血小板生成素的製作方法

2023-06-21 13:39:26 2

專利名稱：血小板生成素的製作方法
技術領域：
本發明領域本發明涉及影響造血細胞、特別是血小板遠祖細胞存活、增殖、分化或成熟的蛋白質的分離、提純和重組體或化學合成。本發明具體涉及編碼能結合併激活細胞因子受體超家族成員mpl的蛋白質配體的核酸的克隆和表達。本發明還涉及應用這些蛋白質單獨或結合其他細胞因子以治療包括血小板減少在內的免疫性或造血性疾病。本發明背景I.造血系統造血系統產生所有哺乳動物生存必需的高度特化的成熟血細胞。這些成熟細胞包括專門輸送氧氣和二氧化碳的紅細胞；擔負細胞介導和抗體介導的免疫反應的T和B淋巴細胞；專門生成血塊的血小板；以及作為清除細胞或輔佐細胞以抵禦感染的粒細胞和巨噬細胞。粒細胞進一步分為具有獨立功能的特化細胞類型中性細胞、嗜酸性細胞、嗜鹼性細胞和肥大細胞。值得注意的是，所有這些特化的成熟血細胞來自一種最初見於骨髓中的、稱作多能(或全能)幹細胞的單一共同的原始細胞類型(Dexter等，Ann.Rve.Cell Biol.，3423-441〔1987〕)。
在哺乳動物的生命全過程中，必須持續、大量地產生高度特化的成熟血細胞。絕大部分特化的血細胞只能維持幾小時至幾周的功能活性(Cronkite等，Blood，Cells，2263-284〔1976〕)。因此，為了維持哺乳動物正常的穩態血細胞需求，需要不斷更新成熟血細胞、原始幹細胞本身，以及在原始細胞和成熟細胞之間的任何中間遠祖細胞系或譜系定向的遠祖細胞系。
造血系統的核心是多能幹細胞。這些細胞相對量少，通過增殖進行自身更新產生子代幹細胞，或經一系列分化步驟轉化為增多且成熟的譜系限定的遠祖細胞，最終形成高度特化的成熟血細胞。
例如，來自幹細胞的稱作CFC-Mix的某些多能遠祖細胞經增殖(自身更新)和發育而產生包含全部不同骨髓細胞的集落紅細胞、中性細胞、巨核細胞(血小板的前身)、巨噬細胞、嗜鹼性細胞、嗜酸性細胞和乳大細胞。其它淋巴譜系的遠祖細胞增殖和發育成為T細胞和B細胞。
此外，在CFC-Mix遠祖細胞和骨髓細胞之間，存在另一組定向於子代的中間遠祖細胞。這些譜系限定的遠祖細胞按其產生的子代表分類。因此，已知骨髓細胞最接近的前身為產生紅細胞的紅細胞集落形成單位(CFU-E)、產生中性細胞和巨噬細胞的粒細胞/巨噬細胞集落形成細胞(GM-CFC)、產生巨核細胞的巨核細胞集落形成細胞(Meg-CFC)、產生嗜酸性細胞的嗜酸性細胞集落形成細胞(Eos-CFC)以及產生肥大細胞的嗜鹼性細胞集落形成細胞(Bas-CFC)。其它介於多能幹細胞和成熟血細胞之間的中間前身細胞也已知(見下述)或會被發現具有各種程度的譜系限定和自身更新能力。
因為丟失了多能性並且獲得了譜系限定和成熟性，所以，正常造血細胞系統中的主細胞似乎降低自身更新的能力。因此，在造血細胞譜的一端，是具有自身更新和分化成所有各種譜系特化的定向遠祖細胞能力的多能幹細胞。這種能力是骨髓移植治療的基礎，在該治療中原始幹細胞重新注入整個造血細胞系統中。在造血細胞譜的另一端，是高度譜系限定的遠祖細胞及其子代，它們失去了自身更新的能力，但獲得了成熟的功能活性。
由各種造血生長因子或細胞因子精細地控制著幹細胞和譜系限定遠祖細胞的增殖和發育。這些生長因子在體內的作用是複雜的，尚未完全被了解。一些生長因子，例如白細胞介素-3(IL-3)能刺激多能幹細胞和一些譜系定向的遠祖細胞，包括如巨核細胞。其它因子，如粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)起初被認為其作用限於GM-CFC′s，但後來發現，GM-CSF還影響特別是巨核細胞的增殖和發育。因此，發現IL-3和GM-CSF更有重疊的生物活性，儘管它們具有不同的潛能。最近，發現白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素11(IL-11)單獨地對巨核細胞集落形成均無明顯影響，而與IL-3協同作用時則刺激巨核細胞的成熟(Yonemura等，Exp.Hematol.，201011-1016〔1992〕)。
因此，造血生長因子可影響-個或多個譜系的生長和分化，在影響單個遠祖細胞系方面可與其它生長因子重疊，或可與其它生長因子協同作用。
而且，在從全能幹細胞通過各種定向的譜系限定遠祖細胞到成熟血細胞的細胞發育不同階段，造血生長因子能夠顯示出它們的效應。例如，紅細胞生成素(epo)似乎僅僅促進成熟紅細胞的遠祖細胞的增殖。IL-3似乎較早地發揮影響原始於細胞和中間譜系限定遠祖細胞的效應。其它生長因子如幹細胞因子(SCF)可影響甚至更原始的細胞發育。
綜上所述可理解，影響任何血細胞或其前身的存活、增殖、分化或成熟的新的造血生長因子將是有用的，特別有肋於由疾病或放療或化療引起的削弱的造血系統的重建。II.巨核細胞生成——血小板產生巨核細胞生成和血小板產生的調節參見綜述Mazur，Exp.Hematol.，15248〔1987〕Hoffman，Blood，741196-1212〔1989〕。簡而言之，骨髓多能幹細胞分化成巨核細胞、紅細胞和髓細胞系。據信，在幹細胞和巨核細胞之間有定向巨核細胞遠祖細胞這一級。至少鑑定出三類巨核細胞遠祖細胞，即爆發集落形成單位巨核細胞(BFU-MK)、集落形成單位巨核細胞(CFU-MK)和低密度巨核細胞遠祖細胞(LD-CFU-MK)。巨核細胞成熟本身是發育的延續，可根據標準的形態標準分成若干階段。巨核細胞(MK或meg)家族最早的可識別成員為成巨核細胞。這些細胞開始時直徑為20-30μm，有嗜鹼性細胞質和一個略微不規則的核，該核具有疏鬆的、略呈網狀的染色質和幾個核仁。此後，成巨核細胞可含有多至32個核多倍體，但細胞質仍維持稀疏和不成熟。在成熟過程中，核變得更呈小葉狀且固縮，細胞質的量增加，變得更嗜酸性且呈顆粒狀。這一家族的大多數成熟細胞的邊緣可有釋放血小板的外觀。通常，10％以下的巨核細胞處於胚胎細胞階段，50％以上為成熟細胞。通常用於巨核細胞系列的權威形態學分類是最早期形態的成巨核細胞；中間形態的前巨核細胞或嗜鹼性巨核細胞；後期形態的成熟(嗜酸性、顆粒狀或產生血小板的)巨核細胞。成熟巨核細胞將細胞質纖絲延伸進血竇腔，在血竇腔中它們碎裂成單個血小板(Williams等，Hematlolgy，1972)。
據信巨核細胞生成涉及一些調節因子(Williams等，Br.J.Haematol.，52173〔1982〕和Willams等，J.Cell Physiol.，110101〔1982〕)。巨核細胞生成的早期階段假定呈有絲分裂，涉及來自CFU-MK的細胞增殖和細胞集落的起始形成，但不受血小板數量的影響(Burstein等，J.Cell Physiol.，109333〔1981〕和Kimura等，Exp.Hematol.，131048〔1985〕)。成熟的後期階段呈非有絲分裂，涉及核的多倍體化和細胞質成熟，可能通過外周血小板數目以反饋機制進行調節(Odell等，Blood，48765〔1976〕和Ebbe等，Blood，32787〔1968〕)。
對獨特的、特異性的巨核細胞集落刺激因子(MF-CSF)的存在頗有爭議(Mazur，Exp.Hematol.，15340350〔1987〕)。但是，多數作者相信，作為血小板產生這一對生存極其重要的過程絕對地受細胞因子的調節。存在巨核細胞/血小板特異性細胞因子這一假說為30多年的研究提供了基礎，但至今尚無象單一的MK-CSF(TPO)這樣的細胞因子被提純、測序和分析鑑定。
雖然據報導，MK-CSF′s被從實驗性產生的血小板減少(Hill等，Exp.Hematol.，14752〔1986〕)和人胚腎條件培養基〔CM〕(McDonald等，J.Lab.Clin.Med.，8559〔1975)以及從可塑性貧血和特發性血小板減少性紫癜尿提取物(Kawakita等，Blood，6556〔1983〕和血漿(Hoffman等，J.Clin.invest.，751174〔1985〕)中部分地提純，但在大多數病例中，它們的生理功能尚未明了。
商陸促分裂原激活的脾細胞條件培養基(PWM-SpCM)和鼠骨髓單核細胞細胞系WEHI-3(WEHI-3CM)被用作巨核細胞促進劑。PWM-SpCM含有多種促進CFU-MK生長的因子(Met-calf等，Pro.Natl.Acad.Sci.，USA，7217441748〔1975〕；Quesenberry等，Blood，652141985；和lscove，N.N.，inHematopoietic Cell Differentiation，ICN-UCLA Symposia onMolecular and Cellular Biology，Vol.10，Golde等編輯〔NewYork，Academy Press〕pp 37-52〔1978〕)，其中一個是白細胞介素-3(IL-3)，這是一種多譜系細胞集落刺激因子(multi-CSF〔Burstein，Blood Cells，11469〔1986〕〕)。這種培養基中的其它因子尚未被鑑定和分離出來。WEHI-3鼠骨髓單核細胞系分泌相對地大量的IL-3和較少量的GM-CSF。現已發現，IL-3促進大範圍的造血細胞生長(lhle等，J.lmmunol.，13282〔1983〕)。還發現，在非常早期的多能前體誘導中以及在非常大量的混合造血細胞集落的形成中，IL-3和很多已知的造血激素或生長因子協同作用，(Bartelmez等，J.Cell Physiol.，122382369〔1985〕和Warren等，Cell，46667674〔1988〕)，包括紅細胞生成素(EPO)和白細胞介素-1(IL-1)。
巨核細胞促進劑的其它來源還見於鼠肺、骨、巨噬細胞系、腹膜滲出物細胞和人胚腎細胞的條件培養基中。儘管有某些相牴觸的數據(Mazur，Exp.Hematol.，15340350〔1987〕)，但有一些證據(Geissler等，Br.J.Haematol.，60233-238〔1985〕)表明，激活的T淋巴細胞而非單核細胞在巨核細胞生成中起促進作用。這些發現提示，激活的T淋巴細胞分泌物如白細胞介素可以是MK發育中的調節因子(Geissler等，Exp.Hematol.，15845-853〔1987〕)。用純化的紅細胞生成素(EPO)對巨核細胞生成進行的一些研究(Vainchenker等，Blood，54940〔1979〕；McLeod等，Nature，261492-4〔1976〕和Williams等，Exp.Hematol.，12734〔1984〕)表明，該激素對MK集落形成具有促進作用。這在不含血清培養物和含血清培養物中，以及缺乏輔佐細胞的情況下均得到了證明(Williams等，Exp.Hematol.，12734〔1984〕。與PWM-SpCM的效應相反，EPO被假設為更多地涉及巨核細胞生成的單細胞和雙細胞階段，而PWM-SpCM涉及巨核細胞發育的四細胞階段。所有這些因子對巨核細胞的早期和晚期的相互作用有待闡明。
從一些實驗室得到的資料提示，僅各自具有MK-集落刺激活性的多譜系因子是GM-CSF和IL-3，而在較低程度上，是B細胞刺激因子IL-6(Ikebuchi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，849035〔1987〕。最近，一些作者報導了IL-11和白血病抑制因子(LIF)與IL-3起協同作用，增加巨核細胞體積和倍性(Yonemura等，British Journal of Hematology，8416-23〔1993〕；Burstein等，J.Cell.Physiol.，153305-312〔1991〕；Bruno等，Blood，7650-56〔1990〕；Metcalf等，Blood，772150-2153〔1991〕；Bruno等，Exp.Hematol.，19378-381〔1991〕；和Yonemura等，Exp.Hematol.，201011-1016〔1992〕。
