一種用於檢測肺炎支原體的pcr引物及其應用的製作方法

2023-06-13 21:16:56

一種用於檢測肺炎支原體的pcr引物及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於檢測肺炎支原體的螢光定量PCR引物及其應用。本發明所提供的引物對可為引物對1（序列1和序列2）或引物對2（序列3和序列4）或引物對3（序列5和序列6）。實驗證明，利用本發明所提供的引物對對待測樣本進行螢光定量PCR檢測，與其他商品化檢測引物以及IgM抗體檢測法和培養法相比，本發明方法能夠特異性檢測MP，不受MP親緣關係較近的4種常見病原支原體和呼吸道常見細菌和真菌病原菌的幹擾。該方法除可以定性檢測MP外還可以很好的定量檢測MP，是一種快速、特異性強、靈敏度高、適合臨床使用的檢測所有株肺炎支原體的定量PCR檢測技術，在臨床檢測中具有非常好的檢測效果和應用價值。
【專利說明】—種用於檢測肺炎支原體的PCR引物及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於病原體檢測領域，涉及一種用於檢測肺炎支原體的PCR引物及其應用。
【背景技術】
[0002]肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, MP)是呼吸道感染(包括社區獲得性肺炎，CAP)中非常重要的病原體。肺炎支原體肺炎廣泛存在於全球範圍內，多為散發病例，約3-6年發生一次地區性流行，流行時間可長達I年，流行年份的發病率可以達到非流行年份的數倍，容易在學校、幼兒園及軍隊等人員比較密集的環境中集中發病。最近的一項包括亞洲地區在內的全球性CAP病原學調查結果顯示，肺炎支原體肺炎佔CAP的12 %，在所有非典型病原體感染所導致的CAP中所佔的比例超過了 50%。與大多數國外地區相比，我國肺炎支原體肺炎的發病率可能更高。有研究表明，肺炎支原體已經超過了肺炎鏈球菌，成為成人CAP的首要致病原。
[0003]據報導，大於20%的社區獲得性肺炎由肺炎支原體(MP)引起。由於肺炎支原體缺乏細胞壁，造成社區常用的β -內醯胺類抗生素對其無效，因此，為避免濫用抗生素，早期診斷尤為重要。間接診斷MP感染的抗體檢測方法已廣泛應用於臨床檢測，但是這些方法靈敏度不理想，且存在MP感染後持續陽性的現象。國外早已將PCR診斷技術應用於MP感染的診斷，但由於普通的P CR操作過程中易汙染，使得假陽性率較高，臨床應用受到限制。
[0004]實時突光定量PCR (Real-time fluorescent quantitative PCR, QPCR)是在 PCR技術基礎上發展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術，1996年由美國Applied Biosystems公司首先推出，螢光定量PCR對PCR產物的檢測原理做了很大的改進，它利用螢光染料在激發光的作用下，所釋放的螢光光能的變化來動態直接反映出PCR擴增產物量的變化，因螢光信號變量和擴增產物量成正比，通過足夠靈敏的自動化儀器對螢光的採集和分析，從而實現對起始模板定量及定性的分析。Sybr Green I是一種和DNA結合的螢光染料，在PCR反應體系中，加入過量SYBR螢光染料，SYBR螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈，發射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射螢光信號，從而保證螢光信號的增高與PCR產物的增加完全同步。當進行實時監測時，可檢測到DNA聚合酶進行DNA合成階段螢光信號增加，而在模板變性階段螢光信號減少。因此，在每一次PCR循環終點，可通過檢測螢光來檢測擴增DNA的增加量。
[0005]此技術除了具有傳統PCR的特異性強、靈敏度高、檢測時間短等特點外，還具有以下特點:全封閉反應，無需凝膠電泳等PCR後處理，減小對環境的汙染；不使用有毒試劑，操作安全；採用對數期分析，摒棄終點數據，定量準確；定量範圍寬，可達到10個數量級；儀器在線實時監測，結果直觀。

【發明內容】

