子宮內膜異位相關疾病的診斷方法

2023-06-13 21:19:36

專利名稱：子宮內膜異位相關疾病的診斷方法
技術領域：
本發明涉及子宮內膜異位(endometriosis)相關疾病的分子生物學的診斷方法。此外，本發明涉及利用了子宮內膜異位的分子機制的該疾病的治療藥物以及治療方法。
背景技術：
子宮內膜異位通常為婦科疾病，該疾病對10％處於生育年齡的女性群體有影響(非專利文獻1)。子宮內膜異位的組織與正常的子宮內膜一樣，經歷周期性的增殖和破壞，導致了周期性的痛經、性交疼痛症、骨盆痛以及月經時發生血尿。此外，據報導30～40％的不孕患者患有該疾病(非專利文獻2)。尚且不清楚在部分患者中出現的子宮內膜細胞轉移、在其它位置增殖時的機制，不過炎症細胞因子的脫離調控有可能導致了子宮內膜異位的發展(非專利文獻3、4)。事實上，單細胞的激活和向腹腔內的移動在子宮內膜異位中是最常見報導的成為免疫學異常之一(非專利文獻5～8)。
二噁英(Dioxin)是擾亂內分泌的物質中的一種，其普遍存在於環境中。3，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxisin(TCDD，Dioxin)是在二噁英類之中毒性最強的物質，其具有各種毒性效果(例如免疫毒性、血液毒性、致畸毒性以及致癌性等)(非專利文獻9、10)、TCDD以及相關化合物所誘導的基因表達的變化是從毒素與芳香烴受體(AhR)(Aryl hydrocarbon receptor)結合的時間點開始的，然後芳香烴受體與芳香烴受體核轉位子(aryl hydrocarbon receptornuclear trans1ocator，ARNT)形成二聚體，形成與含有XRE(異物應答序列)基序的基因調控元件相互作用的複合體(非專利文獻11、12)。將猴子慢性暴露在TCDD中，劑量依賴性地發生了從輕度到重度的子宮內膜異位(非專利文獻13)，對二噁英與子宮內膜異位的相關性進行了幾個研究(非專利文獻14～18)。不過，最近的報告指出了暴露於TCDD與子宮內膜異位無關的結果(非專利文獻19、20)，導致暴露於二噁英與子宮內膜異位的相關性至今不明。
本發明人等鑑定了含有IgE依賴性組胺釋放因子(HistamineReleasing FactorHRF)的TCDD目的基因(非專利文獻21～23)。不過，對於作為這種TCDD目的基因產物的HRF與子宮內膜異位的關係一無所知。
非專利文獻1Wheeler J.M.J.Reprod Med.1989，34(1)41-6非專利文獻2Candiani G.B.et al，Obstct Gynecol.Surv.1991，46(6)374-82非專利文獻3Garcia-Velasco J.A.and Arici A.FertilSteril.1999，71(6)983-93非專利文獻4Barcz et al.Med.Sci.Monit.2000，6(5)1042-6非專利文獻5Jolicoeur C.et al.Am.J.Pathol.1998，152(1)125-33非專利文獻6Lebovic D.I.et al.Fertil Steril 2001，75(1)1-10非專利文獻7Hornung D.et al.Am.J.Pathol.2001，158(6)1949-54非專利文獻8Blumenthal R.D.et al.Am.J.Pathol.2000，156(5)1581-8非專利文獻9Chapman D.E.and Schiller C.M.Toxicol Appl.Pharmacol.1985，78(1)147-57非專利文獻10McGregor D.B.et al.Environ Health Perspect.1998，106 Suppl 2755-60非專利文獻11Sagawa K.and Fujii-Kuriyama T.J.Biochem.(Tokyo)1997，122(6)1075-9非專利文獻12Nebert D.W.Crit.Rev.Toxicol.1989，20(3)153-74非專利文獻13Rier S.E.et al.Fundam.Appl.Toxicol.1993，21(4)433-41非專利文獻14Gibbsons A.Science 1993，262(5183)1373非專利文獻15Obsteen K.G.and Sierra-Rivera E.Endocrinol.1997，15(3)301-8非專利文獻16Bruner-Tran K.L.et al.Gynecol.Obstet.Invest.1999，48 Suppl.145-56非專利文獻17Johson K.L.et al.Environ Health Perspect1997，105(7)750-5非專利文獻18Yang J.Z.and Foster W.G.Toxicol.Ind.Health1997，13(1)15-25非專利文獻19Igarashi T.et al.Endocr.J.1999，46(6)765-72非專利文獻20Pauwels A.et al.Hum.Reprod.2001，16(10)2050-5非專利文獻21Oikawa K.et al.Cancer Res.2001，61(15)5707-9非專利文獻22Oikawa K.et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，290(3)984-7非專利文獻23Ohbayashi et al.FEBS Lett.2001，508(3)341-4發明內容以往除了用腹腔內視鏡看血的方法診斷子宮內膜異位之外，還沒有其他有效的方法。
一方面針對各種人類疾病，以該疾病特異的標記物蛋白質或者其基因表達為指標的分子生物學診斷不斷普及。這種方法不需要太大的設備，對受檢者造成的負擔很少，即使對多數無自我感覺症狀的受檢者也可以大範圍地實施。不過，對於子宮內膜異位而言，尚且不知道用於進行這種分子生物學的診斷方法的有效的標記物蛋白質或者其基因。
本發明鑑於上述情況，以提供利用了與子宮內膜異位密切相關的標記物的分子生物學的診斷/治療方法為課題。
此外，本發明還以提供用於該診斷/治療方法的各種材料為課題。
本申請作為解決上述的課題，提供了以下(1)～(17)的發明(1)子宮內膜異位相關疾病的診斷方法，其特徵在於，測定受檢者機體試樣中組胺釋放因子(HRF蛋白質)的存在量，將HRF蛋白質的量與正常機體試樣(或稱「生物試樣」)中的量相比較，與正常機體試樣相比而HRF蛋白質的量表現出有意義地高的受檢者被判定為患有子宮內膜異位相關疾病的患者或者具有患該疾病的高風險者。
(2)識別HRF蛋白質的抗體。
(3)可與所述發明(2)的抗體不同的表位結合的抗體。
(4)上述發明(2)或者(3)的抗體，是用具有從序列表序列號2的胺基酸序列的第90～130位選出的連續的5～20個胺基酸殘基的肽作為免疫抗原而獲得的抗體。
(5)上述發明(2)或者(3)的抗體，是用具有從序列表序列號2的胺基酸序列的第1～95位選出的連續的5～20個胺基酸殘基的肽作為免疫抗原而獲得的抗體。
(6)上述發明(2)或者(3)的抗體，是用具有從序列表序列號2的胺基酸序列的第115～172位選出的連續的5～20個胺基酸殘基的肽作為免疫抗原而獲得的抗體。
(7)子宮內膜異位相關疾病的診斷方法，其特徵在於，其中至少包括下述工序(a)使受檢者的機體試樣與固定有上述發明(2)的抗體的載體接觸的工序；(b)洗滌在工序(a)中與機體試樣接觸的載體的工序；(c)使標記的上述發明(3)的抗體接觸經過工序(b)的洗滌後的載體的工序；(d)測定載體上的結合標記或者游離標記的工序；(e)以在工序(d)中測定的標記量作為HRF蛋白質的量的指標，與正常機體試樣的結果進行比較的工序；以及，(f)將與正常機體試樣進行比較而表現出有意義地高的HRF蛋白質的量作為表示與子宮內膜異位相關疾病或者該病的患病風險程度的指標的工序。
(8)子宮內膜異位相關疾病的診斷方法，其特徵在於，其中至少包括下述工序(a)對受檢者的機體試樣進行組織固定化處理的工序；(b)將工序(a)中製備的組織固定化標本製成切片的工序；(c)以上述發明(2)的抗體對在工序(b)中得到的切片組織進行免疫組織染色的工序；(d)以在工序(c)中得到的免疫組織染色的程度作為HRF蛋白質的量的指標，與正常機體試樣的結果進行比較的工序；以及(e)將與正常機體試樣進行比較而表現出有意義地高的HRF蛋白質的量作為表示與子宮內膜異位相關疾病或者該病的患病風險程度的指標的工序。
(9)子宮內膜異位相關疾病診斷試劑盒，其特徵在於，含有至少標記了的上述發明(2)的抗體。
(10)子宮內膜異位相關疾病診斷試劑盒，其特徵在於，其中至少含有下述要素(a)上述發明(2)的抗體；以及，(b)標記了的上述發明(3)的抗體。
(11)子宮內膜異位診斷試劑盒，其特徵在於，其中至少含有下述要素(a)固定有上述發明(2)的抗體的載體；以及，(b)標記了的上述發明(3)的抗體。
(12)一種抗體，其可識別HRF蛋白質，並且可中和HRF蛋白質的活性。
(13)子宮內膜異位相關疾病的治療藥物，其特徵在於，其中含有權利要求12的抗體。
(14)子宮內膜異位相關疾病的治療方法，其特徵在於向體內給予權利要求12的抗體或者權利要求13的治療藥物。
即，本發明人等調查在子宮內膜組織和子宮內膜異位移植物中的TCDD目的基因(HRF，CYP1A1)的表達，結果發現子宮內膜異位的發展與HRF的表達水平之間具有很高的相關性關係，至此完成本發明。
在本發明中，「子宮內膜異位相關疾病」指的是子宮內膜異位以及由於子宮內膜異位導致的月經困難症、不孕症以及子宮腺肌病等。「診斷」指的是對受檢者是否患有子宮內膜異位相關疾病的判定、對是否存在將來患有子宮內膜異位的危險性的判定以及對是否存在在治療後子宮內膜異位相關疾病再復發的危險性的判定。此外，在診斷中也包括對所患有的子宮內膜異位或者其患病的危險性達到何種程度的測定。
