為獲得梭菌毒素的梭菌細菌培養基及方法

2023-06-13 01:51:21 2

專利名稱：為獲得梭菌毒素的梭菌細菌培養基及方法
交叉引用本申請是2003年9月25日提交的系列號為10/672,876的美國專利申請的部分繼續申請，其全部內容通過引用的方式納入本說明書。
背景技術：
本發明涉及獲得生物活性的肉毒毒素的培養基和方法。具體而言，本發明涉及生物體例如肉毒梭菌(Clostridium botulinum)細菌的基本上不含動物產物的培養基、培養物和厭氧發酵方法，以獲得大量生物活性的肉毒毒素。
適用於因治療、診斷、研究或美容的目的而給予人或動物的藥物組合物可包括活性成分。該藥物組合物還可包括一種或多種賦形劑、緩衝液、載體、穩定劑、防腐劑和/或填充劑。藥物組合物中的活性成分可為生物學成分，例如肉毒毒素。用於製備肉毒毒素的藥物組合物的肉毒毒素活性成分可通過多步的培養、發酵和組合的方法獲得，該方法利用了一種或多種動物源性產物(例如用於獲得原料肉毒毒素的一種或多種培養和發酵培養基中的肉湯和酪蛋白成分，和最終組合的肉毒毒素藥物組合物中的血液組分或血源性賦形劑)。給予患者含有利用動物源性產物的方法得到的生物活性組分的藥物組合物，可使患者具有接受攝入各種病原體或感染性製劑的潛在危險。例如藥物組合物中可含有朊病毒。朊病毒是一種蛋白感染性顆粒，推測它來自產生正常蛋白的相同的核酸序列，作為異常構象的同種型而產生。進一步推測在翻譯後水平的由正常同種型蛋白到朊病毒蛋白同種型的「募集反應」(「recruitmentreaction」)中存在感染性。看起來是正常的內源性細胞蛋白被誘導而錯誤地摺疊成致病性的朊病毒構象。
克雅病(Creutzfeldt-Jacob disease)是一種罕見的神經變性病症——人類傳染性海綿樣腦病，其傳染性因子似乎是朊病毒蛋白的一種異常同種型。患克雅病的個體可在六個月內從看上去完全健康的狀態惡化為運動不能性緘默症(akinetic mutism)。因此，給予患者含有用動物源性產物獲得或組合的生物組分例如肉毒毒素的藥物組合物，存在感染朊病毒介導的疾病如克雅病的潛在危險。
肉毒毒素梭菌屬按照形態學和功能劃分有多於127個種。厭氧性的革蘭氏陽性細菌肉毒梭菌產生一種多肽性的強神經毒素肉毒毒素，該毒素在人類和動物中引起被稱為肉毒中毒的神經麻痺疾病。肉毒梭菌及其芽孢常見於土壤中，該細菌可在家庭式罐頭工廠未適當滅菌和封閉的食品容器中生長，這可引發多種情形的肉毒中毒。肉毒中毒作用一般出現於食用了被肉毒梭菌培養物或芽孢感染的食品後18-36小時。肉毒毒素似乎可以不衰減地穿過腸內膜(lining)而攻擊周圍運動神經元。肉毒毒素中毒的症狀可以由行走、吞咽及語言困難發展至呼吸肌麻痺和死亡。
A型肉毒毒素是已知對人類致死力最強的天然生物試劑。A型肉毒毒素(純化的神經毒素複合物)對小鼠的LD50大約是50皮克。以摩爾計算，A型肉毒毒素的致死力比白喉毒素高1.8×109倍、比氰化鈉高6×108倍、比眼鏡蛇毒素高3×107倍，比霍亂毒素高1.2×107倍。Singh，Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins，Neuronal Toxings II，第四章，63-84頁，B.R.Singh等編著，Plenum Press，New York(1976)(根據0.05ngBOTOX等於1單位的事實對其中所述A型肉毒毒素的LD50為0.3ng等於1單位進行了校正)。BOTOX是Allergan公司(Irvine，California)市售的A型肉毒毒素純化神經毒素複合物的商標。將腹膜內注射至每隻重18-20克的雌性Swiss Webster小鼠的LD50定義為肉毒毒素的一個單位(U)。也就是說，殺死一群雌性Swiss Webster小鼠的50％的肉毒毒素的量為1個單位的肉毒毒素。鑑定了七種常見的免疫學上有差別的肉毒梭菌神經毒素，它們分別為肉毒神經毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G，其中的每一種血清型是用型特異性抗體中和來鑑別的。這些不同血清型的肉毒毒素在感染動物種類和引發麻痺的嚴重程度和持續時間上不盡相同。例如，用在大鼠體內產生麻痺的水平為量度，測得A型肉毒毒素的效力比B型肉毒毒素強500倍。此外還測得B型肉毒毒素在大約480U/kg的劑量時對靈長類動物是無毒的，該劑量是A型肉毒毒素對靈長類動物的LD50的12倍。肉毒毒素似乎是以高親和力結合膽鹼能運動神經元，還被移位至神經元內並阻斷乙醯膽鹼的突觸前釋放。
肉毒毒素在臨床上，已用於治療例如以骨骼肌機能亢進為特徵的神經肌肉病症。美國食品藥品監督管理局(U.S.Food and DrugAdministration)批准了A型肉毒毒素可用於12歲以上患者的自發性瞼痙攣、斜視和偏側顏面痙攣的治療，頸肌張力障礙(cervical dystonia)的治療和眉間線(面部)皺紋的治療。FDA還批准了B型肉毒毒素可用於頸肌張力障礙的治療。外周注射(即肌內或皮下注射)A型肉毒毒素的臨床效果通常出現於在注射後的一周以內，經常出現於注射後幾小時以內。單次肌內注射A型肉毒毒素後症狀緩解(即肌肉麻痺鬆弛)的一般持續時間為大約三至六個月。
雖然所有血清型的肉毒毒素都能明顯抑制在神經肌肉連接處的神經遞質乙醯膽鹼的釋放，但它們是通過影響不同的神經分泌蛋白和/或在這些蛋白的不同位點進行切割起到抑制作用。A型肉毒毒素是一種鋅內肽酶，它可特異性水解細胞內與囊泡相關的蛋白SNAP-25的肽鍵。E型肉毒毒素也切割這個25kDa的突觸小體相關蛋白(SNAP-25)，但是與A型肉毒毒素相比，它靶向於該蛋白中的不同胺基酸序列。B、D、F和G型肉毒毒素作用於囊泡相關蛋白(VAMP，也叫小突觸泡蛋白)，每種血清型切割該蛋白的不同位點。最後是C1型肉毒毒素，它表現為切割突觸融合蛋白和SNAP-25。上述這些作用機制的差異影響了各種血清型肉毒毒素的相對效力和/或作用持續時間。
不論是哪種血清型，毒素中毒的分子機制似乎都差不多，都至少包含三個步驟或階段。在該過程的第一步，毒素通過重鏈(H鏈)和細胞表面受體之間的特異性相互作用，結合到靶神經元的突觸前膜；每種血清型的肉毒毒素的受體被認為是不同的。H鏈的羧基端片段Hc似乎對毒素至細胞表面的靶向作用十分重要。
在第二步中，毒素穿過中毒細胞的質膜。毒素首先通過受體介導的胞吞作用被細胞吞食，形成含有毒素的內含體。然後毒素從內含體逃脫至細胞的胞質中。上述的最後一步被認為是由H鏈的氨基端片段HN介導，它引發毒素對大約5.5或更低的pH值的反應——構象改變。已知內含體具有降低內含體內pH值的質子泵。構象改變暴露了毒素內部的疏水性殘基，這使得毒素可以將自身埋入內含體膜中。然後毒素穿過內含體膜移位至胞質溶膠中。
肉毒毒素活性機制的最後一步似乎涉及連接H鏈和L鏈的二硫鍵的還原。肉毒梭菌和肉毒毒素的全部毒素活性都包含於全毒素的L鏈中；L鏈是鋅(Zn++)內肽酶，它可選擇性地切割蛋白，該蛋白對於包含神經遞質的囊泡與原生質膜的胞質膜表面相識別和對接以及囊泡和質膜的融合十分重要。肉毒神經毒素——肉毒毒素B、D、F和G——引起小突觸泡蛋白(也叫囊泡相關膜蛋白(VAMP))的降解，小突觸泡蛋白是一種突觸體膜蛋白。任何一種上述的切割事件都會導致大部分存在於突觸囊泡的胞質表面的VAMP被除去。每種毒素特異性地切割不同的鍵。
對於所有這七種已知的肉毒毒素血清型，肉毒毒素蛋白分子的分子量都為約150kDa。有趣的是，梭菌細菌是以含有150kDa的肉毒毒素蛋白分子及一種或多種相關的非毒素蛋白的複合物的形式來釋放肉毒毒素的。因此，梭菌細菌可以以900kDa、500kDa和300kDa的形式產生A型肉毒毒素複合物。B和C1型肉毒毒素似乎僅以500kDa複合物的形式產生。D型肉毒毒素以300kDa複合物和500kDa複合物的形式產生。最後，E和F型肉毒毒素僅以約300kDa複合物的形式產生。認為複合物(即分子量大於約150kDa)中包括非毒素血凝素蛋白和非毒素及非毒性非血凝素蛋白。因此肉毒毒素複合物可包括肉毒毒素分子(神經毒性成分)和一種或多種非毒性血凝素蛋白和/或非毒素非血凝素蛋白(後者可被稱為NTNH蛋白)。這兩種非毒素蛋白(可與肉毒分子一起組成有關的神經毒素複合物)可使肉毒毒素分子更為穩定，防止變性，並可在毒素被攝取時保護毒素抵抗消化性的酸。此外，可能較大的(大於約150kDa的分子量)肉毒毒素複合物會導致肉毒毒素從肌內注射肉毒毒素複合物的位置擴散的速度較慢。可以通過在pH7.3的條件用紅細胞處理複合物，或通過使複合物經受分離過程的方式使毒素複合物解離為毒素蛋白和血凝素蛋白，所述的分離過程例如在pH約7-8的合適緩衝液中進行的柱層析。肉毒毒素蛋白在除去血凝素蛋白後就很不穩定。