[0006]本發明的一個目的是提供一種用於檢測或輔助檢測肺炎支原體的引物對。[0007]本發明所提供的引物對特異於肺炎支原體的ATPase基因。具體而言，所述引物對為如下引物對I或引物對2或引物對3:
[0008]所述引物對I為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對；所述引物對2為由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對；所述引物對3為由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對。
[0009]進一步，組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子的摩爾比為1:1。
[0010]製備所述引物對的方法也屬於本發明的保護範圍。
[0011]該方法具體可包括將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝的步驟。
[0012]本發明是另一個目的是提供一種用於檢測或輔助檢測肺炎支原體的試劑盒。
[0013]本發明所提供的用於檢測或輔助檢測肺炎支原體的試劑盒，可為實時螢光定量PCR試劑盒，具體可含有所述引物對和如下物質中的至少一種:dNTP、DNA聚合酶和螢光染料。
[0014]在本發明中，所述螢光染料具體為SYBR green。
[0015]製備所述試劑盒的方法也屬於本發明的保護範圍。[0016]該方法具體可包括如下步驟:將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝後，與如下物質中的至少一種包裝於同一個試劑盒內:dNTP、DNA聚合酶和螢光染料。
[0017]在本發明中，所述螢光染料具體為SYBR green。
[0018]所述引物對或所述試劑盒在製備檢測或輔助檢測肺炎支原體的產品中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0019]具體的，採用所述引物對或所述試劑盒通過實時螢光定量PCR檢測肺炎支原體時，反應體系中，反應初始時上下遊引物的終濃度均可為0.4μ M ;反應條件均可為:50°C 2分鐘，I個循環；95°C 15分鐘，I個循環；94°C 15秒，56°C 31秒，72°C 20秒(單點採集螢光，SYBR green通道)，40個循環。
[0020]進一步，在本發明中，進行實時螢光定量PCR的所述反應體系如下:2倍定量PCR反應液10μ 1,0.4μ I的引物混合液(上下遊引物的濃度均為20 μ Μ)，以及7.6μ I的去離子水，DNA模板2 μ I。其中，所述2倍定量PCR反應液為Qiagen公司產品，名稱為QuantiTectSYBR Green PCR kit,目錄號:204141。
[0021]在本發明中，以上所有的所述肺炎支原體均為人肺炎支原體，如肺炎支原體國際標準菌株!7H (ATCC15531)。
[0022]實驗證明，利用本發明所提供的引物對對待測樣本進行螢光定量PCR檢測，與其他商品化檢測引物以及IgM抗體檢測法和培養法相比，本發明檢測引物對及試劑盒能夠特異性檢測MP，不受MP親緣關係較近的4種常見病原支原體和呼吸道常見細菌和真菌病原菌的幹擾。該方法除可以定性檢測MP外還可以很好的定量檢測MP，是一種快速、特異性強、靈敏度高、適合臨床使用的檢測所有株肺炎支原體的定量PCR檢測技術，在臨床檢測中具有非常好的檢測效果和應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發明採用實施例1獲得的引物MPP7對不同樣品進行實時螢光定量PCR的擴增曲線圖。其中，標註Positive的曲線為肺炎支原體國際標準株(ATCC15531)基因組DNA樣品，標註P1-P4的曲線分別為將肺炎支原體國際標準株!7H (ATCC15531)稀釋4倍、16倍、64倍、256倍後的樣品，其餘曲線為四種支原體屬病原基因組DNA樣品和11種呼吸道常見細菌、真菌基因組DNA樣品。
