和5′RACE產物的鹼基序列進行組合，確定樣品中催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列(如序列1所示)。由cDNA全長序列確定開放讀框(ORF)，推定對應於各個密碼子的胺基酸序列(如序列2所示)。
(6)通過ORF區域的PCR擴增和其產物的TA克隆確定大蔥催淚成分合成酶基因的鹼基序列由上述(5)的鹼基序列解析結果推測到序列1所示的cDNA的第244位的腺嘌呤(A)變為鳥嘌呤(G)的cDNA的存在(通過腺嘌呤(A)為高峰、而鳥嘌呤(G)低峰可以檢測)。
根據ORF序列的推定，做成從其起始密碼子(ATG)開始的正向引物E2-AF-F(ATGGAGCTAAATCCTGGTGCGC(序列21))。
使用做成的引物E2-AF-F和NotI引物，以大蔥cDNA為模板進行PCR，將得到的擴增產物插入到pGEM-T Easy Vector(Promegu公司生產)後、導入大腸桿菌(XL1-Blue MRF′)，對鹼基序列進行解析。結果確認了序列1的第244位變成了鳥嘌呤(G)的cDNA的存在。序列3給出了確定的序列。由序列推定了對應於各個密碼子的胺基酸序列(如序列4所示)。
實施例2(來自野薤的催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列)以新鮮的野薤(A.chinense L.)作為提取材料。總RNA的提取方法以及cDNA的合成、利用3′RACE法進行的該cDNA 3′側區域的擴增、利用5′RACE法進行的該cDNA 5′側區域的擴增、鹼基序列的解析和胺基酸序列的推定用與實施例1同樣的方法進行。序列5給出了解析的來自野薤的催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列，序列6給出了對應於其密碼子的胺基酸序列。
實施例3(來自亞實基隆蔥的催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列)以新鮮的亞實基隆蔥(A.cepa L.)為提取材料。總RNA的提取方法以及cDNA的合成、利用5′RACE法進行的該cDNA 5′側區域的擴增、鹼基序列的解析和胺基酸序列的推定用與實施例1相同的方法進行。
但是，在利用3′RACE法進行的該cDNA 3′側區域的擴增中，利用nested PCR法進行2次PCR。在第1次PCR中，將實施例1的有義引物由ACE02f變為E2-1-N(GGIGCI(A/C)GIAA(A/G)TGG(序列23))，PCR條件③的54℃、1分鐘也變為43℃、1分。以這樣獲得的擴增產物作為模板進行第2次PCR，這第2次的PCR條件和使用的引物與實施例1給出的利用3′RACE法進行該cDNA的3′側區域的擴增用的一樣。
序列7給出了解析的來自亞實基隆蔥的催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列，序列8給出了對應於其密碼子的胺基酸序列。
實施例4(來自韭蔥的催淚成分合成酶基因的cDNA序列)將新鮮的韭蔥(A.ampeloprasum L.)作為提取材料。總RNA的提取方法以及cDNA的合成、鹼基序列的解析和胺基酸序列確定用與實施例1相同的方法進行。
但是在利用3′RACE法對該cDNA 3′側區域的擴增中，不但通過實施例1的有義引物ACE02f，而且僅以洋蔥催淚成分合成酶基因的序列為基礎設計的其它有義引物也不能獲得擴增產物。因此，找到洋蔥、野薤、大蔥3種催淚成分合成酶基因中序列保守的區域(圖5)，通過在有義引物使用由該序列設計的E2/uni/f/298(GAATTTTGGGCCAAGGAGAAGCTGG(序列25))，才初次擴增該cDNA的3′側區域。
用由洋蔥序列設計的引物不能得到的擴增產物的結果在5′RACE中也同樣得不到。因此，通過由作為有義引物使用E2/uni/f/298得到的韭蔥3′RACE產物的鹼基序列設計E2/r/580-Le(CACACAGCATCACA AATTGAC(序列28))，用作5′RACE法的反義引物，才初次擴增該cDNA的5′側區域。