並且，在發明中，「HRF多聚寡核苷酸」指的是編碼HRF蛋白質的多聚寡核苷酸(嘌呤或者嘧啶在糖上以β-N-糖苷鍵結合後形成的核苷酸的磷酸酯(ATP、GTP、CTP、UTP；或者dATP、dGTP、dCTP、dTTP))結合的分子。具體而言，是指編碼HRF蛋白質的基因組DNA、從基因組DNA轉錄得到的mRNA、從mRNA合成的cDNA。此外，可以是雙鏈，也可以是單鏈。另外，還包括這些基因組DNA或者mRNA、cDNA的正義鏈以及反義鏈。此外，所說的「多聚寡核苷酸」指的是結合有不少於100個核苷酸的分子，「寡核苷酸」指的是連接有2～99個的分子。此外，「蛋白質」和「肽」指的是由通過醯胺鍵(肽鍵)相互結合的多個胺基酸殘基構成的分子。特別是將具有2～33個胺基酸殘基的物質稱為「寡肽」，將具有不少於34個胺基酸殘基的物質稱為「多肽」。
此外還包括對序列表所示的鹼基序列以及胺基酸序列進行1個以上鹼基的添加、缺失、向其他鹼基的置換、或者以這些鹼基突變為基礎的1個以上胺基酸殘基的添加、缺失以及向其它胺基酸的置換。
在發明的實施方式的說明或者在實施例中對在本發明中的其他的用語或者概念進行了詳細的規定。用語基本上以IUPAC-IUBCommission on Biochemical Nomenclature為依據，或者以本領域中慣用的用語的含義為依據。此外，為了實施本發明而使用的各種技術，除了特別明示有出處的技術之外，均為根據公知的文獻等本領域的技術人員可以容易並且確實地實施的技術。可以根據下述中記載的方法或者其中引用的文獻記載的方法或者與之本質上相同的方法或者其改良方法實施(其中的某些內容可以作為參考也包括在本說明書的內容中)例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，18thEdition，ed.A.Gennaro，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990中記載的藥劑的製備；J.Sambrook，E.F.Fritsch T.Maniatis，「MolecularCloningA Laboratory Manual(2ndedtion)」，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；D.M.Gloveret al.ed.，「DNA Cloning」2nded.，Vol 1 to 4，(The PracticalApproach Series)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley Sons，New York，N.Y，1995；日本生化學會編「續生化學實驗講座I、基因研究方法II」、東京化學同人(1986)；日本生化學會編、「新生化實驗講座2、核酸III(重組DNA技術)」、東京化學同人(1992)；R.Wu ed.，「Methods in Enzymology」，Vol.68(Recombinant DNA)，Academic Press，New York(1980)；R.Wued.，「Methods in Enzymology」，Vol.100(Recombinant DNA，PartB)101(Recombinant DNA，PartC)，Academic Press，New York(1983)；R.Wu et al.ed.，「Methods in Enzymology」，Vol.153(Recombinant DNA，Part D)，154(Recombinant DNA，Part E) 155(Recombinant DNA，Part F)，Academic Press，New York(1987)；J.H.Miller ed.，「Methods in Enzymology」，Vol.204，AcademicPress，New York(1991)；R.Wu et al.ed.，「Methods in Enzymology」，Vol.218，Academic Press，New York(1993)；S.Weissman(ed.)，「Methods in Enzymology」，Vol.303，Academic Press，New York(1999)；J.C.Glorioso et al.(ed.)，「Methods in Enzymology」，Vol.306，Academic Press，New York(1999)等中記載的基因工程學以及分子生物學技術。


圖1表示調查來自正常組織子宮內膜組織、子宮內膜異位患者的正常子宮內膜組織以及子宮內膜異位移植物上的HRF與CYP1A1的表達的結果。(A)通過Northern印跡分析對HRF mRNA水平進行調查。用人β肌動蛋白探針進行印跡的再次探測，測定總RNA水平。通過用於分析Sourthern印跡的定量RT-PCR來測定由Northern印跡所檢查的試樣中的CYP1A1的mRNBA水平。為了確認定量的精度，將5倍不同濃度的cDNA試樣(1×以及5×)作為PCR的模板，以相同的配置進行檢查。將β肌動蛋白作為mRNA量的內部對照。(B)展示的是同樣表示對應於HRF以及CYP1A1的mRNA水平的圖。使用densintometry(MOLECULAR IMAGER，Nippon Bio-Rad)將mRNA水平相對β肌動蛋白信號進行標準化處理。試樣11-2A表示HRF的mRNA水平，10-2A表示CYP1A1的mRNA水平，任意地設定為10。當多個試樣來自一個人時，通過計算用平均值表示。誤差線(Error Bar)表示多個試樣的最大值。12-1、7-1、8-1以及6B為正常子宮內膜組織，標有星號的1C為子宮內膜異位患者的正常部位的子宮內膜。
圖2是調查子宮內膜異位移植物中的HRF表達的結果。(A)是用Northern印跡分析正常子宮內膜組織、子宮內膜異位患者的正常部位的子宮內膜組織以及子宮內膜異位移植物中的HRF的表達的結果。在印跡中使用β肌動蛋白探針進行再探測，測定總的RNA水平。柱條上的N、Eu以及En分別表示正常子宮內膜組織、子宮內膜異位患者的正常部位的子宮內膜組織以及子宮內膜異位移植物。(B)表示的是對於圖1A以及圖2A中調查的試樣，通過Northern分析測定得到的表示HRF mRNA水平的柱圖。使用densintometry(MOLECULAR IMAGER，NipponBio-Rad)將HRF mRNA水平相對β肌動蛋白信號進行標準化處理。將試樣6B的mRNA水平任意設定為1。當多個試樣來自1個人的時候，經計算用平均值表示。誤差線表示多個試樣的最大值。
圖3是免疫組織化學分析HRF以及CD68的表達的結果。用茶色的染色使陽性部分可見。用蘇木素進行逆染。檢測(A)以及(B)的正常子宮內膜組織中的HRF蛋白質(A增殖期，B分泌期，原圖放大倍率×200)。(C)檢測在卵巢子宮內膜異位移植物內部的HRF蛋白質(原圖放大倍率×200)。(D)表示子宮內膜異位移植物的形態的連續切片的HE染色結果(原圖放大倍率×200)。(E)以更高倍率檢測與(C)相同視野的HRF蛋白質(原圖放大倍率×400)。(F)在子宮內膜異位移植物的連續切片上的CD68陽性巨噬細胞的免疫組織化學分析的局部圖(原圖放大倍率×400)。
圖4是移植分析的結果。(A)NIH3T3細胞內的HRF蛋白質的western印跡分析的結果。wt親本NIH3T3細胞，HRF含有HRF的逆轉錄病毒載體感染後穩定表達HRF的細胞株(pMSCV-HRF-3T3)、vector用空載體感染的對照細胞(pMSCV-3T3)。(B)表示表現出HRF過表達的細胞在裸鼠中具有高的移植效率。縱軸上的標記表示如下的狀態。+++觀察到無數的移植克隆的狀態；++觀察到數十個移植克隆的狀態；+觀察到幾個移植克隆的狀態；-未觀察到移植克隆的狀態。分別用白色圓形或黑色圓形表示用對照細胞或者HRF過表達細胞注射過的小鼠。
具體實施例方式
本申請發明(1)的診斷方法為測定在受檢者的機體試樣中的組胺釋放因子(HRF蛋白質)的存在量，將HRF蛋白質的量作為指標診斷子宮內膜異位相關疾病的方法。即，將與正常機體試樣相比，HRF蛋白質的量有意義地多的受檢者判定為患有子宮內膜異位相關疾病的患者或者具有患該病風險的人。即，將HRF蛋白質的存在量有意義地多的受檢者判定為患有子宮內膜異位相關疾病的患者或者具有患有該病風險的人。因為由HRF基因表達的HRF蛋白質的存在量與子宮內膜異位相關疾病具有密切關係，所以可以以受檢者的機體試樣(例如子宮內膜組織等)中的HRF蛋白質的量作為指標，對子宮內膜異位進行診斷。此外，HR蛋白質的量「有意義地多」指的是將受檢者的HRF蛋白質的量與在正常機體試樣(即，健康的正常人的機體試樣)中測定的HRF蛋白質的量相比較，其為10％以上，優選30％以上，更優選70％以上，最優選100％以上的情況。此外，該「有意義地多」還指例如對於同一個受檢者的多個試樣的HRF多聚核苷酸表達量的平均值與多個在正常試樣中的相同的平均值進行統計學的檢測的時候，前者比後者更有意義地多的情況。
如上所述的以HRF蛋白質的量為指標的發明(1)的診斷方法，可以按照公知的基因工程學以及分子生物學技術，通過本領域用於測定檢驗中特定的蛋白質的量的已知方法，例如原位雜交、Western印跡、各種免疫組織學方法等檢驗、測定HRF蛋白質的量。利用這種技術的HRF蛋白質的量測定體系、子宮內膜異位相關疾病的檢測體系、子宮內膜異位相關疾病的風險檢測體系、所述體系中利用的試劑、方法、工藝、解析程序等全部包括在本發明的技術以及利用該技術的系統中。
作為用於上述發明(1)的診斷方法中使用的材料，本申請特別提供了下述發明(2)和(3)的抗體。
發明(2)的抗體是能夠特異性識別HRF蛋白質的抗體(抗HRF抗體)。並且此處所說的「抗體」既可以是在廣義含義下使用的抗體，也可以是針對目的HRF多肽以及相關肽片斷的單克隆抗體的單一物質或者是具有針對各種表位的特異性的抗體組合物，此外，也包括一價抗體或者多價抗體以及多克隆抗體和單克隆抗體，而且，還包含完整(intact)分子、其片段以及其衍生物，所謂的F(ab′)2、Fab′以及Fab片段，此外，還包括至少具有2個抗原或者表位(epitope)結合部位的嵌和抗體或者雜和抗體，此外，還包含例如四聚物(quadrome)、三聚物(Triome)等雙特異型的重組抗體、種間雜和抗體、抗獨特型抗體，以及經過化學修飾或者加工等的這些抗體的衍生物，可以是應用公知的細胞融合或者雜交瘤技術或者抗體工程，或使用合成或者半合成技術得到的抗體，從生成抗體的角度出發，可以是採用公知的以往技術或者使用DNA重組技術製備的抗體，具有對本說明書中記載並且定義的目的抗原物質或者目的表位的中和特性的抗體或者結合特性的抗體。特別優選的抗體為完整的能特異地識別HRF蛋白質(多肽)的抗體，例如上述發明(4)～(6)的抗體等。