其它令人感興趣的文獻包括Eppstein等，美國專利No.4,962,091；Chong，美國專利NNo.4,879,111；Fernandes等，美國專利No.4,604,377；Wissler等，美國專利No.4,512,971；Got-tlieb，美國專利No.4,468,379；Bennett等，美國專利No.5,215,895；Kogan等，美國專利No.5,250,732；Kimura等，Eur.J.lm-munol.，20(9)1927-1931〔1990〕；Secor等，J.of lmmunol.，144(4)1484-1489〔1990〕；Warren等，J.of lmmunol.，140(1)94-99〔1988〕；Warren等，Exp.Hematol.，17(11)1095-1099〔1989〕；Bruno等，Exp.Hematol.，17(10)1038-1043〔1989〕；Tamikawa等，Exp.Hematol.，17(8)883-888〔1989〕；Koike等，Blood，75(12)2286-2291〔1990〕；Lotem，Blood，75(5)1545-1551〔1989〕；Rennick等，Blood，73(7)1828-1835〔1989〕；和Clutterbuck等，Blood，73(6)1504-1512〔1989〕。III.血小板減少血小板是血凝機制中的關鍵要素。稱作小血板減少的血小板循環水平的耗竭存在於各種臨床狀況和疾病中。血小板減少通常定義為血小板計數低於150×109/升。根據血小板壽命，可將血小板減少的主要原因粗略地分為三類，即(1)骨髓引起的血小板產生受損，(2)脾血小板匯集(脾大)或(3)外周循環中血小板破壞增加(例如自身免疫性血小板減少或化療和放療)。此外，接受大劑量的快速施用破壞血小板的血製品的患者，可因稀釋而發生血小板減少。
血小板減少的臨床出血症狀依賴於血小板減少的嚴重性、病因和可能伴有的凝血缺陷。通常，血小板計數在20－100×109/升的患者有外傷後過多出血的危險，而血小板計數低於20×109/升的患者可自發性出血。後一種患者是血小板輸液的候選者，伴隨有免疫性和病毒性危險。當病因是血小板產生減少而不是破壞增加時，任何一種程度的血小板減少其出血傾向更為嚴重。在後一種情況，加速的血小板轉運導致更新、更多的止血更有效的血小板循環。血小板減少可來自各種疾病，簡述如下。更詳細的描述可參見Schafner，A.L.，″Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function，″InternalMedicine，第三版，John J.Hutton等，編輯，Litte Brown和Co.，Boston/Toronto/London〔1990〕。
(a)由血小板產生受損造成的血小板減少先天性血小板減少的病因包括體質性再生障礙性貧血(Fanconi綜合症)和先天性無巨核細胞性血小板缺乏，這些可能與骨骼畸形相關。獲得性血小板產生疾病是由巨核細胞發育不全或低效血小板生成造成的。有多種情況會導致巨核細胞發育不全，其中包括骨髓發育不全(包括特發性形式或由化療劑或放療造成的骨髓抑制)、骨髓纖維變性、白血病和轉移腫瘤或肉芽腫對骨髓的侵襲。在有些情況中，毒素、感染原或藥物會相對選擇性地幹擾血小板生成；其實例包括由酒精或某些病毒感染造成的暫發性血小板減少和與服用噻嗪類利尿劑有關的輕度血小板減少。最後，巨成紅細胞形成過程(葉酸或B12缺乏)中繼發的低效血小板生成也會導致血小板減少，通常伴隨以貧血和白細胞減少。
當前對由血小板產生減弱造成的血小板減少的治療依賴於對存在的骨髓障礙病因的鑑定和逆轉。通常只對有嚴重出血併發症的病人或為了手術過程中的保護而進行血小板輸液，因為同種免疫可能導致對繼續輸入血小板產生不應性。由嚴重血小板減少導致的黏膜出血可通過口服或靜脈注射以抗溶纖維蛋白劑來得到緩解。但是，如果對瀰漫性血管內凝血(DIC)病人使用抗溶纖維蛋白劑可能使血栓形成併發症進一步發展。
(b)由脾(血小板)匯集造成的血小板減少由任何原因造成的脾大都可能與輕度至中度的血小板減少相關。與下文將要論述的在免疫介導的血小板減少中脾對血小板的積極性破壞相比，這是一個很消極的脾血小板匯集過程(脾功能亢進)。雖然脾功能亢進的最常見病因是酒精性肝硬變造成的門靜脈高血壓引起的充血性脾大，但其它形式的充血性、浸潤性或淋巴組織增生性脾大也與血小板減少相關。單由脾功能亢進引起的血小板減少通常計數不低於50×109/升。
(c)由非免疫介導的血小板破壞造成的血小板減少各種非免疫過程對血小板的加速破壞會導致血小板減少。這種類型的疾病包括瀰漫性血管內凝血，血管內假體裝置、體外血循環和如血栓形成性血小板性紫癜等血栓形成性微血管病。在所有這些情況中，暴露於假體表面或異常血管內膜的循環中的血小板會在這些位置被消耗或被網狀內皮系統破壞，然後在未成熟前將其清除。Braunwald等編輯的Harrison’s Principles of Internal Medicine第11版，P1478，McGraw Hill(1987)中較為詳細地敘述了可能導致瀰漫性血管內凝血(DIC)的疾病狀況。血管內假體裝置包括心瓣膜和主動脈內球囊能導致輕度至中度的破壞性血小板減少，而接受心肺分流術或血液透析的病人中的暫發性血小板減少可能是由體外迴路中血小板的消耗或破壞造成的。
(d)藥物誘導的免疫性血小板減少有100多種藥物與免疫介導的血小板減少有關。但是，只對奎尼丁、奎寧、金、磺胺類藥、頭孢噻吩和肝素進行了詳細的定性。藥物誘導的血小板減少通常十分嚴重而且一般在病人服用了致敏藥物後的幾天內立即發生。
(e)免疫性(自身免疫性)血小板減少性紫癜(ITP)
成人中的ITP是一種慢性病，其特徵在於自身免疫性血小板破壞。這種自身抗體通常是IgG，但對其它免疫球蛋白也有報導。雖然ITP自身抗體已被發現與血小板膜GPIIbIIIa相關，但大多數病例中的血小板抗原特異性仍未鑑定出來。致敏血小板的血管外破壞發生在脾和肝的網狀內皮系統中。雖然半數以上的ITP病例是特發性的，但大多數病人患有風溼性或自身免疫性疾病(如系統性紅斑狼瘡)或淋巴組織增生性疾病(如慢性淋巴細胞性白血病)。
(f)HIV誘導的ITPITP是越來越常見的一種HIV感染併發症(Morris等，Ann.Intern.Med.，96714-717〔1982〕)，而且能出現在疾病發展的任何階段，在已被確診的獲得性免疫缺陷綜合症(AIDS)病人、AIDS相關複合症的病人和被HIV感染但無AIDS症狀的病人中都有發生。HIV感染是一種傳染性疾病，最終表現為細胞免疫功能的深度缺陷和發生機會性感染及病情惡化。由HIV感染引起的最初免疫異常是表達CD4細胞表面糖蛋白的T淋巴細胞的發展性減少和功能性損壞(Lane等，Ann.Rev.Immunol.3477〔1985〕)。可能是CD4輔助性/誘導性T細胞功能的喪失造成了導致機會性感染和AIDS病情惡化特徵的細胞免疫和體液免疫的深度缺陷。(H.Lane同上)。
雖然還不知到HIV相關的ITP機制，但據信不同於與HIV感染不相關的ITP機制(walsh等，N.Eng.J.Med.311635-639〔1984〕；和Ratner，Am.J.Med.，86194-198〔1989〕)。IV.當前對血小板減少的治療方法對血小板減少病人的治療方法取決於臨床症狀的嚴重性和緊迫性。對HIV相關性和HIV不相關性血小板減少的治療方法相似，而且，雖然已經使用了多種不同的治療方法，但這樣的治療仍有爭議。
糖皮質素(如強的松龍)療法成功地提高了確診患血小板減少症病人的血小板數，但在大多數病人中，這種反應不完全，或者會在減少糖皮質素的劑量或中斷服用時出現復發。基於以HIV相關的ITP患者進行的研究，有些研究者提出糖皮質素療法可能導致易感染AIDS。通常在血小板低於20×109/升以下或在出現自發性出血時服用糖皮質素。
至於對糖皮質素不應的病人，化合物4-(2-氯苯基)-9-甲基-2-〔3-(4-嗎啉基)-3-丙酮-1-基〕6H-噻吩並〔3，2，f〕〔1，2，4〕三唑〔4，3，a〕〔1，4〕二氮雜草(WEB2086)已被成功地用於治療HIV不相關的ITP重病例。用WEB2086治療一血小板數為37,000-58,000/微升的病人，1-2周的治療後，血小板數升至140,000-190,000/微升。(EP361,077和Lohman等，Lancet，1147(1988))。
雖然獲得性無巨核細胞性血小板減少性紫癜(AATP)的最佳治療方法還不確定，但抗胸腺細胞球蛋白(ATG)(一種針對人胸腺組織的馬抗血清)已被顯示可產生長期的、完全的緩解。(Trimble等，Am.J.Hematol.，37126-127〔1991〕)。但最近的一則報導指出，ATG的造血作用緣於硫柳汞，而蛋白質被假設起著汞載體的作用。(Panella等，Cancer Research，504429-4435〔1990〕)。
已有報導稱脾摘除具有良好效果。脾摘除在許多病人中消除了大多數血小板破壞位置和大多數自身抗體產生源。該方法可在大量的病人中產生長期的、無需治療的緩解。但是，缺乏免疫力的病人通常應避免外科手術，所以脾摘除只適用於重症血小板減少病例(如重症HIV相關性ITP)及對2至3周的糖皮質素治療無反應或中斷糖皮質素服用後無法獲得持續性反應的病人。基於現有的科學知識，還不清除脾摘除是否會使病人傾向於患AIDS。
除了強的松龍療法和脾摘除外，某些細胞毒劑，如長春新鹼和疊氮胸苷(AZT，zidovudine)也顯示出用於治療HIV誘導的ITP的可能性，但結果都是初試性的。