得到的3′RACE產物、5′RACE產物通過直接測序進行鹼基序列解析。將3′RACE產物的鹼基序列和5′RACE產物的鹼基序列匯總，推定出韭蔥催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列。然而，由鹼基序列解析結果判定韭蔥中存在鹼基序列不同的多個催淚成分合成酶基因cDNA，但韭蔥的cDNA序列只通過RACE法還不能確定。
因此，做成從最靠近由RACE結果推定的cDNA全長序列的5′末端ATG開始的正向引物E2-AP-F2(ATGGCGCAAAATCCTGGTGTGC(序列29))。
使用做成的引物E2-AP-F2和NotI引物，以韭蔥cDNA為模板進行PCR，將得到的擴增產物插pGEM-T Easy Vector後、導入大腸桿菌(XL1-Blue MRF′)中，對鹼基序列進行解析。結果確定了2種cDNA序列。序列9、13給出了確定的韭蔥的2種序列。就各個序列推定出對應於各個密碼子的胺基酸序列(如序列10、14所示)。
實施例5(來自大頭蒜的催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列)以新鮮的大頭蒜(A.ampeloprasum L.)為提取材料。總RNA的提取方法以及cDNA的合成、鹼基序列的解析和胺基酸序列的推定用與實施例1相同的方法進行。
但是，利用3′RACE法進行該cDNA3′側區域的擴增中，將實施例1的有義引物由ACE02f變為由其它蔥屬植物(洋蔥、野薤、大蔥)的催淚成分合成酶基因的3′側區域找到的所有植物共通的序列設計的E2/uni/f/298(GAATTTTGGGCCAAGGAGAAGCTGG(序列25))。
另外，在利用5′RACE法進行的該cDNA的5′側區域的擴增中，將實施例1的反義引物由ACE02f變為由洋蔥的鹼基序列設計的引物(E2-1-5R-1)(TCCTCGTACCCTGTAAAACACTCAG(序列26))。
序列15給出了解析的來自大頭蒜的催淚成分合成酶基因的cDNA全長序列，序列16給出了對應於其密碼子的胺基酸序列。
實施例6(蛋白質的製造方法)(1)表達質粒的構建(野薤、亞實基隆蔥、大頭蒜)使用由序列5、7以及15所示的催淚成分合成酶的基因序列的開放讀框5′末端設計的正向引物和與附在寡dT引物的錨部分互補的反向引物，以來自各個蔥屬植物的cDNA為模板，進行PCR反應，得到約700bp的產物。作為蔥屬植物使用野薤、亞實基隆蔥、大頭蒜，作為正向引物，對於野薤使用E2-AC-F(ATGGAGCAAAATTCTGGTACGC(序列22))，對於亞實基隆蔥使用E2-AA-F(ATGGAGCTAAATCCTGGTGCAC(序列24))、對於大頭蒜使用E2-APEG-F(ATGATGACATATCCTGGAAATCG(序列27))，對於反向引物，所有場合下都使用與附著在寡dT引物的錨部分互補的引物。
將得到的產物按照先前敘述的鹼基序列確定方法亞克隆到pGEM-T Easy Vector後，導入大腸桿菌(XL1-Blue)，解析鹼基序列。圖6給出了亞克隆的步驟。
從帶有整合產物的pGEM-T-Easy Vector的大腸桿菌中得到了具有序列5、7、15所示的編碼各多肽的鹼基序列的大腸桿菌(XL-1 BlueMRF′/pGEM-T-E2-AC(野薤)、XL-1 Blue MRF′/pGEM-T-E2-AA(亞實基隆蔥)、XL-1 Blue MRF′/pGEM-T-E2-APEG(大頭蒜))。
(大蔥、韭蔥)對於大蔥、韭蔥使用實施例1、4製作的序列3、9、13所示具有編碼各多肽的鹼基序列的大腸桿菌(XL-1 Blue MRF′/pGEM-T-E2-AF(大蔥)、XL-1 Blue MRF′/pGEM-T-E2-LK29A(韭蔥29A)、XL-1 Blue MRF′/pGEM-T-E2-LK58E(韭蔥58E))。
作為蛋白質的表達用載體使用在穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)基因序列的下遊帶有蛋白酶識別部位和多克隆位點的pGEX-4T(Amersham Pharmacia生產)(圖7)。
將pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生產)和NotI(Takara公司生產)切斷得到的大片段和上述pGEM-T-E2-AF(大蔥)用EcoRI和NotI切斷得到的約700bp片段連接，構建了表達質粒pGEX-4T-E2-AF(大蔥)。
將pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生產)和NotI(Takara公司生產)切斷得到的大片段和上述pGEM-T-E2-AC(野薤)用EcoRI和NotI切斷得到的約700bp的片段連接，構建表達質粒pGEX-4T-E2-AC(野薤)。
將pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生產)和NotI(Takara公司生產)切斷後得到的大片段和上述pGEM-T-E2-AA(亞實基隆蔥)用EcoRI和NotI切斷得到約700bp的片段連接，構建表達質粒pGEX-4T-E2-AA(亞實基隆蔥)。
將pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生產)和NotI(Takara公司生產)切斷得到的大片段和上述pGEM-T-E2-APEG(大頭蒜)用EcoRI和NotI切斷得到的約700bp片段連接，構建表達質粒pGEX-4T-E2-APEG(大頭蒜)。
將pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生產)和NotI(Takara公司生產)切斷後得到的大片段和上述pGEM-T-E2-LK29A(韭蔥序列9)用EcoRI和NotI切斷得到的約700bp片段連接，構建表達質粒pGEX-4T-E2-LK29A(韭蔥序列9)。
將pGEX-4T用EcoRI(Takara公司生產)和NotI(Takara公司生產)切斷得到的大片段和上述pGEM-T-E2-LK58EA(韭蔥序列13)用EcoRI和NotI切斷得到的約700bp片段連接，構建表達質粒pGEX-4T-E2-LK58E(韭蔥序列13)。
(2)使用表達質粒的大腸桿菌轉化體製作和培養利用感受態細胞法將上述的pGEX-4T-E2-AF(大蔥)導入大腸桿菌BL21-Gold(STRATAGENE公司生產)，得到轉化體BL21-Gold/pGEX-4T-E2-AF(大蔥)(圖7)。
同樣將上述的pGEX-4T-E2-AC(野薤)導入大腸桿菌BL21-Gold(STRATAGENE公司生產)得到轉化體BL21-Gold/pGEX-4T-E2-AC(野薤)(圖7)。
同樣將上述的pGEX-4T-E2-AA(亞實基隆蔥))導入大腸桿菌BL21-Gold(STRATAGENE公司生產)得到轉化體BL21-Gold/pGEX-4T-E2-AA(亞實基隆蔥)(圖7)。
同樣將上述的pGEX-4T-E2-APEG(大頭蒜)導入大腸桿菌BL21-GOLD(STRATAGENE公司生產))，得到轉化體BL21-GOLD/pGEX-4T-E2-APEG(大頭蒜)。
同樣將上述的pGEX-4T-E2-LK29A(韭蔥序列9)導入大腸桿菌BL21-GOLD(STRATAGENE公司生產))，得到轉化體BL21-GOLD/pGEX-4T-E2-LK29A(韭蔥序列9)。
同樣將上述的pGEX-4T-E2-LK58E(韭蔥序列13)導入大腸桿菌BL21-GOLD(STRATAGENE公司生產))得到轉化體BL21-GOLD/pGEX-4T-E2-LK58E(韭蔥序列13)。
將得到的轉化體於含有100μg/ml的氨苄青黴素的LB培養基中在37℃下進行振蕩培養。向培養基添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導生產，GST和各催淚成分合成酶蛋白質的融合蛋白質(以下，關於大蔥的融合蛋白稱為GST-E2-AF、關於野薤的融合蛋白稱為GST-E2-AC、關於亞實基隆蔥的融合蛋白稱為GST-E2-AA、關於大頭蒜的融合蛋白稱為GST-E2-APEG、關於韭蔥(序列9)的融合蛋白稱為GST-E2-LK29A、關於韭蔥(序列13)的融合蛋白稱為GST-E2-LK58E)蓄積在菌體內。