由天然肉毒梭菌細菌產生的所有血清型的肉毒毒素都是無活性單鏈蛋白的形式，這種單鏈無活性蛋白必須經過蛋白酶的切割或切口才變得有神經活性。產生A型和G型肉毒梭素的細菌菌株具有內源性蛋白酶，因此A和G血清型可主要以活性形式從細菌培養物中回收。相反地，C1、D和E血清型的肉毒毒素是由非蛋白水解性菌株合成，所以從培養物中回收時通常是無活性的。蛋白水解性和非蛋白水解性的菌株均可產生血清型B和F，所以可以活性或無活性的形式被回收。然而，即使是蛋白水解性菌株，例如產生B型肉毒毒素的菌株，也只能切割一部分所產生的毒素。經切割的和未切割的分子的精確比例取決於培養時間的長度和培養物的溫度。因此，例如，B型肉毒毒素的任何製劑中，可能都有一部分是無活性的，這可能能夠解釋所知的B型肉毒毒素的效力比A型肉毒毒素低得多。臨床製劑中無活性肉毒毒素分子的存在會增加製劑的蛋白總負荷，從而導致抗原性提高而未提高臨床效力。此外，還已知B型肉毒毒素在肌內注射的情況下，與同劑量水平的A型肉毒毒素相比，其活性持續時間較短，效力也較弱。
體外研究表明肉毒毒素抑制腦幹組織原代細胞培養物的由鉀離子誘導的乙醯膽鹼和去甲腎上腺素的釋放。此外，還報導過在脊髓神經元原代培養物中肉毒毒素抑制甘氨酸和穀氨酸的誘發釋放，以及在腦突觸體標本中肉毒毒素抑制下述每一種神經遞質的釋放乙醯膽鹼、多巴胺、去甲腎上腺素、CGRP和穀氨酸。
用於藥物組合物的肉毒毒素可通過肉毒梭菌的厭氧發酵獲得，所述厭氧發酵使用的是所熟知的Schantz方法的修改版(參見例如SchantzE.J.，et al.，Properties and use of botulinum toxin and other microbialneurotoxins in medicine，Microbial Rev 1992 Mar；56(1)80-89；SchantzE.J.，et al.，Preparation and characterization of botulinum toxin type A forhuman treatment，Neurological Disease and therapy.Therapy withbotulinum toxin(1994)(第三章)，Jankovic J著，New York，MarcelDekker；1994，41-49頁，and；Schantz E.J.，et al.，Use of crystalline type Abotulinum toxin in medical research，inLewis GE Jr，ed.BiomedicalAspects of Botulism(1981)New York，Academic Press，143-50頁.)。
肉毒毒素(150kDa的分子)和肉毒毒素複合物(300kDa至900kDa)可從下列公司或機構獲得，例如List Biological Laboratories，Inc.，Campbell，California；the Center for Applied Microbiology andResearch，Proton Down，U.K.；Wako(Osaka，Japan)和SigmaChemieals of St Louis，Missouri。市售的含有肉毒毒素的藥物組合物包括Allergan，Inc.，Irvine，California出售的BOTOX(純化A型肉毒毒素神經毒素複合物和人血清白蛋白及氯化鈉)(每瓶裝100單位的凍乾粉末，用前以0.9％氯化鈉溶液重新溶解)，Ipsen Limited，Berkshire，U.K.出售的Dysport(肉毒毒素藥物組合物中含純化A型肉毒毒素血凝素複合物和人血清白蛋白及乳糖)(凍乾粉末，用前以0.9％氯化鈉溶液重新溶解)，和Solstice Neurosciences，San Diego，California出售(之前由Elan Corporation，Dublin，Ireland出售)的MyoBlocTM(注射用溶液，含B型肉毒毒素、人血清白蛋白、丁二酸鈉和氯化鈉，pH值為5.6)。
A型肉毒毒素在治療各種臨床病症方面的成功引起人們對其他血清型的肉毒毒素的關注。因此，至少A、B、E和F型的肉毒毒素已在臨床上應用於人類。此外，純(約150kDa)肉毒毒素已用於治療人類。參見例如Kohl A et al.，Comparison of the effect of botulinum toxin A(BOTOX)with the highly-purified neurotoxin(NT 201)in the extensordigitorum brevis muscle test，Mov Discord 2000；15(Suppl 3)165。由此，肉毒毒素藥物組合物可用純(約150kDa)肉毒毒素製備，而不使用肉毒毒素複合物製備。
已知A型肉毒毒素可溶於pH4-6.8的稀釋水溶液中。在pH值大於7時，起穩定作用的非毒性蛋白從神經毒素上解離，使毒性逐漸喪失，尤其是pH值和溫度升高時更是如此。Schantz E.J.，et al.，Preparationand characterization of botulinum toxin type A for human treatment(具體44-45頁)，Jankovic J.，et al，Therapy with botulinum toxin(第三章)，Marcel Dekker，Inc(1994)。
與常見的酶一樣，肉毒毒素(為細胞內肽酶)的生物活性至少部分依賴於其三維構象。因此，A型肉毒毒素可被熱、各種化學表面延伸劑和表面乾燥劑去毒。此外，還已知除非存在合適的穩定劑，否則將由已知的培養、發酵和純化過程所得的毒素複合物稀釋至用於藥物組合物製劑的極低的濃度會使得毒素迅速失活。由毫克量的毒素稀釋至每毫升含幾納克的溶液的過程存在很大的困難，因為在如此大稀釋倍數的情況下特異性毒性會迅速消失。因為可能在含毒素的藥物組合物製成的幾個月或幾年後才使用毒素，所以可使用例如白蛋白或明膠的穩定劑穩定毒素。
據報導，肉毒毒素已被用於各種臨床處置中，包括
(1)肌內注射(多處肌肉)每次約75-125單位的BOTOX以治療頸肌張力障礙；(2)肌內注射每次5-10單位的BOTOX以治療眉間皺紋(眉溝)(肌內注射5單位至降眉間肌和肌內注射10單位至每塊皺眉肌)。
(3)在恥骨直腸肌的括約肌內注射30-80單位的BOTOX以治療便秘。
(4)每塊肌肉肌內注射1-5單位的BOTOX以治療瞼痙攣，注射上眼瞼的側瞼板前眼輪匝肌和下眼瞼的側瞼板前眼輪匝肌。
(5)在眼外肌肌內注射1-5單位的BOTOX以治療斜視，注射量根據被注射肌肉的大小和所需的肌肉麻痺範圍(即所需的屈光度校正量)有所變化。
(6)在五處不同的上肢屈肌肌內注射BOTOX以治療中風後的上肢痙攣，注射量如下(a)指深屈肌7.5U至30U(b)指淺屈肌7.5U至30U(c)尺側腕屈肌10U至40U(d)橈側腕屈肌15U至60U(e)肱二頭肌50U至200U。
同一次治療期間注射上述五處肌肉的每一處，這樣患者在每一次治療期間其上肢屈肌接受90U至360U的BOTOX的肌內注射。
(7)顱骨膜注射(對稱注射至眉間肌、額肌和顳肌)25U的BOTOX以治療偏頭痛，在25U注射後三個月以內，通過對偏頭痛發作頻率、最嚴重程度、相關嘔吐和急性藥物使用的下降水平的測量，發現注射作為偏頭疼的預防性治療，與賦形劑治療相比有明顯的益處。
已知A型肉毒毒素的效力可最長達12個月(European J.Neurology6(Supp 4)S111-S11501999)，在某些情況下可長達27個月。TheLaryngoscope 1091344-13461999。然而，肌內注射BOTOX的通常持續時間一般為3至4個月。
一種市售含肉毒毒素的藥物組合物以BOTOX的商標銷售(由Allergan，Inc.，Irvine，California銷售)。BOTOX由純化A型肉毒毒素複合物、人血清白蛋白和氯化鈉組成，滅菌、真空乾燥形式包裝。A型肉毒毒素由在含N-Z氨基酪蛋白和酵母提取物的培養基生長的肉毒梭菌Hall菌株產生。A型肉毒毒素複合物通過一系列酸或酸和醇沉澱方法從培養液中純化為結晶複合物，該結晶複合物包括活性的高分子量毒素蛋白和相關的血凝素蛋白。將結晶複合物重溶於含鹽和白蛋白的溶液中並過濾除菌(0.2微米)然後真空乾燥。BOTOX可在肌內注射之前重新溶解於無菌、無防腐劑的鹽溶液中。每小瓶BOTOX含約100單位(U)的A型肉毒毒素複合物、0.5毫克人血清白蛋白和0.9毫克氯化鈉，為無菌真空乾燥形式，不含防腐劑。