[0024]圖2為本發明採用實施例1獲得的引物MPP7對不同樣品進行實時螢光定量PCR的電泳圖。其中，Pl =Mp陽性對照4倍稀釋；P2:Mp陽性對照16倍稀釋；P3:Mp陽性對照64倍稀釋；P4:Mp陽性對照256倍稀釋；Mg:生殖支原體(ATCC33530) ；Mho:人型支原體(ATCC23114) ；UU:解脲脲原體(ATCC27618) ；Mp1:梨支原體(ATCC25960) ；Mp 和 O:肺炎支原體國際標準株FH (ATCC15531)(濃度為4X108拷貝/ml) ；1:流感嗜血桿菌(hin) ；2:A型鏈球菌(gas) ；3:表皮葡萄球菌(sep) ；4:金黃色葡萄球菌(sau) ；5:大腸桿菌(eco) ；6:肺炎克雷伯菌(kpn) ；7:卡他莫拉菌(bca) ；8:鮑曼不動桿菌(aba) ；9:肺炎鏈球菌(spn) ；10:銅綠假單胞菌(pae ) ; 11:白色念珠菌(cal) ;NC和N:陰性對照；M:分子量標準(由大到小依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp)。
[0025]圖3為本發明採用實施例1獲得的引物對MPP7進行實時螢光定量PCR的標準曲線。
[0026]圖4為採用中山大學達安基因股份有限公司MP FQ-PCR產品(目錄號:DA-B064)，對肺炎支原體國際標準株FH (ATCC15531)，臨床陽性樣本，以及四種支原體屬病原和11種呼吸道常見細菌、真菌進行實時螢光定量PCR檢測的擴增曲線圖。其中，Mpi為梨支原體(ATCC25960)，Mg 為生殖支原體(ATCC33530)，UU 為解脲脲原體(ATCC27618)，sep 為表皮葡萄球菌(ATCC12228)，sau為金黃色葡萄球菌(ATCC25923)，hin為流感嗜血桿菌(ATCC49247)，Mpl:肺炎支原體臨床陽性樣本1，Mp2:肺炎支原體臨床陽性樣本2。其餘曲線為人型支原體(ATCC23114)、A型鏈球菌(gas) (ATCC19615)、大腸埃希氏菌(eco)(ATCC25922)、肺炎克雷伯菌(kpn) (ATCC700603)、卡他莫拉菌(bca) (ATCC25238)、鮑曼不動桿菌(aba ) (ATCC19606 )、肺炎鏈球菌(spn ) (ATCC49619 )、銅綠假單胞菌(pae )(ATCC27853)和白色念珠菌(cal) (ATCC90028)。
【具體實施方式】`
[0027]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0028]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0029]實施例1、用於檢測肺炎支原體的螢光PCR引物的獲得
[0030]一、引物對的設計與合成
[0031]根據已發表在GenBank上的人肺炎支原體國際標準株(ATCC15531)的基因組DNA序列(GenBank序列號:CP002077),最終確定以該菌株的16S rRNA (GenBank序列號:AF132740)和ATPase基因序列(GenBank序列號:U43738)為模板，利用引物設計軟體PrimerPrimierf.0，進行引物設計。避開與其他病原體同源性較高的區域，手工調整參數，擴增產物大小在150~300bp範圍，引物的Tm值在54~64°C範圍，共設計選取20對引物，其中針對16S rRNA序列的引物6對，針對ATPase序列的引物14對。獲得的引物序列送英濰捷基(上海)貿易有限公司進行引物合成。
[0032]二、引物對可靠性檢測
[0033]提取人肺炎支原體國際標準株(ATCC15531)的基因組DNA，進行QPCR實驗，調整退火溫度等參數，並將QPCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，驗證所設計合成的20對引物的可靠性，淘汰擴增效率低以及擴增產物不特異的引物對。經過初篩實驗，保留16S rRNA引物4對，ATPase引物10對，並使用提取的臨床陽性MP培養株基因組DNA進行驗證，繼續進入下一輪實驗。
[0034]提取與肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,MP)感染相似、臨床症狀難以區分的多種常見病原體實驗室培養株基因組DNA，作為模板，分別使用上述初篩後的14對引物，與MP基因組DNA同時進行QPCR實驗，通過優化反應條件，篩選出只對MP進行特異性擴增的引物序列。經過上述實驗過程，得到如下3對PCR引物。