即，發明(4)～(6)的抗體分別為用序列號2的胺基酸序列組成的HRF蛋白質的部分肽作為抗原製備得到的抗體，分別為識別HRF蛋白質的不同部位的抗體。例如使用肽合成儀諸如以Fmoc-bop法合成用於製備這種抗體的HRF肽。也可以在HRF肽的N末端導入組氨酸。可以通過使用μBondasphere、C18柱(Waters)等高效液相層析柱等進行純化，作為免疫抗原使用。
發明(3)的抗體為結合到與上述發明(2)的抗體不同的表位的抗體。這種抗體是通過將與用於製備上述發明(2)的抗體的寡肽不同的片斷作為免疫原製備得到的。例如上述發明(4)～(6)的抗體中的任何一個均可以作為發明(2)的抗體，其他可以作為發明(3)的抗體。
當這種抗體例如為多克隆抗體時，可用HRF蛋白質或者其片斷(寡肽)作為免疫原免疫動物然後，從血清得到。或者通過注射HRF蛋白質多核苷酸的重組載體或者通過基因槍將其導入到動物的肌肉或者皮膚然後，通過獲取血清的方法進行製備。作為動物可以使用小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、綿羊、牛、馬、豬、狗、貓、猴、雞等。此外，優選考慮到與用於適合於細胞融合的親本細胞的動物。
將致敏抗原免疫動物時，可以按照公知的方法例如村松繁等編、試驗生物學講座14、免疫生物學、丸善株式會社、昭和60年，日本生化學會編、續生化學試驗講座5、免疫生化學研究法、東京化學同人、1986年，日本生化學會編、新生化學試驗講座12、分子免疫學III、抗原/抗體/補體，東京化學同人，1992年等中記載的方法進行。例如作為常規的方法，通過將致敏抗原向哺乳動物等的腹腔內或者皮下注射等。此外，也可以在致敏抗原免疫時使用適當的載體。可以通過將用於免疫的製劑(根據需要可以和佐劑一起)一次或者多次注射到哺乳動物中進行免疫。代表性的有將該用於免疫的製劑以及/或者佐劑向哺乳動物中進行多次皮下注射或者腹腔內注射。用於免疫的製劑例如可以是含有上述抗原肽或者其相關肽片斷。用於免疫的製劑，也可以使用與已知在哺乳動物體內具有免疫原性的蛋白質(例如上述載體蛋白質類等)形成的偶聯物。作為佐劑，可以列舉弗氏完全佐劑、Ribi佐劑、百日咳疫苗、BCG、脂質A、脂質體、氫氧化鋁、二氧化矽等。
將免疫後的動物飼養一定的時間後，可以從由該動物獲取的血液中製備含有多克隆抗體的血清。確認所得到的抗血清能識別HRF後，就可以將其作為本發明特定的活性成分。
在該發明中，作為抗HRF抗體，也可以使用作為來自哺乳動物的單克隆抗體而獲得的抗體，可以使用任何方法使培養的一系列細胞系產生抗體分子。修飾語「單克隆抗體」指的是從實質上為均質的抗體的團體中得到的具有其抗體特性的抗體。只要是能使該抗體產生所需要的，可以採用任何特定的方法，沒有限制。多種單克隆抗體可以是自然產生的，也以可以是僅以少量存在的突變體，除此之外，可以含有相同抗體的集合。單克隆抗體具有高特異性，其針對的是具有單一的抗原性的位點。與常規的典型地含有針對不同抗原決定簇(表位)的多種抗體的抗體製備物相比較，各單克隆抗體針對的是該抗原上的單一的抗原決定簇。除了其特異性之外，單克隆抗體是通過培養的雜交瘤合成的，具有在不夾雜有或者少夾雜其他免疫球蛋白類方面的優點。單克隆抗體包括雜交瘤抗體以及重組抗體。這些抗體只要具有所期望的生物活性，不限制其來源或者免疫球蛋白的類型或者亞型的種類，可以用恆定區置換可變區或者用重鏈置換輕鏈，用其他種類的鏈置換某種的鏈，或者使之與異種蛋白質融合得到的抗體(例如美國專利4816567號Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.79-97，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987等)。
此外，單克隆抗體可以按照公知的單克隆抗體的製備方法(《單克隆抗體》、長宗香明、寺田弘共著，廣川書店，1990年，「MonoclonalAntibody」James W.Goding，third edition，Academic Press，1996)。
用於製備這種抗體的HRF蛋白質或者HRF肽可以是例如使用含有HRF多聚核苷酸的重組表達載體的公知的體外轉錄、翻譯方法或者適當的宿主(大腸桿菌、枯草桿菌等原核細胞、或者酵母、昆蟲細胞、動植物細胞等(例如也包括蠶等昆蟲))-載體系統(例如也包括杆狀病毒載體系統)通過基因重組技術得到的。例如根據序列表序列號1的HRF基因/胺基酸序列，將編碼具有HRF或者其一部分的區域、HRF的部分蛋白質或者多肽片段、相當於HRF的胺基酸序列的一部分的胺基酸序列的肽的核酸序列插入到公知的表達載體中，轉化到適當的宿主細胞後，用公知的方法從該宿主細胞或者其培養上清中純化具有目的HRF蛋白質或者其一部分的區域的蛋白質、HRF的一部分的蛋白質或者多肽片段、相當於HRF胺基酸序列的一部分的胺基酸序列的肽。此外，特別是可以用固相法等公知的方法通過化學合成的方法合成寡肽。
並且，HRF多核苷酸已知各種突變體(例如GenBank/XM_294045、XM_038391、XM_293291、XM_209741、XM_210566、XM_066706、XM_066675、XM_071321等)，作為優選例，可列舉SEQ ID1(鹼基序列)所示的HRF cDNA(或者TPT-1GenBank/NM_003295)。這種多肽可以通過各種公知的方法簡單地得到。例如為cDNA的情況下，可以使用公知的方法(Mol.Cell Biol.2，161-170，1982；J.Gene25，263-269，1983；Gene，150，243-250，1994)合成cDNA，使用分別以公知的鹼基序列為基準而製備的探針DNA，通過分離各cDNA的方法得到cDNA。可以將得到的cDNA通過例如PCR(Polymerase ChainReaction)法、NASBN(Nucleic acid sequence based amplification)法、TMA(Transcription-mediated amplification)法以及SDA(Strand Displacement Amplification)法等常規的基因擴增方法進行擴增。此外，使用根據本發明提供的引物組，以從人的細胞中分離的mRNA為模板，通過RT-PCR法得到必要量的各cDNA。
此外，可以通過用適當的限制性酶切斷上述的多核苷酸(cDNA)，得到編碼特定的HRF肽的HRF多核苷酸。或者根據Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418；Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105661；Belousov(1997)Nucleic AcidRes.253440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19373-380；Blommers(1994)Biochemistry 337886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.6890；Brown(1979)Meth.Enzymol.68109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.221859；美國專利4458066號中記載的公知的化學合成技術，在體外進行合成。
發明(2)和(3)的抗體根據需要可以以從其中純化後的形態供給使用。作為純化、分離抗體的方法，可以使用公知的方法，例如硫酸銨沉澱法等鹽析、葡聚糖等凝膠過濾法、離子交換層析法、電泳法、透析、超濾法、親和層析法、高效液相層析法等進行純化後使用。優選將含有抗血清、單克隆抗體的腹水等經過硫銨分級後，用諸如DEAE-瓊脂糖的陰離子交換凝膠以及諸如蛋白A柱的親和柱等處理，進行純化分離。特別優選的可列舉固定有抗原或者抗原片斷(例如合成肽、重組抗體蛋白質或者肽、抗體特異性識別的部位等)的親和層析、固定有蛋白A的親和層析、羥基磷灰石層析等。
也可以使用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶處理這些抗體，根據情況經過還原後得到的所謂Fab、Fab′、F(ab′)2的抗體片斷。可以使用已知的任意的檢測方法、例如競爭性結合測定、直接以及間接夾心測定以及免疫沉降測定對抗體進行檢測(Zola，MonoclonalAntibodiesA Manual of Techniques，pp.147-158(CRC Press，Inc.，1987))。
可以使用本領域中已知的各種方法向抗體上偶聯各種可以檢測的原子團，例如David et al.，Biochemistry，13卷，1014-1021頁(1974)；Pain et al，J.Immunol.Meth.，40pp.219-231(1981)；以及「Methods in Enzymology」，Vol.184，pp.138-163(1990)中記載的方法。作為添加了標記物的抗體，可以使用IgG級分，此外，可以使用胃蛋白酶消化還原後得到的特異結合部Fab′。
已知有很多能夠固定抗原或者抗體的載體，在本發明中，可以從中適當加以選擇。作為載體，已知有多種用於抗原抗體反應等的載體，在本發明中當然也可以使用選自這些公知的載體。作為特別適合的載體，例如玻璃，例如氨基烷基矽烷玻璃等活化玻璃、多孔玻璃、矽膠、二氧化矽-氧化鋁、氧化鋁、磁化鐵、磁化合金等無機材料、聚乙烯(Polyethylene)、聚丙烯、聚氯化乙烯、聚偏氟乙烯、聚乙烯(polyvinyl)、聚醋酸乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚丙烯醯胺、交聯聚丙烯醯胺、苯乙烯-甲基丙烯酸酯、聚縮水甘油甲基丙烯酸酯、丙烯醛-乙二醇丙烯酸二酯共聚物等、交聯的白蛋白、膠原、明膠、糊精、瓊脂、交聯瓊脂、纖維素、結晶纖維素、羧甲基纖維素、纖維素乙酸酯等天然或者合成的纖維素、交聯糊精、尼龍等聚醯胺、聚氨基甲酸乙酯、聚環氧樹脂等有機高分子物質，此外，將其乳化聚合得到物質，矽橡膠等、細胞、紅細胞等根據需要，通過矽烷偶合劑等導入官能基團。