根據在合適大小的注射器中的合適的稀釋液總量，用不含防腐劑的無菌的生理鹽水(0.9％氯化鈉注射液)重新溶解真空乾燥的BOTOX。由於BOTOX會因氣泡或類似的劇烈攪拌作用而變性，所以要將稀釋液緩慢的注射至藥瓶內。重新溶解的BOTOX可置於冰箱內(2°至8℃)儲存，溶液為澄清的無色液體，無顆粒物。有報導稱重新溶解的BOTOX可保持效力最多達30天。參見例如Guttman C.，Botox retainsits efficacy for blepharospasm treatment after freezing and storage，NewYork investigators find，Euro Times 2000 Nov/Dec；5(8)16。真空乾燥產品在冷凍箱內或低於-5℃儲存。
通常，識別了四種肉毒梭菌的生理群(I、II、III、IV)。能產生不同血清型毒素的生物可來自一種以上的生理群。例如B型和F型毒素可由I群或II群的菌株產生。此外，也鑑定了能產生肉毒神經毒素的梭菌菌種其他菌株(巴氏梭菌(C.baratii)，F型；丁酸梭菌(C.butyricum)，E型；諾氏梭菌(C.novyi)，C1或D型)。
肉毒梭菌各型的生理群列於表1。
表I.肉毒梭菌生理群

上述各型毒素可通過從肉毒梭菌生物的適當生理群中篩選產生。指定為I群的生物通常被認為具有蛋白水解性並產生A、B和F型肉毒毒素而被提及。指定為II群的生物為糖分解性並產生B、E和F型肉毒毒素。指定為III群的生物僅產生C和D型肉毒毒素，並且因其產生大量丙酸而與I和II群相區別。IV群的生物僅產生G型肉毒毒素。
已知可使用基本上不含動物產物的特異培養基來獲得破傷風毒素。參見例如美國專利6,558,926。但應注意到即使該專利公開的「不含動物產物」培養基也使用了細菌用蛋白腖——一種肉類消化物。很明顯，由破傷風梭菌產生破傷風毒素和由肉毒梭菌細菌產生肉毒毒素，二者需要不同的生長、培養基和發酵參數及考慮因素。參見例如Johnson，E.A.，et al.，Clostridium botulinum and its neurotoxinsa metabolic and cellularperspective，Toxicon 39(2001)，1703-1722。
因此需要不含或基本不含動物產物(例如動物源性蛋白)的培養基和方法來獲得或產生生物活性的肉毒毒素。

發明內容
本發明滿足了上述需求並提供了用於獲得或產生生物活性的肉毒毒素的不含或基本不含動物產物(例如動物源性蛋白)的培養基和方法。所獲得的肉毒毒素可以用於製備肉毒毒素活性成分藥物組合物。
定義如本發明中所使用，下面提出的單詞或術語具有如下定義。
「約」意為如此限定的項、參數或術語包括一個範圍，該範圍為所指出的項、參數或術語的值加上或減去10個百分點所構成。
「給藥」或「給予」意為將藥物組合物給(即給予)患者的步驟。在此公開的藥物組合物為「局部給藥」，具體方式例如肌內(i.m.)、皮內、皮下給藥、鞘內給藥、顱內、腹膜內給藥、表面(經皮膚)給藥和植入(即植入例如聚合物植入物或微滲透泵的緩釋裝置)等常規給藥方式。
「不含動物產物」或「基本上不含動物產物」分別包括「不含動物蛋白」或「基本上不含動物蛋白」，意為不含有或基本不含有血源性產物、血液混合物和其他動物源性產物或化合物。「動物」意為哺乳動物(例如人)、鳥類、爬行類、魚類、昆蟲、蜘蛛或其他動物種類。「動物」不包括例如細菌的微生物。因此，本發明範圍內的不含動物產物培養基或方法或基本上不含動物產物的培養基或方法可包括肉毒毒素或肉毒梭菌細菌。例如，一種不含動物產物的方法或基本上不含動物產物的方法意為一種基本上不含動物源性蛋白或實質上不含動物源性蛋白或完全不含動物源性蛋白的方法，所述動物源性蛋白例如免疫球蛋白、肉類消化物、肉類副產物和奶或乳品產物或消化物。因此，不含動物源性產物的方法的一個實例為不含肉類和乳品的產物或肉類或乳品的副產物的方法(例如細菌培養或細菌發酵方法)。
「肉毒毒素」意為由肉毒梭菌產生的神經毒素，以及經修飾、重組、雜交和嵌合的肉毒毒素。重組的肉毒毒素可包括由非梭菌菌種重組產生的其輕鏈和/或重鏈。本發明中使用的「肉毒毒素」包括肉毒毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。本發明中使用的「肉毒毒素」還包括肉毒毒素複合物(即300、600和900kDa複合物)和純肉毒毒素(即約150kDa的神經毒性分子)，上述兩者均適用於本發明的實踐。「純化的肉毒毒素」意為與其他蛋白或雜質分離或基本分離的純肉毒毒素或肉毒毒素複合物，所述其他蛋白或雜質可能伴隨著肉毒毒素一起從培養物或發酵過程中獲得。因此，除去非肉毒毒素蛋白和其他雜質的純化的肉毒毒素純度為至少90％，優選高於95％，最優選高於99％。肉毒C2和C3細胞毒素不是神經毒素，不在本發明的範圍之內。
「梭菌神經毒素」意為梭菌細菌例如肉毒梭菌、丁酸梭菌或巴氏梭菌產生或天然具有的神經毒素及非梭菌菌種重組產生的梭菌神經毒素。
「完全不含」(即術語「由......組成」)意為在所使用的儀器或方法的檢驗範圍內，該物質不能被檢測到或不能肯定其存在。
「實質上不含」(或「實質上由......組成」)意為僅能檢出痕量的該物質。
「經修飾的肉毒毒素」意為這樣一種肉毒毒素，它與天然肉毒毒素相比，其胺基酸序列中至少有一處被缺失、被修飾或被置換。此外，經修飾的肉毒毒素可為重組產生的神經毒素或重組產生神經毒素的衍生物或片段。經修飾的肉毒毒素保留了天然肉毒毒素的至少一種生物學活性，例如與肉毒毒素受體結合的能力或抑制神經遞質從神經元釋放的能力。經修飾的肉毒毒素的一個實例是含有一種肉毒毒素血清型(例如血清型A)的輕鏈和另一種肉毒毒素血清型(例如血清型B)的重鏈的肉毒毒素。經修飾的肉毒毒素的另一個實例是與例如P物質的神經遞質相偶聯的肉毒毒素。
「患者」意為接受醫學或獸醫學治療的人類或非人類受試者。因此，本發明的公開的藥物組合物可用於治療任何動物，例如哺乳動物。
「藥物組合物」意為一種製劑，其中的活性成分可以是肉毒毒素。「製劑」一詞意為藥物組合物中除了神經毒素活性成分之外還含有至少一種附加成分(例如人血清白蛋白和/或氯化鈉)。所以，藥物組合物為一種適合對例如人類的受試者為診斷、治療或美容而施用(即通過肌內或皮下注射或通過插入貯庫(depot)或植入物的方式)的製劑。該藥物組合物可以是冷凍乾燥或真空乾燥狀態、用鹽溶液或水將凍幹或真空乾燥的藥物組合物重新溶解形成的溶液、或不需要重新溶解的溶液。活性成分可以為肉毒毒素血清型A、B、C1、D、E、F或G的一種或肉毒毒素，它們都可以由梭菌細菌天然地產生。如上所述，藥物組合物可為液體或例如真空乾燥的固體。藥物組合物的組成成分可以包括於一種單一的組合物中(就是說除了任何必需的重溶溶液外，所有組成成分在藥物組合物初始組合的時候都存在)或包括於二組分系統中，例如真空乾燥的組合物用稀釋劑例如鹽溶液重新溶解，而該稀釋劑中含有在藥物組合物初始組合時不存在的成分。雙組分系統的優點在於它可以引入成分，所述成分在長期與雙組分系統的第一組分共同貯存的情況下沒有足夠的相容性。例如，重溶賦形劑或稀釋劑可含有對防止使用期間的微生物生長提供充分保護的防腐劑，所述使用期間例如一周的冷藏期，但在兩年的冷凍儲存期中沒有防腐劑，因為在這期間它可能降解毒素。其他可能不適於與肉毒毒素或其他成分長期共存的成分，可用上述方式加入；也就是在接近使用的時候在第二賦形劑中(即在重溶溶液中)加入。組合肉毒毒素活性成分藥物組合物的方法公開於美國專利公布20030118598 A1。
「基本上不含」意為存在的水平低於藥物組合物重量百分比的1％。
「治療製劑」意為可用於治療並由此減輕病症或疾病的製劑，所述病症或疾病例如以周圍肌肉的過度興奮(即痙攣)為特徵的病症或疾病。
本發明提供含有至少下降水平的動物或乳品副產物並優選基本上不含有動物或乳品副產物的培養基。「動物或乳品副產物」意為不論是體內還是體外，在動物細胞(不包括細菌)中或由動物細胞產生的任何化合物或化合物的組合。優選的非動物來源的培養基成分例如蛋白、胺基酸和氮，包括植物、微生物(例如酵母)和合成化合物。
本發明還提供使用至少一種基本上不含動物或乳品副產物的培養基獲得肉毒毒素的方法。例如，肉毒毒素可通過在基本上不含動物產物的發酵培養基中培養肉毒梭菌而獲得。
本發明還包括通過在基本上不含動物產物、而含有植物源性產物的發酵培養基中培養肉毒梭菌而獲得的肉毒毒素。此外，肉毒毒素還可通過在基本上不含動物產物、而含有一些基於大豆產物的發酵培養基中培養肉毒梭菌而獲得。
在另一個優選實施方案中，肉毒毒素還可通過在基本上不含動物產物、而含有替換動物源性產物的水解大豆產物的發酵培養基中培養肉毒梭菌而獲得。優選地，在培養基中的生長持續至至少出現細胞裂解。用於接種發酵培養基的肉毒梭菌的菌種可來自含肉毒梭菌的種子培養基。優選地，生長於種子培養基並用作發酵培養基接種物的肉毒梭菌處於其對數生長期。用於接種種子培養基的肉素梭菌的菌種可來自凍幹的培養物。肉毒梭菌可以動物奶或豆奶中培養物的形式被凍幹。優選地，肉毒梭菌以豆奶中培養物的形式被凍幹。
