一種分離水牛奶中酪蛋白組分的方法
2023-06-13 14:45:16 1
專利名稱：一種分離水牛奶中酪蛋白組分的方法
技術領域：
本發明涉及一種分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，尤其是一種通過簡單エ藝同時將a S-酪蛋白、酪蛋白和K -酪蛋白分離的方法。
背景技術：
水牛奶中乳蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白組成，其中以雜交高代為例，asl-酪蛋白、a s2-酪蛋白、β -酪蛋白、K -酪蛋白分別佔酪蛋白的35. 30%、16. 97%、33. 88%、13. 85%，a -乳清蛋白、β -乳球蛋白分別佔乳清蛋白的30. 95%、48. 49%。酪 蛋白以酪蛋白膠束結合磷酸鈣形成的複合體形式存在，稱為「酪蛋白酸鈣-磷酸鈣複合體」(Ca-phosphocaseinate或 Ca-caseinate-phospnhate-complate)0近幾十年來，為了研究酪蛋白膠束體系的穩定機制，以及各酪蛋白組分的結構功能特性，分離純化酪蛋白組分是開展上述研究的基礎，分離純化的效率和質量直接關係後續多項工作的成敗，因此成為研究的熱點。目前酪蛋白組分的分離方法主要包括沉澱分離、層析分離、膜分離以及酶法分離等，其中，層析分離主要用於實驗室規模，而膜分離以及酶法分離一般都需要結合其他方法共同完成分離步驟，應用最為廣泛的是沉澱分離，主要是利用各酪蛋白組分在不同溫度、離子強度，鈣濃度的溶液中溶解性的不同進行分離，分離過程主要關注目標產物的得率以及純度，但對其分離過程的系統研究較少。
發明內容
本發明的目的是提供一種分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，能夠同時分離as-酪蛋白、β_酪蛋白和K-酪蛋白，並且操作簡單，分離效果明顯，適宜エ業化生產。本發明的目的通過以下技術方案實現一種分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，包括以下步驟①新鮮水牛奶，於8000g、4°C下離心脫脂20 30min後，採用等電點緩慢酸沉的方法，用酸溶液緩慢調節脫脂後牛奶的PH至4. 5^4. 7，於8000g、4°C下離心20 30min保留沉澱，蒸餾水洗滌2次，即得到粗製酪蛋白粉末，凍幹備用；②將等電點緩慢酸沉，凍幹後得到的酪蛋白粉末配製成2%的酪蛋白溶液，採用鹼溶液緩慢調節酪蛋白溶液的PH至7. (Γ7. 5 ；③按照O. 06mol的Ca2+濃度在步驟②酪蛋白溶液中加入ニ價可溶性鈣鹽，在8000g下離心20 30min，保留上清液和沉澱，將沉澱溶於こニ胺四こ酸ニ鈉溶液中，透析後凍幹即獲得質量分數達91. 6%的a s-酪蛋白；④在步驟③離心保留的上清液中繼續加入ニ價可溶性鈣鹽，使Ca2+濃度終濃度到達O. 3mol，再次離心，保留上清液和沉澱，上清液透析凍幹後獲得質量分數達43. 3%的K -酪蛋白，將沉澱溶於こニ胺四こ酸ニ鈉溶液中，透析後凍幹即獲得質量分數達100%的β-酪蛋白。所述酪蛋白為水牛奶及水牛奶製品的酪蛋白。
所述水牛奶為摩拉純種水牛奶、摩拉雜交一代水牛奶、摩拉雜交高代水牛奶；所述水牛奶製品為水牛奶酸乳、水牛奶乾酪、水牛奶乳粉。所述ニ價可溶性鈣鹽為氯化鈣。所述こニ胺四こ酸ニ鈉溶液為こニ胺四こ酸ニ鈉配製成O. 06 O. 3mol溶液。所述酸溶液為冰こ酸或鹽酸配製成O. 05 O. Imol溶液。所述鹼溶液為氫氧化鈉或氨水配製成O. I O. 2mol溶液。本發明具有以下優點I.本發明採用分級鈣沉對a S-酪蛋白、β-酪蛋白和K-酪蛋白三種酪蛋白組分進行了同步分離，操作エ藝簡單，為較大規模分離酪蛋白組分提供一種簡單可行的方法，一方面為實驗室製備樣品提供了參考，同時對大規模エ業化製備也具有一定的借鑑意義，為後續エ業應用提供了便利。2.本發明製取的as-酪蛋白、β-酪蛋白和K-酪蛋白純度高，為試劑型a s-酪蛋白、β -酪蛋白的生產提供了方法，同時該エ藝採用的試劑很少，節約了製備成本。3.本發明製取的a S-酪蛋白、β-酪蛋白和K -酪蛋白得率均較高，能夠有效利用資源。
圖I為等電點緩慢酸沉後得到的酪蛋白電泳圖。I-低分子量蛋白標品2-脫脂後的水牛奶全蛋白3-等電點緩慢酸除去酪蛋白後的乳清蛋白4-等電點緩慢酸沉得到的酪蛋白，上樣濃度均稀釋至lOOOyg/mL，上樣量