[0035]引物對MPP7，特異於MP ATPase基因，擴增產物大小為291bp，序列如下:
[0036]MPP7F:5，-CCCAACTCAAGCGAATCGTAG-3』(序列 I)；
[0037]MPP7R:5，-CCATCAGCGACACTAATAACCTTG-3，(序列 2)。
[0038]引物對MPP8，特異於MP ATPase基因，擴增產物大小為292bp，序列如下:
[0039]MPP8F:5，-GGGGATTGCTGGGAAGTATGTC-3』(序列 3)；
[0040]MPP8R:5，-GCGCACGGTTATAGTTCAAACC-3』(序列 4)。
[0041]引物對MPP9，特異於MP ATPase基因，擴增產物大小為223bp，序列如下:
[0042]MPP9F:5， -GCCGTTGGGCAAGTAGTTCTC-3，(序列 5)；
[0043]MPP9R:5，-CGGTGGGGTTATCGGTGTCAC-3，(序列 6)。
[0044]實施例2、用於檢測肺炎支原體的螢光PCR引物的特異性檢測及最低檢測限的確
定
[0045]本實施例採用肺炎支原體國際標準株ra (ATCC15531)，以及四種支原體屬病原和11種呼吸道常見細菌、真菌對實施例1得到的3個引物對進行特異性檢測。其中，四種支原體屬病原為:生殖支原體(ATCC33530)、人型支原體(ATCC23114)、解脲脲原體(ATCC27618)和梨支原體(ATCC25960) ；11種呼吸道常見細菌、真菌為:流感嗜血桿菌(hin) (ATCC49247)、A 型鏈球菌(gas) (ATCC19615)、表皮葡萄球菌(sep) (ATCC12228)、金黃色葡萄球菌(sau) (ATCC25923)、大腸埃希氏菌(eco) (ATCC25922)、肺炎克雷伯菌(kpn) (ATCC700603)、卡他莫拉菌(bca) (ATCC25238)、鮑曼不動桿菌(aba) (ATCC19606)、肺炎鏈球菌(spn) (ATCC49619)、銅綠假單胞菌(pae) (ATCC27853)和白色念珠菌(cal)(ATCC90028)。
[0046]分別提取如上所述的肺炎支原體國際標準株ra (ATCC15531)，以及四種支原體屬病原和11種呼吸道常見細菌、真菌的基因組DNA，並進行純化後統一調整濃度為4X IO8拷貝/ml，以其為模板，分別採用實施例1得到的3個引物對進行實時螢光定量PCR。同時設置以水代替DNA模板的陰性對照。另外，對於人肺炎支原體國際標準株FH (ATCC15531)的基因組DNA再設置分別稀釋4、16、64和256倍的四個樣品。
[0047]實時螢光定量PCR反應體系:2倍定量PCR反應液10μ 1，0.4μ I的引物混合液(上下遊引物的濃度均為20 μ Μ),以及7.6 μ I的去離子水。上述成分混合均勻後，加入DNA模板2 μ I。該反應體系中，反應初始時，上下遊引物以的濃度均為0.4 μ Μ。其中，2倍定量PCR反應液為Qiagen公司產品，名稱為QuantiTect SYBR Green PCR kit,目錄號:204141。
[0048]將樣品管放入上海宏石SLAN-96P螢光PCR儀後，設置如下條件進行反應:50°C 2分鐘，I個循環；95°C 15分鐘，I個循環；94°C 15秒，56°C 31秒，72°C 20秒(單點採集螢光，SYBR green通道)，40個循環。
[0049]反應結束後根據擴增曲線及電泳圖譜判定結果。
[0050]實驗重複三次。
[0051]結果顯示:採用3個引物對分別進行實時螢光定量PCR檢測時，均只有肺炎支原體國際標準株FH (ATCC15531)基因組DNA及其四個稀釋樣品可觀察到明顯的螢光強度變化，而其它樣品與陰性對照一樣，螢光強度均沒有變化。其中，採用引物對MPP7時，擴增曲線如圖1所示。採用3個引物對分別進行實時螢光定量PCR檢測時，均只有肺炎支原體國際標準株(ATCC15531)基因組DNA及其四個稀釋樣品可觀察到預期大小的目的條帶，而其它樣品與陰性對照一樣，沒有目的條帶。其中，採用引物對MPP7時，PCR反應後的電泳圖譜如圖2所示。以上擴增曲線和電泳圖譜的結果表明，實施例1獲得的3個引物對肺炎支原體均具有良好的特異性。