本發明還提供用於培養肉毒梭菌的組合物，所述組合物包括基本上不含動物源性產物的培養基。
在一個實施方案中，該組合物構成基本上不含動物源性產物、而含有非動物來源的至少一種產物、還含有肉毒梭菌的培養基。
在另一個實施方案中，該組合物構成基本上不含動物源性產物、而含有源自植物的至少一種產物、還含有肉毒梭菌的培養基。本發明又一個實施方案可為一種組合物，構成基本上不含動物源性產物、而含有源自大豆的至少一種產物、還含有肉毒梭菌的培養基。
本發明包括通過下述步驟獲得生物活性梭菌毒素(例如在APF培養基中的肉毒毒素)的方法(1)提供發酵培養基(該培養基至少是基本上不含動物源性產物的，含有約4-8％(重量)的大豆來源產物)；(2)在可產生肉毒毒素的條件下，在發酵培養基中發酵肉毒梭菌；以及(3)從發酵培養基中回收生物活性的肉毒毒素。在此方法中，發酵培養基還可包括約0-3％(重量)的酵母提取物和約0.5-5％(重量)的葡萄糖。優選地，發酵培養基含有約1-2％(重量)的葡萄糖。進行發酵步驟的條件為pH約5.0至5.5、時間約45小時至75小時、溫度在約33°至36℃及厭氧性環境。
用於獲得生物活性梭菌毒素的方法還可以(在上述步驟(1)提供發酵培養基之前)包括下述兩個步驟(a)獲得基本上不含動物源性產物並含有約4-8％(重量)的大豆來源產物的培養基，和(b)在培養基中培養肉毒梭菌。
值得注意的是，在本方法中的從發酵培養基中回收生物活性的肉毒毒素的步驟(3)可以為或可包括APF純化步驟。
用於獲得生物活性梭菌毒素的方法的詳細實施方案可以包括下述步驟(a)獲得基本上不含動物源性產物而含有約4-8％(重量)的大豆來源產物的培養基，並在培養基中培養肉毒梭菌；(b)提供基本上不含動物產物的發酵培養基，該培養基包括(i)約4-8％(重量)的大豆來源產物，(ii)約0-3％(重量)的酵母提取物，(iii)約1-2％(重量)的葡萄糖，(c)在下列可產生肉毒毒素的條件下，在發酵培養基中發酵肉毒梭菌細菌，包括(i)在pH約5.0至5.5的條件下進行發酵步驟，(ii)進行發酵步驟約45小時至75小時，(iii)在約33°-36℃的溫度條件下進行發酵步驟，(iv)在厭氧性環境中進行發酵步驟，以及；(d)從發酵培養基中回收生物活性的肉毒毒素，其中回收步驟為APF純化步驟。
本發明還包括用於培養或發酵肉毒梭菌的培養基，其中所述培養基基本上不含動物源性產物，而含有源自植物的蛋白產物。培養基可包括約4-8％(重量)的大豆來源產物、約0-3％(重量)的酵母提取物和約1-2％(重量)的葡萄糖。
本發明還涉及一種製備基本上不含動物產物的藥物組合物的方法，所述藥物組合物中的活性成分為肉毒毒素，所述方法包括下述步驟(a)通過以下步驟獲得生物活性的肉毒毒素(i)提供基本上不含動物源性產物的發酵培養基；
(ii)在可產生肉毒毒素的條件下，在發酵培養基中發酵肉毒梭菌，以及；(iii)從發酵培養基中回收生物活性的肉毒毒素，以及；(b)使肉毒毒素與合適的賦形劑組合，由此製備基本上不含動物產物的藥物組合物，所述藥物組合物中的活性成分為肉毒毒素。
此外，本發明還涉及通過以下步驟獲得生物活性的肉毒毒素的方法(a)提供基本上不含動物產物、含有約4-8％(重量)的大豆來源產物的發酵培養基；(b)在發酵培養基中發酵肉毒梭菌，其中發酵培養基保持在pH約5到5.5的pH值；以及(c)從發酵培養基中回收生物活性的肉毒毒素。
最後，本發明還涉及用於培養和/或發酵肉毒梭菌細菌毒素的不含動物蛋白的培養基。優選地，培養基基本上不含動物源性產物，而含有約4-8％的大豆來源產物、約0-3％(重量)的酵母提取物和約1-2％(重量)的葡萄糖。


下列附圖解釋或說明了本發明的一些方面。
圖1的題目為「氮源(即HySoy加YE)％對比活性和pH」，本圖顯示按下述方法測得的肉毒毒素活性(1)左側Y軸小鼠致死劑量50(MLD 50)(藍色柱)，和(2)左側Y軸SNAP 25活性(紅色柱)，不同的APF培養基經歷的發酵時間示於各柱的頂端，APF培養基的pH值示於右側Y軸的pH，APF培養基中的水解大豆和酵母提取物的％濃度(重量)示於X軸。圖1中的所有培養基都含有1％(重量)的葡萄糖。
圖2為概括流程圖，比較了用於獲得肉毒毒素的非APF方法(圖2的上半部分)和本發明範圍內的用於獲得肉毒毒素的APF方法(圖2的下半部分)的製備細胞庫、培養和發酵步驟。圖2省略了收穫和純化步驟。
圖3是在APF發酵方法中，發酵培養基含1％(重量)的葡萄糖和1％(重量)的酵母提取物的條件下，比較了大豆蛋白濃度對A型肉毒毒素複合物產生的影響。圖3中X軸代表發酵培養基中特定的水解大豆蛋白(HySoy)的重量百分比濃度，左側Y軸代表最終純化的肉毒毒素複合物的效力，右側Y軸代表細胞裂解程度的百分數，細胞裂解程度按以下等式確定 其中OD600 最大值對應於最大生長量時在600nm處測量的光密度，OD600 終點為發酵收穫時的光密度。
具體實施例方式
本發明基於下述發現基本不含動物產物或動物副產物的培養基和方法可以用於能夠產生生物活性肉毒毒素的生物(如肉毒梭菌細菌)的培養和發酵。所得的肉毒毒素可以用於製備肉毒毒素活性成分藥物組合物。因此在此公開的是含有明顯降低了肉類或乳品副產物水平的培養基，優選的培養基實施方案基本上不含所述的動物產物。
本發明涉及發明人的令人驚奇的發現動物基礎的產物在用於肉毒梭菌生長的培養基中並不是必需的，特別是植物基礎的產物可以替代用於肉毒梭菌生長的培養基中一般使用的動物基礎的產物。
現有技術中使用的用於細菌生長和發酵的培養基通常含有一種或多種動物源性成分，例如熟肉。根據本發明，優選的用於肉毒梭菌生長的培養基含有動物源性產物的量不超過培養基總重量的約5％至約10％。更優選地，本發明範圍內的培養基中的動物源性產物的含量不超過培養基總重量的1％至小於5％。最優選地，所有用於生產肉毒毒素的肉毒梭菌生長的培養基和培養物完全不含有動物源性產物。上述培養基包括但不限於用於肉毒梭菌的小規模和大規模發酵的培養基、用於接種於種子(第一)培養基的肉毒梭菌的培養物生長的培養基和發酵(第二)培養基、以及用於長期儲存肉毒梭菌培養物(例如原種培養物)的培養基。
在本發明的某一個優選實施方案中用於肉毒梭菌生長和肉毒毒素生產的培養基可包括大豆基礎的產物以替代動物源性產物。或者，可以使用平原羽扇豆(Lupinus campestris)的脫苦味的種子替代大豆基礎產物。已知平原羽扇豆的蛋白含量與大豆十分接近。優選地，上述培養基包括水解的和可溶於水的大豆或平原羽扇豆來源產物。但是，不溶性的大豆或平原羽扇豆產物也可以用於本發明以替代動物產物。可用大豆或平原羽扇豆產物替代的常見動物產物包括牛心浸液(BHI)、動物源性腖產物例如細菌用蛋白腖、水解酪蛋白和乳品副產物例如動物奶。
優選地用於肉毒梭菌生長的含大豆基礎或平原羽扇豆基礎的產物的培養基與通常使用的含動物源性產物的相似，只是基本所有的動物源性產物均被植物源性產物所替代。例如，大豆基礎發酵培養基可包括大豆基礎產物、碳源例如葡萄糖、鹽例如NaCl和KCl、含磷酸鹽成分例如Na2HPO4、KH2PO4、二價陽離子例如鐵和鎂、鐵粉和胺基酸例如L-半胱氨酸和L-酪氨酸。用於接種(即接種或第一培養基)發酵(第二)培養基的肉毒梭菌的培養物生長的培養基，優選地至少含有大豆基礎產物、鹽源例如NaCl和碳源例如葡萄糖。
本發明提供用於最大化肉毒毒素產量的肉毒梭菌的生長方法，所述方法使用基本上不含動物產物的培養基。用於生產肉毒毒素的肉毒梭菌的生長可通過在含有替代動物源性產物成分的大豆副產物的培養基中的發酵而發生。發酵培養基的接種菌可以來源於小規模生長培養基(種子培養基)。根據發酵步驟的大小和體積，種子培養基中的為提高菌體量的連續生長步驟的數目可能變化。為培養用於接種發酵培養基的肉毒梭菌的合適的量，可以在種子培養基中進行包括一步或多步的生長步驟。對於不含動物產物的培養肉毒梭菌的方法來說，優選地肉毒梭菌的生長從儲存於非動物來源的培養基的培養物開始。儲存培養物，優選為凍幹的儲存培養物通過在含有大豆來源蛋白和缺少動物副產物的培養基中的生長產生。肉毒梭菌在發酵培養基中的生長可以通過儲存的凍幹培養物直接接種而發生。
在本發明優選的實施方案中，肉毒梭菌的生長經過兩個時期——種子生長和發酵。這兩個時期均在厭氧性環境下進行。種子生長期通常用於從儲存培養物「放大」微生物數量。種子生長期的目的是使微生物的數量增加至可用於發酵。此外，種子生長期使得儲存培養物中相對休眠的微生物恢復活力並生長為活性生長的培養物。而且，用活性生長的培養物比用儲存培養物能夠更精確地控制用於接種發酵培養物的成活微生物的體積和數量。因此，用於接種於發酵培養基的種子培養物的生長是優選的。此外，可以使用涉及種子培養基中生長的任何次數連續步驟的生長以放大用於接種發酵培養基的肉毒梭菌數量。應注意到肉毒梭菌在發酵期中的生長是可以通過直接接種而直接從儲存培養物開始的。