10 μし圖2為分級鈣沉後得到的酪蛋白電泳圖。I-低分子量蛋白標品，2-、3_、4-、5-、6-、7_ 分別為 O. 30mol、0. 25mol、O. 20mol、O. 15mol,0. 10mol、0.06molCa2+處理酪蛋白後沉澱溶解液，8-、9-、10_、11_、12_、13-分別為 O. 30mol、0. 25mol、0. 20mol、0. 15mol、0. IOmol>0. 06mol Ca2+處通釀蛋白後上清液，上樣濃度均稀釋至1000 μ g/mL,上樣量10 μし圖3為採用考馬斯亮藍法得到的蛋白質含量標準曲線。
具體實施例方式下面通過實驗對酪蛋白組分的分離效果進行評價。I、等電點緩慢酸沉粗分酪蛋白效果的評價為了評價等電點緩慢酸沉後酪蛋白的純度，我們採用SDS-PAGE對脫脂後牛乳中的蛋白組成及等電點緩慢酸沉後沉澱及上清液中的蛋白組成進行了對比分析。結果見圖I。由圖I可知，圖I中泳道2的全蛋白經等電點緩慢酸沉後，基本上可以將水牛奶中的牛血清蛋白及乳清蛋白全部除去，得到如圖I中泳道4的粗酪蛋白，而牛血清蛋白和乳清蛋白等雜質留在酸沉酪蛋白後的如圖I中泳道3的酸乳清中。該方法操作簡單，分離效果良好，適宜規模化生產。2、分級鈣沉酪蛋白組分效果的評價為了評價各種鈣鹽濃度下酪蛋白組分的分離情況，我們採用SDS-PAGE和考馬斯、亮藍法對 O. 06mol、0. IOmol、0· 15mol、0. 20mol、0. 25mol、0. 30molCa2+ 處通後的釀蛋白組分進行了純度和得率分析。結果見圖2、圖3和表I。從圖2中可以看出，Ca2+濃度達到O. 06mol時，酪蛋白中的as-酪蛋白已完全沉澱，並有β_酪蛋白也同時發生沉澱，且沉澱物中除了以上兩種酪蛋白組分外，牛血清蛋白也發生完全沉澱。同時，在0.06mol-0. 30mol Ca2+濃度處理酪蛋白沉澱溶解液的電泳條帶中，O. 06molCa2+濃度出現微弱的κ -酪蛋白條帶，隨著Ca2+濃度不斷加大，κ -酪蛋白條帶反而不斷減弱，尤其是當Ca2+濃度達到O. 20mol時，κ-酪蛋白條帶幾乎消失。在O. 06mol-0. 30molCa2+濃度處理酪蛋白的上清液中，主要含有β-酪蛋白和κ-酪蛋白兩條帶，且隨著Ca2+濃度的逐漸増大，β_酪蛋白條帶逐漸減弱，與考馬斯亮藍測定上清液中蛋白質含量變化趨勢相一致。根據以上現象，可以判斷，通過Ca2+沉澱酪蛋白三種組分的先後 次序為α s-酪蛋白最先I丐沉，其次是β -酪蛋白，最後是K -酪蛋白。由圖2還可看出，K-酪蛋白在極低的0.06mol Ca2+濃度存在條件下，開始發生沉澱，隨Ca2+濃度的不斷増大，K-酪蛋白反而溶解，不再沉澱析出。這與as-酪蛋白遇鈣沉澱，引起K-酪蛋白的交聯沉澱有夫。在Ca2+處理後酪蛋白上清液的所有條帶中均不含有牛血清蛋白，而都含有條帶很弱的β_乳球蛋白、α-乳白蛋白，說明牛血清蛋白對Ca2+非常敏感，很低的濃度即發生沉澱，而β_乳球蛋白和α -乳白蛋白對Ca2+卻有一定的耐受能力。表I各等級鈣沉組分中酪蛋白的質量
Ca-濃.iHU (K Miol O,IOmol 0.15mol 12Umol 0.25mol .3umol
酪蛋白含量上清液 0.381 0.354 0.335 0.323 0.305 0.284 Cg)沉澱 0.505 0.533 0.549 0.567 0.582 0.603
酪蛋白得率上清液 38.1 35.4 33,5 32.3 30.5 28.4 (%)沉澱 50.5 53.3 54.9 56.7 58.2 60.3
酪蛋白總回收率(％)88.6 88.7 88.4 89.0 88.7 88.7
_ 蛋白 ft 率( )=き·^^^^^^^^普!根據表1，可以明顯看出，在O. 06mol_0. 30mol Ca2+濃度處理酪蛋白的上清液中，蛋白質質量逐步減少，結合電泳圖譜，該過程上清液中主要組分為酪蛋白和K-酪蛋白，而沉澱中K-酪蛋白析出量小，說明該過程主要發生β-酪蛋白的沉澱反應。據此可以提出ー種簡單分離β -酪蛋白的方法——二次鈣沉法即先採用O. 06mol Ca2+濃度處理酪蛋白，離心棄沉澱，即棄去a s-酪蛋白，保留上清液，添加ニ價可溶性鈣鹽，使Ca2+終濃度達到O. 3mol，再次離心，保留沉澱，將沉澱溶入こニ胺四こ酸ニ鈉溶液中，攪拌使其充分溶解，透析後即可得到質量分數達100%的β -酪蛋白。