[0052]另外，根據肺炎支原體國際標準株-- (ATCC15531)基因組DNA稀釋4、16、64和256倍後樣品的檢測結果，以起始模板濃度(拷貝/ml)的對數為橫坐標，以閾值循環數為縱坐標，繪製標準曲線。標準曲線公式為Ct=KXlgXJb (Ct為閾值循環數；K為斜率A為起始模板濃度(單位:拷貝/ml) ；b為截距)。
[0053]MPP7 的標準曲線如圖 3 所示，公式為:Ct=-5.621gX0+58.79 (r2=0.99743)。利用該標準曲線可以定量檢測待檢測樣品中的MP濃度，最低檢測限約達2188拷貝/ml (Ct為40時，X0的取值)。
[0054]本發明的發明人同時採用了中山大學達安基因股份有限公司MP FQ-PCR產品(目錄號:DA-B064)，對如上所述的肺炎支原體國際標準株(ATCC15531)，臨床陽性樣本，以及四種支原體屬病原和11種呼吸道常見細菌、真菌進行實時螢光定量PCR檢測，所有操作按照產品說明書進行。
`[0055]結果顯示:中山大學達安基因股份有限公司MP FQ-PCR產品對梨支原體(Mpi )，生殖支原體(Mg)，解脲脲原體(UU)，表皮葡萄球菌(s印)，金黃色葡萄球菌(sau)和流感嗜血桿菌(hin)等出現不同程度的交叉反應，呈現出假陽性結果(圖4)。
[0056]實施例3、用於檢測肺炎支原體的螢光PCR引物的臨床樣本驗證
[0057]本實施例中，發明人於發熱門診回顧性分析100例社區獲得性肺炎患者(年齡^ 14歲)的MP相關檢測結果，以雙份血清中MP-1gG抗體4倍及以上升高作為MP感染診斷「金標準」，分別評價中山大學達安基因股份有限公司MP FQ-PCR產品(目錄號:DA-B064)、採用實施例1獲得的引物對MPP7進行的實時螢光定量PCR法、IgM抗體檢測法和培養法的檢出率，靈敏度，特異性，陽性預測值，陰性預測值和陽性似然比。
[0058]在每例患者第一次門診(即感染急性期)時，採集咽拭子放入2ml生理鹽水中保存，和非抗凝靜脈血2ml，其中，取咽拭子標本200μ I兩份，分別進行肺炎支原體培養，和肺炎支原體DNA提取(進而進行PCR檢測)，分離靜脈血血清，分別進行IgM和IgG抗體檢測；在每例患者發病14-28天時(即感染恢復期)，採集非抗凝靜脈血2ml，分離靜脈血血清，進行IgG抗體檢測。
[0059]肺炎支原體的培養法，具體如下:
[0060]採用經典的變色培養基液體培養法(參考文獻「Waites KB, BebearCM，Robertson JAjet al.Cumitech34, laboratory diagnosis of mycoplasmalinfections.F.S.Noltej coordinating ed.Washington, DC:American Society forMicrobiology, 2001.」)。購買OXIOD公司的基礎肉湯培養基(產品目錄號為CM0403)、葡萄糖(產品目錄號為LP0071)和培養添加劑(產品目錄號為SR0059C)，以及國藥集團化學試劑有限公司的苯酚紅(產品目錄號為71032594)，自行配製變色培養基(配方:每100ml中加入基礎肉湯培養基2.lg，葡萄糖0.5g，培養添加劑I支，苯酚紅0.01g)。取200 μ I入組患者咽拭子標本液，加入至2ml變色培養基中，37°C培養2-6周，以顏色由澄清紅變澄清黃判為陽性，否則判為陰性。
[0061]肺炎支原體的實時螢光定量PCR檢測法，具體如下:
[0062]利用德國Qiagen公司DNA提取試劑盒(貨號51306)，提取咽拭子標本的DNA核酸。採用本發明實施例1獲得的引物對MPP7進行實時螢光定量PCR的反應體系和反應程序參見實施例2。而採用中山大學達安基因股份有限公司MP FQ-PCR產品(目錄號:DA-B064)進行實時螢光定量PCR，所有操作按照說明書進行。以上兩種實時螢光定量PCR，均設置陽性對照——肺炎支原體國際標準株FH (ATCC15531)基因組DNA (濃度為4X IO8拷貝/ml)。