由此可知，治療血小板減少的一種方法應是獲取一種能加速巨核細胞或其前體分化和成熟成為血小板產生形式的藥劑。在鑑定這樣一種通常稱為「血小板生成素」(TPO)的藥劑方面已經花費了大量努力。文獻中常見的TPO的其它名稱還有血小板產生刺激因子(TSF)、巨核細胞集落刺激因子(MK-CSF)，巨核細胞刺激因子和巨核細胞促進劑。早在1959年，就已經發現了TPO活性(Rak等，Med.Exp.，1125)，對它進行定性和純化的努力一直持續至今。雖然有TPO-活性多肽的部分純化的報導(例如參見Tayrien等，J.Biol.Chem.，2623262〔1987〕和Hoffman等，J.Clin.Invest.751174〔1985〕)，但其它報導則推測TPO本身並不是一種獨立體，而只是某種已知激素的多功能表現形式(IL-3，Sparrow等，Prog.Clin.Biol.Res.，215123〔1986〕)。不管何種形式和來源，具有血小板生成活性的分子都應具有重要的治療價值。雖然尚無蛋白質被確切鑑定為TPO，但相當大的興趣則圍繞著最近的一項發現即mpl，一種假定的細胞因子受體，可能轉導一個血小板生成信號。V.Mpl是一種巨核細胞生成性細胞因子受體據信，造血細胞的增殖和成熟受某些因子緊密地調節，這些因子正向或負向調節多能幹細胞的增殖和多譜系分化。這些作用是通過細胞外蛋白因子與特異性細胞表面受體的高親合性結合介導的。這些細胞表面受體具有高度的同源性，而且通常被歸類為細胞因子受體超家族的成員。該超家族的成員包括以下物質的受體IL-2(β和γ鏈)(Hatakeyama等，Science，244551-556〔1989)；Takeshita等，Science，257379-382〔1991〕)、IL-3(itoh等，Science，247324-328〔1990)；Gorman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，875459-5463〔1990)；Kitamura等，Cell，661165-1174〔1991a)；Kitamura等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，885082-5086〔1991b〕)、IL-4(Mosley等，Cell，59335-348〔1989〕)、IL-5(Takaki等，EMBO J.，94367-4374〔1990)；Tavernier等，Cell，661175-1184〔1991〕)、IL-6(Yamasaki等，Science，241825-828〔1988〕；Hibi等，Cell，63149-1157〔1990I〕、IL-7(Goodwin等，Cell，60941-951〔1990〕)、IL-9(Renault等，Proc.Natl.A-cad.Sci.USA，895690-5694〔1992〕)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)(Gearing等，EMBO J.83667-3676〔1991〕)；Hayashida等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2449655-9659〔1990〕)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)(Fukunaga等，Cell，61341-350〔1990a〕；Fukunaga等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，878702-8706〔1990b〕；Larsen等，J.Exp.Med.，1721559-1570〔1990〕)，EPO(D』Andrea等，Cell，57277-285〔1989〕；Jones等，Blood，7631-35〔1990〕)、白血病抑制因子(LIF)(Gearing等，EMBO J.，102839-2848〔1991〕)、制癌蛋白M(OSM)(Rose等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，888641-8645〔1991〕)和促乳素(Boutin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，887744-7748〔1988〕；Edery等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86211 2-2116〔1989〕)，生長激素(Leung等，Nature，330536-543〔1987〕和睫狀神經營養因子(CNTF)(GH)(Davis等，Science，25359-63〔1991〕)的受體。
細胞因子受體超家族中的成員可分為三種功能類別(有關綜述可參見Nicola等，Cell，671-4〔1991〕)。第一類由單鏈受體組成，如紅細胞生成素受體(EPO-R)或粒細胞集落刺激因子受體(G-CSF-R)，它們通過細胞外結構域與配體高親合性結合併產生一種細胞內信號。第二類受體又稱α-亞基，包括白細胞介素-6受體(IL6-R)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子受體(GM-CSF-R)、白細胞介素-3受體(IL3-Rα)和其它細胞因子受體超家族的成員。這些α-亞基與配體低親合性結合但不能轉導細胞內信號。一種能轉導信號的高親合性受體是由α-亞基和稱為β-亞基的第三類細胞因子成員(如βc、IL3-Rα和GM-CSF-R等三種α-亞基的共同β-亞基)之間形成的一種異源二聚體而產生的。
mpl是細胞因子超家族中一員的證據來自於序列同源性(Gear-ing，EMBO J.83667-3676〔1988〕；Bazan，Proc.Natl.Sci.USA，876834-6938〔1990〕；Davis等，Science，25359-63〔1991〕和Vigon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895640-5644〔1992〕)和其轉導增殖信號的能力。
由鼠c-mpl的分子克隆推導的蛋白質序列揭示這種蛋白與其它細胞因子受體具有同源性。其胞外結構域含465個胺基酸殘基，該結構域由兩個亞結構域構成，每個亞結構域有4個高度保守的半胱氨酸和N端亞結構域和C端亞結構域的一段特殊基序。預計結合配體的胞外結構域具有相似的雙重β-摺疊桶幾何結構。這種重複的胞外結構域與IL-3、IL-5和GM-CSF受體共同的信號轉導鏈和LIF的低親合性結合結構域(Vigon等，Oncogene，82607-2615〔1993〕)具有高度的同源性。所以mpl可能屬於細胞因子受體超家族的低親合性配體結合類。
鼠mpl與人成熟mplp比較顯示，兩種蛋白質表現出81％的序列一致性。尤其是，N端和C端胞外亞結構域分別具有75％和80％的序列一致性。最保守的mpl區是胞質結構域，顯示出91％的胺基酸一致性，在跨膜結構域附近有一段在兩物種中完全一致的37個殘基序列。所以，mpl被報導為細胞因子受體超家族中最保守的成員之一(Vigon，同上)。
mpl是能夠轉導增殖信號的功能性受體的證據來源於嵌合受體的構建，嵌合受體含有與某已知細胞因子高親合性的細胞因子受體的胞外結構域和mpl的胞質結構域。由於還沒有報導過已知的mpl的配體，所以必須由第一類細胞因子受體如IL-4R或G-CSFR構建嵌合型高親合性配體結合胞外結構域。Vigon等(同上)將G-CS-FR的胞外結構域與c-mpl的胞質結構域和跨膜結構域融合。用這種G-CSFR/c-mpl嵌合體和作為對照的全長G-CSFR轉染IL-3依賴的細胞系BAF/B03(Ba/F3)。用嵌合體轉染的細胞在細胞因子IL-3或G-CSF存在時生長良好。同樣，用G-CSFR轉染的細胞在IL-3或G-CSF中也生長良好。沒有生長因子時，所有細胞均死亡。Skoda等(EMBO J.12(7)2645-2653〔1993〕)也進行了類似的實驗，實驗中將人IL-4受體(hIL-4-R)的胞外結構域和跨膜結構域與鼠mpl的胞質結構域融合，並以此轉染鼠的IL-3依賴性Ba/F3細胞系。用野生型hIL-4-R轉染的細胞在種特異性IL-4或IL-3存在時均能正常增殖。用hIL-4R/mpl轉染的Ba/F3細胞在hIL-4存在時(有或無IL-3時)增殖正常，由此表明在Ba/F3細胞中，mpl的胞質結構域包含了轉導增殖信號所必需的全部要素。
這些嵌合實驗證明了mpl胞質結構域轉導增殖信號的能力，但沒有提及mpl的胞外結構域是否能結合配體。這些結果與至少兩種可能性相一致，即mpl象EPO-R或G-CSFR一樣，是一種單鏈受體(第一類)或著是需要一個IL-3樣α-亞基的信號轉導β-亞基(第三類)(Skoda等，同上)。VI.Mpl配體是一種血小板生成素(TPO)如上所述，有人提出血清中含有一種有時被稱為血小板生成素(TPO)的獨特因子，它協助各種其它細胞因子促進巨核細胞的生長與成熟。還未曾從血清或其它來源中分離出這種天然因子，雖然許多研究組織為此進行了大量的努力。即使不知道mpl是否能直接結合某種巨核細胞刺激因子，最近的實驗仍證明了mpl與來自再生障礙性骨髓患者血清中發現的一種或多種因子的增殖信號的轉導有關(Methia等，Blood，82(5)1395-1401〔1993〕)。
有一種獨特的不同於IL-1α、IL-3、IL-4、IL-6、IL-11、SCF、EPO、G-CSF和GM-CSF的血清集落形成因子通過mpl來轉導增殖信號的證據來自於對原始和定向造血細胞系中c-mpl表達分布的檢測和在一種這些細胞系中進行的mpl反義研究。
在免疫純化的人造血細胞中使用逆轉錄酶(RT)-PCR(Methia等，同上)表明只在CD34+純化的細胞、巨核細胞和血小板中發現了強mpl mRNA信息。由骨髓(BM)純化而得的CD34+細胞約佔全部BM細胞的1％，並且富集於所有譜系的原始和定向遠祖細胞中(如紅細胞、粒巨噬細胞和巨核細胞)。
有報導顯示Mpl反義寡脫氧核苷酸抑制來自多能CD34+細胞的巨核細胞集落形成，這些多能CD34+細胞培養於取自再生障礙性骨髓(一種巨核細胞集落刺激活性〔MK-CSA〕的豐富來源)患者的血清中。這些相同的反義寡脫氧核苷酸對紅細胞或粒巨噬細胞集落形成都沒有作用。
mpl是否直接結合配體和是否血清因子顯示能通過mpl作用導致巨核細胞生成仍不清楚。但是曾有人提出，如果mpl確實直接結合配體，其胺基酸序列可能是高度保守的，並由於人和鼠mpl胞外結構域之間的高度序列一致性而具有種間交叉反應性(Vigon等，同上〔1993〕)。VII.目的綜上所述，可以理解，在本領域中存在著一種現時且將持續的要求，即分離和鑑定能促進造血細胞、尤其是用於治療血小板減少的巨核細胞或其前體增殖、分化和成熟的分子。據信，這類分子是一種mpl配體，所以還進一步需要分離出這種配體以評價它們在細胞生長和分化中的作用。
所以，本發明目的之一是獲取一種藥學純的能刺激巨核細胞增殖、分化和/或成熟為成熟的血小板生成形式的分子。
本發明目的之二是提供用於治療造血性疾病，尤其是血小板減少的治療形式的分子。
本發明目的之三是分離，純化，尤其是鑑定能在體內結合被稱為mpl的某細胞因子超家族受體的蛋白質配體並轉導增殖信號。
本發明目的之四是提供編碼這類蛋白質配體的核酸分子和用這些核酸分子在重組細胞培養物中產生用於診斷和治療的mpl結合配體。
本發明目的之五是提供蛋白質配體的衍生物和修飾形式，包括它們的胺基酸序列變異體、變異糖蛋白形式和它們的共價衍生物。
本發明目的之六是提供mpl配體與某異源蛋白組合而成的融合多肽和它們的共價衍生物。
本發明目的之七是提供mpl配體與胺基酸添加和取代後的EPO序列組合而成的變異多肽，從而生成一種能調節血小板和紅細胞遠祖細胞增殖和生長的蛋白質。
本發明另一目的是製備用於提高針對mpl配體或其融合形式的抗體的免疫原，以及獲取能結合這類配體的抗體。
參照以下說明，本發明的這些及其它目的對本領域一般技術人員來說將是顯而易見的。本發明概述本發明目的是通過提供一種分離的哺乳動物巨核細胞生成性增殖和成熟促進蛋白而達到，該蛋白被命名為「mpl配體」(ML)或「血小板生成素」(TPO)，它能刺激巨核細胞增殖、成熟和/或分化成成熟的血小板生成形式。
可以用以下方法從某天然來源純化這種基本均一的蛋白質(1)在可使待純化mpl配體分子選擇性吸附於固定化受體多肽上的條件下，將含有待純化mpl配體分子的某源血漿與某固定化受體多肽，尤其是固定在某載體上的mpl或mpl融合多肽接觸，(2)洗滌固定化受體多肽及其載體以去除未吸附物質，(3)用洗脫緩衝液從吸附有mpl配體分子的固定化受體多肽上洗脫mpl配體分子。天然來源最好是含有mpl配體的哺乳動物血漿或尿液。該哺乳動物可患有再生障礙性貧血，而固定化受體是mpl-lgG融合體。