為了進一步評價各鈣鹽濃度處理酪蛋白後，各酪蛋白組分中的as-酪蛋白、β -酪蛋白和K -酪蛋白的質量分數，我們採用以下計算方法對其進行估算如果忽略沉澱中的牛血清蛋白和K -酪蛋白以及上清液中的乳清蛋白，根據a s-酪蛋白、酪蛋白和K -酪蛋白在水牛奶中的比例3. 77:2. 45:1，結合分級鈣沉酪蛋白總回收率，可以估算沉澱以及上清液中各種酪蛋白組分質量分數比例，以沉澱中a s-酪蛋白的質量分數為例A1=B1 X B2 X B3式中A1為沉澱中a S-酪蛋白質量；B1為酪蛋白總質量；B2為酪蛋白總回收率；B3為理論上酪蛋白中a S-酪蛋白所佔的質量分數。
權利要求
1.一種分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟 ①新鮮水牛奶，於8000g、4°c下離心脫脂20 30min後，採用等電點緩慢酸沉的方法，用酸溶液緩慢調節脫脂後牛奶的PH至4. 5^4. 7，於8000g、4°C下離心20 30min保留沉澱，蒸餾水洗滌2次，即得到粗製酪蛋白粉末，凍幹備用； ②將等電點緩慢酸沉，凍幹後得到的酪蛋白粉末配製成2%的酪蛋白溶液，採用鹼溶液緩慢調節酪蛋白溶液的PH至7. (Γ7. 5 ； ③按照O.06mol的Ca2+濃度在步驟②得到的酪蛋白溶液中加入二價可溶性鈣鹽，於8000g、4°C下離心20 30min，保留上清液和沉澱，將沉澱溶於乙二胺四乙酸二鈉溶液中，透析後凍幹即獲得質量分數達91. 6%的a s-酪蛋白； ④在步驟③離心保留的上清液中繼續加入二價可溶性鈣鹽，使Ca2+濃度終濃度到達O.3mol，再次離心，保留上清液和沉澱，上清液透析凍幹後獲得質量分數達43. 3%的κ -酪蛋白，將沉澱溶於乙二胺四乙酸二鈉溶液中，透析後凍幹即獲得質量分數達100%的β-酪蛋白。
2.如權利要求I所述的分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，其特徵在於所述酪蛋白為水牛奶及水牛奶製品的酪蛋白。
3.如權利要求2所述的分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，其特徵在於所述水牛奶為摩拉純種水牛奶、摩拉雜交一代水牛奶、摩拉雜交高代水牛奶；所述水牛奶製品為水牛奶酸乳、水牛奶乾酪、水牛奶乳粉。
4.如權利要求2所述的分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，其特徵在於所述二價可溶性鈣鹽為氯化鈣。
5.如權利要求2所述的分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，其特徵在於所述乙二胺四乙酸二鈉溶液為乙二胺四乙酸二鈉配製成O. 06 O. 3mol溶液。
6.如權利要求2所述的分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，其特徵在於所述酸溶液為冰乙酸或鹽酸配製成O. 05 O. Imol溶液。
7.如權利要求2所述的分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，其特徵在於所述鹼溶液為氫氧化鈉或氨水配製成O. I O. 2mol溶液。
全文摘要
一種分離水牛奶中酪蛋白組分的方法，以水牛奶為原料，採用等電點緩慢酸沉，再結合分級鈣沉的方法對水牛奶中αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白三種酪蛋白組分進行了分離。分級鈣沉酪蛋白各組分的總回收率達到88%，其中分離後的αs-酪蛋白和β-酪蛋白的質量分數分別達到91.6%和67.8%，κ-酪蛋白的質量分數也由13.8%提高至43.3%，為進一步純化奠定了基礎。同時在理論上，若採用二次分級鈣沉的技術路線可將β-酪蛋白的質量分數提高至100%。該方法操作簡單，分離效果明顯，適宜工業化生產。
文檔編號C07K14/47GK102675448SQ20121018739
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月8日 優先權日2012年6月8日
發明者李全陽, 李紅, 楊同香 申請人:廣西大學