5-甲基1-(取代苯基)-2-(1H)吡啶酮化合物作為抗炎藥物和α-腫瘤壞死因子(TNF-α)阻斷...的製作方法

2023-06-13 19:46:41

專利名稱：5-甲基1-(取代苯基)-2-(1H)吡啶酮化合物作為抗炎藥物和α-腫瘤壞死因子(TNF-α)阻斷 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及包含5-甲基-1-(取代苯基)-2- (1H)吡啶酮類化合物的藥 物組合物的用途。
背景技術：
炎症是一種常見的病理，許多不同的疾病都可因類似的病理狀況而 歸納成炎症類疾病。炎症是一個非常複雜的過程，目前己經確定有很多種 介質參與了炎症過程。特別突出的是，許多炎症類疾病都牽涉到一種關鍵 的細胞因子a-腫瘤壞死因子(TNF-a)，因此這類炎症類疾病又被稱作 以a-腫瘤壞死因子為中介的疾病，類風溼性關節炎(RA)是此類疾病的 代表。
a-腫瘤壞死因子是一種多性能的多肽化合物，分子量為17kDa。當 微生物感染或腫瘤細胞侵害組織或器官時，許多種細胞都會作出反應而分 泌a-腫瘤壞死因子。儘管其它種類細胞，例如T細胞、肥大細胞、中性 白細胞、內表皮細胞和星形細胞都可受激分泌a-腫瘤壞死因子，但a-月中 瘤壞死因子的主要來源是被激活的巨噬細胞。大量的研究已表明，cx-月中 瘤壞死因子的增加與很多炎症類疾病的發生有關係，這些疾病包括類風溼 性關節炎(RA)、銀屑病、關節型銀屑病、哮喘、壞血症及節段性迴腸炎 (Crohn's)等。
類風溼性關節炎(RA)是一種全身性疾病，其特徵為關節內滑膜的 慢性炎症反應。嚴重的炎症反應可引起軟骨的退化和近關節骨的侵蝕。大
6量數據不僅已表明a-腫瘤壞死因子是類風溼性關節炎發病過程中的一個
關鍵，而且還是個很好的藥物治療的靶子。近十幾年來，許多國家的藥政
部門相繼批准上市了三種知名的蛋白質類的a-腫瘤壞死因子的阻斷劑 etanercept (Enbrel)， inflixmab (Remicade)，禾口 adalimumab (Humira)。雖然這 些注射用蛋白藥物的效果很好，可是它們的局限性也逐漸地顯現出來 (Anti-TNF-oc therapies: the next generation, Palladino MA.et al, Nat Rev. Drug Dd， 2(9) 736-746， 2003)。因此，許多研究項目都在嘗試開發小分子的、可 口服的的抗a -腫瘤壞死因子的藥物。
哮喘的一大特徵是在支氣管的黏膜上有大量滲出的炎症細胞，包括 被激活的肥大細胞和T細胞。 一般認為有多種細胞因子參與了導致上述特 徵的過程，尤其是白介素-4、白介素-5、白介素-6和a -腫瘤壞死因子。 其中a -腫瘤壞死因子被認為是在許多依賴於細胞因子的炎症疾病和影響 免疫應答以及氣道發炎過程中的一種最重要的介質。近期的研究表明接觸 致敏物質是哮喘的主要原因，哮喘在全球範圍內的流行就是由於對空氣中 的致敏物質的大量接觸造成的。過敏反應產生的肥大細胞與巨噬細胞可大 量分泌a -腫瘤壞死因子，因此從哮喘病人的細支氣管洗出的分泌液中的 a -腫瘤壞死因子的含量遠高於健康人的水平。
壞血病，又稱全身性炎症反應綜合症(SIRS)，是由肌體對細菌感 染的過度反應而產生的一種很危險的重症。壞血病會導致全身瀰漫炎症反 應和凝血。炎症反應會導致皮膚發紅，全身發熱，大量出汗，渾身疼痛及 器官的功能失調或衰竭。壞血病過程中的大量凝血會減少四肢和重要器官 的血流從而進一步導致器官的衰竭壞死。對壞血病休克的實驗動物模型的 研究結果揭示，給予a -腫瘤壞死因子阻斷劑可明顯降低動物的死亡率， 表明a -腫瘤壞死因子是導致壞血病的主要炎症反應前期的細胞因子。已報導的具有抗炎和抗纖維化活性的化合物有許多。美國專利USP
3，839，346、 USP 4,052,509和USP 4,042,699報導總共29個具通式I的吡啶
酮類化合物
通式I中的A是芳香基團。這些化合物有很好的抗炎和鎮痛作用並可降低
血糖和血尿酸的濃度，尤其是其中的一個化合物，5-甲基-1-苯基-2- (1H) 吡啶酮，有最好的活性和較低的毒性。
美國專利USP 5,310,562報導了 5-甲基-1-苯基-2- (1H)吡啶酮 (PIRJFEMDONE， PFD)的抗纖維化活性。美國專利USP 5，518，729和 USP 5，716，632隨後將抗纖維化活性延伸到44個N-取代-2 (1H)吡啶酮 (結構通式I)或N-取代的3 (1H)吡啶酮化合物。
美國專利USP 5,962,478又進一步闡述了 5-甲基-1-苯基-2- (1H) 口比 啶酮和44個類似結構化合物的抗oc -腫瘤壞死因子的活性。
中國專利ZL02114190.8披露了許多新5-甲基-1-取代苯基-2- (1H)吡 啶酮類化合物及其合成方法。這些化合物有通式II的結構其中當n-l時，所述的取代基R可以是F、 Br、 I;當11 = 2時，所述的 取代基R可以是F、 Cl、 Br、 I、直鏈烷基、直鏈烷氧基或直鏈卣代烷基。 所述的取代基團R在苯環上的位置可以是鄰位、間位或對位。
美國專利USP 5,716，632 and USP 5,962,478中列出的7個5-甲基-l-取 代苯基-2- (1H)吡啶酮類化合物最初是由Gadekar在美國專利USP 4,042,699中提出的。根據所掌握的數據，Gadekar為"取代苯基"的化合物 總結了一個構效關係，這種特殊構效關係教導非取代苯基吡啶酮化合物有 最好的生物活性。在一個正在待批的美國專利中，我們得到的啟示是， 就抗纖維化而言，實際上是取代苯基的吡啶酮化合物(具有結構通式II) 具有更理想的活性。因此， 一項有意義的研究是確定具有結構通式II的取 代苯基吡啶酮化合物是否具有理想的抗oc -腫瘤壞死因子的活性。