可選的是，優選的巨核細胞生成性增殖和成熟促進蛋白是分離的和基本均一的利用合成或重組方法製得的mpl配體多肽。
本發明的「mpl配體」多肽或「TPO」最好與高度純化的基本均一的豬mpl配體多肽胺基酸序列至少具有70％的全序列一致性，而與豬mpl體基多肽「EPO結構域」至少具有80％的序列一致性。可選的是，本發明的mpl配體是具有

圖1所示成熟胺基酸序列(SEQ IDNO1)的成熟人mpl配體(hML)，或其變異體或其轉錄後修飾形式或具有與成熟人mpl配體約80％序列一致性的蛋白質。mpl配體變異體可以是片段，尤其是成熟的人mpl配體(hML)的氨基端或「EPO結構域」片段。最好，氨基端片段保留有第一至第四半胱氨酸殘基之間幾乎全部人ML序列，但可以含有該區域外的一般性添加、缺失或取代。根據這種實施方式，片段多肽可由以下結構式表示X-hML(7-151)-Y其中hML(7-151)表示Cys7至Cys151之間的人TPO(hML)胺基酸序列(包括Cys7和Cys151)；X表示Cys7的氨基或一個或多個成熟hMl的氨基端胺基酸殘基或其胺基酸殘基延伸至如Met、Tyr或至含有如蛋白酶解位置的引導序列(如Xa因子或凝血酶)；Y表示Cys151的羧基或一個或多個成熟hMl的羧基端胺基酸殘基或其延伸胺基酸殘基。
可選的是，mpl配體多肽或其片段可以與某異源多肽融合(嵌合體)。優選的異源多肽是某種細胞因子、集落刺激因子或白細胞介素或其片段，尤其是成套配體(kit-ligand，KL)、IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、EPO、GM-CSF或LIF。一種優選的異源多肽是免疫球蛋白鏈，尤其是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgD、IgM或其片段，尤其是含有IgG重鏈恆定區。
另一方面，本發明提供了一種含有分離的mpl激動劑的組合物，具有生物活性並最好能刺激標記的核苷酸(如3H-胸苷)摻入用人mpl轉染的IL-3依賴的、Ba/F3細胞DNA中。可選的是，該mpl激動劑是有生物活性的mpl配體，並最好能在鼠血小板回跳測定中刺激35S摻入循環的血小板中。合適的mpl激動劑包括hML153、hML(R153A、R154A)、hML2、hML3、hML4、mML、mML2、mML3、pML和pML2或它們的片段。
在其它實施例中，本發明提供了一種分離的能結合mpl配體的抗體。這種分離的能結合mpl配體的抗體可選地與另一種多肽融合，而這種抗體或其融合體可用於從前述來源中分離和純化用於固定mpl的mpl配體。在該實施例的另一方面內容中，本發明提供了一種用於體內或在體外檢測mpl配體的方法，包括使抗體與被疑含有配體的某種樣品(尤其是血清樣品)接觸以及檢測是否發生結合。
在其它實施例中，本發明提供了一種分離的編碼mpl配體或其片段的核酸分子，該核酸分子可選地用某種可檢測成份進行標記；並且提供了一種具有與某mpl配體編碼序列的核酸分子互補或在中度至高度嚴緊條件下能與之雜交的核酸分子。優選的核酸分子是那些人、豬和鼠mpl配體的編碼核酸，包括RNA和DNA、為基因組和cDNA。在該實施例的另一方面中，核酸分子是編碼mpl配體的DNA並且還含有一可複製載體，其中DNA與可被用該載體轉化的宿主識別的調控序列可操作地連接。可選的是，DNA是具有圖1中5′-3′(SEQ ID NO2)或3′-5′序列的cDNA或其片段。這一方面內容還包括用該載體轉化的宿主細胞(最好是CHO細胞)和一種使用DNA來產生mpl配體的方法，最好包括在轉化後宿主細胞培養物中表達編碼mpl配體的cDNA和從宿主細胞或宿主細胞培養物中回收mpl配體。以此方式製備的mpl配體最好是人mpl配體。
本發明還包括一種用於治療患有某種造血性疾病，尤其是血小板減少的哺乳動物的方法，它包括給哺乳動物服用有效治療量的某種mpl配體。可選的是，可將這種mpl配體與某種細胞因子，尤其是某種集落刺激因子或白細胞介素聯合服用。優選的集落刺激因子或白細胞介素包括成套配體(KL)、ILF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、IL-1、IL-3、IL-6和IL-11。
本發明還包括從產生TPO的微生物中分離和純化TPO(ML)的方法(1)裂解或溶解含TPO的細胞，(2)可選地將可溶性物質與含TPO的不溶性物質分離，(3)用溶解緩衝液溶解不溶性物質中的TPO，(4)將溶解的TPO與其它可溶性和不溶性物質分離，(5)在氧還緩衝液中重摺疊TPO，(6)將正確摺疊的TPO與錯誤摺疊的TPO分離。
該方法用離液劑溶解含TPO的不溶性物質，該離液劑選自胍鹽、硫氰酸鈉或脲。該方法還提出，溶解的TPO是通過離心、凝膠過濾和反相色譜中的一步或多步與其它可溶性和不溶性物質分離。該方法的重摺疊步驟提供了一種既含氧化劑又含還原劑的氧化還原緩衝液。通常，氧化劑是氧氣或含有至少一個二硫鍵的化合物，而還原劑是含有至少一個游離巰基的化合物。最好，氧化劑選自已氧化的穀胱甘肽(GSSG)和半胱氨酸，而還原劑選自已還原的穀胱甘肽(GSH)和半胱氨酸。最優選的氧化劑是已氧化的穀胱甘肽(GSSG)，而最優選的還原劑是已還原的穀胱甘肽(GSH)。而且，氧化劑的摩爾比最好等於或大於還原劑。另外氧化還原緩衝液還含有去垢劑，最好選自CHAPS和CHAPSO，含量至少為1％。氧化還原緩衝液還含有濃度以約0.1-0.5M為佳的NaCl和濃度以大於15％為佳的甘油。氧化還原緩衝液的pH以pH7.5-pH9.0為佳，重摺疊步驟在4℃進行12-48小時。重摺疊步驟產生具有生物活性的TPO，其中在最靠近EPO結構域氨基端的Cys和最靠近其羧基端的Cys之間形成一個二硫鍵。
本發明還包括一種從微生物中純化具有生物活性TPO的方法，它包括(1)至少溶解微生物的胞外膜，(2)用離液劑處理含TPO的裂解物，(3)重摺疊TPO，(4)從正確摺疊的TPO中分離去雜質和錯誤摺疊的TPO。附圖簡述圖1顯示推斷的人mpl配體(hML)cDNA的胺基酸序列(SEQID NO1)和編碼的核苷酸序列(SEQ ID NO2)。在每一行的開頭對核苷酸進行編號。5』和3』非翻譯區用小寫字母表示。從成熟mpl配體(ML)蛋白序列的Ser1開始，在序列上方對胺基酸殘基進行編號。假定的外顯子3的邊界用箭頭標出，並加框標出潛在的N-糖基化位點。以序列上方的黑點標出半胱氨酸殘基。劃線序列對應於由純化自豬血漿的mpl配體測得的N端序列。
圖2顯示用3H-胸苷摻入的實驗過程。為了測定各種來源中mpl的存在，mpl P Ba/F3細胞在缺乏IL-3的條件下，在溼度培養箱中37℃、5％CO2和空氣下培養24小時。在IL-3飢餓培養後，將細胞鋪平在含有或不含有稀釋樣品的96孔培養板上，在細胞培養箱中培養24小時。將20μl含1μCi3H-胸苷的無血清RPMI培養基加入每一孔中進行最後6-8小時的培養。然後在96孔濾板上收穫細胞並用水洗滌。然後對濾板進行計數。
圖3顯示了鏈黴蛋白酶、DTT和高溫對APP刺激Ba/F3-mpl細胞增殖的效應作用。為了用鏈黴蛋白酶消化APP，將鏈黴蛋白酶(Boehringer Mannheim公司)或牛血清白蛋白與Affi-gel10(Bio-rad公司)偶聯後，與APP分別在37℃孵育18小時。接著，離心去除樹脂而對上清液進行分析。APP還被加熱至80℃4分鐘或製成100μM的DTT後透析PBS。
圖4顯示從Phenyl-Toyopearl，Blue-Sepharose和Ultra-lind-mpl柱上的mpl配體活性物洗脫。mpl親和柱上的洗脫組分4-8是峰值活性部分。
圖5顯示Ultralink-mpl洗脫組分的SDS-PAGE。200μl每一洗脫組分2-8中分別加入1ml-20℃、含1mM HCl的丙酮。3小時後，樣品在-20℃進行離心，然後對所得的沉澱在-20℃用丙酮洗滌兩次。接著將丙酮洗滌後的沉澱溶於30μl SDS-溶解緩衝液中，製成100μM DTT並在90℃加熱5分鐘。然後將樣品在4-20％SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分離，通過銀染色可目測到蛋白質。
圖6顯示SDS-PAGE上的mpl配體活性物。在非還原條件下，mpl-親和柱的洗脫組分6在4-20％的SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分離。電泳後將凝膠切割成12個等分區，然後如實施例所述進行電洗脫。將電洗脫後的樣品透析入PBS，以1/20的稀釋液進行分析。用於校準凝膠的分子量(Mr)標準是Novex Mark12標準物。
圖7顯示已耗盡APP的mpl配體對人巨核細胞生成的影響。將1ml通過1ml mpl-親和柱(700μg mpl-IgG/ml NHS-superose，Pharmacia公司)來製備已耗盡APP的mpl配體。人外周幹細胞被製成10％APP或10％已耗盡APP的mpl的配體並培養12天。如實施例所述定量分析巨核細胞生成。
圖8顯示通過APP mpl-IgG對人巨核細胞生成刺激作用的影響。人外周幹細胞被製成10％APP並培養12天。在第0，2，4天加入mpl-IgG(0.5μg)或ANP-R-IgG(0.5μg)。12天後，如實施例所述定量分析巨核細胞生成。括號中給出實際重複數據表示重複樣品的平均值。
圖9顯示了編碼mpl配體的人基因組DNA的390bp片段雙鏈。還顯示了「外顯子3」的推導胺基酸序列(SEQ ID NO3)，編碼序列(SEQ IS NO4)和它的互補序列(SEQ ID NO5)。
圖10顯示了成熟的人mpl配體(hML)(SEQ ID NO6)和成熟的人紅細胞生成素(hEPO)(SEQ ID NO7)的推導胺基酸序列。將人mpl配體的假定胺基酸序列與人紅細胞生成素的序列排齊。加框標出相同的胺基酸，為對齊而引入的空檔用虛線表示。用下劃線標出潛在的N-糖基化位置，對hML用實線，對hEPO用虛線。對紅細胞生成素活性來說是關鍵性的兩個半胱氨酸用大黑點標出。
圖11顯示成熟的人mpl配體同種型的推導胺基酸序列hML(SEQ ID NO6)、hML2(SEQ ID NO8)、hML3(SEQ ID NO9)和hML4(SEQ ID NO10)。加框標出相同的胺基酸，為對齊而引入的空檔用虛線表示。
圖12A，12B和12C顯示了人mpl配體對Ba/F3-mpl細胞增殖作用的影響(A)，用放射性標記的特異性針對巨核細胞糖蛋白GPIIbIIIa的鼠IgG單克隆抗體定量分析體外人巨核細胞生成(B)和在血小板回跳測定中檢測鼠血小板生成(C)。
293細胞利用CaPO4法(Gorman，Cin DNA CloningA NewApproach 2143-190〔1985〕)單獨以pRK5載體、以pRK5-hML或以pRK5-ML153(pRK5-ML153是利用PCR在hML的殘基153後引入一個終止密碼子而產生)轉染過夜。然後如實施例1中所述在條件培養基中培養36小時，分析Ba/F3-mpl細胞增殖(A)或體外人巨核細胞生成(B)的刺激作用。利用125I放射性標記的針對巨核細胞特異糖蛋白GPIIbIIIa的鼠IgG單克隆抗體定量分析巨核細胞生成(如Grant等，Blood 691334-1339〔1987〕所述)。利用McDon-ald，T.P.在Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1441006-10012(1973)中所述的回跳血小板生成測定分析部分純化的重組ML(rML)對體內血小板生成的作用(C)。部分純化的rML是從200ml含重組ML的條件培養基製得。將培養基通過在PBS中平衡的2mlBlue-Separose柱，用PBS洗柱，用含2M脲和2M NaCl的PBS洗脫。將活性洗脫組分透析入PBS，用無內毒素的BSA製成1mg/ml濃度。每ml樣品含少於1單位的內毒素。給小鼠注射64,000、32,000或16,000單位的rML或單獨的賦形劑。每組6個小鼠。給出每一組的平均值和標準差。利用比較中值的2具尾T-測驗測定p值。