作為載體，可列舉粒子、微粒、微小粒子、膜、濾紙、珠子、試管、管子、試驗容器的內壁，例如試管、滴定板(titer plate)、滴度孔、微孔、玻璃池、合成樹脂的小池等由合成材料構成的小池、玻璃棒、由合成材料構成的棒、使末端加粗或者變細的棒、使末端具有圓形突起或者具有扁平突起的棒、製成平板狀的棒等的固體物質(物體)的表面等。
可以通過使用吸附等物理方法或者縮合劑等、或採用活化後的物質等的化學性方法、以及利用相互的化學性結合反應的方法等向這些載體上結合HRF抗體。
發明(2)和(3)的抗體中還包括通過分別以標記物進行標記的抗體。作為標記，可列舉酶、酶底物、酶抑制劑、輔因子類、輔酶、酶前體、輔基酶蛋白、螢光物質、色素物質、化學發光化合物、發光物質、發色物質、磁物質、金屬粒子，例如金膠體等、非金屬元素粒子、例如膠體銀等、放射性物質等。優選的標記物質可以使用包括酶、放射性同位素或者螢光色素的化學物質。酶只要能夠滿足單位時間內每摩爾酶所能催化的基質數(turn over number)越大，與抗體結合越穩定，可使基質特異性地著色等的條件即可，沒有特別的限制，可以使用通常在EIA中使用的酶。作為酶，有脫氫酶、還原酶、氧化酶等氧化還原酶，例如催化胺基酸、羰基、甲基、醯基、磷酸基等轉移的轉移酶，例如水解酯鍵、糖鍵、醚鍵、肽鍵等的水解酶、裂合酶、異構酶、連接酶等。可以將多個酶聯合使用進行檢測。例如可以利用酶循環。酶標記等可以置換成生物素標記物和親和酶標親和素(鏈黴親和素)。這樣，使用生物素-親和素系統，或者使用針對抗HRF抗體的抗體等的二抗等，可以適當採用本領域內公知的能增加敏感度的方法。可以使用多種不同種類的標記進行標記。這種情況下，可以連續地或者非連續地、同時或者分別地進行多個測定。
作為代表性的酶標記，可列舉辣根過氧化物酶等過氧化物酶、大腸桿菌β-D-半乳糖苷酶等半乳糖苷酶，蘋果酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶、糖化酶、乙醯膽鹼酯酶、過氧化氫酶、牛小腸鹼性磷酸酶、大腸桿菌鹼性磷酸酶等鹼性磷酸酶等。
可以用馬來醯亞胺化合物等交聯劑按照公知的方法使這些酶與抗體結合。作為底物，可以使用與所用的酶的種類相對應的公知的物質。例如4-甲基傘形花磷酸酯(umbelliferone phosphate)等羥基香豆素衍生物、硝基苯基磷酸酯等磷酸化酚衍生物等。例如可以在用過氧化物酶作為酶時，使用3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺，或作為酶用鹼性磷酸酶時，可以使用對硝基苯酚等。在本發明中，在形成信號時，也可以組合使用4-羥苯基醋酸、o-苯二胺(OPD)、四甲基聯苯胺(TMB)、5-氨基水楊酸、3，3-二氨基聯苯胺四氫氯化物(DAB)、3-氨基9-乙基卡巴唑(AEC)、酪胺、發光氨、光澤精蟲螢光素(Lucigenin Luciferin)及其衍生物；Pholad luciferin等和辣根過氧化物酶等的過氧化物酶；Lumigen PPD、(4-甲基)傘形酮內酯-磷酸、p-硝基酚-磷酸、酚-磷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、AMPAKTM(DAKO)、AmpliQTM(DAKO)等和鹼性磷酸酶；4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷這種傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷、o-硝基酚-β-D-葡萄糖醛酸苷等硝基酚葡萄糖醛酸苷等與基β-D-葡萄糖醛酸苷酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、TBTS等與葡萄糖氧化酶等酶試劑。可以使用對苯二酚、羥基苯醌、羥基蒽醌等對苯二酚化合物、硫辛酸、穀胱甘肽等的硫醇類化合物、酚衍生物等在酶等作用下形成的物質。
作為放射性同位素，可以使用常規在RIA中使用的32P、125I、14C、35S、3H等。作為螢光物質或者化學發光化合物，可列舉異硫氰酸螢光素(FITC)，例如異硫氰基羅丹明B、四甲基異硫氰基羅丹明(RITC)、四甲基異硫氰基羅丹明異構體R(TRITC)等羅丹明衍生物、7-氨基-4-香豆素-3-醋酸、丹磺醯氯、丹磺醯氟、螢光胺、藻膽素、吖啶酯鹽、光藻素、螢光素酶、雌馬酚等發光胺、咪唑、草酸酯、稀土類螯合化合物、香豆素衍生物等。作為螢光色素，可以使用通常在螢光抗體法中使用的物質。在對包括發色、螢光等生成的信號等進行檢測時，既可以通過目測，也可以使用公知的裝置，例如也可以使用螢光光度計、讀板儀等。此外，在對放射性同位素等發出的信號進行檢測時，也可以使用公知的裝置，例如也可以使用γ計數器、液閃計數器等。
在標記抗體時，可以利用硫醇基和馬來醯亞胺基的反應、吡啶基雙硫基和硫醇基的反應、氨基和醛基的反應等，也可以從公知的方法或者本領域的技術人員容易得到的方法，還有對這些進行修飾後的方法中加以適當選擇。可以使用能在製備免疫原性複合物中使用的縮合劑、能在與載體的結合中使用的縮合劑等。作為縮合劑，可以列舉甲醛、戊二醛、六甲撐二異氰酸酯、六甲撐二異硫氰酸酯、N，N′-聚甲撐二碘乙醯胺、N，N′-乙撐二馬來醯亞胺、聚乙二醇二丁二醯琥珀酸酯、二重氮苯氰、1-乙基-3--(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺、琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶乙基)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀醯亞胺-4-(N-甲基馬來醯亞胺)環己烷-1-碳酸酯(SMCC)、N-磺酸琥珀醯亞胺基-4-(N-甲基馬來醯亞胺)環己烷-1-碳酸酯、N-琥珀醯亞胺基(4-碘乙醯)氨基苯甲酸酯、N-琥珀醯亞胺基4-(苯基來醯亞胺)丁酯、N-(ε-羥己醯馬來醯亞胺)琥珀醯亞胺(EMCS)、亞氨基四氫噻吩、S-乙醯基巰基琥珀酸酐、甲基-3-(4′-二巰基吡啶)丙醯胺酯、甲基-4-巰基丁醯亞胺酯、甲基-3-巰基丁醯亞胺酯、N-馬來醯胺-S-乙醯丁醯乙酯等。
作為在診斷方法中使用這種抗體的一種實施形式，是在液相體系中檢測抗體與HRF蛋白質的結合。例如將發明(2)的抗體進行標記，將標記了的抗體與機體試樣接觸使標記的抗體與HRF蛋白質結合，分離該結合物。可以用公知的分離方法(層析法、固相法等)作為分離方法等分離HRF蛋白質+標記抗體的結合物。此外，可以使用以公知的Western印跡為基準的方法。在測定標記的信號時，當用酶作為標記的情況下，加入在酶的作用下可分解顯色的底物，通過測定光學測定底物的分解量計算酶的活性，將其換算成結合的抗體量，與標準值進行比較計算出抗體量。當使用的是放射性同位素的情況下，用液閃計數器等測定放射性同位素髮出的放射線量。此外，使用的是螢光色素的情況下，可以通過組裝有螢光顯微鏡的測定裝置測定螢光量。
作為在液相體系進行診斷的以外的方法，可使發明(2)的抗體(一抗)與機體試樣接觸，使一抗與HRF蛋白質結合，使標記的發明(2)的抗體(二抗)與該結合物結合，檢測該三者結合物上的標記信號。或者，為了進一步增強信號，也可以首先將未標記的二抗與抗體+抗原肽結合物結合，然後向該二抗上結合標記物質。進行這種向二抗上結合標記物質時，例如可以將二抗進行生物素化，將標記物質進行親和素化。或者也可以標記可識別二抗的部分區域(例如Fc區域)的抗體(三抗)，使該三抗與二抗結合。並且，可以一抗和二抗二者都可以使用單克隆抗體，或者，也可以在一抗和二抗中的任何一方使用多克隆抗體。從液相中分離結合物或者檢測信號與上述相同。此外，作為可使該診斷方法簡便並且大範圍地實施的方式，提供發明(10)的診斷試劑盒。
使用抗體的其他的診斷方法是在固相體系中使抗體和HRF蛋白質結合的實驗方法。在該固相體系的方法中，優選的方法可進行極其微量的HRF蛋白質的檢測和簡便地操作的方法。即，該固相體系的方法是如下的方法將發明(2)的抗體固定到樹脂板上或者膜上等，使HRF蛋白質與該固定化的抗體結合，洗滌去除未結合的蛋白質後，使經標記了的發明(3)抗體的標記化抗體與板上殘留的抗體+HRF蛋白質結合物相結合，檢測該標記抗體的信號。該方法是稱為「夾心法」的方法，使用酶作為標記物的情況下，ELISA(enzyme linkedimmunosorbent assay)是廣泛使用的方法。其中的兩類抗體二者均可以使用單克隆抗體，或者其中的任何一方使用多克隆抗體。
在本發明中的診斷是通過免疫染色，例如組織或者細胞染色、免疫電子顯微鏡、免疫分析，可以進行例如競爭型免疫分析或者非競爭型免疫分析、放射免疫測定法(RIA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法(LIA)、酶免疫測定法(EIA)、ELISA等，在可以進行或者不進行B-F分離的情況下，對其進行測定。優選RIA、EIA、FIA、LIA，此外，可列舉夾心法分析。在夾心法測定中還可以包括同時夾心分析、正向(forward)夾心分析或者反向夾心分析等。
在本發明中，作為測定HRF蛋白質的量的系統，例如針對組織的免疫染色、免疫電鏡等的蛋白質測定體系；針對組織抽提物、血液、體液等的EIA、RIA、FIA、LIA、Western印跡等蛋白質測定體系。