在發酵期中，使用含有來自種子生長的肉毒梭菌的一部分種子培養基或全部種子培養基來接種發酵培養基。優選地，使用約2-4％的含有來自種子生長的肉毒梭菌的種子培養基來接種發酵培養基。利用發酵在大規模厭氧環境下生產最大量的微生物(Ljungdahl et al.，Manual ofindustrial microbiology and biotechnology(1986)，Demain等著的American Society for Microbiology，Washington，D.C.84頁)。
肉毒毒素的分離和純化可以使用蛋白純化領域的普通技術人員所熟知的方法進行。參見例如Coligan et al.，Current Protocols in ProteinScience，Wiley Sons；Ozutsumi et al.Appl.Environ.Microbiol.49；939-9431985。
為了生產肉毒毒素，可使肉毒梭菌的培養物在用於接種發酵培養基的種子培養基中生長。涉及在種子培養基中生長的連續步驟的數目根據在發酵期肉毒毒素的生產規模可有所不同。然而，如前所述，發酵期的生長可以直接由儲存培養物的接種開始。用於肉毒梭菌生長的通常的動物基礎種子培養基包括BHI、細菌用蛋白腖、NaCl和葡萄糖。如前所述，備選種子培養基可根據本發明製備，其中的動物基礎組分被非動物基礎組分替代。例如但不限於在用於肉毒梭菌生長和肉毒毒素生產的培養基中，大豆基礎的產物可以替代BHI和細菌用蛋白腖。雖然肉毒梭菌培養物可以在含有不溶性大豆的培養基中生長，優選地，該大豆基礎的產物可溶於水並包括水解大豆。但是在來源於可溶性大豆產物的培養基中的生長水平和後續的毒素產量更高。
根據本發明可使用任何來源的大豆產物。優選地，大豆為水解大豆，並且水解使用非動物酶進行。各種來源的水解大豆可從許多商業售主那裡獲得。上述大豆的來源包括但不限於Hy-Soy(Quest international)、Soy腖(Gibco)、Bac-soytone(Difco)、AMISOY(Quest)、NZ soy(Quest)、NZ soy BL4、NZ soy BL7、SE50M(DMV InternationalNutritionals，Fraser，N.Y.)和SE50MK(DMV)。最優選地，水解大豆的來源為Hy-Soy或SE50MK。水解大豆的其他潛在來源是已知的。
根據本發明Hy-Soy在種子培養基中的濃度範圍為25-200g/L。優選地，Hy-Soy在種子培養基中的濃度範圍為50-150g/L。最優選地，Hy-Soy在種子培養基中的濃度為約100g/L。此外，NaCl的濃度範圍為0.1-2.0g/L。優選地，NaCl的濃度範圍為0.2-1.0g/L。最優選地，NaCl在種子培養基中的濃度為約0.5g/L。葡萄糖的濃度範圍為0.1g/L-5.0g/L。優選地，葡萄糖的濃度範圍為0.5-2.0g/L。最優選地，葡萄糖在種子培養基中的濃度為約1.0g/L。本發明還優選但非必需的是將葡萄糖與種子培養基的其他組分一起高壓滅菌。在生長前種子培養基的pH水平可為7.5-8.5。例如，在肉毒梭菌的生長前種子培養基的pH可為約8.1。
肉毒梭菌在種子培養基中的生長可以分一個或多個階段進行。優選地，在種子培養基中的生長分兩個階段進行。在階段一，將肉毒梭菌懸於一定量的培養基中，並在厭氧性環境下、在34±1℃、培養24-48小時。優選地，階段一的生長進行約48小時。在階段二，將含有肉毒梭菌的一部分或全部的階段一培養基接種到階段二種子培養基上進一步生長，接種後的階段二培養基也在厭氧性環境下、在34±1℃、培養約1-4天。優選地在階段二種子培養基中的生長進行約3天。還優選在用種子培養基中的最後的生長物接種發酵培養基之前，在任一階段的種子培養基中的生長都不導致細胞裂解。
用於肉毒梭菌生長的含動物副產物的標準發酵培養基基於Mueller和Miler的配方(MM；J.Bacteriol.67271，1954)。含有動物副產物的MM培養基中的成分包括BHI和NZ-CaseTT。NZ-CaseTT為一種市售肽和胺基酸源，它源自酪蛋白的酶消化物，為存在於動物奶中的一群蛋白質。本發明證實非動物基礎產物可以在發酵培養基中替換BHI和NZ-CaseTT。例如但不限於大豆基礎產物可以替換用於肉毒梭菌發酵的MM培養基的動物基礎組分。雖然如前所述，不溶性大豆產物可以用於實踐本發明，但優選地該大豆基礎產物為水溶性的並源自水解大豆。
根據本發明均可使用任何來源的大豆基礎產物，優選地，水解大豆從Quest International(Sheffield)公司獲得，其商品名為Hy-Soy，或者從DMV International Nutritionals(Fraser，N.Y.)公司獲得，其商品名為SE50MK。可溶性大豆產物還可從包括但不限於下列的來源獲得Soy腖(Gibco)、Bac-soytone(Difco)、AMISOY(Quest)、NZ soy(Quest)、NZ soy BL4、NZ soy BL7和SE50MK(DMV InternationalNutritionals，Fraser，N.Y.)。
在本發明的另一個優選實施方案中，用於發酵肉毒梭菌的培養基不含動物副產物，而含有水解大豆、葡萄糖、NaCl、Na2HPO4、MgSO47H2O、KH2PO4、L-半胱氨酸、L-酪氨酸和粉末狀鐵。如同公開的種子培養基一樣，水解大豆可以替代發酵培養基中的動物副產品。這些動物副產品包括BHI和NZ-CaseTT(酶消化的酪蛋白)。
Hy-Soy在用於生產肉毒毒素的發酵培養基中的濃度範圍優選地為約10-100g/L。優選地Hy-Soy的濃度為約20-60g/L。最優選地Hy-Soy在發酵培養基中的濃度為約35g/L。為獲得肉毒毒素的最大產量，特別優選的發酵培養基中的各組分濃度約為7.5g/L的葡萄糖、5.0g/L的NaCl、0.5g/L的Na2HPO4、175mg/L的KH2PO4、50mg/L的MgSO47H2O、125mg/L的L-半胱氨酸和125mg/L的L-酪氨酸。粉末狀鐵的用量範圍可在50mg/L至2000mg/L，優選地，粉末狀鐵的用量範圍為約100-1000mg/L。最優選地，粉末狀鐵在發酵培養基中的用量範圍為約200mg/L至600mg/L。
為獲得毒素產量的最佳水平，大豆基礎發酵培養基的初始pH值(高壓滅菌前)優選地在約5.0至7.1。發現pH控制增加了肉毒毒素回收率。優選地發酵培養基的初始pH值約為7。如實施例7中所解釋的，發現如果pH值下降並保持於5-5.5，則可獲得穩定肉毒毒素的高產率。如同在種子培養基中的描述一樣，優選地，將包括葡萄糖和鐵的發酵培養基各組分一起高壓滅菌。
優選地將用於肉毒梭菌生長的一部分第二階段種子培養基接種發酵培養基。在厭氧箱中於34±1℃進行發酵約7至9天。細菌生長可以通過測量培養基的光密度(O.D.)來監測。發酵優選在出現細胞裂解後至少48小時以後停止，細胞裂解可由生長測量法(光密度)測定。當細胞裂解時，培養基的O.D.下降。
在本發明的一個優選實施方案中，用於肉毒梭菌長期儲存和種子培養基接種的肉毒梭菌培養物在豆奶中生長並凍幹後儲存於4℃。在動物奶中凍幹以備保存的肉毒梭菌培養物也可以用於生產肉毒毒素。但是為保持在整個肉毒毒素的生產過程中培養基基本上不含動物副產物，優選將肉毒梭菌的初始培養物保存於豆奶中而不是動物奶中。
實施例下述實施例說明了本發明所涉及的具體方法，並非意在限制本發明的範圍。肉毒梭菌培養物可從各種來源獲得，包括List Laboratories，Campell，California。在下述的所有實施例中，「肉毒梭菌」指的是A型肉毒梭菌的Hall A(ATCC命名號3502)菌株。
實施例1用於肉毒梭菌的不含動物產物的種子培養基的製備使用下述成分製備對照種子培養基，每升培養基含NaCl(5g)、細菌用蛋白腖(10g)、葡萄糖(10g)、BHI(至1升)，pH8.1(用5N NaOH調節)。
使用下述成分製備試驗用(不含動物產物)培養基，每升培養基含NaCl(5g)、大豆蛋白腖(10g)、葡萄糖(10g)、Hy-Soy(35g/L，製成1升培養液)，pH8.1(用5N NaOH調節)。