發明概述
本發明描述了 5-甲基-1-取代苯基2- (1H)吡啶酮類化合物的抗(x-月中 瘤壞死因子的活性。中國專利ZL02114190.8披露了一系列有代表性的取 代苯基吡啶酮類化合物的合成工藝，這些公開內容併入此處作為參考。這 些吡啶酮的例子有1- (3'-氟苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮(AKF-PD) 、 1- (3'-溴苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮(AKF-BR) 、 l畫 (3'-氯苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮(AKF-CL) 、 1- (3'-甲基苯 基)_5-甲基-2- (1H)吡啶酮(AKF-CH3)和l - (3'-甲氧基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮(AKF-OCH3)。這些化合物都被用小鼠的巨噬細 胞測試過，其中AKF-PD被進一步在各種類風溼性關節炎的動物模型實驗 中觀察。這些測試和觀察的結果表明5-甲基-1-取代苯基-2- (1H)吡啶酮 類化合物有可能作為一種非常低毒性的藥物用來治療如類風溼性關節炎這 類以oc -腫瘤壞死因子為中介的疾病。在一個具體實施方案中，本發明闡述了一個或多個具結構通式II的
吡啶酮化合物的用於治療如類風溼性關節炎這類以a -腫瘤壞死因子為中
介的疾病的用途。
在通式II中當n-l時，所述的取代基R可以是F、 Br、 I、硝基、 烷基、烷氧基或滷代烷基；當！1 = 2時，所述的取代基R可以是F、 Cl、 Br、 I、垸基、烷氧基或滷代烷基。
本發明還提供了一種藥物組合物，其包含具有結構通式II的5-甲基-1-取代苯基-2- (1H)吡啶酮類化合物，該藥物組合物可有效治療如類風溼性 關節炎這類以a -腫瘤壞死因子為中介的疾病，所述吡啶酮類化合物以治 療有效量存在於該藥物組合物中。
本發明還提供了一種治療如類風溼性關節炎這類以a -腫瘤壞死因子 為中介的疾病的方法，包括給患者使用具有結構通式II的吡啶酮化合物， 該化合物結構中，n=l，取代基R是F，艮P， AKF-PD。
本發明還提供了一種包含上述具有結構通式II的5-甲基-1-取代苯基-2- (1H)吡啶酮類化合物的藥物組合物用於治療如類風溼性關節炎這類以 cc -腫瘤壞死因子為中介的疾病的用途。
結合下列附圖內容，通過以下優選實施方案的具體描述將進一步揭 示本發明的上述和其它特徵以及優越性。


圖1: AKF-PD和PFD對小鼠的巨噬細胞生成TOF-a mRNA的抑制作用。
圖2: AKF-PD對小鼠的巨噬細胞的TNF-a的蛋白合成與分泌的抑制 作用。
圖3:五種5-甲基-1-取代苯基-2- (1H)吡啶酮類化合物對小鼠的巨噬 細胞的TNF-cc的蛋白合成與分泌的抑制作用。
圖4: AKF-PD對關節炎模型大鼠的血清TNP-oc濃度的降低。
圖5: AKF-PD對關節炎模型大鼠爪子組織中的TOF-cc濃度的降低。
發明詳述
在本文的闡述中，術語"抗a-腫瘤壞死因子為中介的疾病"意指治 療所有因TNF-a為關鍵的病理因素的疾病，例如類風溼性關節炎。術語 "抗炎"意指處理所有的炎症反應，尤其是處理局部的免疫反應，但排除 a -腫瘤壞死因子為中介的疾病。
已發表的文獻都認為5-甲基-1-苯基-2- (1H)吡啶酮(PFD)是具有理想 的抗a-腫瘤壞死因子和抗炎活性的化合物，這種觀點與Gadekar's提出的 構效關係是一致的，即，非取代苯基的所述吡啶酮化合物的活性好於有取 代苯基的吡啶酮化合物。因此，意想不到的結果是，本發明發現5-甲基-1-取代苯基-2- (1H)吡啶酮(結構通式II),尤其是AKF-PD，顯示了比5-甲基-l-(未取代苯基)-2 (1H)吡啶酮(PIRPENIDONE)更強的抗a-腫 瘤壞死因子和抗炎活性，而且毒性也比PFD低了許多。
一些有代表性的5-甲基-1-取代苯基-2- (1H)吡啶酮化合物都是按中 國專利ZL02114190.8中描述的合成工藝合成的，將這些描述併入此處作 為參考。這些吡啶酮類化合物包括1 - ( 3 '-氟苯基)-5 -甲基-2 - (1H) 吡啶酮 (AKF-PD) ， 1- (3'-溴苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮 (AKF-BR) ， 1- (3'-氯苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮 (AKF-CL) ，1- (3'-甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮(AKF-CH3)和l-(3'-甲氧基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮(AKF-OCH3)。研究表 明，這些5-甲基-1-取代苯基-2- (1H)吡啶酮相比於PIRFENIDONE， 5-甲 基-1-未取代苯基-2- (1H)吡啶酮，具有更好的抗oc-腫瘤壞死因子活性。 這些化合物中，最有效的是l- (3'-氟苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮 (AKF-PD)。不僅如此，1- (3'-氟苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮的 毒性可以顯著減低。正如本文描述的，1- ( 3'-氟苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮(AKF-PD)的半數至死量，LD5Q，只有PIRFENIDONE的 30%。值得一提的是，象類風溼性關節炎這類以a -腫瘤壞死因子為中介 的疾病或溼疹這類的皮膚病， 一般都是慢性的或反覆復發的疾病。任何治 療手段都將是一個長期過程，需要長期的藥物介入作為保證。因此，就 長期給藥而言，臨床使用上很需要毒性低的抗TNF-a或抗炎藥物。
其它的5-甲基-1-取代苯基-2- (1H)吡啶酮(結構通式n)包括，但不 限於以下所例
當11=1， R = Br，化合物可是1-(2'-溴苯基)-5-甲基-2- (1H)吡 啶酮，1- ( 3'-溴苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，或l國4'-溴苯基)畫 5-甲基-2- (1H)吡啶酮。
當n二l， R=F，化合物可是l- (2'-氟苯基)-5-甲基-2- (1H) 吡啶酮，1- (3'-氟苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，或1- (4'-氟苯 基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮。
當n=l ， R=I，化合物可是l- (2'-碘苯基)-5-甲基-2- (1H) 口比啶酮，1- (3'-石典苯基)-5匿甲基-2- (1H)卩比徒酮，或1- (4'-石典苯 基)-5-甲基-2- (m)吡啶酮。
當n二2， R=F、 Br或Cl，化合物可是1 - (2',3'-二溴苯基)-5-甲 基-2- (1H)吡啶酮，1- (2',4'隱二溴苯基)國5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (2',5'-二溴苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，l國(2'，6'-二溴苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (3'，4'-二溴苯基)-5-甲基-2畫(1H)吡啶酮，1- (3'，5'-二溴苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1-(2',3'-二氯苯基)隱5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (2',4'-二氯苯基)-5扁甲基-2- (1H)吡啶酮，l陽(2'，5'-二氯苯基)-5-甲基誦2- (1H)吡啶酮，l隱(2'，6'-二氯苯基)-5畫甲基畫2- (1H)吡啶酮，l-(3'，4'岡二氯苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (3'，5'-二氯苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮，1- (2',3'-二氟苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1-(2'，4'-二氟苯基)陽5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (2',5'-二氟苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (2'，6'-二氟苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (3',4'-二氟苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，或l- (3'，5'-二氟苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮。
當n= 1或2， R 二三氟甲基，化合物可是1 - (2，-三氟甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (4，-三氟甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (2'，3'-雙三氟甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，l畫(2',4'-雙三氟甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (2',5'-雙三氟甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (2',6'-雙三氟甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (3',4'-雙三氟甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，或1- (3',5'-雙三氟甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮。