(3)蛋白質的分離(純化)象上述那樣操作，對於所有的植物進行轉化體培養，通過離心分離收集菌體後、進行超聲破碎。對於大蔥、野薤、亞實基隆蔥，將通過離心回収的上清流過穀胱甘肽瓊脂糖4 Fast Flow柱(AmershamPharmacia)，使GST融合蛋白質吸附於柱上。洗淨柱子後，用含有還原型穀胱甘肽的洗脫緩衝液將融合蛋白質洗出，得到3種融合蛋白質樣品(GST-E2-AF、GST-E2-AC、GST-E2-AA)的純化物。
將2種融合蛋白質樣品流過HiTrap Desalting柱(AmershamPharmacia)，除去還原型穀胱甘肽，再度吸附於穀胱甘肽瓊脂糖4 FastFlow柱。洗浄柱後，用含有凝血酶的緩衝液充滿柱，於室溫下進行2小時蛋白酶處理，將GST標記從融合蛋白質切下來。將除去GST標記的重組GST-E2-AF、GST-E2-AC以及GST-E2-AA從柱上洗脫下來，再向該洗脫液中加入Benzamidine Sepharose 6 B進行混合，通過離心分離，除去洗脫液的凝血酶，得到3種重組樣品(RC-E2-AF(大蔥)、RC-E2-AC(野薤)、RC-E2-AA(亞實基隆蔥))。
(4)重組蛋白質的催淚成分合成酶活性對融合蛋白質樣品GST-E2-AF、GST-E2-AC、GST-E2-AA以及除去GST標記的重組樣品RC-E2-AF、RC-E2-AC、RC-E2-AA 6樣品測定催淚成分合成酶活性。對於大頭蒜和韭蔥，測定上述(3)中菌體超聲破碎後的離心上清(GST-E2-APEG/sup(大頭蒜)、GST-E2-LK29A/sup(韭蔥序列9)、GST-E2-LK58E/sup(韭蔥序列13))的催淚成分酶活性。
測定按照國際專利申請PCT/JP01/07465所述的以下方法進行。
即，將上述重組蛋白質樣品用稀釋用緩衝液(50mM磷酸鉀緩衝液pH6.5)稀釋，向10μl稀釋樣品中加入40μl大蒜蒜氨酸酶(50units/ml)和PeCSO溶液(20mg/ml)20μl，於室溫下反應3分鐘後、將1μl反應液注入HPLC，測定催淚成分的生成量。在分析中使用ODS柱(4.6φ×250mm)(センシユウ科學公司生產)。此外，流動相為30％(v/v)的酸性MeOH、流速為0.6ml/min、柱溫為35℃、檢測波長為254nm。
測定結果表明，在所有的融合蛋白質樣品中都檢測到催淚成分合成酶活性。另外，對用沒有導入催淚成分合成酶基因的表達質粒pGEX-4T製作的轉化體(BL21-Gold/pGEX-4T-GST)進行培養，即使進行穀胱甘肽瓊脂糖柱處理也沒有檢測到催淚成分合成酶活性。而取代樣品使用磷酸緩衝液的空白中也沒有催淚成分合成酶活性。
由以上結果可以確認即使在催淚成分合成酶基因的N末端結合了象GST(分子量約27000)那樣的大蛋白質的融合蛋白質也具有催淚成分合成酶活性。
另外在RC-E2-AF、RC-E2-AC以及RC-E2-AA中也檢測到催淚成分合成酶活性。
實施例7(轉化植物的做成)(1)載體的製作載體的製作是通過在調節區域(啟動子)的下遊接上催淚成分合成酶基因的全長、或其一部分(最好是18bp以上)序列的有義取向序列、反義取向序列或含有兩方取向序列的任一個，通過在其下遊連上終止子，整合到質粒製作的。接上催淚成分合成酶基因序列的有義取向和反義取向的兩方序列，在其下遊接上終止子整合到質粒時，在有義和反義序列間最好插入「間隔」(spacer)(另外的鹼基序列)。通過這樣連接，會使在大腸桿菌內的穩定性提高。另外在上述間隔中，最好是含有「內含子」(非翻譯區域的鹼基序列)的序列。由此在個體中的表達抑制的左右變高，另外表達被抑制的個體的回收率上升。以下操作可以使用一般的基因克隆技術進行。
①將亞克隆了催淚成分合成酶基因的質粒導入大腸桿菌(例如、XL1-Blue)後使其增殖，以該質粒為模板進行PCR，使催淚成分合成酶基因的全長、或其一部分序列擴增。擴增的序列按照目的取向與啟動子連接，付加終止子後整合到質粒中。含有有義取向和反義取向兩方序列時，兩者之間插入含有內含子的間隔。
作為啟動子可以使用例如菜花樣花葉病毒的35S啟動子，只要是在植物細胞進行表達，也可以使用其它的啟動子。而作為終止子可以使用例如正纈氨酸合酶(ノパリンシンテ一ス)的終止子，也可以使用其他的終止子。
作為整合基因的中間載體質粒可以使用pBI101等一般的質粒，對此沒有特別限定。而作為整合基因的質粒通過使用加入適當的選擇標記(潮黴素或卡那黴素等抗生素抗性標記)的質粒，可以使得篩選轉化個體變得容易。