實施例2在不含動物產物的種子培養基中培養肉毒梭菌可將肉毒梭菌的凍幹培養物分別懸浮於1ml的實施例1中的對照種子培養基和試驗用種子培養基中，(將每一種子培養基)分成兩管，每管分別含有10ml種子培養基，然後在34℃培養約24-48小時。然後可用1ml的培養物接種於(分別)含40ml種子培養基的125ml DeLongBellco培養瓶中。接種培養物可置於Coy厭氧箱(Coy LaboratoryPruducts Inc.，Grass Lake，Mich.)中，於33℃±1℃培養24小時。
實施例3用於肉毒梭菌的不含動物產物的發酵培養基的製備可使用下述成分製備基礎發酵培養基，每兩升培養基含葡萄糖(15g)、NaCl(10g)、Na2HPO4(1g)、KH2PO4(0.350g)、MgSO47H2O(0.1g)、半胱氨酸-HC(0.250g)、鹽酸酪氨酸(0.250g)、粉末狀鐵(1g)、ZnCl2(0.250g)和MnCl2(0.4g)。
可使用下述成分製備對照發酵培養基，每兩升培養基含BHI(500ml；這相當於45.5克的乾重牛心浸液)、NZ-CaseTT(30g)和基礎培養基(至2升)，pH6.8。
可以先製備基礎發酵培養基並調節其pH值至6.8。然後製備牛心浸液(BHI)並用5N NaOH調節其pH值至8。然後可將BHI加至基礎培養基中。再準備NZ-CaseTT。然後將NZ-CaseTT加到已加入牛心浸液的基礎培養基中，並通過加入HCl使其溶解。然後可用5N NaOH調節pH值至6.8。然後將培養基分裝至16個100mm試管中，每管8ml，然後在120℃高壓滅菌25分鐘。
試驗用發酵培養基(不含動物產物)可通過用試驗氮源替換對照培養基中存在的BHI而製備。合適的試驗發酵培養基氮源包括Hy-Soy(Quest)、AMI-Soy(Quest)、NZ-Soy(Quest)、NZ-Soy BL4(Quest)、NZ-Soy BL7(Quest)、Sheftone D(Sheffield)、SE50M(DMV)、SE50(DMV)、SE50MK(DMV)、Soy Peptone(Gibco)、Bacto-Soyton(Difco)、Nutrisoy 2207(ADM)、Bakes Nutrisoy(ADM)、Nutrisoyflour、Soybean meal、Bacto-Yeast Extract(Difco)、Yeast Extract(Gibco)、Hy-Yest 412(Quest)、Hy-Yest 441(Quest)、Hy-Yest 444(Quest)、Hy-Yest 455(Quest)、Bacto-Malt Extract(Difco)、CornSteep和Proflo(Traders)。
試驗發酵培養基可以按照上述的對照培養基的方法製備，不過不加入BHI並且先用3N HCl或5N NaOH調節相關的氮源pH值至6.8。可將培養基分裝至16個100mm試管中，每管8ml，然後在120℃高壓滅菌20-30分鐘。
實施例4肉毒梭菌在不含動物產物的發酵培養基中的生長可將40μl的試驗種子培養基培養物(不含動物產物)用於接種每一管16×100mm試管中的8ml的對照或試驗發酵培養基等分試樣。培養物可置於33±1℃培養24小時。然後可將試管置於厭氧箱中培養以使細菌生長。每一次培養基分析可平行進行三份(即，在同樣的培養基中包含三次獨立的接種)，還可包括一個作為分光光度計上的空白的未接種對照。可使用Turner分光光度計(型號330)在660nm處每24小時測量生長(用光密度OD測定)。在細胞裂解持續大約48小時之後可停止培養，然後測定肉毒毒素產量。
可使用含下列成分的Hy-Soy發酵培養基進行附加的試驗，每500ml培養基含Hy-Soy(17.5g)、葡萄糖(3.75g)、NaCl(2.5g)、Na2HPO4(0.25g)、MgSO47H2O(0.025g)、KH2PO4(0.0875g)、L-半胱氨酸(0.0625g)、L-酪氨酸(0.0625g)、粉末狀鐵(0.25g)、pH 6.8。
實施例5在不含動物產物的發酵培養基中生長的肉毒梭菌的肉毒毒素的產量測定可離心實施例4中的培養細胞，然後測定上清液的pH值。給定樣品中的肉毒毒素水平可以通過加入標準抗毒素並測量出現絮凝作用所需時間來測定。可以測定Kf(出現絮凝作用所需時間，以分鐘計)和Lf(絮凝作用的限度；相當於1國際單位的標準抗毒素，以絮凝作用測定)。從給定培養物的每一發酵物試管中取4ml發酵培養基，並將其混合於15ml離心管中，這樣總體積為12ml。將試管以5000rpm(3400g)、4℃離心30分鐘。可將1ml上清液的等分試樣加入到含有0.1-0.6ml標準肉毒毒素抗血清的試管中，然後小心振蕩試管以混合內容物。然後可將試管置於45±1℃的水浴中，並記錄初始時間。可經常檢查試管並將絮凝作用開始的時間記錄為Kf。絮凝作用最先開始的那一管中的毒素濃度可被命名為LfFF。絮凝作用第二開始的管中的毒素濃度可被命名為LfF。
可在下列培養基中進行平行的發酵、生長和毒素產量分析(1)對照種子培養基(用於接種對照發酵培養基)和對照發酵培養基；和(2)試驗種子培養基(不含動物產物、用於接種於試驗發酵培養基)和試驗發酵培養基(不含動物產物)。值得注意的是，可以測得在不含動物產物的培養基中的肉毒梭菌的發酵以及從也不含動物產物(使用大豆來源產物替代動物產物)的培養物中的接種會導致近似為50或更多的Lf毒素。最小的Lf毒素約等於10。優選的Lf毒素至少為20。最優選的Lf毒素大於50。
此外，還可測得不同的大豆產物在缺少BHI的發酵培養基中可以支持肉毒梭菌的生長。因此，可溶性的大豆產物可以替代BHI用於肉毒梭菌的生長。最佳的濃度可為12.5或25g/L。Hy-Soy(Sheffield)可提供最高量的生長。不溶性的大豆產物效率可能低一些。
而且，所得的結果顯示在替代BHI用於肉毒梭菌生長的能力方面，Quest Hy-Soy、DMV SE50MK和Quest NZ-Soy可能是有效的大豆產物。結果可以顯示最適用於生長的大豆產物(例如Quest Hy-Soy、DMVSE50MK和Quest NZ-Soy)可以有效地替代BHI用於毒素生產。用於毒素生產的最佳的大豆產物可為22.75g/L的Quest Hy-Soy。更高濃度的該產物可能產生更好的生長，但不能提高毒素產量。提出了用SE50MK也可以得到類似的結果，更高的濃度可能使生長增加但不能提高毒素產量。另一方面，NZ-Soy在其更高濃度時可能提供更好的生長和更高的毒素產量。
最後，測得大豆產物可有效地替代BHI和NZ-CaseTT。從大豆基礎培養基中去除NZ-CaseTT會使生長降低2-4倍。在NZ-CaseTT存在和不存在的條件下，用於生長的最佳大豆產物可為SE50MK。Hy-Soy可替代BHI和NZ-CaseTT用於毒素生產。然而發酵循環可能需要延長至1或2天。在培養基中HY-Soy可替代BHI和NZ-CaseTT用於毒素生產。然而可以測得酵母提取物可能抑制毒素生產。
可以測得HY-Soy在22.75g/L時可完全替代BHI和NZ-CaseTT用於毒素生產。56.88g/L的HY-Soy對於生長的效果可能是最佳的，與此不同，34.13g/L的HY-Soy對於毒素生產時期的效果可能是最佳的。
因此，令人驚奇的測定了培養基中Hy-Soy或[Hy-Soy+Hy-Yest]是否可以替代BHI和細菌用蛋白腖用於肉毒梭菌的種子生長。此外，可以設計試驗以測定在種子培養基中使得肉毒梭菌的肉毒毒素產量達到最高水平的最佳組分濃度。在不含BHI和NZ-CaseTT的種子培養基和發酵培養基中生長的肉毒梭菌的毒素產量可以達到或超過在含有BHI和NZ-CaseTT的培養基中所得的毒素產量。
可以測定用於在種子培養基中生長的Hy-Soy或[Hy-Soy+Hy-Yest]的最佳濃度。試驗可以證實，Hy-Soy可以替代BHI和細菌用蛋白腖作為氮源用於肉毒梭菌在種子培養基中的生長，以及用於在隨後的發酵期中的肉毒毒素的生產。並且，Hy-Soy作為種子培養基中的氮源，與[Hy-Soy+Hy-Yest]相比可在後續的發酵步驟中產生更高水平的肉毒毒素。提供最高毒素水平的種子培養基中的Hy-Soy的濃度範圍約為62.5g/L至100g/L。
可以設計附加的試驗以測定在種子培養基中使得肉毒梭菌發酵產生的肉毒毒素產量達到最高水平的Hy-Soy的最佳濃度。由此，種子培養基中30g、50g、75g和100g的Hy-Soy均可使肉毒梭菌發酵產生的肉毒毒素產量接近或超過在含有BHI和細菌用蛋白腖作為氮源的培養基中所得的肉毒毒素水平。
發現了種子培養基中100g/L的Hy-Soy的濃度可導致在後續的發酵步驟中毒素產量的最高水平。此外，數據顯示Hy-Soy種子培養基的種子步驟-1在48小時後比在24小時後產生了更多的生長。