當n= 1或2， R =甲基，化合物可是1 - (2'-甲基苯基)-5 -甲基-2 -(1H)吡啶酮，1- (3-甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1-(2',3'-二甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (2',4'-二甲基苯
基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (2',5'-二甲基苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮，1- (2',6'-二甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，或
1- (3',4'-二甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮。當n二l或2， R^甲氧基，化合物可是l- (2'-甲氧基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (3'-甲氧基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，
1- (2'，3'-二甲氧基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (2',4'-二甲氧基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (2'，5'-二甲氧基苯基)-5-甲基-
2- (1H)吡啶酮，1- (2'，6'-二甲氧基苯基)畫5-甲基-2- (1H)吡啶酮，1- (3',4'-二甲氧基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮，或l - (3'，5'-二甲氧基苯基)-5-甲基-2- OH)吡啶酮。
在一個實施方案中，本發明提出了一種治療a-腫瘤壞死因子為中介的疾病的方法，該方法包括提供一種包含一種或多種具有上述結構通式II化合物的藥物組合物。所述化合物中，當n = 1時，所述的取代基R可以是F、 Br、 I、硝基、烷基、垸氧基或滷烷基；當n = 2時，所述的取代基R可以是F、 Cl、 Br、 I、垸基、烷氧基或滷烷基；且所述的取代基團R在苯環上的位置可以是鄰位、間位或對位等。優選地，當n = 1時，R為F、 Br、或I;當n = 2時，R為F、 Cl、 Br、 I、烷基、烷氧基或滷烷基，例如，R可以是直鏈烷基、支鏈烷基、直鏈垸氧基或直鏈滷垸基。通常情況，直鏈烷基或支鏈烷基的碳數為1到6，優選1到4。
根據本發明的治療方法，含有一種或多種所述化合物的藥物組合物的給藥日劑量為大約25到大約6000毫克。本發明中的藥物組合物可以用任一常規辦法給藥，比如口服，注射，或外用。同樣地，本發明中的藥物組合物可按照常規工藝製備成任何適當的給藥劑型，例如溶液，片劑，膠囊，栓劑，吸入劑，混懸劑，凝膠劑，乳劑，或油膏劑。
在另一個實施方案中，本發明提出了一種治療例如類風溼性關節炎這類以oc-腫瘤壞死因子為中介的疾病的方法，該方法包括給患者使用含有符合通式II的5 -甲基-1 -(取代苯基)-2 - (1H)吡啶酮化合物，該化合物結構中，取代基R為F,位置在3位。該藥物組合物可製備成各種常規
製劑以任一常規辦法給藥。
本發明還提出了一種用於治療如類風溼性關節炎這類以a -腫瘤壞死因子為中介的疾病的藥物組合物，該藥物包含治療有效劑量的5 -甲基-1 -(取代苯基)-2- (1H)吡啶酮類的化合物。該5-甲基-1-(取代苯基)-2- (1H)吡啶酮具有上述結構通式II，其中當n-l時，所述的取代基R可以是F、 Br、 I、硝基、烷基、烷氧基或滷垸基；當11 = 2時，所述的取代基R可以是F、 Cl、 Br、 I、烷基、烷氧基或滷垸基。所述的取代基團R在苯環上的相應位置是鄰位、間位或對位。理想的結構是，當n = 1時，R為F、 Br、或I;當11 = 2時，R為F、 Br、 I、垸基、烷氧基或滷烷基，例如，R可以是直鏈垸基，支鏈烷基，直鏈垸氧基或直鏈滷垸基。通常情況下，直鏈烷基或支鏈烷基的碳數為1到6左右，優選1到4。在一個具體實施方案中，用於治療以a-腫瘤壞死因子為中介的疾病時，上述藥物的有效劑量為每日5到6000毫克左右。較理想，治療以a -腫瘤壞死因子為中介的疾病時有效劑量是50到2000毫克左右。最佳的劑量為100到1000毫克左右。
以下的實例僅僅是為了有助於進一步理解本發明所描述的技術思想，只是包括了本發明一些特定方案和具體實施方案的描述，這些實例對本發明沒有任何限制作用。
實施例l
AKF-PD和PD對小鼠巨噬細胞的TNF-a mRNA合成的抑制作用
實驗設計以不同濃度的AKF-PD或PFD對小鼠巨噬細胞，264.7RAW，預處理4小時，藥物濃度為0、 10 ing/ml、 100 pg/ml,和500嗎/ml 。然後再用5 ng/mL濃度的脂多糖(LPS，內毒素)刺激該被AKF-PD 或PFD處理過的小鼠巨噬細胞264.7 RAW,刺激時間為15-20個小時。收集該內毒素刺激過的細胞並分離出mRNA。 TNF-a mRNA的表達量以實時定量的PCR方法測定，測定用的試劑盒(TaqMan PCR core reagentkit)購自Applied Biosystems.