②將①的質粒整合到大腸桿菌(例如HB101、SURE2)後使其增殖，該大腸桿菌和帶有輔助質粒的大腸桿菌(例如HB101(pRK2013))、以及帶有輔助Ti質粒(例如、pAL4404)的土壤桿菌(例如根癌土壤桿菌LBA4404最好，此外也可以使用EHA105或EHA101等那樣系統的土壤桿菌)進行三親株交配、①的質粒內的插入基因被重組到土壤桿菌內。另外，即使不藉助於輔助質粒的三親株交配，也可以通過電穿孔法直接將整合了導入基因序列的質粒導入土壤桿菌中。
(2)在重組中使用的洋蔥等植物材料的製作。
①植物材料只要是具有再分化能力(再生植物體的能力)的植物可以使用任一種。使用洋蔥等蔥屬植物時，最好是使用從植物體誘導具有再分化能力的愈傷組織。對于洋蔥等蔥屬植物，作為誘導愈傷組織的植物器官，可以使用來自種子的成熟或未熟胚、來自種子的發芽初生根、鱗片葉生長點、盤莖部等。
②誘導愈傷組織的培養基組成最好是使用植物培養中通常可以使用的MS培養基的組成，也可以使用其它培養基的組成。誘導愈傷組織的培養基中的必需成分是植物激素的植物生長激素。植物生長激素的濃度最好是1-100μM。作為植物生長激素如4-FPA(4-氟苯氧乙酸)、Picrolam(4-氨基-3，5，6-三氯-2-吡啶羧酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)等誘導愈傷組織的比較好，也可以使用其它的植物生長激素。
③愈傷組織的培養可以在適於培養的條件下進行，最好是在25℃、1000-3000lux左右的螢光燈照射下進行。誘導的愈傷組織可以通過繼代培養進行維持。但是為了使用保持再分化能力的愈傷組織，最好是將用於愈傷組織誘導的培養期間縮短，減少繼代培養的次數。具體來說，用於愈傷組織誘導的培養期間為3～4個月左右，繼代培養的次數在3次以下為好。④對于洋蔥等，由於品種不同，愈傷組織的再分化能力上存在很大的差距，最好使用再分化能力大的品種。例如泉州中甲高黃、紅花(くれない)、紅葉(もみじ)、天壽等。
(3)基因導入載體對愈傷組織的感染①使帶有(1)中得到的基因導入載體的土壤桿菌菌體增殖，將愈傷組織浸入該菌液。此時，重要的是添加為了使土壤桿菌感染單子葉植物所需要的化合物乙醯丁香酮。乙醯丁香酮的濃度最好是100-200μM。
②對菌和愈傷組織進行共存培養3日以上、最好是4～6日左右後、使用頭孢噻肟或羧苄青黴素抗生素，除去土壤桿菌。
(4)從受感染的愈傷組織挑選轉化個體在與預先整合到載體的潮黴素或卡那黴素等抗生素抗性標記對應的培養基上培養愈傷組織，使其發育生長後、再分化。存活的是轉化成功的個體。由愈傷組織再分化中使用的培養基組成可以使用植物培養通常使用的MS培養基組成，也可以使用其它組成的培養基。重要的是要從再分化培養基中除去植物生長激素。
(5)轉化個體的確認目的基因是否導入再分化植物中可以利用從植物體提取DNA，Southern雜交法(中山広樹等著、生物實驗提示(バイオ実験イラストレイテツド)②基因解析的基礎，p137-151(1995))進行確認。
(6)轉化個體的特性的評價可以確認再分化植物含有的硫代亞磺酸鹽及其反應物的量。
工業實用性本發明的催淚成分生成基因抑制催淚成分合成酶的表達量，在為了增大具有抗哮喘作用等的硫代亞磺酸鹽及其反應物的生成量所需要的反義核苷酸的設計等中是有用的，利用基因重組技術也可以有效地製造出催淚成分合成酶、可以實現有效地生產在淚缺乏症(乾眼症)等的治療起作用的催淚成分方面起到顯著效果。
序列表110好侍食品株式會社120具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽、編碼該蛋白質或多肽的DNA、利用該DNA製造具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽的製造方法以及具有抑制該蛋白質或多肽的mRNA翻譯的功能的核酸分子130Y1K0092150JP 2002-565231512002-03-01150JP 2002-565581512002-03-01150JP 2002-2757991512002-09-2016030170PatentIn version 3.12101211739212DNA213Allium fistulosum L.