實施例6用於獲得肉毒毒素的非APF方法通過肉毒梭菌細菌的發酵獲得了梭菌毒素，因此按下述步驟實行了改良的Schantz(非APF)方法以獲得高效力和高度純化的肉毒毒素(即原料毒素(bulk toxin))。改良的Schantz(非APF)方法可提供高產量的肉毒毒素。Schantz方法和改良的Schantz方法在所有發酵培養基中均使用了酪蛋白。
原種培養物的製備從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，Manassas，Virginia可以獲得各種梭菌細菌。或者，可通過分離各種來源的肉毒梭菌製備肉毒梭菌細胞庫瓶(cell bank vial)，所述來源包括土壤或腐爛動物屍體的深度採樣(在厭氧性或準厭氧性部位)。通常，可從診斷為肉毒中毒的患者的生理液體(即創傷肉毒梭菌中毒患者的傷口擦拭物)的樣品中獲得肉毒毒素。圖1的上半部分概括了用於製備細胞庫瓶和用於肉毒毒素的培養和發酵的非APF方法。
將從天然或患者來源獲得的肉毒梭菌在血瓊脂平板上培養，然後將高生長菌落接種至細胞庫瓶培養基中。用於肉毒梭菌的細胞庫瓶培養基為含有新鮮碎牛肉的熟肉培養基。將活躍生長的培養物與甘油混合以製備肉毒梭菌細菌的細胞庫瓶(即原種培養物)，將其冷凍以備後用。
種子培養將肉毒梭菌細胞庫瓶在室溫下融化，然後進行下列4個培養步驟。(1)為了選擇合適形態的菌落，從融化的細胞庫瓶取等分試樣，通過在預還原Columbia血瓊脂平板上的細菌劃線進行培養，在34℃±1℃的條件下厭氧性培養30-48小時。(2)然後，將選出的菌落接種於含酪蛋白生長培養基的試管中，於34℃培養6-12小時。然後將具有最快生長速度和最高密度(生長篩選步驟)的試管中的內容物通過下述兩個擴大厭氧性培養步驟培養(3)在1升的種子培養瓶中於34℃進行12-30小時的第一次培養，接著(4)在25升含酪蛋白生長培養基的種子發酵罐中於35℃進行6-16小時的第二次培養。上述兩個擴大培養步驟在含有如下成分的營養培養基中進行2％酪蛋白水解酶(酪蛋白[奶蛋白質]消化物)、1％酵母提取物和1％葡萄糖(右旋糖)，溶於水，pH7.3。
發酵在擴大培養後進行進一步的培養，所述培養在35℃、在商業規模(即115升)發酵罐中、含酪蛋白培養基中、在受控厭氧性環境的條件下進行60-96小時。細菌的生長通常在24至36小時後完成，並且在60-96小時的發酵過程中大多數細菌經過裂解並釋放肉毒毒素。在Schantz方法或改良的Schantz方法中不需要對發酵培養基的pH值進行控制。認為毒素通過細胞裂解釋放，由存在於培養發酵液中的蛋白酶激活。視情況所需，可以使用單層厚度濾器對該培養基進行過濾除去粗大的雜質(即完整的和破裂的細胞)，以獲得稱為澄清培養物的澄清溶液。
收穫可通過在20℃用硫酸降低pH值至3.5以沉澱粗製毒素實現毒素的收穫。然後將粗製毒素通過超微過濾然後滲濾而濃縮。
純化將收穫的粗製毒素轉移至消化容器中，並加入蛋白酶抑制劑鹽酸苯甲脒以穩定毒素。加入DNA酶和RNA酶以消化核酸。含毒素的物質經過UF/DF和三個沉澱步驟(冷乙醇、鹽酸和硫酸銨沉澱)。純化的肉毒神經毒素複合物(原料毒素)以在磷酸鈉/硫酸銨緩衝液中的懸液形式儲存於2-8℃。
所得的原料毒素為高質量的結晶型900kDA型肉毒毒素複合物，它由肉毒梭菌的HallA菌株產生、具有≥3×107U/mg的特異效力、小於0.60的A260/A278值和在凝膠電泳上的獨特條帶形式，並且它適用於肉毒毒素藥物組合物的組合。
組合可能涉及如下步驟原料毒素的多倍稀釋，與一種或多種賦形劑(例如白蛋白和氯化鈉)混合以形成毒素組合物，和以低壓凍幹、冷凍乾燥或真空乾燥組合物的方法製備對儲存和裝運穩定的組合物形式。
由Schantz方法或改良的Schantz方法得到的純化的肉毒毒素複合物可以用pH 7-8的緩衝液從離子交換柱上洗脫，以使非毒素複合蛋白與肉毒毒素分子解離，從而得到(取決於發酵的肉毒梭菌的類型)近似150kD分子量、特異效力為1-2×108LD50U/mg或更高的純的A型肉毒毒素；或近似156kD分子量、特異效力為1-2×108LD50U/mg或更高的純化B型肉毒毒素；或近似155kD分子量、特異效力為1-2×107LD50U/mg或更高的純化F型肉毒毒素。
實施例7用於獲得肉毒毒素的APF培養基和方法本實施例闡明了一種為獲得高效力和高純度A型肉毒毒素(即原料毒素)而進行的APF方法。該方法可用於肉毒毒素的其它血清型。
原種培養物製備如實施例6所述，肉毒梭菌可從ATCC、各種天然來源或肉毒中毒的患者處獲得。圖2的下半部分概括了用於製備細胞庫瓶和用於肉毒毒素的培養和發酵的APF方法。通過在植物瓊脂平板上培養肉毒梭菌製備APF細胞庫瓶。將大豆來源HySoy(Quest)和酵母提取物和葡萄糖按3∶1∶1(重量百分比)的比例與瓊脂混合併使其凝固而製備植物瓊脂平板。其他市售的APF瓊脂平板和用於製備平板的脫水粉末也認為是適用的。將選出的高生長菌落接種至APF細胞庫瓶培養基中。所用的APF細胞庫瓶培養基含有同樣3∶1∶1比例的水解大豆蛋白、酵母提取物(在酵母培養或由此製備的酵母提取物的製備方法中均不使用動物產物)和葡萄糖。其它的營養物比例(即6∶1∶1、6∶0∶1和6∶3∶1)也認為是適用的。所用的水解大豆(HySoy)和酵母提取物(HyYest)濃縮物從Quest International公司獲得。將APF培養基中的肉毒梭菌培養物與甘油混合、等分至冷凍瓶中冷凍以備後用。所研製的APF培養基可用於儲存肉毒梭菌細菌一年或更久而不喪失活力。這些在冷凍瓶中的冷凍培養物和甘油的混合物就是APF細胞庫瓶。
種子培養將APF細胞庫瓶在室溫下融化，然後進行一步培養用APF細胞庫瓶的內容物直接接種(即不插入血瓊脂培養或試管生長步驟)於一升種子培養瓶中，使用相同的培養基(APF細胞庫瓶[儲存]培養基可以與APF發酵[生長]培養基不同)並保持於35℃、初始的培養基pH為7.0、厭氧環境(氮氣)中培養15至24小時。
發酵接著將種子瓶培養物轉移至含有APF培養基的商業規模的10升生產發酵罐中，保持於35℃、初始的培養基pH為7.0、厭氧環境(氮氣)中培養52-72小時。在發酵開始約15個小時以後(培養物的pH自然地降低到6.0以下)，通過將HCl加至培養物中而開始pH控制程序，使pH範圍在5.0-5.5。發現為了獲得活性肉毒毒素令人滿意的產量，有必要將APF發酵培養基的pH控制在一個窄範圍以內。由此發現將pH值控制在pH 5.0至5.5基本上防止了肉毒毒素的降解和效力損失。認為在發酵過程中大多數細胞都經過裂解並釋放肉毒毒素，並且由細胞裂解釋放的毒素被存在於培養發酵液中的蛋白酶激活。使用單層厚度濾器對該培養基進行過濾除去粗大的雜質(即完整的和破裂的細胞)並得到稱為澄清培養物的澄清溶液。
收穫肉毒毒素的收穫可按照實施例6進行(即硫酸沉澱，接著用微濾和滲濾濃縮)。
純化毒素的純化可按照實施例6所述進行，即加入鹽酸苯甲脒和DNA酶和RNA酶，硫酸沉澱，冷乙醇沉澱，磷酸鹽緩衝液提取，鹽酸沉澱，磷酸鹽緩衝液提取和原料毒素儲存。
作為實施例6的收穫和純化步驟的備選方案，也可以進行柱層析步驟。
所得的原料毒素為高質量的結晶型900kDA型肉毒毒素複合物，它由肉毒梭菌的Hall A菌株產生、具有≥3×107U/mg的特異效力、小於0.60的A260/A278值和在凝膠電泳上的獨特條帶形式，並且它適用於肉毒毒素藥物組合物的組合。因此，用於肉毒毒素的APF方法可以生產高質量的毒素。
由APF方法得到的純化的肉毒毒素複合物可以用pH 7-8的緩衝液通過離子交換柱並從柱上洗脫，以使非毒素複合蛋白與肉毒毒素分子解離，從而得到(取決於發酵的肉毒梭菌的類型)近似150kD分子量、特異效力為1-2×108LD50U/mg或更高的純化肉毒毒素；或近似156kD分子量、特異效力為1-2×108LD50U/mg或更高的純化B型肉毒毒素；或近似155kD分子量、特異效力為1-2×107LD50U/mg或更高的純化F型肉毒毒素。例如，使用本發明的APF培養基可得到肉毒毒素特異效力為1.02×108LD50U/mg的A型肉毒毒素複合物。
在本實施例7中，使用了含1％(重量)或2％(重量)葡萄糖的APF培養基(注意1％(重量)葡萄糖意為每100ml培養基有1g葡萄糖，2％(重量)葡萄糖意為每100ml培養基有2g葡萄糖)，並測得在1％葡萄糖的APF培養基中，最大細菌生長(以培養物的峰值光密度[於600nm處測量光密度]測定)出現於發酵後約20小時，而在2％葡萄糖的APF培養基中，最大細菌生長出現於發酵後約40小時，但是在培養基的葡萄糖含量如此變化的情況下，它們的峰值光密度並無明顯不同。認為在1％葡萄糖APF培養基中，在發酵55小時後細胞自溶和毒素釋放導致活性肉毒毒素的最大含量(以對活性毒素的SNAP-25分析測定)，但是在2％葡萄糖APF培養基中，在培養基中的活性肉毒毒素的含量出現得晚一些(以對活性毒素的SNAP-25分析測定)，並且在發酵65小時以後仍舊增加。因此，較快的毒素釋放發生於使用較低含量(1％)葡萄糖的APF培養基時，這表明在使用較低含量(1％)葡萄糖的APF培養基時，可能進行了較有效的毒素生產過程(即每單位時間得到較多的毒素)。
