一種應用於PCR或RT‑PCR的改良的緩衝體系及應用的製作方法

2023-06-13 03:10:31 1

本發明涉及分子檢測領域，提供了一種應用於pcr或rt-pcr的改良的緩衝體系及應用。

背景技術：

目前，pcr技術廣泛的應用於生物，醫療，食品等領域。提供一個穩定的pcr或rt-pcr緩衝體系是pcr過程中各種酶高效進行的關鍵因素。tris-hcl緩衝體系是最經典的pcr工作反應體系，保障pcr工作中ph的穩定性等功能。但tris-hcl緩衝液是一種雙極化的離子緩衝液，pka為8.3(20℃)，△pka為0.021/℃，相對溫度較敏感，隨著溫度的升高ph降低。在典型的熱循環條件下，當延伸溫度在72℃時，真正的ph值在6.8-7.8之間，在ph小於7.5以下，緩衝能力極差。對許多熱啟動酶而言，ph變化導致酶活性下降甚至失活，影響pcr或rt-pcr的檢測靈敏度及精密度。

為了對現有技術進行改進，人們進行了長期的探索，提出了各種各樣的解決方案。例如，中國專利文獻公開了一種高gc含量基因的pcr擴增緩衝液[申請號：cn105861491a]，本發明公開了一種高gc含量基因的pcr擴增緩衝液。所述高gc含量基因的pcr擴增緩衝液包括如下組分：tris-hcl150mmol/l、(nh4)2so440mmol/l、一水甜菜鹼2.6mol/l、乳化劑tween200.02％、pcr反應增強劑20％，配置後，過濾去菌，-20℃保存。本發明還公開一種基於高gc含量基因的pcr擴增緩衝液的擴增方法及應用。本發明使用了(nh4)2so4替代了kcl，以增加引物與模板結合的特異性，並能兼容更廣譜的mg2+範圍。

上述方案雖然在一定程度上解決了現有技術的不足，但是整體設計還不夠合理。目前，仍缺乏一種檢測靈敏度好的改良的pcr或rt-pcr緩衝體系及應用。

技術實現要素：

本發明的目的是針對上述問題，提供了一種檢測靈敏度好的應用於pcr或rt-pcr的改良的緩衝體系及應用。

為達到上述目的，本發明採用了下列技術方案：本發明的一種應用於pcr或rt-pcr的改良的緩衝體系，所述改良的緩衝體系為3-(n-嗎啉)丙磺酸、tris和檸檬酸三鈉相互混合而成；所述3-(n-嗎啉)丙磺酸：tris：檸檬酸三鈉的摩爾比為20-100：10-50：1-5。

進一步地，所述溶液狀態為鹼性。

進一步地，所述改良的緩衝體系的ph為8.3-9。

更進一步地，所述改良的緩衝體系的ph為8.8。

本發明所述的應用於pcr或rt-pcr的改良的緩衝體系在pcr或rt-pcr的檢測中的應用。

本發明所述的應用於pcr或rt-pcr的改良的緩衝體系在病原體的dna或rna的擴增實驗中的應用。

進一步地，所述病原體為B型肝炎病毒hbv、人類免疫缺陷病毒hiv或結核桿菌tb中的任意一種。

有益效果：本發明的緩衝穩定性更強，擴增效率更高，檢測靈敏度及精密度好。

與現有技術相比，本發明具有如下優點：

(1)本發明利用一種常用於製備中性緩衝體系的化學物質mops，中文名又稱3-(n-嗎啉)丙磺酸，溶液狀態成鹼性，與tris製備成一種tris-mops緩衝體系，該體系結合了mops優點，mops一種較穩定的中性緩衝液，pka72(25℃)緩衝範圍6.5-7.9之間，廣泛用於二維凝膠電泳中等電聚焦電泳的電解質系統成分，還可用於northern雜交，作為rna的分離及轉膜時的緩衝液，降低緩衝體系對溫度的敏感性而ph變化加大。

(2)本發明還在tris-mops緩衝體系中添加了一種弱酸強鹼鹽檸檬酸鈉，檸檬酸鈉具有耦合mg2+離子能力，允許體系加入更多的mg2+。mg2+的作用主要是dntp-mg2+與核酸骨架相互作用並能影響polymerase的活性，一般的情況下mg2+的濃度在0.5-5mm之間調整，mg離子濃度對pcr擴增效率影響很大，濃度過高可降低pcr擴增的特異性，濃度過低則影響pcr擴增產量甚至使pcr擴增失敗而不出擴增條帶。首先檸檬酸鈉耦合mg2+，但隨著pcr進行過程中，mg2+離子消耗，耦合的mg2+緩慢釋放補充消耗的mg2+，保障pcr高效率進行，同時又不會因為mg2+濃度過高，影響pcr反應特異性。

(3)所述的tris-mops-檸檬酸鈉緩衝體系相比tris-hcl緩衝體系緩衝穩定性更強，擴增效率更高，用於pcr或rt-pcr反應過程中反應體系，提高pcr或rt-pcr的檢測靈敏度及精密度，用於核酸分子診斷領域，具有廣泛的應用前景。

附圖說明

圖1是本發明圖緩衝體系與傳統緩衝體系對比擴增曲線圖；

圖2hbv、hiv、tb擴增產物凝膠電泳圖，1代表對照組擴增產物凝膠電泳圖，2代表實驗組擴增產物凝膠電泳圖，mk為dl500，最上為500bp，最亮為200bp。