實驗結果如圖1所示，AKF-PD和PFD都對小鼠巨噬細胞受內毒素刺激後的TNF-a mRNA的生成有抑制作用。當藥物劑量為500嗎/ml時，對TNF-amRNA的抑制程度可達到大約百分之五十。在圖1中，未經內毒素刺激和藥物處理的小鼠巨噬細胞的TNF-a的基因表達為1，作為基準。其他的數據均相對該基準而成倍增長。小鼠P肌纖蛋白(肌動蛋白)的基因表達作為實驗的內標。圖1中每一帶誤差標的柱形圖代表兩個平行樣品的平均mRNA量水平士SD。所有AKF-PD的三個濃度與基準的統計分析比較得出的p值都小於0.01 (/K0.01);而在同樣的條件下，只有兩個濃度的PFD (100和500ing/ml)才有小於0.01的/ 值。與PFD—樣，AKF-PD 可有效地阻斷LPS內毒素刺激小鼠巨噬細胞導致TNF-a的增加。
實施例2
AKF-PD對小鼠巨噬細胞的TNF-a蛋白的合成與分泌的抑制作用
實驗設計AKF-PD對TNF-a蛋白合成和分泌的影響釆用LPS刺激的小鼠巨噬細胞株RAW264.7進行分析。以不同濃度的AKF-PD對細胞預處理4小時，藥物濃度為0， 30 pg/ml， 100 pg/ml，和300 ng/ml。然後再用100ng / mL濃度的脂多糖(LPS,內毒素)進一步刺激RAW264.7細胞，刺激時間為8個小時。將內毒素剌激過的細胞收集後製備成細胞分解物。將餘下細胞培養液(media)濃縮成十倍。用對小鼠TNF-a特異的酶標分析試劑，OptiEIATM (BD Biosciences),按照廠家說明分析細胞分解物和濃縮的細胞培養液。
實驗結果如圖2所示，用100 pg/ml的AKF-PD處理過的細胞的TNP-cc的分泌受到64%的抑制。當AKP-PD的劑量為300 pg/ml時，TNF-
1606分泌的抑制可達89% (圖2A) 。 AKF-PD對細胞內的TNF-oc水平也有一 定的抑制作用，300 pg/ml的AKF-PD有大約50%的抑制(圖2B)。所以 給予RAW264.7細胞AKF-PD都會對細胞內的和分泌的TNF-ot有明顯 的、且依賴於劑量的抑制作用。圖2中，每個帶有誤差標的柱形圖代表來 自三個平行受測樣品中TNF-cx的平均值及其標準差(SD)。對於AKF-PD 處理的細胞的分泌水平，在所有AKF-PD的三個濃度相對於基準(參 照)的統計分析比較得出的p值都小於0.001;就細胞內的TNF-cc水平而 言，在100 jug/ml和300 )Lig/ml劑量的AKF-PD的p值分別都小於0.01 。
實施例3
多種5-甲基-1-(取代苯基)-2- (1H)吡啶酮類的化合物對小鼠巨噬細 胞的TNF-cx蛋白的合成與分泌的抑制作用
實驗設計用內毒素刺激的小鼠巨噬細胞株RAW264.7進行五種5 -甲 基-l-(取代苯基)-2 - (1H)吡啶酮類的化合物對TNF-a蛋白的合成與 分泌作用效果的分析。這五種化合物為1- (3'-氟苯基)-2- (1H)吡 啶酮(AKF-PD) ， 1- ( 3'-溴苯基)-5-甲基-2- (1H)卩比啶酮(AKF-BR) ， 1- (3'-氯苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮(AKF-CL) ， 1-(3'-甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮(AKF-CH3)和l - (3'-甲氧 基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮(AKF-OCH3)。以30嗎/ml濃度的 各種AKF化合物對所述細胞預處理4小時。然後再用100ng / mL濃度的 脂多糖(LPS,內毒素)進一步刺激被AKF化合物處理過的264.7RAW細 胞，刺激時間為8個小時。將除去細胞後的培養液濃縮十倍後，以對小鼠 TNF-a特異的酶標分析試劑，OptEIA (BD Biosciences),按照生產商的使 用說明對濃縮的細胞培養液進行分析。
實驗結果如圖3所示，五種5-甲基-l-取代苯基-2 (1H)吡啶酮化 合物都對LPS內毒素刺激而分泌TNF-a水平有抑制作用。在30 (ag/ml濃度下，AKF-PD和AKF-OCH3的抑制作用最明顯，分泌出的TNF-a分別減少 56%和63%。 AKF-BR， AKF-CL和AKF-CH3也表現出抑制作用，但是對 TNF-ot分泌水平的抑制作用較弱。圖3中每個帶有誤差標的柱形圖代表了 三個平行受測樣品中TNF-a的平均值及其標準差(SD)。對於AKF化合 物處理的細胞，相對於基準所顯示的所有處理的的統計分析比較得出的p 值都小於0.001。
實施例4
AKF-PD對大鼠關節炎動物模型的TNF-a的血清水平的抑制作用
實驗設計一種最常見的人類風溼性關節炎(RA)動物模型，大鼠