如圖1所示，還測得使用APF培養基生產肉毒毒素的最佳參數為以下參數的組合(1)APF發酵培養基中約6％(重量)的水解大豆濃縮物(圖1中的「HySoy Conc.」)。6％大豆意為每100ml培養基含6g大豆蛋白；(2)APF發酵培養基中約0％至3％的酵母提取物濃縮物(圖1中的「YE Conc.」)；(3)在33-35℃的溫度下，厭氧性(氮氣環境)條件下進行50-72小時的發酵；(4)在初期的細胞生長後，整個發酵過程中發酵培養基的pH保持於pH 5.0至5.5，和(5)APF發酵培養基中含1％(重量)葡萄糖。
因此，如圖1所示，當APF培養基中存在較多的蛋白(以HySoy和YE的總量計)時，培養基的pH趨於升高並使得毒素穩定性較低，當培養基中總的蛋白營養含量相同而pH值降低時，毒素產量會大大增加。在非APF方法中，總的蛋白含量較低使得pH值並不趨於上升，所以就不會有因pH升高而對毒素產量的不良影響。圖1顯示當培養基的pH被控制在約5.3至5.5的窄範圍內時，一致地具有較高活性(以MLD50和SNAP-25分析測定)。圖1還顯示用含有6％水解大豆和1％酵母提取物的培養基獲得了最高的毒素產率(以SNAP-25分析測定)。
所使用的SNAP-25分析是一種基於ELISA測定肉毒毒素的SNAP-25蛋白水解活性的方法。SNAP-25是分子量為25kDa的神經突觸體相關蛋白的縮寫。SNAP-25是一種與神經元胞吐作用有關的206個胺基酸的質膜蛋白。該分析基於Ekong T.，et al.，RecombinantSNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxinendopeptidase activity in vitro，Microbiology(1997)，vol 143，pages3337-3347所公開的方法。該分析使用結合於聚苯乙烯96孔微量培養板的截短型SNAP-25蛋白(206個胺基酸殘基的肽)和識別切割產物(197個胺基酸殘基的肽)的單克隆抗體，所述切割產物由還原型A型肉毒毒素在SNAP-25的197和198胺基酸的酶水解而產生。然後用第二抗體(辣根過氧化物酶[HRP]偶聯的山羊抗小鼠IgG)檢測結合於切割產物的單克隆抗體，這可在顯色底物(TMB)存在的情況下產生顏色改變。
MLD50(小鼠50％致死劑量)分析是一種測量肉毒毒素效力的方法，在所述分析開始時，將肉毒毒素腹膜內注射到每一隻重17至22克的雌性小鼠(約4周齡)。將小鼠以頭部向下傾斜的仰臥姿勢固定，使用25至27規格的3/8」至5/8」針頭將一份在鹽水中系列稀釋的肉毒毒素以約30度的角度腹膜內注射至小鼠的右下腹部。記錄對於每一稀釋度的後續72小時中的死亡率。製備的稀釋液應使得最大濃度的稀釋液對被注射的小鼠產生至少80％的死亡率，最小濃度的稀釋液對被注射的小鼠產生不高於20％的死亡率。必須有最少四種稀釋度屬於死亡率的單調下降區間。單調下降區間的起始死亡率不小於80％。在四個或更多的單調下降死亡率中，最高的兩個和最低的兩個死亡率必須是遞減的(即不相等的)。在注射後三天以內的觀察期內，使50％的小鼠死亡的稀釋液被定義為含有一單位(1U)肉毒毒素的稀釋液。
值得注意的是，本發明的APF方法至少在以下方面不同於實施例6的非APF方法(1)用APF培養基替代了細胞庫瓶的熟肉培養基；(2)除去了血瓊脂菌落篩選步驟；(3)除去了隨後的酪蛋白培養基基礎試管生長步驟；和(4)在整個過程中用APF培養基替代了非APF發酵培養基。
圖2概括了工業規模(非APF)Schantz方法(實施例6)和實施例7的工業規模的APF方法，經過細胞庫的建立、培養和發酵步驟的差別。圖2省略了收穫和純化步驟。
還發現APF培養基可用於篩選肉毒梭菌細菌。因此，同時實行實施例6和7初始培養步驟，可使得具有有助於在APF培養基之中或之上生長和產生肉毒毒素的特徵的肉毒梭菌細菌分離與生長。肉毒梭菌培養物從非APF培養基到APF培養基的轉移富集並篩選了適合於新環境的細菌，或者通過那些不能在新環境中生長和繁殖的細菌的選擇性相繼死亡來富集並篩選。
本發明中引用了多種出版物、專利和/或出版文獻，它們的內容整體通過援引的方式納入本發明。
雖然就某些優選方法詳細描述了本發明，但在本發明範圍內也可能有其他的實施方案、形式和變動。例如，在本發明範圍內會有各種各樣的不含動物產物的方法。
因此，下述權利要求的精神和範圍並不限於上述優選實施方案的描述。
權利要求
1.一種獲得生物活性肉毒毒素的方法，包括下述步驟(a)提供一種發酵培養基，所述培養基基本上不含動物源性產物並包括約4-8％(重量)的大豆來源產物；(b)在允許肉毒毒素生產的條件下，在發酵培養基中發酵肉毒梭菌細菌，和；(c)從發酵培養基中回收生物活性肉毒毒素。
2.根據權利要求1的方法，其中所述發酵培養基還包括約0-3％(重量)的酵母提取物。
3.根據權利要求1的方法，其中所述發酵培養基還包括約1-2％(重量)的葡萄糖。
4.根據權利要求1的方法，其中所述發酵步驟在pH值約為5.0-5.5的條件下進行。
5.根據權利要求1的方法，其中所述發酵步驟進行約45小時-75小時。
6.根據權利要求1的方法，其中所述發酵步驟在約33-36℃的溫度下進行。
7.根據權利要求1的方法，其中所述發酵步驟在厭氧性環境中進行。
8.根據權利要求1的方法，在提供步驟之前，還包括下述步驟獲得基本不含動物源性產物而包括約4-8％(重量)的大豆來源產物的培養基並在所述培養基中培養肉毒梭菌細菌。
9.根據權利要求1的方法，其中所述回收步驟為不含動物蛋白(APF)純化步驟。
10.一種獲得生物活性肉毒毒素的方法，包括如下步驟(a)獲得基本上不含動物源性產物的，含有約4-8％(重量)的大豆來源產物的培養基，並在培養基中培養肉毒梭菌；(b)提供基本上不含動物源性產物的發酵培養基，所述培養基包括(i)約4-8％(重量)的大豆來源產物，(ii)約0-3％(重量)的酵母提取物，(iii)約1-2％(重量)的葡萄糖，(c)在下列可產生肉毒毒素的條件下，在發酵培養基中發酵肉毒梭菌，包括(i)在初期細胞生長後，pH值約5.0到5.5的條件下進行發酵步驟，(ii)進行發酵步驟約45小時至75小時，(iii)在約33°-36℃的溫度條件下進行發酵步驟，(iv)在厭氧性環境中進行發酵步驟，以及；(d)從發酵培養基中回收生物活性的肉毒毒素，其中所述回收步驟為APF純化步驟。
11.一種用於培養或發酵肉毒毒素的培養基，其中所述培養基基本上不含動物源性產物，並包括植物源性蛋白產物。
12.根據權利要求11的培養基，其中所述培養基包括約4-8％(重量)的大豆來源產物。
13.根據權利要求11的培養基，其中所述培養基包括約0-3％(重量)的酵母提取物。
14.根據權利要求11的培養基，其中所述培養基還包括約1-2％(重量)的葡萄糖。
15.一種用於培養和/或發酵肉毒梭菌細菌的培養基，其中所述培養基基本上不含動物源性產物，並且所述培養基包括(a)約4-8％(重量)的大豆來源產物；(b)約0-3％(重量)的酵母提取物，和；(c)約1-2％(重量)的葡萄糖。
16.一種製備基本上不含動物產物的藥物組合物的方法，所述藥物組合物中的活性成分為肉毒毒素，所述方法包括下述步驟(a)通過以下步驟獲得生物活性的肉毒毒素(i)提供基本上不含動物源性產物的發酵培養基；(ii)在可產生肉毒毒素的條件下，在發酵培養基中培養肉毒梭菌，以及；(iii)從發酵培養基中回收生物活性的肉毒毒素；(b)使肉毒毒素與合適的賦形劑組合，由此製備基本上不含動物產物的藥物組合物，所述藥物組合物中的活性成分為肉毒毒素。
17.一種獲得生物活性的肉毒毒素的方法，包括如下步驟(a)提供基本上不含動物源性產物、並包括約4-8％(重量)的大豆來源產物的發酵培養基；(b)在發酵培養基中發酵肉毒梭菌，其中所述發酵培養基在初期細胞生長後保持在pH 5-5.5的pH值；以及(c)從發酵培養基中回收生物活性的肉毒毒素。
全文摘要
用於生產肉毒毒素的肉毒梭菌細菌的培養和發酵的不含動物產物(APF)的培養基和方法。所獲得的肉毒毒素可用於配製和組合肉毒毒素藥物組合物。APF培養基可包括具有顯著降低的水平的肉類或乳品副產物，並使用非動物源性產物替代動物源性產物。優選地，所使用的APF培養基基本上不含或不含動物源性產物。
文檔編號A61K39/08GK1930186SQ200580006748
公開日2007年3月14日 申請日期2005年3月3日 優先權日2005年3月3日
發明者王平, S·多諾萬 申請人:阿勒根公司