具體實施方式

本發明結合附圖和具體實施例作進一步說明。應該理解，這些實施例僅用於說明目的，而不用於限制本發明範圍。

實施例1

本發明的一種應用於pcr或rt-pcr的改良的緩衝體系，所述改良的緩衝體系為3-(n-嗎啉)丙磺酸、tris和檸檬酸三鈉相互混合而成；所述3-(n-嗎啉)丙磺酸：tris：檸檬酸三鈉的摩爾比為20：50：2。

所述溶液狀態為鹼性。

所述改良的緩衝體系的ph為8.3。

本發明所述的應用於pcr或rt-pcr的改良的緩衝體系在pcr或rt-pcr的檢測中的應用。

實施例2

實施例2與實施例1的區別在於：本發明的一種應用於pcr或rt-pcr的改良的緩衝體系，所述改良的緩衝體系為3-(n-嗎啉)丙磺酸、tris和檸檬酸三鈉相互混合而成；所述3-(n-嗎啉)丙磺酸：tris：檸檬酸三鈉的摩爾比為60：10：1。

所述改良的緩衝體系的ph為8.8。

本發明所述的應用於pcr或rt-pcr的改良的緩衝體系在病原體的dna或rna的擴增實驗中的應用。

所述病原體為結核桿菌(tb)。

實施例3

實施例3與實施例1的區別在於：本發明的一種應用於pcr或rt-pcr的改良的緩衝體系，所述改良的緩衝體系為3-(n-嗎啉)丙磺酸、tris和檸檬酸三鈉相互混合而成；所述3-(n-嗎啉)丙磺酸：tris：檸檬酸三鈉的摩爾比為100：40：5。

所述改良的緩衝體系的ph為9。

本發明所述的應用於pcr或rt-pcr的改良的緩衝體系在病原體的dna或rna的擴增實驗中的應用。

所述病原體為B型肝炎病毒(hbv)。

實施例4

實施例4與實施例1的區別在於：本發明所述的應用於pcr或rt-pcr的改良的緩衝體系在病原體的dna或rna的擴增實驗中的應用。

所述病原體為人類免疫缺陷病毒(hiv)。

試驗1

如圖1所示，本發明的核酸模板：

hiv-1假病毒顆粒，採用qiagen公司的qiaampviralrnakit提取rna，備用；

引物探針：

上遊引物5-attagtcctattgaaactgtgccag-3hplc純

下遊引物5-atactggagtattgtatggattttcag-3hplc純

探針fam-tgaagccaggaatggatggccca-bhq1hplc純

螢光定量rt-pcr擴增：

每個測試反應體系配製如下，50μl體系，包含pcrmix(設置實驗組和對照組)27.5μl、酶混合液(設置實驗組和對照組)2.5μl瞬時離心，然後加入待檢測的模板20μl；同樣按照上述體系設置陽性和陰性對照，加入陽性質控品或陰性質控品20μl進行擴增。

所述pcrmix(實驗組)為表1所示，所採用的rt-pcr緩衝體系為實施例1：

表1

所述pcrmix(對照組)為表2所示：

表2

將各反應管放入定量pcr儀器的反應槽內，設置各檢測的名稱和螢光基團種類(設置目的基因的報告基團為fam，淬滅基團選擇none)，設定循環條件：

伯樂cfx96螢光pcr儀循環條件為45℃40分鐘，94℃2分鐘；94℃15秒，65℃30秒，72℃30秒，8個循環；94℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，8個循環；94℃15秒，53℃50秒，40個循環。55℃時收集螢光。

結果分析和判定如圖1所示：圖1數據顯示，靠左的是實驗組對應本發明的tris-mops-檸檬酸鈉緩衝體系進行的rt-pcr擴增曲線(重複1次)，靠右的是對照組對應tris-hcl緩衝體系進行rt-pcr擴增曲線。實驗組進行的rt-pcr擴增相比對照組擴增ct值提前，說明實驗組相比對照組，用於rt-pcr擴增，靈敏度有所提高。

試驗2

應用範圍

(1)選擇病原體hbv、hiv，病毒載量水平約為1×103copies/ml；病原體tb，菌濃度為1×103個菌/ml，採用提取試劑盒提取病原體的dna或rna；

(2)實驗組反應體系hbv和hiv採用實施例3的緩衝體系，tb採用實施例2的緩衝體系；其他組分與試驗1相一致。對照組反應體系見試驗1

(3)在普通pcr儀器上進行擴增。

如圖2所示，從左至右點樣順序分別為mk，陰性對照、對照組hbvdna擴增產物，實驗組hbvdna擴增產物，對照組hivrna擴增產物，實驗組hivrna擴增產物，對照組tbdna擴增產物，實驗組tbdna擴增產物。數據說明，所發明的體系適用於各種病毒或病原體的dna或rna的擴增，另外hivrna或tbdna對照組體系對應點樣孔無擴增產物條帶，而實驗組體系有明顯的擴增產物條帶，進一步說明所發明的tris-mops-檸檬酸鈉緩衝體系用於pcr或rt-pcr，檢測靈敏度優於對照組體系。

本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發明精髓作舉例說明。本發明所屬技術領域的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或採用類似的方式替代，但並不會偏離本發明的精髓或者超越所附權利要求書所定義的範圍。