220
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21012211169212PRT213Allium cepa L.
40012Met Glu Leu Asn Pro Gly Ala Pro Ala Val Val Ala Asp Ser Ala Asn1 5 10 15Gly Ala Arg Lys Trp Ser Gly Lys Val His Ala Leu Leu Pro Asn Thr20 25 30Lys Pro Glu Gln Ala Trp Thr Leu Leu Lys Asp Phe Ile Asn Leu His35 40 45Lys Val Met Pro Ser Leu Ser Val Cys Glu Leu Val Glu Gly Glu Ala50 55 60Asn Val Val Gly Cys Val Arg Tyr Val Lys Gly Ile Met His Pro Ile65 70 75 80Glu Glu Glu Phe Trp Ala Lys Glu Lys Leu Val Ala Leu Asp Asn Lys85 90 95Asn Met Ser Tyr Ser Tyr Ile Phe Thr Glu Cys Phe Thr Gly Tyr Glu100 105 110Asp Tyr Thr Ala Thr Met Gln Ile Val Glu Gly Pro Glu His Lys Gly115 120 125Ser Arg Phe Asp Trp Ser Phe Gln Cys Lys Tyr Ile Glu Gly Met Thr130 135 140
Glu Ser Ala Phe Thr Glu Ile Leu Gln His Trp Ala Thr Glu Ile Gly145 150 155 160Gln Lys Ile Glu Glu Val Cys Ser Ala16521013211661212DNA213Allium ampeloprasum L.
220
221CDS222(1)..(492)223P220
221polyA位點222(637)..(661)223P40013atg gcg caa aat cct ggt gtg cct gct gtt gcc act gag cca aaa tgg48Met Ala Gln Asn Pro Gly Val Pro Ala Val Ala Thr Glu Pro Lys Trp1 5 10 15aca ggc aag gtc agt gca tcg ctt cca aat aca aag cca gag caa gca96Thr Gly Lys Val Ser Ala Ser Leu Pro Asn Thr Lys Pro Glu Gln Ala20 25 30tgg aca ctg cta aaa gac ttt gtt aac ctt gac aag gtt atg cct tca144Trp Thr Leu Leu Lys Asp Phe Val Asn Leu Asp Lys Val Met Pro Ser35 40 45ttg tca gtt tgt gaa ctt gta gaa ggt gaa ccc aat gcc gtt ggt tgt192Leu Ser Val Cys Glu Leu Val Glu Gly Glu Pro Asn Ala Val Gly Cys50 55 60act cgc tac gtt aaa ggt atg atg cac cca atg gaa gtg gaa ttt tgg240Thr Arg Tyr Val Lys Gly Met Met His Pro Met Glu Val Glu Phe Trp
65 70 75 80gcc aac gag cag ctg gtg gag ctg gat gac gag acc atg acc tac agt288Ala Asn Glu Gln Leu Val Glu Leu Asp Asp Glu Thr Met Thr Tyr Ser85 90 95tat att ttt act aag gcc ttt aca ggg tat gag ggt tac atg ggt acc336Tyr Ile Phe Thr Lys Ala Phe Thr Gly Tyr Glu Gly Tyr Met Gly Thr100 105 110atg caa ctt gtg gag gaa agc gat cag aag gga act agg ttt gac tgg384Met Gln Leu Val Glu Glu Ser Asp Gln Lys Gly Thr Arg Phe Asp Trp115 120 125tct ttt cag tgc aag tac att gag ggt gtg act gcc aca tca ttc gct432Ser Phe Gln Cys Lys Tyr Ile Glu Gly Val Thr Ala Thr Ser Phe Ala130 135 140gct gtt ctg cag att tgg gca gat gag att gcc cag aaa att gaa gag480Ala Val Leu Gln Ile Trp Ala Asp Glu Ile Ala Gln Lys Ile Glu Glu145 150 155 160att tgc aaa gca tgatcatgaa tatgggtcaa tttgtgatgc tgtgtgcatg532Ile Cys Lys Alatgtgttttcc attctgtctt gtgatgtaat gaagtaacgt aattaccaga tgcatgtaat 592ctgtagtggc tgtgttttca ataaataaga atttgctttc ttgcaaaaaa aaaaaaaaaa 652aaaaaaaaa 66121014211164212PRT213Allium ampeloprasum L.