在EIA測定體系中，例如在競爭法中將抗HRF抗體用作固定化抗體使用，使用標記抗原以及未標記抗原(作為抗原，可列舉HRF蛋白質或者其片段肽等)，此外，在非競爭法中，例如在夾心法中，可以利用固定化的抗HRF抗體或者標記的抗HRF抗體之外，可以直接標記抗HRF抗體，或者不進行固定化，針對抗HRF抗體進行抗體標記，來進行固定化。作為增加敏感度的方法，例如與非酶標記的一抗的組合可列舉利用高分子聚合物和酶以及一抗(例如使用Envision試劑；Enhanced polymer one-step staining(EPOS)等)；與非酶標記二抗的組合可列舉PAP(peroxidase-antiperoxidase)法等酶與抗酶抗體複合物的組合，SABC(avidin-biotinylated peroxidasecomplex)法等生物素標記二抗和親和素複合物的組合、ABC(Streptavidin-biotin complex)法、LSAB(labeledstreptavidin-biotin)法等生物素標記二抗以及生物素標記酶-鏈黴親和素複合物的組合、CSA(catalyzed signal amplification)法等SABC和生物素標記酪胺與酶標記鏈黴親和素的組合，用高分子聚合物標記二抗和酶等。
對於上述的常規的技術方法的詳細介紹可以參見綜述、書籍等，[例如入江寬編，「放射免疫分析」，講談社，昭和49年發行；入江寬編，「續放射免疫分析」，講談社，昭和54年發行；石川榮治等編，「酶免疫測定法」，醫學書院，昭和53年發行；石川榮治等編，「酶免疫測定法」(第2版)，醫學書院，昭和57年發行；石川榮治等編，「酶免疫測定法」(第3版)，醫學書院，昭和62年發行；H.V.Vunakiset al.(ed.)，「Methods in Enzymology」，Vol.70(ImmunochemicalTechniques，Part A)，Academic Press，New Youk(1980)；J.J.Langone et al.(ed.)，「Methods in Enzymology」，Vol.73(Immunochemical Techniques，Part B)」Academic Press，NewYouk(1981)；J.J.Langone et al.(ed.)，」Methods in Enzymology」，Vol.74(Immunochemical Techniques，Part C)，Academic Press，New York(1981)；J.J.Langone et al.(ed.)，「Methods inEnzynology」，Vol.84(Immunochemical Techniques，PartDSecected Immunoassays)，Academic Press，New York(1982)；J.J.Langone et al.(ed.)，「Methods in Enzymology」，Vol.92(Immunochemical Techniques，Part EMonoclonal Antibodies andGeneral Immunoassay Methods)，Academic Press，New York(1983)；J.J.Langone et al.(ed.)，「Methods in Enzymology」，Vol.121(Immunochemical Techniques，PartIHybridoma Technology andMonoclonal Antibodies)，Academic Press，New York(1986)；J.J.Langone et al.(ed.)，「Methods in Enzymology」，Vol.178(Antibodies，Antigens，and Molecular Mimicry)，Academic Press，New York(1989)；M.Wilchek et al.(ed.)，「Methods in Enzymology」，Vol.184(Avidin-Biotin Technology)，Academic Press，New York(1990)；J.J.Langone et al.(ed.)，「Methods in Enzymology」，Vol.203(Molecular Design and ModelingConcepts andApplications，Part BAntibodies and Antigens，Nucleic Acids，Polysaccharides，and Drugs)，Academic Press，New York(1991)等中的內容或者其中所引用文獻的內容。
本申請提供了作為在該固相體系中的細胞抽提物或者血液中測定蛋白質的量的診斷方法的發明(7)。即，該發明(7)是一種子宮內膜異位相關疾病的診斷方法，其特徵為其中至少包括下述工序(a)使受檢者的機體試樣與固定有上述發明(2)的抗體的載體接觸的工序；(b)洗滌在工序(a)中與機體試樣接觸的載體的工序；(c)使標記的上述發明(3)的抗體接觸經過工序(b)中洗滌後的載體的工序；(d)測定載體上的結合標記或者游離標記的工序；(e)以在工序(d)測定的標記量作為HRF蛋白質的量的指標，與正常機體試樣的結果進行比較的工序，以及(f)將與正常機體試樣進行比較而表現出有意義地高的HRF蛋白質的量作為表示患有子宮內膜異位相關疾病或者其風險程度的指標的工序。
此外，作為可使該診斷方法簡便並且在範圍地實施的方式，提供了發明(11)的診斷試劑盒。
此外，本申請提供了用作在固相體系中測定組織或者細胞的HRF蛋白質的量的方法的發明(8)的診斷方法。即，該方法是一種子宮內膜異位相關疾病的診斷方法，其特徵為其中至少包括下述工序(a)使受檢者的機體試樣進行組織固定化處理的工序；
(b)將在工序(a)中製備的組織固定化標本製成切片的工序；(c)通過上述發明(2)的抗體對在工序(b)中得到的組織切片進行免疫組織染色的工序；(d)以通過工序(c)測定的免疫組織染色的程度作為HRF蛋白質的量的指標，與正常機體試樣的結果進行比較的工序，以及(e)將與正常機體試樣進行比較而表現出有意義地高的HRF蛋白質的量作為表示患有子宮內膜異位相關疾病或者其風險程度的指標的工序。
在該發明(8)的方法中，可以使用1種抗體或者2種抗體(例如發明(2)的抗體和標記的抗Ig抗體等)進行通過抗體的免疫組織染色。
作為可有效地進行如發明(8)等的診斷的手段，提供了發明(9)的診斷試劑盒。
發明(9)～(11)的診斷試劑盒是為了進行上述各診斷方法的試劑盒。這些試劑盒可以根據被檢成分的種類存在各種市售的，本發明的診斷試劑盒除了可以使用由本發明提供的抗體和/或標記抗體之外，也可以使用公知公用的試劑盒中所用的各要素構成的試劑盒。
並且，通過本申請提供的診斷方法，可以將2種以上前述的各種方法相組合，或者可以例如並用以公知的方法(例如Northern印跡法、RT-PCR法、DNA微陣列法等)進行測定方法。
發明(12)是一種可識別HRF蛋白質，並且能中和HRF蛋白質的活性的抗體，發明(13)是含有該抗體的子宮內膜異位相關疾病的治療藥物。此外，發明(14)是一種治療子宮內膜異位相關疾病的方法，其特徵在於，向體內給予上述抗體或者治療藥物。
發明(12)的抗體是具有中和HRF蛋白質的活性(即，妨礙或者抑制HRF蛋白質的活性)的抗體，其對子宮內膜異位相關疾病的治療有效。如下面的實施例所示，HRF蛋白質產生過剩的細胞在體內增殖活躍，據此認為細胞內HRF蛋白質的過剩活性導致了子宮內膜組織的移植或者增殖。因此，通過中和該HRF蛋白質的活性，有可能治療子宮內膜異位或者至少停止或者抑制該病的發展、惡化。
將可使HRF強制表達的細胞置於小鼠等的動物體內，如注入到腹腔內，結果發現在腹腔內引起子宮內膜異位樣病變，據此闡明可以利用上述可中和HRF的抗體，抑制HRF的影響等，將其應用到治療中。
發明(12)的抗體，優選單克隆抗體，進一步優選人源化的單克隆抗體。將非人抗體進行人源化的方法是公知的，例如用人抗體的相應序列置換來自齧齒動物的抗體的互補決定區(CDR)(例如Joneset al.，Nature，1986，321522-525；Riechmann et al.，Nature，1988，332323-327；Verhoeyen et al.，Science，1988，2391534-1536)。這種「人源化」抗體是用自非人種的相對應的序列置換無傷的人的可變區域的1個或者多個胺基酸殘基得到的嵌合抗體(例如美國專利4816567)。實際上，人源化抗體典型的是用幾個CDR殘基以及根據不同情況的幾個FR殘基置換嚙齒類抗體對應部位的殘基而得到的抗體。此外，除此之外可以按照幾個公知的方法(例如Hoogenboom andWinter，1991，J.Mol.Biol.，227381；Marks et al.，1991，J.Mol.Biol.，222581；Cole et al.，1985，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss.p.77；Boerner et al.，1991，J.Immunol.，147(1)86-95)製備人源化抗體。此外，可以通過轉基因有人免疫球蛋白基因座的動物，例如將內源性免疫球蛋白基因導入到部分或者完全失活的小鼠中使之產生人源化抗體(例如美國專利5545807號、美國專利5569425號、美國專利5625126號、美國專利5633425號、美國專利5661016號，Marks et al.，1992，Bio/Technology10，779-783；Lonberg et al.，1994，Nature，368856-859；Morrison，1994，Nauture，368812-13；Fishwild et al.，1996，NatureBiotechnology，14845-51；Neuberger，1996，NatureBiotechnology，14826；Lonberg and Huszar，1995，Intern.Rev.Immunol.，1365-93)。