圖13比較了人mpl配體同種型和變異體在Ba/F3-mpl細胞增殖測定中的作用。如實施例1所述在各種稀釋比時對hML，模擬試驗、hML2、hML3、hML(R153A、R154A)、和hML153進行了測定。
圖14A，14B和14C顯示了人mpl配體(hML)或人TPO(hT-PO)的推導胺基酸序列(SEQ ID NO1)和人基因組DNA編碼序列(SEQ ID NO11)。在每行的開頭為核苷酸和胺基酸編號。
圖15顯示了純化的293-rhML332和純化的293-rhML153的SDS-PAGE。
圖16顯示了核苷酸序列cDNA編碼(SEQ ID NO12)和某種鼠ML同種型的開放讀框的推導胺基酸序列(SEQ ID NO13)。該成熟鼠mpl配體同種型含331個胺基酸殘基，比假定的全長mML少4個，因此表示為mML2。核苷酸編號在每行的開頭。從Ser1開始在序列上方為胺基酸殘基編號。下劃線標出潛在的N-糖基化位點。用序列上方的黑點標出半胱氨酸殘基。
圖17顯示該鼠ML同種型(mML)的cDNA序列(SEQ IDNO14)和假定的蛋白質序列(SEQ ID NO15)。核苷酸編號在每行開頭。胺基酸編號在序列上方，從Ser1開始。該成熟鼠mpl配體同種型含335個胺基酸殘基，並據信是全長mpl配體，標為mML。用虛線標出信號肽序列，用箭頭標出可能的切割位點。5′和3′的非翻譯區用小寫字母表示。可變拼接產生的兩處缺失(mML2和mML3)用下劃線標出。用一黑點標出4個半胱氨酸殘基。7個潛在的N-糖基化位點加框標出。
圖18比較了人ML同種型hML3(SEQ ID NO9)和鼠ML同種型mML3(SEQ ID NO16)推導的胺基酸序列。將人mpl配體的假定胺基酸序列與鼠mpl配體序列排齊。相同的胺基酸被加框，為對齊引入的空檔用虛線標出。在每行開頭對胺基酸編號。
圖19比較了鼠ML(SEQ ID NO17)，豬ML(SEQ ID NO18)和人ML(SEQ ID NO6)的成熟ML同種型的假定胺基酸序列。將胺基酸序列排齊，其中有用虛線標出為對齊而引入的空檔。在每行開頭給胺基酸編號，加框標出相同的殘基。用加陰影的方框標出潛在的N-糖基化位置，用點標出半光氨酸殘基。表示潛在的蛋白酶切割位點的保守性雙鹼性胺基酸基序被加以下劃線。在三種類中都出現的4個胺基酸缺失(ML2)用粗體方框標出。
圖20顯示了某種豬ML同種型(pML)的cDNA序列(SEQ IDNO19)和假定成熟蛋白序列(SEQ ID NO18)。該豬mpl配體同種型含332個胺基酸殘基，並據信是全長的豬mpl配體，命名為pML。在每行開頭為核苷酸編號。在序列上方給胺基酸殘基編號，從Ser1開始。
圖21顯示了某種豬ML同種型(pML2)的cDNA序列(SEQID NO20)和假定的成熟蛋白序列(SEQ ID NO21)。該豬mpl配體同種型含328個胺基酸殘基，比全長豬mpl配體少4個，命名為pML2。在每行開頭給核苷酸編號。在序列上方給胺基酸殘基編號，從Ser1開始。
圖22比較了全長豬ML同種型pML的推導胺基酸序列(SEQID NO18)和命名為pML2的豬ML同種型的推導胺基酸序列(SEQ ID NO21)。將pML的假定胺基酸序列與pML2的序列排齊。給相同的胺基酸殘基加框，虛線表示為對齊而引入的空檔。在每行開頭給胺基酸編號。
圖23顯示了用於轉染宿主CHO-DP12細胞來產生CHO-rhTPO332的質粒pSV15.ID.LL.MLORF(「全長」或TPO332)的有關特性。
圖24顯示了用於轉染宿主CHO-DP12細胞來產生CHO-rhTPO153的質粒pSV15.ID.LL.MLEPO-D(「截短的」或TPO153)的有關特性。
圖25A、25B和25C顯示了E.coli-rhTPO(Met-1，153)在正常小鼠體內對血小板(A)、紅細胞(B)和白細胞(C)的作用。給兩組6個一組的雌性C57 B6小鼠每天注射PBS緩衝液或0.3μg E.coli-rhTPO(Met-1，153)(100μl sc.)。在第0天和第3-7天，由眶竇抽取40μl血。該血樣被立即稀釋在10ml商購稀釋劑中並在SerronoBaker Hematology Analyzer 9018上獲取全血計數。數據表示為平均值的均值±標準差。
圖26A，26B和26C顯示了E.coli-rhTPO(Met-1，153)在亞致死照射過的小鼠體內對血小板(A)、紅細胞(B)和白細胞(C)的作用。用來自137Cs的750cGyγ射線亞致死照射兩組10個雌性C57 B6小鼠，並每天注射PBS緩衝液或0.3μg E.coli-rhTPO(Met-1，153)(100μl sc.)。在第0天和以後的間隔時間點，由眶竇抽取40μl血。該血樣被立即稀釋在10ml商購稀釋劑中並在Serrono BakerHematology Analyzer 9018上獲取全血計數。數據表示為平均值的均值±標準差。
圖27A、27B和27C顯示了CHO-rhTPO332在正常小鼠體內對(A)血小板、(B)紅細胞和(C)白細胞的作用。給兩組6個一組的雌性C57 B6小鼠每天注射PBS緩衝液或0.3μg CHO-rhTPO332(100μl sc.)。在第0天和第3-7天，由眶竇抽取40μl血。該血樣被立即稀釋在10ml商購稀釋劑中並在Serrono Baker HematologyAnalyzer 9018上獲取全血計數。數據表示為平均值的均值±標準差。
圖28顯示了從各種細胞系獲得的各種形式的rhTPO劑量反應曲線。對取自以下細胞系的rhTPO繪製劑量反應曲線來自CHO(來自中國倉鼠卵巢細胞的全長形式)的hTPO332；hTPOMet-1153(E-coli衍生的截短形式，有一個N-端甲硫氨酸)；hTPO332(來自人293細胞的全長TPO)；Met-less 155 E.coli(來自E.coli的截短形式〔rhTPO155〕，無末端甲硫氨酸)。用各種rhTPO分別給各組6個一組的C57B6小鼠注射7天。每天從眶竇抽取40μl血進行全血計數。圖上表示的數據是所見出現在第7天的最強作用，只有一個例外(Met153 E-coli)。而在前述的「Met 153 E-coli」組中，最強作用出現在第5天。數據表示為平均值的均值±標準差。
圖29顯示了比較在CHO細胞中產生的全長和「截短」形式的rhTPO與來自E.coli截短形式的活性的劑量反應曲線。給6個一組的C57B6雌性小鼠每天注射0.3μg的各種類型rhTPO。在第2-7天，由眶竇抽取40μl血進行全血計數。處理組是來自E.coli的截短形式TPO rhTPO153；全長TPO rhTPO332(混合組份)含約80-90％全長和10-20％截短形式；TPO332(30K組份)＝從原混合製劑純化的截短組份；TPO332(70K組份)＝從原混合製劑純化的全長TPO組份。數據表示為平均值的均值±標準差。
圖30是表示測定TPO的KIRA ELISA實驗的示意圖。該圖顯示了MPL/Rse.gD嵌合體和親代受體的相關部分以及最終結構(圖的右側)和表示測定的有關步驟流程圖(圖的左側)。
圖31是表示程序中每一步的KIRA ELISA測定流程圖。
圖32A-32L提供了在實施例17中用於表達Res.gD的pSVI17.ID.LL表達載體的核苷酸序列(SEQ ID NO22)。
圖33是製備質粒pMP1的圖示。
圖34是製備質粒pMP21的圖示。
圖35是製備質粒pMP151的圖示。
圖36是製備質粒pMP202的圖示。
圖37是製備質粒pMP172的圖示。
圖38是製備質粒pMP21O的圖示。
圖39是來自pMP21O質粒文庫中5個最佳TPO表達克隆(SEQ ID NO23、24、25、26、27和28)的列表。
圖40是製備質粒pMP41的圖示。
圖41是製備質粒pMP57的圖示。
圖42是製備質粒pMP251的圖示。
本發明的詳細描述1.定義一般情況下，下列詞語用於說明書、實施例和權利要求書時，具有以下所述定義。
「離液劑」指一種處於水溶液中並達到適合濃度時，能引起蛋白質空間構型和構象變化的化合物，這種變化是通過至少部分地破壞維繫蛋白質正常二級和三級結構的力來實現。這些化合物包括尿素，鹽酸胍和硫氰酸鈉等。通常要求這些化合物達到4-9M的高濃度時才能對蛋白質的構象發生作用。
「細胞因子」表示由一個細胞群分泌的蛋白質的一般性術語，該類蛋白質作為胞間介體作用於其他細胞。例如淋巴因子、單核因子和傳統的多肽激素等。其中包括生長激素、胰島素樣生長因子、人生長激素、N-甲硫氨醯人生長激素、牛生長激素、甲狀旁腺素、甲狀腺素、胰島素、胰島素原、松馳素、鬆弛素原、糖蛋白激素(如促卵泡素[FSH]、促甲狀腺素[TSH]、促黃體素[LH])、造血生長因子、肝生長因子、成纖維細胞生長因子、促乳素、胎盤促乳素、α腫瘤壞死因子(TNF-α和TNF-β)、穆勒氏抑制物、鼠促性腺素關聯肽、抑制素、活化素、血管內皮生長因子、整聯蛋白、神經生長因子(如NGF-β)、血小板生長因子、轉化生長因子TGFs(如TGF-α和TGF-β)、胰島素樣生長因子-I和-II、促紅細胞生成素(EPO)、骨誘導因子、幹擾素(如α、β、γ幹擾素)、集落刺激因子(CSFs)(如巨噬細胞集落刺激因子[M-CSF]、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子[GM-CSF]、粒細胞集落刺激因子[G-CSF])、白細胞介素(IL′s)(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12)和其他多肽因子(如白細胞抑制因子[LIF]、幹細胞生長因子[SCF]和成套配體)。本文中的「細胞因子」術語表示各種從自然來源或重組細胞培養物中得到的蛋白質。類似地，這一術語也包括具有生物活性的等價物，例如其胺基酸序列中一個或多個胺基酸不同或糖基化類型及程度不同。
「mpl配體」、「mpl配體多肽」、「ML」、「血小板生成素」或「TPO」在本文中互換使用，並包括任何具有可與mpl結合的特性的多肽。mpl是細胞因子受體超家族中的一員，並具備如下所述的ML的生物學特性。其中一種典型的生物學特性是能促進標記的核苷酸(如3H-胸苷)摻入用人mpl P轉染的、依賴IL-3的Ba/F3細胞DNA中。另一種典型的生物學特性是在鼠血小板回跳分析實驗中，能促進35S摻入循環的血小板。這個定義主要指某種多肽，這種多肽從mpl配體來源(如發育不全的豬血漿)或其他來源(如包括人在內的其他動物種類)中分離到，或者通過重組或合成方法製備，同時該定義也包含了包括功能性衍生物、片段、等位基因、同種型及其類似物在內的多種形式。