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Thr Gly Lys Val Ser Ala Ser Leu Pro Asn Thr Lys Pro Glu Gln Ala20 25 30Trp Thr Leu Leu Lys Asp Phe Val Asn Leu Asp Lys Val Met Pro Ser35 40 45Leu Ser Val Cys Glu Leu Val Glu Gly Glu Pro Asn Ala Val Gly Cys50 55 60Thr Arg Tyr Val Lys Gly Met Met His Pro Met Glu Val Glu Phe Trp65 70 75 80Ala Asn Glu Gln Leu Val Glu Leu Asp Asp Glu Thr Met Thr Tyr Ser85 90 95Tyr Ile Phe Thr Lys Ala Phe Thr Gly Tyr Glu Gly Tyr Met Gly Thr100 105 110Met Gln Leu Val Glu Glu Ser Asp Gln Lys Gly Thr Arg Phe Asp Trp115 120 125Ser Phe Gln Cys Lys Tyr Ile Glu Gly Val Thr Ala Thr Ser Phe Ala130 135 140Ala Val Leu Gln Ile Trp Ala Asp Glu Ile Ala Gln Lys Ile Glu Glu145 150 155 160Ile Cys Lys Ala21015211726212DNA213Allium ampeloprasum L.
220
221CDS222(57)..(563)223P220
221polyA位點222(717)..(726)223P40015acacacaact cagacccaca tttcgttgta tttagtagat tattcagtca ggaaaa atg 59Met1atg aca tat cct gga aat cgt gct gta gcc act gat ggt gcc aaa gaa107Met Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Ala Val Ala Thr Asp Gly Ala Lys Glu5 10 15gct cca aaa tgg aaa ggc aaa gcc tat gcc ttg ctt cca aat aca aag155Ala Pro Lys Trp Lys Gly Lys Ala Tyr Ala Leu Leu Pro Asn Thr Lys20 25 30cca gag cac gcg tgg aaa cta cta aaa gac ttc att aac ctt cac aag203Pro Glu His Ala Trp Lys Leu Leu Lys Asp Phe Ile Asn Leu His Lys35 40 45acc atg cca tcg ctg tca gtt tgt gaa ctg gta gaa ggt gag gtc aat251Thr Met Pro Ser Leu Ser Val Cys Glu Leu Val Glu Gly Glu Val Asn50 55 60 65gct gta ggt tgt gtt cgt cat gtt aaa ggt ata atg cat cca atg gag299Ala Val Gly Cys Val Arg His Val Lys Gly Ile Met His Pro Met Glu70 75 80cag gag ttt tgg gct aag gag aag ctg gtg gca gtc gat gac aag gcc347Gln Glu Phe Trp Ala Lys Glu Lys Leu Val Ala Val Asp Asp Lys Ala85 90 95atg agc tac agt tat att ttt act gag tgt ttt aca ggg tac gag gat395Met Ser Tyr Ser Tyr Ile Phe Thr Glu Cys Phe Thr Gly Tyr Glu Asp
100 105 110tac acg gcc acc atg caa att atg gat gga tgc gag cat aag gga agc443Tyr Thr Ala Thr Met Gln Ile Met Asp Gly Cys Glu His Lys Gly Ser115 120 125aga ttt gag tgg tcc ttc cag tgt aac tac atc gag ggt atg act gaa491Arg Phe Glu Trp Ser Phe Gln Cys Asn Tyr Ile Glu Gly Met Thr Glu130 135 140 145tct gcc ttc act gac att ctg cag cat tgg acc act gag att ggt cag539Ser Ala Phe Thr Asp Ile Leu Gln His Trp Thr Thr Glu Ile Gly Gln150 155 160aaa att gaa gag att tgc agt gct tgattatgaa tatcggttta tgctgtgatg 593Lys Ile Glu Glu Ile Cys Ser Ala165caatgtgtgt gtattaatcc ctgccttgtg atgtgataaa ataacttaat atgtcatatg 653catgtaatag gcaagccagg gtggtgttgt gttctcaata aaaagcattt gctttttgca 713taaaaaaaaa aaa 72621016211169212PRT213Allium ampeloprasum L.