將發明(13)的藥劑製備成含有上述抗體的製劑。即，將具有所期望程度的純度的抗體以親油性製劑或者水性溶液的形態，與任意在製劑上允許的載體、賦形劑或者穩定劑相混合，製備並加以保存(Remingtons′s Pharmaceutical Science 18thedition 1990)。所允許的載體、賦形劑或者穩定劑的用量以及濃度以不對患者產生毒性為條件，可以根據劑型或者給藥途徑加以適當選擇。例如磷酸、檸檬酸以及其他的有機酸等緩衝液；含有抗壞血酸以及蛋氨酸的防氧化劑；防腐劑(十八烷基二甲基苄基銨氯化物、六水氯化鎂、ベンズアルコニウムクロライド、ベンズエトニウムクロライド、酚、丁基或者苄醇、對羥基苯甲酸甲酯或者丙酯等羥基苯甲酸的烷基酯、鄰苯二酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇以及m-甲酚等)，低分子量(約不足10個殘基)多肽、血清白蛋白、明膠或者免疫球蛋白等蛋白質，聚乙烯吡咯烷酮等親水性聚合物、甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸、或者賴氨酸等胺基酸；含有甘油、甘露糖、或者糊精的單糖、雙糖以及其他碳水化合物EDTA等的螯合劑、蔗糖、鼠李糖醇、海藻糖、山梨醇等糖，鈉等鹽成對離子，金屬絡合物(例如Zn-蛋白質絡合物)或者吐溫(TWEEN)(商品名)、PLURONICS(商品名)、以及聚乙二醇(PEG)等的非離子表面活性劑。
本發明的試劑可以含有細胞毒性製劑、細胞因子或生長抑制劑等活性成分。這些成分也可以包含在例如通過凝聚技術或者表面聚合製備的微囊(例如各種羥甲基纖維素或者明膠微囊以及多聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、或者膠體狀藥物遞送體系1t；BR(例如脂質體、白蛋白小球、微乳液、納米粒子以及納米囊)中(參見Remington′sPharmaceutical Science 18thedition，1990)。
此外，向體內給藥的製劑必需是無菌的。使之通過滅菌過濾膜的過濾很容易實現這點。製成緩釋製劑也可以。緩釋製劑的優選例是含有抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質(例如膜或者微囊的形狀)。緩釋性製劑的例子為聚酯水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或者聚(乙烯醇))、ポリアクチド(美國專利3773919號)、L-穀氨酸以及γ-乙基-L穀氨酸酯、非分解性的乙烯-醋酸乙烯、LUPRON DEPOT(商品名)(乳酸-甘油酸共聚物與醋酸羅沙替丁的可以注射的小球)等分解性乳酸-甘油酸共聚物、聚-(D)-3-羥基丁酸等。此外，乙烯-醋酸乙烯以及乳酸-甘油酸等的聚合物可以歷時100天釋放出分子。
可以通過向生物體內給予上述抗體或者藥物製劑來實施發明(14)的治療方法。例如將藥物製劑局部給藥到子宮內膜處或者通過靜脈給藥到全身的方法。抗體的給藥量對應於患者的體重、症狀等，可以是每天大約100μg/Kg體重～10mg/Kg體重左右。
實施例以下，通過示出實施例，對本發明進行更詳細的說明，本發明並不受到下述例子的限制。
試驗例11.材料和方法1-1.組織材料為了製備RNA，從18例患者中得到以下的試樣。1)子宮內膜異位移植物(n＝21)、2)來自子宮內膜異位患者的正常部位的子宮內膜組織(通過搔爬得到的，n＝4)、3)來自未患子宮內膜異位的患者的正常子宮內膜組織(n＝6)。幾種試樣來自同一個人的不同部位。將試樣在液氮中冷凍，儲存在-80℃，準備用於製備RNA。從卵巢得到子宮內膜異位的移植物。所用的試樣是將用於製備RNA的正常子宮內膜組織、和從患者的平滑肌腫塊或者子宮脫落物中得到的能正常地增殖和分泌的子宮內膜組織在福馬林中固定、石蠟包埋後得到的。病理標本是通過組織學實驗進行階段區分，其結果將子宮內膜異位分成第III直到IV階段(t-ASRMrevised American Society forReproductive Medicine classification of endometriosis「修訂版美國生殖醫學學會子宮內膜異位分類」，1996)。此外，該研究的女性受檢者未表現出子宮內膜的過形成或者腫瘤形成，在手術前未接受抗炎藥物或者激素藥物給藥。手術前獲得書面同意，按照東京醫科大學醫院的人體調查相關設施內部監察委員會所確認的程序進行。
1-2.Northern印跡分析根據文獻(Oikawa K.et al.Cancer Res.2001，61(15)5707-9)的內容進行Northern印跡。按照文獻(Oikawa K.etal.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，290(3)984-7)的內容製備HRF探針。以人β肌動蛋白cDNA對照探針(CLONTECHLaboratories Inc.)為標準。
1-3.用於Southern印跡分析的RT-PCR根據文獻(Kubota M.et al.Am.J.Pathol.1997，151(3)735-44)的內容，使用寡核苷酸dT引物，從總RNA合成第一鏈的cDNA。然後，將得到的第1鏈cDNA溶液2μl(1×)和10μl(5×)用作模板，進行PCR。在添加下述4種引物後，在初期於95℃變性2分鐘，(於95℃下，0.5分鐘，於65℃下，0.5分鐘，於72℃下，1分鐘)進行×22循環的條件下，PCR擴增CYP1A1和β肌動蛋白的cDNA片段。
用於擴增CYP1A1的引物5′-ccacaaccaccaagaactgcttag-3′(SEQ ID3)5′-gaaggggacgaaggaagagtg-3′(SEQ ID4)用於擴增β肌動蛋白的引物5′-gggaaatcgtgcgtgacgttaag-3′(SEQ ID5)5′-tgtgttggcgtacaggtctttg-3′(SEQ ID6)通過瓊脂糖電泳分離擴增的產物後，進行印跡和雜交。通過使用上述的引物對的逆轉錄PCR得到CYP1A1 cDNA探針。將人β肌動蛋白cDNA探針(CLONTECH)作為對照。使用Rediprime II random trimelabeling system(Amersham Pharmacia Biotech)，用32P標記這些cDNA探針。
1-4.製備抗體和免疫組織化學方法使用兔子，按照標準方法製備針對來自人HRF的寡肽(GKLEEQRPERVKPFMTSEQ ID2的101-116)的肽抗體，將其命名為HRF-GKL。免疫組織化學分析是在抗HRF抗體、HRF-TPY(Oikawa K.etal.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，290(3)984-7)以及HRF-GKL(按照1∶100稀釋)或者抗人CD68抗體(1∶100稀釋，Dako公司)的混合液存在的情況下，將脫臘的切片溫育1夜。進行抗HRF染色時，使用壓力滅菌器對脫臘的切片進行熱誘導性的抗原恢復。使用LSABC(Dako)進行檢測，此處將3，3′-二氨基聯苯胺(DAB)用作顯色物質。使用蘇木素進行逆染。
1-5. Western印跡分析可以按照文獻(Oikawa K.et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，290(3)984-7)的內容進行Western印跡分析。使用抗HRF(HRF-GKL或者HRF-TPY)進行膜的探針處理，按照1∶2000的稀釋比例進行。使用ECL plus Western blotting detection system(AmershamPharmacia Biotech)進行信號檢測。
1-6.細胞培養和逆轉錄病毒感染從美國典型培養物保藏中心(ATCC)得到NIH3T3細胞。將細胞保持在37℃的條件下、於添加了10％DMEM(GIBCO BRL，LifeTechnologies，Inc.)中，在5％CO2的環境下。使用下述引物通過PCR擴增含有全長ORF的小鼠HRF cDNA5′-ttggatccatgatcatctaccgggacctg-3′(SEQ ID7)5′-ttgaattcttaacatttctccatctctaa-3′(SEQ ID8)將得到的片段用BamHI以及EcoRI消化，克隆到逆轉錄表達載體MSCV-puro(CLONTECH)的BglII-EcoRI部位。重組逆轉錄病毒的製備和感染流程可以按照文獻(Kuroda＞et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96(9)5025-30)的內容。感染24小時後，使用1μg/ml嘌呤黴素(CLONTECH)歷時2周對感染細胞進行篩選。
1-7動物和處置將5×105個細胞的部分樣品注射到6周齡的雌性BALB/C裸鼠的腹腔內，進行移植分析。2周後處死動物，測定移植物克隆數。
2.結果2-1.在子宮內膜異位中TCDD誘導性基因HRF的表達模式通過Northern印跡分析，測定子宮內膜異位時的HRF表達模式。其結果，在經確認從5例患者中的3例中得到的子宮內膜異位移植物組織中有HRF的高水平表達(圖1A以及1B)。為了通過二噁英誘導人的細胞色素p450基因超家族的一部分(例如CYP1A1、CYP1A2以及CYP1B1)，針對二噁英依賴性的基因表達調節的基本目標是誘導CYP1A1。為此，為了調查暴露於二噁英與HRF表達的關係，在此通過Southern分析使用RT-PCR調查CYP1A1的表達(Trifa Y.etal.J.Biol.Chem.1998，273(7)3980-5；Oikawa K.et al.Gene 2000，261(2)221-8)。其結果，CYP1A1並未在全部例中表現出高的HRF表達(圖1A以及1B)。所以，在幾種情況下，HRF表達可能與TCDD的誘導無關，由此確認在子宮內膜異位中的HRF的誘導與TCDD暴露無關。
2-2.在子宮內膜異位移植物中的HRF過表達經確認在子宮內膜異位再次復發的患者的子宮內膜異位移植物中存在HRF的過表達。即，針對7例子宮內膜異位患者進行了Nortern印跡分析(圖2A)。比較正常的子宮內膜組織以及患有子宮內膜異位的患者的正常部位的子宮內膜，觀察到在子宮內膜移植物上存在HRF的高度表達。