「mpl配體片段」或「TPO片段」指除去了一個或多個胺基酸殘基或糖單元的、自然產生成熟全長mpl配體或TPO序列中的一段。其中，胺基酸殘基的去除可以發生在肽鏈上的任何位置，包括N末端、C末端或肽內部。該片段至少具備一種與mpl配體相同的生物學特性。這種mpl配體片段一般有一個至少10、15、20、25、30或40個胺基酸殘基的連續序列，與從哺乳動物中分離的mpl配體，包括從發育不全的豬血漿中分離的配體或者人或鼠的mpl配體，尤其是其促紅細胞生成素(EPO)結構域，序列完全相同。N末端片段的代表性例子有hML153或TPO(Met-11-153)。
「mpl配體變異體」或「mpl配體序列變異體」在本文中表示下述具有生物活性的mpl配體，它與具有如圖1(SEQ ID NO1)所示推斷序列的、從重組細胞培養物或發育不全的豬血漿中分離到的mpl配體或人配體並不100％地有相同的序列。通常，一個具有生物活性的mpl配體變異體應至少有70％的胺基酸序列與從發育不全的豬血漿中分離到的mpl配體或成熟的鼠或人配體及其片段相同(見圖1[SEQ ID NO1])，達到至少約75％則較好，至少約80％則更好，至少約85％還要好，至少約90％甚至還要好，最好至少約95％相同。
「嵌合mpl配體」表示由全長mpl配體或其一個或多個片段融合或結合於一條次要的異源多肽或其一個或多個片段中而組成的一種多肽。這種嵌合體至少有一種生物學特性與mpl配體相同。那條次要的多肽一般為細胞因子、免疫球蛋白或其片段。
「分離的mpl配體」、「高純度mpl配體」和「基本均一的mpl配體」可互換使用，表示從某個mpl配體源純化或由重組或合成方法得到的mpl配體，其中基本上不含其他肽或蛋白質。(1)用轉杯式測序儀或非常商業化的市售胺基酸測序儀或根據本申請歸檔後公布的改進方法從N末端或某段內部胺基酸序列中獲取至少為15、較好為20個的胺基酸殘基，或者(2)用考馬斯亮藍或較佳地用銀染法，在非還原或還原條件下，以SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳來達到均一性。在這裡，均一性表示雜蛋白的汙染低於5％。
「生物學特性」一詞在與「mpl配體」或「分離的mpl配體」連同使用時，表示具有由mpl配體(無論是自然的還是變性後的構象)或其片段直接或間接地引起或行使的血小板生成素活性或體內效應子功能或抗原性功能或活性。效應子功能包括mpl結合活性和任何載體結合活性、mpl的興奮作用和拮抗作用尤其是增殖信號的轉導，包括複製、DNA調節功能、其他細胞因子生物學活性的調節，受體(尤其是細胞因子)激活、正向或負向調節、細胞生長或分化等。抗原性功能表示擁有一個能與由天然mpl配體得到的抗體起交叉反應的表位或抗原位點。mpl配體多肽的主要抗原性功能是它與由分離自發育不全的豬血漿mpl配體得到的抗體結合，其親和性至少有106l/mole。通常，該親和性至少為107l/mole。最佳情況下，具有抗原活性的mpl配體多肽是一種與由具備上述某個效應子功能的mpl配體得到的抗體相結合的多肽。用於確定「生物活性」的抗體是通過以下方法得到的兔多克隆抗體首先在Freund′s完全佐劑中，製備從重組細胞培養物或發育不全的豬血漿中分離的mpl配體，然後皮下注射製備物，再向腹膜內注射製備物以增強免疫應答，直至mpl配體抗體的效價達到平臺區。
「生物活性」一詞在與「mpl配體」或「分離的mpl配體」連同使用時，表示本文中所描述的一種mpl配體或多肽，其顯示血小板生成素活性或者具備從發育不完全的豬血漿分離的或由重組細胞培養物表達的mpl配體的某個效應子功能。本文中所知的mpl配體或多肽的一個基本功能是與mpl結合併能促進標記的核苷酸(3H-胸苷)摻入用人mpl P轉染的、依賴IL-3的Ba/F3細胞DNA中。本文中所知的mpl配體或多肽的另一個效應子功能是在鼠血小板回跳測定中能促進35S摻入循環的血小板。還有一個已知的mpl配體的效應子功能是能促進體外人巨核細胞生成，可用放射性標記的針對巨核細胞糖蛋白GPIIbIIIa的單克隆抗體進行定量。
關於mpl配體序列的「胺基酸序列同一性百分率」，在本文中表示候選序列中的胺基酸殘基與具備如圖1(SEQ ID NO1)所示胺基酸推斷序列的、從發育不全的豬血漿中分離的或者鼠或人配體的mpl配體序列中的殘基完全相同的百分比。為了達到序列同一性的最大百分比，必要時，可在比較前使序列線性化並引入裂口。比較時，任何保守性置換都不作為序列同一性的一部分來分析。mpl配體序列的N末端、C末端或內部的延伸、缺失或插入被認為不影響序列同一性或同源性。因此，一些典型的具有生物活性的mpl配體多肽被認為具有完全相同的序列，包括前mpl配體原、mpl配體原和成熟的mpl配體。
「mpl配體的微量測序」可由任一足夠靈敏的合適的標準程序來完成。在一個這樣的方法中，由SDS凝膠或者最後的高效液相色譜(HPLC)步驟獲得的高純度多肽用配備了一臺120A乙內醯苯硫脲(PTH)胺基酸分析儀的470A型號Applied Biosystems氣相測序儀通過自動Edman(異硫氰酸苯酯)降解直接測序。另外，由化學製劑(如溴化氰、羥胺、2-硝基-5-硫氰酸苯酯)或酶(如胰蛋白酶、膠原蛋白酶、葡萄球菌蛋白酶)消化及純化(如HPLC)後所得到的mpl配體片段也可進行類似的測序。PTH胺基酸的分析使用ChromPerfect數據系統(Justice Innovations，Palo Alto，CA)。序列解譯由Henzel等人在J.Chromatography，40441-52中提及的VAX 11/785 Digital Equipment Co.的計算機來完成。或者，可將一份HPLC組分在5-20％SDS聚丙烯醯胺凝膠上電泳後，電轉移至PVDF膜上(ProBlott，AIB，Foster City，CA)，再用考馬斯亮藍染色(Mat-surdiara，J.Biol.Chem.，26210035-10038)。通過染色鑑別的特異性蛋白從染色斑中切出，並用如上所述的氣相測序儀進行N末端測序。對於內部的蛋白質序列，先將HPLC組分在真空(SpeedVac)中乾燥，然後在合適的緩衝液中重懸，再用溴化氰、賴氨酸特異的酶Lys-C(Wako Chemicals，Richmond，VA)或天冬氨酸特異的酶Asp-N(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)進行消化。消化後，對得到的肽鏈以混合物形式測序或在氣相測序以前，在一個0.1％TFA(三氟醋酸)丙醇梯度的C4柱中進行HPLC分離。
「血小板減少」指血液中的血小板數少於150×109/每升。
「血小板生成活性」是指一種能加速巨核細胞或巨核細胞前體增殖、分化和/或成熟成為血小板生成形式的生物活性。這種生物活性可用多種方法測定，如體內鼠血小板回跳合成測定，用針對人白血病成巨核細胞系[CMK]的抗血小板免疫測定[抗GPIIbIIIa]來進行血小板細胞表面抗原誘導分析，以及一個成巨核細胞系(DAMI)的多倍性化誘導。
「血小板生成素」(TPO)是一種具有血小板生成活性或能夠增加哺乳動物血清中血小板數的化合物。TPO在較佳情況下能夠增加至少10％的內源血小板數，50％則更佳，而在最佳情況下，可使人血液中的血小板數提高到150×109/每升以上。
「分離的mpl配體核酸」是一段RNA或DNA，其中含有不少於16個、較佳地20個或更多序貫的核苷酸鹼基，該序列具備如下特點能編碼具有生物活性的mpl配體及其片斷，與RNA或DNA互補，或與RNA或DNA雜交並且在溫和和嚴緊條件下都能保持穩定結合。這種RNA或DNA應該至少不被一個在自然源中通常與其結合的汙染源核酸所汙染，並且較佳地基本上不含其他哺乳動物RNA或DNA。在這裡，「至少不被一個通常與其結合的汙染源核酸所汙染」包含如下情況核酸存在於源中或自然細胞中但所處染色體位置不同，或者是位於側翼的、一般地在源細胞中找不到的核酸序列。分離的mpl配體核酸的一個例子是一段RNA或DNA，編碼具有生物活性的mpl配體，與人、鼠或豬的mpl配體至少有75％的序列相同，較佳地至少80％，更佳地至少85％，還要佳地為90％，最佳地為95％。
「控制序列」用於涉及表達時，表示在一個特定的宿主有機體中，是一段可操作地連於編碼序列且對該編碼序列表達所必需的DNA序列。適合於原核細胞的控制序列包括啟動子、任選的某個操縱子序列、核糖體結合位點、可能還有一些至今未知的序列。真核細胞已知的控制序列有啟動子、聚腺苷酸信號和增強子。
「可操作地連接」涉及核酸時，意味著該核酸與另一個核酸序列處於功能上相關的位置。例如，如果某種DNA表達的前體蛋白參與了多肽的分泌，那麼這個表達前序列或分泌前導區的DNA就與表達該多肽的DNA可操作地連接；如果一個啟動子或增強子對編碼序列的轉錄有影響，那它與該編碼序列是可操作地連接；或者如果一個核糖體結合位點被置於一個編碼序列上以促進翻譯，那麼它們之間也是可操作地連接。通常，「可操作地連接」要求被連接的DNA序列之間相鄰近。對於分泌前導區，要求相鄰近並處於可讀狀態。但是，增強子並不一定要求鄰近。連接是通過合適的限制性位點相聯而完成。如果這樣的位點並不存在，則根據常規技術使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭來完成。
「外源的」指某個元件時，表示來自於細胞外的核苷酸序列，或者與細胞同源，但是在宿主細胞核苷酸的某一位置中，通常不能發現該元件。
「細胞」、「細胞系」和「細胞培養物」在本文中可互換使用，該定義包含了一個細胞或細胞系的所有子代。因此，類似於「轉化體」和「轉化細胞」的術語包括了原代母細胞及其衍生培養物，而不考慮傳代的次數。應該理解，由於誘導或自發突變，並非所有的子代都有完全相同的DNA序列。那些具有與篩選出的原始轉化細胞相同功能和生物活性的突變後代同樣也包括在內。當試圖指某種特殊表示時，該詞可根據上下文內容來理解。
「質粒」是一種能自我複製的環狀DNA分子，它具有獨立的複製起始點。本文中，用「p」後跟大寫字母和/或數字來表示。本文中的最初質粒來源是商購獲得、在沒有限制的情況下從公共途徑獲得或根據已公開的程序以上述二種質粒為基礎進行構建。另外，其他相當的質粒是本領域中已知的，並且對一般的技術人員而言是顯而易見的。
「限制酶消化」對DNA而言，表示在一種酶的催化作用下，DNA內部的磷酸二酯鍵斷裂，而酶的作用只限於DNA序列上的特定位點。這種酶稱為「限制性內切核酸酶」。每個限制性內切核酸酶識別一段特異的DNA序列，即雙重對稱的「限制酶切位點」。本文中使用的各種限制酶都可以商購，而且可根據供應商提供的反應條件、輔助因子和其他條件來使用。通常，限制酶用下述的縮寫形式來表示第一個大寫字母後跟其他字母表示微生物，從中獲得限制酶，然後是一個數字表示特定的酶。限制酶消化的條件通常為，在約20微升緩衝溶液中，1微克質粒或DNA片段加入約1-2單位酶。特定的限制酶作用的合適緩衝液和底物的量由製造商指定。常規的步驟是37℃溫育約1小時，但應根據供應商的建議加以改動。溫育後，蛋白質和多肽用酚和氯仿抽提來除去，被消化的核酸則用乙醇沉澱的方法從緩衝液中回收。限制酶消化後，可以用細菌鹼性磷酸酶對5′末端磷酸進行水解作用，以防止一個DNA片段的兩個限制酶切末端「環化」或形成一個閉合環而阻止其他DNA片段在限制酶切位點的插入。除非有另外的要求，否則質粒消化後不需要進行5′末端的去磷酸化。去磷酸化的常規步驟和試劑可參見Sambrook等人所著《分子克隆實驗室手冊》中1.56-1.61部分[New YorkCold Spring Har-bor Laboratory Press，1989]。