40016Met Met Thr Tyr Pro Gly Asn Arg Ala Val Ala Thr Asp Gly Ala Lys1 5 10 15Glu Ala Pro Lys Trp Lys Gly Lys Ala Tyr Ala Leu Leu Pro Asn Thr20 25 30Lys Pro Glu His Ala Trp Lys Leu Leu Lys Asp Phe Ile Asn Leu His35 40 45
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223PCR引物40017tggagggtcc tgagcacaag 20
2101821121212DNA213人工合成序列220
223PCR引物40018tggaagaatt cgcggccgca g212101921136212DNA213人工合成序列220
223PCR引物220
221修飾鹼基222(24)..(24)223i220
221修飾鹼基222(25)..(25)223i220
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220
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221修飾鹼基222(35)..(35)223i40019ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng362102021130212DNA213人工合成序列220
223PCR引物40020ctcttcgatt ttctgaccta tctcagtagc 302102121122212DNA213人工合成序列220
223PCR引物40021atggagctaa atcctggtgc gc 222102221122212DNA213人工合成序列
220
223PCR引物40022atggagcaaa attctggtac gc 222102321115212DNA213人工合成序列220
223PCR引物220
221修飾鹼基222(3)..(3)223i220
221修飾鹼基222(6)..(6)223i220
221修飾鹼基222(9)..(9)223i40023ggngcnmgna artgg 152102421122212DNA213人工合成序列220
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223PCR引物40027atgatgacat atcctggaaa tcg 232102821121
212DNA213人工合成序列220
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223PCR引物40029atggcgcaaa atcctggtgt gc 222103021145212DNA213人工合成序列220
223PCR引物40030aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt ttttt 4權利要求
1.DNA，編碼表現出將1-丙烯次磺酸轉變為催淚成分的作用的蛋白質或多肽。
2.權利要求1所述的DNA，其中上述DNA是由序列1、5、7、9、13或15所示的鹼基序列構成的，或由以下(a)～(c)中的任一個構成的(a)由在序列1、5、7、9、13或15所示鹼基序列中付加、缺失、或置換1或多個鹼基後的鹼基序列構成的DNA；(b)在嚴格條件下與由序列1、5、7、9、13或15所示鹼基序列構成的DNA可進行雜交的DNA；(c)由與序列1、5、7、9、13或15所示鹼基序列的同源性在60％以上的鹼基序列構成的DNA。
3.引物，由序列25所示，用於屬於蔥屬植物的催淚成分合成酶基因的分離。
4.利用序列25所示引物，對屬於蔥屬植物的催淚成分合成酶基因進行分離的方法。
5.含有權利要求1或2所述DNA的重組載體。
6.含有權利要求1或2所述的DNA重組載體的轉化體。
7.具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽的製造方法，其特徵是對用含有權利要求1或2所述的DNA重組載體轉化的宿主細胞進行培養，然後對產生在培養基中或細胞中的具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽進行分離。
8.具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽，含有以下任一個序列(a)序列2、6、8、10、14或16所示的胺基酸序列、(b)在序列2、6、8、10、14或16所示的胺基酸序列中付加、缺失或置換1或多個胺基酸後的胺基酸序列、或(c)與序列2、6、8、10、14或16所示胺基酸序列的同源性在65％以上的胺基酸序列。
9.具有抑制權利要求8所述蛋白質或多肽的mRNA翻譯的功能的核酸分子。
全文摘要
本發明涉及與粉碎或切斷洋蔥等植物時發生催淚成分的生成有關的表現出將1－丙烯次磺酸轉變為催淚成分的作用的蛋白質或多肽、編碼該蛋白質或多肽的DNA(催淚成分合成酶基因)、使用用於屬於蔥屬植物的催淚成分合成酶基因分離的引物以及使用該引物分離該基因的方法、含有上述DNA的重組載體、包含含有上述DNA的重組載體的轉化體、對用含有上述DNA的重組載體轉化的宿主細胞進行培養製造具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽的方法、具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽、以及具有抑制具有催淚成分合成酶活性的蛋白質或多肽的mRNA翻譯的功能的核酸分子。
文檔編號C12N15/82GK1639337SQ0380504
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月28日 優先權日2002年3月1日
發明者今井真介, 柘植信昭, 鐮田庸宏, 正村典也, 正野仁慈 申請人:好侍食品株式會社