的佐劑誘發關節炎(AIA)被用來評價AKF-PD對體內TNTF-a水平的抑制 作用。選IO周大的雄性大鼠(Lewis rat)。將熱處理過的Myco^"en'"w 6w0Wcww《Difco Laboratories)以7.5 mg/ml懸浮於不完全Freund式佐齊!j審!j 成Freund式完全佐劑(CFA)。將0.1 ml Freund式完全佐劑乳液以皮內注 射的方式注射到大鼠的鼠尾的根部(Arthritis Rhem 39:1677， 1996)，刺激 CFA誘發的關節炎。 一共三組大鼠零對照組(健康)，佐劑/常規生理 鹽水組，佐劑/AKP-PD組。每組6隻大鼠。注射佐劑後2到14天，每天 分別對兩個佐劑組以灌胃的方式給予500 mg/kg的AKF-PD或生理鹽水， 然後將動物處死。收集血清後用TNF-a特異的酶標分析方法對血清樣品進 行分析，分析試劑購自ChemiKine。
實驗結果如圖4所示，僅注射佐劑的大鼠的TNF-a的血清TNF-a的 水平比零對照組的血清TNF-a的水平高很多(47.9 ng/ml對8.1 ng/ml); 而有關節炎的大鼠經AKF-PD治療後的血清TNF-a的水平被顯著降低 (12.9ng/ml)，該結果與零對照組的血清TNF-oc的水平相差不多(8.1 ng/ml)。圖4中每個帶有誤差標的柱形圖代表同組的6個大鼠的平均血清 TNF-a的水平及其標準差(SD)。實施例5
AKF-PD對大鼠關節炎動物模型的爪掌組織中的TNF-ot水平的抑制作用
實驗設計有關CFA誘發關節炎過程以及AKP-PD的處理均與實施 例4完全相同。大鼠在注射佐劑和AKF-PD 14天被處死。將處死大鼠的爪 掌組織並於-80。C保存。將融化的爪掌組織去皮並切碎，稱重後於4°C用 5M的冷尿素溶液提取(100mg溼組織/5 ml緩衝液)。然後對提取液用硫 酸氨進行沉澱處理。然後將部分純化的提取液立即冷凍保存供進一步分 析。該爪掌組織提取液中的蛋白含量以Bradford蛋白測定套組(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)測定。
實驗結果如圖5所示，和血清測定結果類似(圖4) , AKF-PD可 明顯降低爪掌組織中的TNF-a的水平，從關節炎大鼠中的8.1 ng/ml降低到 AKF-PD治療大鼠中的3.4 ng/ml。圖5中，每個帶有誤差標的柱形圖代表 同組的6個大鼠的平均值及其標準差(SD)。
實施例6
AKF-PD預防佐劑誘導的大鼠關節炎的發生
本發明還採用佐劑誘導的大鼠關節炎模型來驗證以AKF-PD全身給 藥對關節炎的發生的影響。
實驗設計按照實施例4描述的方法對10周的Lewis大鼠用福式完全 佐劑(CFA)處理。從第二天起，這些大鼠每天以灌胃的方式給予500 mg/kg AKF-PD或生理鹽水， 一直到第十四天，然後處死。CFA處理的大 鼠一般會在接種佐劑後兩個星期內出現關節炎症狀(爪掌腫大)。
表1總結了實驗結果兩個星期後，注射佐劑後的大鼠平均減重5 克，而未注射佐劑的正常組大鼠在該兩個星期中平均增重41克。對注射 了佐劑的大鼠施用AKF-PD的大鼠阻止了體重下降並導致平均體重增加了 37克。僅使用佐劑處理的所有對照大鼠(8/8)在注射佐劑後10到14天後都出現了關節炎症狀,而在佐劑+AKD-PD組中，沒有一隻大鼠(0/8)出現
關節炎症狀。
表l關節炎的發生率和爪掌的尺寸
處理方法正常組佐劑佐劑+ AKD-PD
大鼠數量888
平均的體重變化+ 41g-5 g+ 37g
關節炎發生率0/88/80/8
爪掌的尺寸(mm)6.35 ±0.1910.12± 1.896.01 ± 0.25
實施例7
l國(3'-氟苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮(AKF-PD)和Pirfenidone急性
毒性試驗比較。
實驗設計體重18g 22g的昆明種小鼠(KM)，雌雄兼巨有，由中 南大學湘雅醫學院實驗動物學部提供。取健康KM小鼠50隻，隨機分成5 組，每組10隻，雌雄各5隻。給藥前禁食12h，不禁水。按20ml/kg體重 灌胃給藥，給藥(AKF-PD或PFD)劑量為1071mg/kg 6000mg/kg，劑量 組距比為1:0.65 (該劑量與相臨低劑量之比)。所有動物給藥後常規飼 養，記錄一次給藥後14天內小鼠急性毒性反應及死亡情況，並對所有死 亡動物進行解剖，肉眼觀察各臟器變化。
用Bliss方法計算LDso及95°/。可信限。AKF-PD的急毒LD50為 2979.89mg/kg， 95%可信限為2402.70mg/kg 3695.73mg/kg，結果見表2。 PFD的LDso為955.4mg/kg， 95%可信限為550.9 1656.7mg/kg，結果見表 3。表3的結果與文獻報導的PFD吡非尼酮的急性毒性結果1112 mg/kg
(《藥學服務與研究》2005， 5: 4823)禾n 997.7 mg/kg ( US.P.5310562) 很相近。這些結果顯示本發明的AKF-PD的毒性只有PFD的三分之一
(2978mg/kg比955mg/kg)。表2. AKF-PD的LD50
劑量 (mg/kg)對數劑量 (X)動物數 (只)死亡數 (只)死亡率 (%)LD5o及95。/。可信限
6000.03.7782109902979.89mg/kg (2402.70 3695.73)
3卯0.03.5911107702535.03.4040104401647.83.2169101101071.03.02981000表3.小鼠口服PFD的LDso急性毒性試驗結果