限制酶消化後，DNA片段的「回收」或「分離」是指通過聚丙烯醯胺或瓊脂糖電泳使消化產物分離，根據與已知分子量的標記DNA片段比較電泳遷移率來鑑別目的片段，切出含有目的片段的凝膠塊，並將該凝膠塊中的DNA分離出來。這個程序已經被廣泛地掌握。例如，可參見Lawn等人，Nucleic Acids Res.，96103-6114以及Goeddel等人，Nucleic Acids Res.，84057。
「Southern分析」或「Southern印跡法」是這樣一種方法DNA或含DNA的組合物經限制性內切酶消化後，通過與已知標記的寡核苷酸或DNA片段雜交證實DNA序列的存在。Southern分析的步驟通常依次為瓊脂糖凝膠電泳分離DNA消化產物，電泳分離後使DNA變性，並將得到的DNA轉移到硝酸纖維素膜、尼龍膜或其他合適的膜上，分析與射性標記、生物素標記或酶標記探針的雜交情況。參見Sambrook等人著作(同上)中9.37-9.52部分。
「Northern分析」或「Northern印跡法」則是一種通過與一個已知探針如寡核苷酸、DNA片段、cDNA及其片段或RNA片段雜交鑑定RNA序列的方法。探針的標記可用放射性同位素(如32P)、生物素或酶。通常，經瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳分離後，待分析的RNA被轉移到硝酸纖維素膜、尼龍膜或其他合適的膜上與探針雜交。使用的標準技術是本領域中廣為知道的。參見Sambrook等人著作(同上)中的7.39-7.52部分。
「連接」是二個核酸片段間形成磷酸二酯鍵的過程。二個片段的連接要求彼此的末端相互匹配。在某些情況下，末端間的匹配可通過內切酶的消化直接實現。但是，在內切酶消化以後，必需將通常產生的交錯末端轉變為平整末端使之更適合於連接。為產生平整末端，須將DNA在15℃於合適緩衝液中，用10單位DNA聚合酶I Klenow片段或T4 DNA聚合酶並在4種脫氧核糖核苷三磷酸存在下至少作用15分鐘。然後，用酚-氯仿抽提和乙醇沉澱來純化DNA。將用於連接的DNA片段等摩爾數地置於溶液中。溶液中還應含有三磷酸腺苷(ATP)、連接酶緩衝液和一種連接酶如T4 DNA連接酶，其含量約每0.5微克DNA加入約10單位。當DNA與某個載體連接時，先要通過合適限制性內切酶的消化使載體線性化。然後，用細菌磷酸酶或小牛小腸磷酸酶處理線性化片段，以防止在連接過程中發生自身連接。
從細胞中「製備」DNA表示從宿主細胞培養物中分離質粒DNA。大規模和小規模的質粒製備是常用的DNA製備方法，參見Sambrook等人著作(同上)中的1.25-1.33部分。製備後的DNA可用本領域中廣為知道的方法來純化，參見Sambrook等人著作(同上)中的1.40部分。
「寡核苷酸」是用已知化學方法合成的單鏈或雙鏈多聚脫氧核糖核苷酸短鏈。已知的化學合成方法有使用固相技術(參見1988年5月4日發表的EP266,032)或通過脫氧核糖核苷H-膦酸酯中間物(參見Froehler等人，Nucl.Acids Res.，145399-5407)的磷酸三酯、亞磷酸鹽或亞磷醯胺化學方法。其它方法有如下所述的聚合酶鏈反應和其他自動引物法以及固相支持物上的寡核苷酸合成。所有這些方法的敘述見於Engel等人，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.，28716-734(1989)。如果已知基因的整個核酸序列或者得到了編碼鏈的互補核酸序列，就可以使用上述方法。另一種選擇是，如果已知靶胺基酸序列，則可根據每個胺基酸殘基對應的最佳密碼子來推斷潛在的核酸序列。合成後的寡核苷酸通過聚丙烯醯胺凝膠進行純化。
「聚合酶鏈反應」或簡稱「PCR」是一種將微量特定的核酸(RNA和/或DNA)擴增的過程或技術。參見1987年7月28日公布的美國專利號4,683,195。通常，需要從感興趣區段的末端或末端外側獲得序列情況，以設計出寡核苷酸引物。引物與待擴增的模板的互補鏈序列完全相同或相似，使得兩個引物的5′末端核苷酸能夠與擴增物質末端相結合。PCR能夠用來擴增特定RNA序列、整個基因組DNA中特定的DNA序列、從總細胞RNA轉錄得到的cDNA、噬菌體或質粒序列等。參見Mullis等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，51263(1987)；Erlich等人編輯，PCR Technology，(Stock-ton Press，NY，1989)。在本文中，PCR被認為是一種(但不是唯一的一種)擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應方法，包括使用已知的核酸作為引物和用一種核酸聚合酶來擴增或產生特定的核酸片段。
「嚴緊條件」指(1)在低離子強度和高溫下進行洗滌，如50℃時0.015M NaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基磺酸鈉(SDS)，或者(2)在雜交過程中使用甲醯胺等變性劑，如42℃下50％(v/v)的甲醯胺中含有0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM pH6.5的磷酸鈉緩衝液及750mM NaCl、75mM檸檬酸鈉；又如42℃下50％甲醯胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5×Denhardt＇s溶液，超聲處理的鮭精DNA(50微克/毫升)、0.1％SD和10％硫酸葡聚糖，並在42℃下使用0.2×SSC和0.1％SDS洗滌。
「中等嚴緊條件」指使用的洗滌溶液和雜交條件比上述嚴緊條件低，(如溫度、離子強度和SDS百分比濃度)，參見Sambrook等人著作(同上)。中等嚴緊條件的一個例子是在含有以下成份的溶液中37℃溫育過夜，20％甲醯胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt′s溶液、10％硫酸葡聚糖和20微克/毫升變性的剪切鮭精DNA，隨後用1×SSC在37-50℃下洗滌濾膜。熟練的技術人員懂得如何根據探針長度等類似因素調整溫度、離子強度等條件。
「抗體」(Abs)和「免疫球蛋白(Igs)」是有相同結構特徵的糖蛋白。抗體對特定的抗原有特異性結合作用，而免疫球蛋白包括抗體和其他與抗體類似但沒有抗原特異性的分子。例如，後者的多肽鏈由淋巴系統以低水平產生而由骨髓瘤以增強水平產生。
「天然抗體和免疫球蛋白」通常是約150,000道爾頓的異源四聚體糖蛋白。它由兩條完全相同的輕鏈(L)和兩條完全相同的重鏈(H)構成。每條L鏈都與一條H鏈通過共價二硫鍵結合，而不同免疫球蛋白同種型的兩條重鏈之間的二硫鍵數目不同。每條輕鏈和重鏈各自都有規則隔開的鏈內二硫鍵橋。每條重鏈的一端有一個可變區(VH)，後跟若干恆定區。每條輕鏈的一端有一個可變區(VL)，另一端有一個恆定區。輕鏈的恆定區與重鏈的第一個恆定區並排，而輕鏈的可變區與重鏈的可變區並排。相信在輕鏈和重鏈的可變區之間有一個由特定胺基酸殘基形成的界面。(參見Clothia等人，J.Mol.Bi-ol.，186651-663；Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，824592-4596)。
術語「可變的」指各種抗體可變區的特定部分序列普遍相異，從而被用作使每種特定抗體和它的特定抗原間產生特異性結合。然而，在抗體的可變區中，序列的可變性並不是平均分布的。可變性集中在每條輕鏈和重鏈可變區的三個稱作互補決定區(CDRs)或超變區的區段。可變區較高保守性部分則稱作構架(FR)。每條天然輕鏈和重鏈有四個主要為β-摺疊構型的FR區，由三個成環狀的或在某些情況下形成部分β-摺疊結構的CDRs區連接。每條鏈的CDRs區通過FR區緊密地聚集在一起，並和其他鏈的CDRs構成抗體的抗原結合位點(參見Kabat等人所著的Sequneces of Proteins of Immuno-logical Interest，National Institute of Health，Bethesda，MD)。恆定區並不直接參與抗原和抗體的結合，但能表現多種效應子功能，如在抗體依賴的細胞毒中抗體的參與。
經木瓜蛋白酶消化抗體後，產生兩個完全相同的抗原結合片段「Fab」和一個殘餘「Fc」片段。每個Fab片段帶有一個抗原結合位點，而Fc片段易於結晶。胃蛋白酶處理抗體則得到一個「F(ab′)2」片段，帶有兩個抗原結合位點，並仍然能交聯抗原。
「Fv」是帶有完整抗原識別和結合位點的最小抗體片段。這是一種由一條輕鏈的可變區和一條重鏈的可變區通過緊密的非共價結合而形成的二聚體。它的構型中，在VH-VL二聚體的表面，每個可變區的三個CDRs相互作用形成一個抗原結合位點。這六個CDRs共同決定了抗體的抗原結合特異性。但是，甚至單個可變區(或由三個特異於某抗原的CDRs組成的半個Fv)也具有識別和結合抗原的能力，雖然其親和性低於整個結合位點。
Fab片段還包含了輕鏈的恆定區和重鏈的第一個恆定區(CH1)。Fab′片段與Fab片段的不同在於，前者在重鏈CH1區的羧基末端多了幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。Fab′-SH在本文中表示Fab′恆定區的半胱氨酸上攜帶一個游離的巰基。F(ab′)2抗體片段最初以一對中間有半胱氨酸鉸鏈的Fab′形式產生。另外，抗體片段間還有一些化學偶聯。
根據恆定區的胺基酸序列，可將來自脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的「輕鏈」明確地分為兩類κ型和λ型。
根據重鏈恆定區的胺基酸序列，可將免疫球蛋白分為不同的類型。主要有五種免疫球蛋白類型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有的還可以進一步分為亞類(同種型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。不同類型免疫球蛋白重鏈的恆定區則分別對應地稱為α、δ、ε、γ和μ。不同免疫球蛋白類型的亞基結構和三維構型已經知道得相當清楚。
術語「抗體」從最廣義上使用時，其中專門包括專一的單克隆抗體(包括興奮劑和拮抗劑抗體)、具有多表位特異性的抗體組合物以及抗體片段(如Fab、F(ab′)2和Fv)，只要它們具備所要求的生物活性。
術語「單克隆抗體」在本文中指從一個基本同源的抗體群中得到的某種抗體。即除了極少量的自發突變外，構成群體的每個抗體都完全相同。單克隆抗體高度特異地直接對應於專一的抗原位點。而且，不同於常規的(多克隆)抗體製備物，這些製備物一般包括直接針對多個抗原決定簇(表位)的多個抗體，每種單克隆抗體直接針對抗原上的專一決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的優越性還體現在能夠用雜交瘤培養來合成，而不會被其他免疫球蛋白汙染。修飾語「單克隆的」說明了該抗體的特性是來自於基本均一的抗體群，而不表示抗體的獲得需要任何特殊的方法。例如，本發明中使用的單克隆抗體可運用雜交瘤技術(首先由KohlerMilstein在Nature，256495中描述)或重組DNA技術進行製備(參見美國專利號4,816,567[Cabilly等人])。