2-3.在正常子宮內膜和子宮內膜異位移植物上的HRF的免疫組織化學通過使用抗HRF多克隆抗體的免疫組織化學測定表達HRF的子宮內膜細胞的類型。其結果，發現HRF共存於子宮內膜腺與正常組織的間質細胞中，與間質細胞相比，子宮內膜腺表現出更強的表達(圖3A和3B)。表達模式在分泌與增殖相之間沒有顯著變化。進一步對在子宮內膜異位移植物上的HRF表達進行了調查。其結果，在卵巢子宮內膜異位移植物的間質以及上皮成分兩處均存在HRF(圖3C和3E)。在正常的子宮內膜的間質細胞上HRF表達較弱，與此相對，在卵巢的子宮內膜異位移植物上，子宮內膜腺與間質細胞的任何一方均表現出同樣的高水平的HRF表達。在用免疫前的血清作對照的情況下沒有觀察到這些與HRF相對的特異性的信號(未出示數據)。可是，在子宮內膜異位移植物上誘導HRF的機制尚不清楚。據報導通過M-CSF而使之處於活化階段的巨噬細胞能誘導HRF(Teshima S.et al.J.Immunol.1998，161(11)6353-66)，與此一致的是在子宮內膜異位移植物中觀察到與CD68陽性巨噬細胞的相關性(Hornung D.etal.Am.J.Pathol.2001，158(6)1949-54)。所以，利用對移植物的連續切片的CD68染色，鑑定發現在HRF過表達區域內部有CD68陽性的巨噬細胞(圖3F)。使用蘇木素-伊紅染色後的對照切片表現了子宮內膜異位移植物的整體性的形態。根據這些結果，可以認為在子宮內膜異位移植物上的HRF的產生與巨噬細胞相關。
2-4.HRF對NIH3T3細胞的腹腔內移植的效果對HRF表達增加所造成的生理學影響進行調查。子宮內膜異位的原因尚不明確(Klninckx R.P.et al.Gynecol Obstet Invest.1999，47Suppl 13-9，discussion 9-10；van der Linden P.J.Q.FrontBiosci.1997，2c48-52)。如果遵照主要的假說，子宮內膜組織通過輸卵管逆流達到腹腔(逆行性月經)後的移植以及增殖導致發生子宮內膜異位。在這裡關於HRF針對該移植的影響進行研究。最初，製備HRF過表達的NIH3T3細胞的穩定轉化體。用表達HRF的逆轉錄病毒載體(pMSCV-HRF)感染後，確認HRF高表達(圖4A)。然後，將這些細胞(pMSCV-HRF-3T3細胞)注射到裸鼠的腹腔內。與用對照載體(pMSC-3T3)感染的細胞相比較，pMSCV-HRF-3T3細胞具有高的移植能力(圖4B)。從這些數據可知HRF不僅與免疫學功能不全有關，而且在子宮內膜異位移植物的初期發展時也發揮著重要的作用。
實施例2多克隆抗體的製備製備含有抗HRF抗體的抗血清，從該血清中純化抗HRF抗體。
作為致敏抗原可以選擇合成人HRF蛋白質(序列號2)中101-116位的肽。將合成的肽以HLA為載體，使其結合，然後與KLH混合(相對50μg的肽加入50μg的KLH)。將由此得到的抗原液與弗氏完全佐劑混合，製備含有致敏抗原的溶液。將該溶液按照每2周每次1ml的量皮下注射(5次)到體重3～4kg的兔子(SPF Japanese WhiteRabbit)中。
然後，在第5次皮下注射後，間隔1周後從兔子採取血液，製備血清。確認得到的血清中所含有的抗體能特異性地識別HRF蛋白質，將其作為抗HRF抗體。
通過ELISA法確認抗血清為抗HRF抗體(HRF-GKL)。
首先，用20mM碳酸緩衝液(pH9.6)稀釋的抗原多肽包被聚乙烯製成的96孔平板(100ng/孔)，然後，用含有0.05％Tween20的PBS洗滌，去除未吸附的肽。向各孔中加入從免疫的兔子中採取得到的血液中的血清，在室溫下靜置約1小時。洗滌後，添加辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔免疫球蛋白作為二抗，然後再於室溫下靜置約1小時。洗滌後，添加底物過氧化氫和3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMB)使之顯色。向各孔中加入2N硫酸中止顯色反應，使用用於微孔板的吸光度測定儀測定450nm的吸光度，據此測定顯色程度。作為比較，與免疫前採取的血清相比較，確認血清中所含有的抗體確實能特異性地識別HRF蛋白質。上述操作可以使用重組蛋白質作為抗原。
將10μg NIH3T3的全細胞裂解物添加到14％的SDS-PAGE上，用2000倍稀釋的抗血清在Western印跡中進行檢測，將得到的含有抗HRF抗體的血清加到信號條帶上，以此確認其純度。該抗體能在小鼠和人細胞中檢測出相同大小的蛋白質。
可以使用將上述HRF蛋白質的101-116位肽固定到親和凝膠(BIO-RAD公司製造)後的柱子通過親和層析進行純化的抗HRF抗體的製備。將純化的HRF肽與親和凝膠-10(BIO-RAD公司製造)混合，在4℃下反應過夜後，用20mM磷酸緩衝液-生理鹽水(PBS)充分洗滌親和凝膠，在含有100mM單乙醇胺的PBS中對親和凝膠上未反應的官能基團進行過夜封閉，最後用PBS再次洗滌，製備肽固定化柱。向該固定化柱上添加含有抗HRF抗體的兔血清，用PBS充分洗滌後，用20mM甘氨酸-鹽酸緩衝液(pH4.0)洗脫吸附的抗HRF抗體。用200mM Tris-鹽酸緩衝液立即中和洗脫的抗HRF抗體，用PBS透析1晚後，凍存在-80℃。
實施例3夾心EIA按照下述的方法，從實施例2製備的抗HRF抗體以及公知的抗HRF抗體中至少選出1種，通過2種抗HRF抗體的適當組合特異性地檢測、測定HRF蛋白質，由此構成夾心EIA系統。EIA系統可以是一步法也可以是兩步法，標記的抗體不限定於Fab′-HRP。根據測定的目的，可以縮短、延長等調整各反應緩衝液的組成或者反應條件。此外，作為標準品的人HRF可以從組織培養上清、細胞培養上清或者以實施例1記載的內容或者其它的方法使之表達的重組體中進行純化。可以將離子交換、凝膠過濾、使用抗人HRF抗體的親和層析或者除此以外的各種親和層析的組合實現純化。
(a)標記抗體的製備向含有抗HRF抗體(HRF-GKL)的0.1M NaCl的0.1M醋酸緩衝液，pH4.2中添加抗體量的2％(W/W)的胃蛋白酶，在37℃消化24小時。向消化物中添加3M Tris-HCl、pH7.5，使反應中止。通過以0.1M磷酸緩衝液、pH7.0平衡的超凝膠AcA54柱進行凝膠過濾，分離得到F(ab′)2級分。在該F(ab′)2級分中使終濃度為0.01M地添加半胱胺鹽酸鹽，於37℃還原1.5小時，通過以含5mM EDTA的0.1M磷酸緩衝液、pH6.0平衡的超凝膠AcA54柱進行凝膠過濾，分離得到F(ab′)2級分。
除了上述操作之外，可以將HRP溶解到0.1M磷酸緩衝液、pH7.0中，將HRP的25倍摩爾量的EMCS作為DMF添加到其中，在30℃使之反應30分鐘。將其以用0.1M磷酸緩衝液、pH6.0平衡的NICK-5柱(Pharmacia)進行凝膠過濾，分離得到馬來醯亞胺標記的HRP級分。
使等摩爾地將Fab′組分與馬來醯亞胺標記的HPR混合兩種級分，使之在4℃反應20小時後，以Fab′10倍摩爾量的N-乙基馬來醯亞胺封閉未反應的巰基。將其用以0.1M磷酸緩衝液、pH6.5平衡的超凝膠AcA54柱進行凝膠過濾，分離得到F(ab′)-HRP標記抗體。向其中添加0.1％BSA以及0.001％氯己定(Chlorhexidine)，保存在4℃。對使用其他的抗人HRF抗體進行同樣的處理。
(b)抗體結合載體的製備將抗HRF抗體(HRF-TPY)溶解到0.1M磷酸緩衝液、pH7.5中，使之濃度為50μg/mL。將該抗體溶液按照每孔100μL添加到96孔板中，在4℃靜置18小時。去除抗體溶液，用生理鹽水洗滌1次，用含有0.05％Tween20、0.1M NaCl、5mM CaCl2的Tris-HCl緩衝液，在pH8.0洗滌3次後，添加含有1％BSA、0.1M NaCl、5mM CaCl2的Tris-HCl緩衝液，pH8.0進行封閉。對使用的其他的抗人HRF抗體進行同樣的處理，製備固定化抗體。
(c)分步夾心EIA法將純化的人HRF級分作為標準抗原，製成用於定量人HRF的標準曲線。含有1％BSA、0.05％Tween20、0.1M NaCl、5mM CaCl2的Tris-HCl緩衝液，在pH8.0梯度稀釋的標準人HRF，將其分裝，向其中分別加入用含有1％BSA、0.05％Tween20、0.1M NaCl、5mM CaCl2的Tris-HCl緩衝液，在pH8.0製備的標記抗體Fab′-HRP，充分混合。將製備的抗體結合微孔板用含有0.05％Tween20、0.1M NaCl、5mM CaCl2的Tris-HCl緩衝液，在pH8.0洗滌3次，添加標準抗原和標記抗體混合液。在室溫反應1小時後，用含有0.05％Tween20、0.1M NaCl、5mM CaCl2的Tris-HCl緩衝液，在pH8.0洗滌3次。然後，在含有6％二甲基甲醯胺、0.005％g過氧化氫的0.1M醋酸緩衝液(pH5.5)中溶解0.01％3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺，將其加入到向各孔中，在室溫下反應20分鐘後，添加2N硫酸，中止反應。用微孔板讀板儀測定該反應混合液在450nm的吸收，算出標準曲線。
可以從來自人的體液成分、各種人組織的抽提液、來自人或者重組體等的各種培養細胞的細胞提取液、培養上清等中製備待測樣品。代替標準人HRF，將各種待測樣品供給上述的一步夾心EIA，與標準人HRH同時進行反應。將有待檢樣品得到吸光度與保準曲線對比，計算出待檢樣品中含有的人HRF的量。
除了上述之外，使用市售的抗人HRF抗體，按照瓜谷鬱等編、「生物化學試驗法27、石川榮治著、酶標記法」，株式會社學會出版中心(1991年6月20日發行)以及日本生化學會編、「續生化學試驗講座5」、免疫生化學研究法」、p107-112，東京化學同人，1986年3月14日發行中記載的方法(也包括這些方法中引用的文獻中記載的方法)，製備酶標記抗體，再將其用於測定。
實施例4Western印跡表達人HRF的細胞或者組織的培養上清以及純化的重組人HRF在還原條件下，用10％-15％的SDS-PAGE分離後，轉移到polyvinylidene difluoride(PVDF)膜(MILLIPORE)。然後用含有5％的BSA或者5％脫脂奶粉以及0.05％疊氮鈉的TBS(封閉緩衝液)在室溫條件下封閉0.5-1小時後，用HRF-GKL處理，在25℃下，溫育6小時以下。用含有0.1％Tween 20的TBS(含有0.05％疊氮鈉)洗滌各膜4次，將結合的抗體與用封閉緩衝液按照1∶1000稀釋的HRP結合抗兔免疫球蛋白抗體在25℃下，反應1小時。反應後，用含有0.1％Tween20的TBS(含有0.05％疊氮鈉)洗滌膜4次，通過Enhancedchemiluminescence(ECL，Amersham Pharmacia)檢測結合的抗體。