劑量對數劑量動物數死亡數死亡率LD5o及95%可信限
(mg/kg)(X)(只)(只)(%)(mg/kg)
60003.77821010100
39003.59111010訓955.4 mg/kg
25353.404010880(550.9-1656.7)
1647.83.216910660
10713.029810550
權利要求
1、具有通式II的1-(取代苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮(II)化合物用於製備治療TNF-α為中介的疾病的藥物組合物的用途
2、根據權利要求1所述的用途，其中，當n=l時，取代基R選自f、 Br、 I、硝基、垸基、烷氧基或滷代焼基；當n=2時，取代基R選自f、 Cl、 Br、 I、烷基、烷氧基或滷代烷 基；且R為鄰位、間位或對位。
3、根據權利要求1或2所述的用途，其中，n=l或2， r選自直鏈垸 基、支鏈烷基、直鏈烷氧基或直鏈滷代烷基。
4、 根據權利要求3所述的用途，其中，直鏈烷基或支鏈垸基具有1到 大約6個碳。
5、 根據權利要求1、 2、 3或4所述的用途，其中，所述藥物化合物包 含一個或多個選自以下群組的化合物1- ( 2 '-溴苯基)-5-甲基-2-(1h)吡啶酮；1- ( 3'畫溴苯基)-5畫甲基畫2- (1h)卩比啶酮；l-(4'-溴 苯基)國5-甲基-2- (1h)吡啶酮；1- (2'-氟苯基)-5-甲基-2- (1h)吡 啶酮；1- (3'-氟苯基)-5-甲基-2- (1h)吡啶酮；1-(4'-氟苯基)-5-甲基-2- (1h)吡啶酮；1- (2'-碘苯基)-5-甲基-2- (1h)吡啶酮； 1- (3'-碘苯基)-5-甲基-2- (1h)吡啶酮；1- (4'-碘苯基)-5-甲基-2-(lH)吡啶酮；l畫(2',3'畫二溴苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；l畫 (2',4'-二溴苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；1- (2',5'-二溴苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；1- (2'，6-二溴苯基)-5-甲基-2畫(1H)吡啶酮； 1- (3',4'-二溴苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；1- (3',5'-二溴苯基)-5-甲基-2隱(1H)吡啶酮；1- (2'，3'-二氯苯基)-5-甲基-2隱(1H)吡 啶酮；1- (2',4'-二氯苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；l-(2',5'-二氯 苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；1- (2',6'-二氯苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮；1 - (3',4'-二氯苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；1-(3'，5'-二氯苯基)-5-甲基-2誦(1H)吡啶酮；1- (2'，3'-二氟苯基)畫 5一甲基-2- (1H)吡啶酮；l畫(2'，4'-二氟苯基)-5-甲基-2- (1H)吡 啶酮；1- (2'，5'-二氟苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；l-(2',6'-二氟 苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；1- (3',4'-二氟苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮；1- (3'，5'-二氟苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；1-(2'-三氟甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；1- (4'-三氟甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；1- (2',3'-雙三氟甲基苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮；1- (2',4'-雙三氟甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮； 1- (2',5'-雙三氟甲基苯基)畫5-甲基誦2- (m)吡啶酮；1- (2'，6'-雙三 氟甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；1- (3'，4'-雙三氟甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；誦(3',5'-雙三氟甲基苯基)-5-甲基_2- (1H)吡 