[0063]肺炎支原體IgM和IgG抗體檢測法，具體如下:
[0064]採用德國維潤-賽潤公司商品試劑盒(貨號:ESR127G和ESR127M)定量測定感染急性期血清中肺炎支原體IgM和IgG抗體，以及感染恢復期血清中肺炎支原體IgG抗體，所有標本均由相同操作人員使用Thermo公司的Multiskan MK3型酶標儀進行檢測。所有操作按照相應的試劑盒說明書進行。具體的結果判斷標準為:抗體活性單位以U/ml表示，對於IgM抗體，>17U/ml判為IgM抗體陽性(即判為MP感染)，13-17U/ml判為灰區，30U/ml判為IgG抗體陽性，20-30U/ml判為灰區，<20U/ml判為IgG抗體陰性；當感染恢復期血清IgG抗體陽性，且較感染急性期IgG抗體呈4倍或以上升高，定義為MP感染金標準(參考文獻「Burak Turgut, Fatma Uyar, Fulya Ilhan, et al.Mycoplasma Pneumoniae and ChlamydiaPneumoniae Sero-posit ivity in Patients With Age-Related Macular Degeneration.J Clin Med Res, 2010, 2 (2):85 - 89.[4]Jonathan J Deeks and Douglas G Altman.Diagnostic tests4: likelihood ratios.BMJ, 2004, 329 (7458): 168 - 169.，，)。
[0065]實驗重複三次，結果取平均值。
[0066]結果顯示:在100例肺炎患者中，利用雙份血清IgG抗體檢測「金標準」診斷MP感染21例，陽性率21%。待評價4種方法的檢出率、靈敏度、特異性、陽性預測值、性預測值和陽性似然比如表1和表2所示。可見，本發明所採用實施例1獲得的引物對MPP7進行實時螢光定量PCR檢測的方法，其陽性檢出率最高。對於靈敏度、特異性、陽性預測值、性預測值和陽性似然比這5個指標，本發明所採用實施例1獲得的引物對MPP7進行實時螢光定量PCR檢測的方法，均顯著高於其它三種對照方法。
[0067]表1不同方法陽性檢出率的比較
【權利要求】
1.用於檢測或輔助檢測肺炎支原體的引物對，其特徵在於:所述引物對為引物對I或引物對2或引物對3 ; 所述引物對I為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對；所述引物對2為由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對；所述引物對3為由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對。
2.根據權利要求1所述的引物對，其特徵在於:組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子的摩爾比為1:1。
3.製備權利要求1或2所述引物對的方法，包括將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝的步驟。
4.用於檢測或輔助檢測肺炎支原體的試劑盒，其特徵在於:所述試劑盒含有權利要求1或2所述的引物對和如下物質中的至少一種:dNTP、DNA聚合酶和螢光染料。
5.製備權利要求4所述試劑盒的方法，包括如下步驟:將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝後，與如下物質中的至少一種包裝於同一個試劑盒內:dNTP、DNA聚合酶和螢光染料。
6.根據權利要求4所述的試劑盒或權利要求5所述的方法，其特徵在於:所述螢光染料為 SYBR green ο
7.權利要求1或2所述引物對，或權利要求4所述的試劑盒在製備檢測或輔助檢測肺炎支原體的產品中的應用。
8.根據權利要求1-7中任一所述的引物對或方法或試劑盒或應用，其特徵在於:所述肺炎支原體為人肺 炎支原體。
【文檔編號】C12Q1/04GK103740837SQ201410018489
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】高宇輝, 曲久鑫, 曹彬 申請人:高宇輝