除此之外，使用HRF-TPY，按照口野嘉幸等編，「基因/蛋白質、試驗操作，封閉方法」、p212-241、Softscience公司、昭和62年11月10日發行中記載的方法(也包括這些文獻中引用的文獻中記載的方法)，進行Western印跡。
實施例5單克隆抗體的製備從患者中獲取的人子宮內膜異位病變部位組織的細胞中製備總RNA，據此進行RT-PCR，分離人全長HRF cDNA。根據人HRF cDNA全長序列(SEQ ID1)，用下述的寡核苷酸作為PCR引物5′引物(Bgl II)gcgcagatctATGATTATCTACCGGGAC(SEQ ID9)3′引物(Eco RI)ggccgaattcAGATCCAAAATAATTGCC(SEQ ID10)然後，將得到PCR產物克隆到杆狀病毒載體pYNG HisA中，使之感染蠶後，從蠶的體液中提取人HRF蛋白質。然後，使用鎳柱通過組氨酸Tag純化蛋白質。之後將100μg純化的蛋白質分3次免疫到雌性Balb/C小鼠中，此後，切取迴腸淋巴節，使之與小鼠的骨髓瘤細胞P3U1融合，得到雜交瘤。將能產生HRF抗體的雜交瘤進行2次極限稀釋，最終得到雜交瘤HRF25、HRF26、HRF28。用ELISA法進行雜交瘤的篩選。具體而言，將1μg/ml的抗原(由杆狀病毒製備的HRF蛋白質)吸附到ERISA平板3912(Falcon公司製造)上。使之與雜交瘤上清反應，再次與作為二抗的山羊抗小鼠IgG(Zymed 81-6522)反應。添加ALP Rose(Shino-test製造)作為底物，測定A660nm的吸光度。結果得到克隆No.4、18、25、26、28、46、51、54、55、56。吸光度的測定結果如表1所示。
表1

此外，進行使用這些培養上清的Western印跡。具體而言，從確認表達HRF的BJAB中提取總蛋白質，按照Laemmili方法進行SDS-PAGE，進行硝基纖維素膜的封閉。然後，使之與作為一抗的5倍稀釋的雜交瘤上清反應，進行研究。結果確認克隆No.25(HRF25)、26(HRF26)、28(HRF28)能檢測出HRF蛋白質的單一條帶。並且，該3個抗體均為IgG抗體。
此外，以上的結果表明抗HRF抗體能非常特異性地識別人HRF。
抗原使用實施例1的2-4中的強制表達HRF的NIH3T3細胞，在體內和體外篩選上述得到的單克隆抗體的活性，經確認具有活性的抗體可以判定其有望作為子宮內膜異位的診斷藥物、治療藥物。
產業上的可利用性通過以上的詳細說明，根據本發明，可以提供簡便並且確實地診斷子宮內膜異位相關疾病以及患病風險的方法和為實現該目的而採用的材料。據此，可以使早期發現子宮內膜異位相關疾病、選擇更確切的治療方法、防止再發等成為可能。
序列表110白麗高科120子宮內膜異位相關疾病的診斷方法13003-F-104PCT150JP2003-1964591512003-07-1416010170PatentIn version 3.12101211830212DNA213智人(Homo sapiens)220
221CDS222(95)..(613)223
4001cccccccgag cgccgctccg gctgcaccgc gctcgctccg agtttcaggc tcgtgctaag 60ctagcgccgt cgtcgtctcc cttcagtcgc catc atg att atc tac cgg gac ctc115Met Ile Ile Tyr Arg Asp Leu1 5atc agc cac gat gag atg ttc tcc gac atc tac aag atc cgg gag atc 163Ile Ser His Asp Glu Met Phe Ser Asp Ile Tyr Lys Ile Arg Glu Ile10 15 20gcg gac ggg ttg tgc ctg gag gtg gag ggg aag atg gtc agt agg aca 211Ala Asp Gly Leu Cys Leu Glu Val Glu Gly Lys Met Val Ser Arg Thr25 30 35gaa ggt aac att gat gac tcg ctc att ggt gga aat gcc tcc gct gaa 259Glu Gly Asn Ile Asp Asp Ser Leu Ile Gly Gly Asn Ala Ser Ala Glu40 45 50 55ggc ccc gag ggc gaa ggt acc gaa agc aca gta atc act ggt gtc gat 307Gly Pro Glu Gly Glu Gly Thr Glu Ser Thr Val Ile Thr Gly Val Asp60 65 70
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223對人工序列的描述合成的寡核苷酸4003ccacaaccac caagaactgc ttag 24210421121212DNA213人工序列220
223對人工序列的描述合成的寡核苷酸4004gaaggggacg aaggaagagt g 212105
21123212DNA213人工序列220
223對人工序列的描述合成的寡核苷酸4005gggaaatcgt gcgtgacgtt aag23210621122212DNA213人工序列220
223對人工序列的描述合成的寡核苷酸4006tgtgttggcg tacaggtctt tg 22210721129212DNA213人工序列220
223對人工序列的描述合成的寡核苷酸4007ttggatccat gatcatctac cgggacctg 29210821122212DNA213人工序列220
223對人工序列的描述合成的寡核苷酸4008ttgaattctt aacatttctc catctctaa 29
210921128212DNA213人工序列220
223對人工序列的描述合成的寡核苷酸4009gcgcagatct atgattatct accgggac282101021128212DNA213人工序列220
223對人工序列的描述合成的寡核苷酸40010ggccgaattc agatccaaaa taattgcc 28
權利要求
1.子宮內膜異位相關疾病的診斷方法，其特徵在於，測定受檢者機體試樣中組胺釋放因子(HRF蛋白質)的存在量，將HRF蛋白質的量與正常機體試樣中的量相比較，與正常機體試樣相比而HRF蛋白質的量表現出有意義地高的受檢者被判定為患有子宮內膜異位相關疾病的患者或者具有患該疾病的高風險者。
2.識別HRF蛋白質的抗體。
3.與所述權利要求2的抗體不同的表位結合的抗體。
4.權利要求2或者3的抗體，是用具有從序列表序列號2的胺基酸序列的第90～130位選出的連續的5～20個胺基酸殘基的肽作為免疫抗原而獲得的抗體。
5.權利要求2或者3的抗體，是用具有從序列表序列號2的胺基酸序列的第1～95位選出的連續的5～20個胺基酸殘基的肽作為免疫抗原而獲得的抗體。
6.權利要求2或者3的抗體，是用具有從序列表序列號2的胺基酸序列的第115～172位選出的連續的5～20個胺基酸殘基的肽作為免疫抗原而獲得的抗體。
7.子宮內膜異位相關疾病的診斷方法，其特徵在於，其中至少包括下述工序(a)使受檢者的機體試樣與固定有上述權利要求2的抗體的載體接觸的工序；(b)洗滌在工序(a)中與機體試樣接觸的載體的工序；(c)使標記的上述權利要求3的抗體接觸經過工序(b)的洗滌的載體的工序；(d)測定載體上的結合標記或者游離的標記的工序；(e)以在工序(d)中測定的標記量作為HRF蛋白質的量的指標，與正常機體試樣的結果進行比較的工序；以及，(f)將與正常機體試樣進行比較而表現出有意義地高的HRF蛋白質的量作為表示與子宮內膜異位相關疾病或者該病的患病風險程度的指標的工序。
8.子宮內膜異位相關疾病的診斷方法，其特徵在於，其中至少包括下述工序(a)對受檢者的機體試樣進行組織固定化處理的工序；(b)將工序(a)中製備的組織固定化標本製成切片的工序；(c)以上述權利要求2的抗體對在工序(b)中得到的切片組織進行免疫組織染色的工序；(d)以在工序(c)中得到的免疫組織染色的程度作為HRF蛋白質的量的指標，與正常機體試樣的結果進行比較的工序；以及，(e)將與正常機體試樣進行比較而表現出有意義地高的HRF蛋白質的量作為表示與子宮內膜異位相關疾病或者該病的患病風險程度的指標的工序。
9.子宮內膜異位相關疾病診斷試劑盒，其特徵在於，至少含有標記了的上述權利要求2的抗體。
10.子宮內膜異位相關疾病診斷試劑盒，其特徵在於，其中至少含有下述要素(a)上述權利要求2的抗體；以及，(b)標記了的上述權利要求3的抗體。
11.子宮內膜異位診斷試劑盒，其特徵在於，其中至少含有下述要素(a)固定有上述權利要求2的抗體的載體；以及，(b)標記了的上述權利要求3的抗體。
12.抗體，其可識別HRF蛋白質，並且可中和HRF蛋白質的活性。
13.子宮內膜異位相關疾病的治療藥物，其特徵在於，其中含有權利要求12的抗體。
14.子宮內膜異位相關疾病的治療方法，其特徵在於向體內給予權利要求12的抗體或者權利要求13的治療藥物。
全文摘要
本發明通過測定受試者機體試樣中的組胺釋放因子(HRF)蛋白質的存在量，將該HRF蛋白質的量與正常機體試樣中的量相比較，將與正常機體試樣相比有意義地高的HRF蛋白質的量作為子宮內膜異位相關疾病或者其風險程度的指標。
文檔編號C07K16/18GK1823274SQ20048002021
公開日2006年8月23日 申請日期2004年1月13日 優先權日2003年7月14日
發明者小杉好紀, 黑田雅彥, 及川恆輔, 大林徹也 申請人:株式會社白麗高科