啶酮；1- (2'-甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；1-(3'-甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；1- (2'，3'-二甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡 啶酮；1- (2'，4'-二甲基苯基)-5-甲基-2隱(1H)吡啶酮；l-(2'，5'-二 甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；1- (2',6'-二甲基苯基)-5-甲基-2畫(1H)吡啶酮；1- (3',4'-二甲基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮； 1- (3'，5'一二甲基苯基)_5-甲基-2- (m)吡啶酮；1- (2'-甲氧基苯 基)-5-甲基-2- (m)吡啶酮；1- (3'-甲氧基苯基)-5-甲基-2畫(1H)吡啶酮；1- (2',3'-二甲氧基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；1- (2',4'-二甲氧基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；1- (2'，5'-二甲氧 基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮；1- (2',6'-二甲氧基苯基)-5-甲 基畫2畫(1H)吡啶酮；1- (3',4'-二甲氧基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶 酮；1- (3',5'-二甲氧基苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮。
6、 根據權利要求1所述的應用，其中，所述組合物以每日約25到約 6000 mg的劑量施用。
7、 根據權利要求l所述的應用，其中，所說的以a-腫瘤壞死因子為 中介的疾病包括類風溼性關節炎，銀屑病，關節型銀屑病，哮喘，壞血 症或節段性迴腸炎疾病。
8、 根據權利要求1所述的應用，其中，所述藥物組合物的給藥形式 是口服給藥、注射給藥、眼部給藥和/或外用給藥。
9、 根據權利要求1所述的應用，其中，所述藥物組合物中含有的具 結構式n的化合物用於治療a -腫瘤壞死因子為中介的疾病的有效劑量為 每日約25到約6000 mg 。
10、 根據權利要求1所述的應用，其中，所述藥物組合物中含有的具 結構式n的化合物用於治療a -腫瘤壞死因子為中介的疾病的有效劑量為 每日約50到約2000 mg 。
11、 根據權利要求1所述的應用，其中，所述藥物組合物中含有的具 結構式n的化合物用於治療a -腫瘤壞死因子為中介的疾病的有效劑量為 每日約100到約1000 mg 。
12、 一種低毒的、具有通式II的5 -甲基-1 -(取代苯基)-2 -(1H)吡啶酮化合物在製備用於治療以oc-腫瘤壞死因子為中介的疾病的藥物組合物的應用，該化合物結構中，n=l， R = F，formula see original document page 5
13、 根據權利要求12所述的應用，其中，取代基R為3氟，該化合 物是l- (3'-氟苯基)-5-甲基-2- (1H)吡啶酮。
14、 根據權利要求12或13所述的應用，其中，該藥物組合物包含有 效量的通式II化合物，該有效量為每日約25到約6000 mg。
15、 根據權利要求12或13所述的應用，其中，該藥物組合物包含有 效量的通式II化合物，該有效量為每日約50到約2000 mg。
16、 根據權利要求12或13所述的應用，其中，該藥物組合物包含有 效量的通式II化合物，該有效量為每日約100到約1000 mg。
17、 根據權利要求12或13所述的應用，其中，所說的以a -腫瘤壞 死因子為中介的疾病包括類風溼性關節炎，銀屑病，關節型銀屑病，哮 喘，壞血症或節段性迴腸炎。
18、 根據權利要求12或13所述的應用，其中，該藥物組合物的劑型 是口服劑、注射劑、眼科藥劑和/或外用藥劑。
全文摘要
本發明披露了5-甲基-1-(取代苯基)-2-(1H)吡啶酮中具有抗α-腫瘤壞死因子活性的化合物。一個最有代表性的化合物是1-(3′-氟苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮，AKF-PD。本發明同時相應地披露了應用一種或多種5-甲基-1-(取代苯基)-2-(1H)吡啶酮類化合物治療如類風溼性關節炎，銀屑病，及節段性迴腸炎等這類以α-腫瘤壞死因子為中介的疾病的方法。
文檔編號A61K31/4412GK101472588SQ200780023120
公開日2009年7月1日 申請日期2007年4月27日 優先權日2007年4月27日
發明者史躍年 申請人:達瑞科技投資有限公司;北京優尼脈科技開發有限公司