本文中的單克隆抗體還特別地包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)。嵌合抗體重鏈或/和輕鏈上的一部分與來自某一特定物種的或者屬於某一特定抗體類或亞類的抗體的對應序列完全相同或者同源；而餘下的另一部分與來自另一特定物種或者屬於另一特定抗體類或亞類的抗體的對應序列完全相同或者同源。嵌合抗體的片段也具有這種情況，只要它們能表現出所需的生物活性。(參見Cabilly等人的美國專利號4,816,567和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855)。
非人類(如鼠)抗體的「人源化」形式是一種嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗體的其他抗原結合亞序列)，其中帶有極少的非人類免疫球蛋白序列。通常，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的互補決定區(CDR)的殘基被其他物種的CDR的殘基(供體抗體)所代替，如小鼠、大鼠或兔的CDR的殘基，它們具有所需的特異性、親和性和容量。有時，人免疫球蛋白的Fv構架殘基也被相應的非人類殘基代替。甚至，人源化抗體也會含有既非來自受體抗體也非來自供體CDR或構架序列的殘基。這類修飾可以進一步完善和優化抗體的功能。通常，人源化抗體包括了所有的可變區(至少一個，一般兩個)，其中全部的或幾乎全部的CDR區對應於非人類免疫球蛋白的CDR區，而全部的或幾乎全部的FR區是人免疫球蛋白共有序列的FR區。人源化免疫球蛋白最好還帶有至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，一般是人免疫球蛋白恆定區。進一步的細節可參見Jones等人，Nature，321522-525；Reichman等人，Nature，332323-329和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596。
「人體中的非免疫原性」指將存在於藥學上可接受的載體中的多肽或將該多肽以有治療效應的劑量與合適的人體組織接觸，經過一段適當的潛伏斯(如8至14天)後，再次施用該多肽，沒有出現針對該多肽的過敏性和抗性狀態。II.本發明的優選例子本發明優先選用一些被稱為mpl配體或血小板生成素(TPO)的基本同源的多肽。這些多肽與受體細胞因子超家族的一員，mpl，有結合特性，並具有促進標記的核苷酸(3H-胸苷)摻入用人mpl P轉染的、IL-3依賴的Ba/F3細胞DNA中的生物特性。更優先選用的mpl配體是被分離的哺乳動物蛋白質，其具有造血，尤其是巨核細胞生成或血小板生成活性；也就是說，能夠促進未成熟的巨核細胞或巨核細胞前體增殖、成熟和/或分化為成熟的血小板生成形式。本發明最優先選用的多肽是有造血、巨核細胞生成或血小板生成活性的人mpl配體及其片段。可選擇地使這些人mpl配體非糖基化。其他可優先選用的人mpl配體有被稱為hML153或hTPO153的hML「EPO」結構域；被稱為hML245或hTPO245的hML截短形式；具有如圖1(SEQ ID NO1)所示胺基酸序列、被稱為hML、hML332或hTPO332的成熟全長多肽；以及具有生物活性的置換性變異體hML(R153A、R154A)。
本發明可優先選擇的多肽還有具有生物或免疫活性的mpl配體變異體，它們選自hML2、hML3、hML4、mML、mML2、mML3、pML和pML2。
本發明可優先選擇的多肽還有具有生物活性的mpl配體變異體，其與以下的mpl配體比較，至少有70％的胺基酸序列完全相同人mpl配體(見圖1[SEQ ID NO1])、鼠mpl配體(見圖16[SEQID NOS12和13])、重組豬mpl配體(見圖19[SEQ ID NO18])或從發育不全的豬血漿分離的mpl配體。同源性達到至少75％則更好，達到至少80％還要好，達到至少85％又更好，達到至少90％甚至還要好，達到至少95％則最佳。
從發育不全的豬血漿分離的mpl配體有以下特點(1)部分純化的該配體用磷酸鹽緩衝液(PBS)從凝膠濾柱中洗脫，其分子量為60,000-70,000，PBS或含0.1％SDS，或含4MMgCl2；(2)該配體的活性可被鏈黴蛋白酶破壞；(3)該配體在低pH值(2.5)、0.1％SDS和2M尿素時保持穩定；(4)基於能與多種凝集素柱結合，該配體是一種糖蛋白；(5)分子量25,000-35,000的高純度該配體可從非還原性SDS-聚丙烯醯胺凝膠中洗脫。較少量活性物時，洗脫的分子量約18,000-22,000和60,000；(6)分子量28,000-31,000的高純度配體在還原性SDS-聚丙烯醯胺凝膠中以雙聯體形式分離；(7)18,000-22,000、28,000和31,000條帶的氨基末端序列是一樣的SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR(SEQ ID NO29)；(8)下列親和柱可供配體結合和洗脫
Blue-Sepharose，CM Blue-Sepharose，MONO-Q，MONO-S，小扁豆凝集素-Sepharose，麥胚凝集素(WGA)-Sepharose，伴刀豆球蛋白-Sepharose，乙醚650m Toyopearl，丁基650m Toyopearl，苯基650m Toyopearl，和苯基-Sepharose。
更可優先選用的mpl配體多肽由人基因組或具有圖1(SEQ IDNO1)所示胺基酸序列的cDNA編碼。
本發明優先選用的其他具有天然生物活性的mpl配體多肽包括前mpl配體原、mpl配體原，成熟的mpl配體，mpl配體片段及其糖基化變異體。
還有一些本發明優選的多肽，包括mpl配體序列變異體和嵌合體。通常，二者都是具有生物活性的mpl配體變異體，其胺基酸序列至少有70％與人mpl配體或從發育不全的豬血漿分離的mpl配體相同。同源序列分別達到至少75％、80％、85％、90％、95％，則優選的級別依次提高。優選mpl配體變異體的一個例子是hML N末端結構域變異體(因其序列與紅細胞生成素同源而稱為「EPO結構域」)。優選的hML EPO結構域包括成熟hML的前153個胺基酸殘基，也被稱作hML153。一種可供選擇的優選hML序列變異體在C末端結構域有一個或多個鹼性或雙鹼性胺基酸殘基被非鹼性胺基酸殘基(如疏水的、中性的、酸性的、芳香族的、甘氨酸、脯氨酸等)替代。在一種優選的hML C末端結構域序列變異體中，153和154位置的精氨酸被丙氨酸所替代，這種變異體稱作hML332(R153A、R154A)。另一個優選的hML變異體hML332或hML153，其111-114位的殘基(QLPP或LPPQ)缺失或被其他四聯肽(如AGAG或類似序列)所替代。上述的缺失突變被稱作Δ4hML332或Δ4hML153。
優先選用的嵌合體是mpl配體及其片段(定義如下)與異源多肽及其片段融合。例如，hML153可以與IgG片段融合以提高血清半衰期，也可以與IL-3、G-CSF或EPO融合得到一個增強的血小板生成活性或嵌合造血活性分子。
另一個可供選擇的優選人mpl配體嵌合體是「ML-EPO結構域嵌合體」，它的結構特點是，一個或多個(但不是全部)N末端153-157位的hML殘基被人EPO殘基(可能的排列如圖10所示[SEQ ID NO7])替代。在本例的約153-166個殘基長度的hML嵌合體中，人EPO序列中單個或組合殘基被加入或者替換hML序列，替換的位置對應於圖10[SEQ ID NO7]所示的排列。典型的插入hML N端部分的組合序列包括在EPO的24-27、38-40和83-85位置上有一個或多個N-糖基化位點；也包括四個位於EPO的9-22、59-76、90-107和132-152位置的預測的雙親媒性α螺旋管中的一個或多個；以及其他包括高度保守的區域，如N末端區、C末端區和44-52殘基位置(EPO)(參考見Wen等人，Blood，821507-1516和Boissel等人，J.Biol.Chem.，268(21)15983-15993)。預期這種「ML-EPO結構域嵌合體」聯合有血小板生成一紅細胞生成(TEPO)的生物活性。
其他本發明的優選多肽包括mpl配體片段，含有一個至少10、15、20、25、30或40個胺基酸殘基長度的連續序列，該序列與在本文中所描述的分離自發育不全的豬血漿mpl配體或人mpl配體的序列完全相同(見表14，實施例24)。一種優選的mpl配體片段是人ML[1-X]，其中X代表153、164、205、207、217、229或245(見圖1[SEQ ID NO1]中1-X殘基序列部分)。其他優選的mpl配體片段包括那些純化的mpl配體的化學或酶解或者消化後的產物。
本發明另一個優選方面是純化mpl配體分子的方法。該方法的原理為根據待純化的mpl配體分子能夠選擇性地吸咐於固定化的受體多肽，使含mpl配體分子的mpl配體源接觸mpl或mpl融合多肽等固定化的受體多肽；洗滌固定化支持物以除去非吸咐物質；然後用洗脫緩中液將固定化的受體多肽上的分子洗脫下來達到純化。mpl配體源也許是血漿，而優選的固定化受體為mpl-IgG融合體。
重組細胞培養物作為mpl配體源，其培養基或細胞裂解物中的mpl配體含量通常要高於血漿或其他天然來源。在這種情況下，使用上述的mpl-IgG免疫親和方法依然可行，但並非必須，可用本領域中已知的常規蛋白質純化方法。簡而言之，產生基本同源mpl配體的優選純化方法包括用離心或超濾方法除去宿主細胞或裂解片段等微小碎片；可選擇地使用商購的蛋白質濃縮濾膜來濃縮蛋白質；然後，通過下列一個或多個步驟將mpl配體從其他雜質中分離出來免疫親和、離子交換(如DEAE或含羧甲基或磺酸正丙基基團的基質)、Blue-Sepharose、CM Blue-Sepharose、MONO-Q、MONO-S、小扁豆凝集素-Sepharose，麥胚凝集素-Sepharose、伴刀豆球蛋白-Sepharose、乙醚Toypearl、丁基Toypearl、苯基Toypearl、蛋白A-Sepharose，SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、反相HPLC(如帶脂肪族基團的矽膠)或葡聚糖凝膠分子篩大小排阻色譜，以及乙醇或硫酸氨沉澱。上述步驟的任意一個中都可加入氟化甲磺酸等蛋白酶抑制劑，以抑制蛋白水解作用。
在另一個優選例子中，提供了一種能與mpl配體結合的分離抗體。優先選用的mpl配體分離抗體是單克隆的(Kohler和Milstein，Nature，256495-497；Campbell，Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology，Burdon等人編輯，13卷，Elisevier Science Publisrers，Amsterdam；和Huse等人，Science，2461275-1281)。優選的mpl配體分離抗體與mpl配體的親和性至少應為106升/摩爾。抗體結合的親和性達到107升/摩爾時，更應優先選用。最為優先的情況是，抗體針對具上述效應子功能的mpl配體而產生。能與mpl配體結合的分離抗體可有選擇地與另一條多肽融合，該抗體或其融合體可用作固定化的mpl多肽，將mpl配體從上述的來源中分離純化到。在本例進一步的優先考慮中，本發明提供了一種檢測體外或體內mpl配體的方法用可疑含配體的樣品如血清樣品接觸抗體，檢測是否發生結合。
在進一步的優選例子中，本發明提供了一種編碼mpl配體及其片段的分離的核酸分子，該核酸分子可用一個可檢測成分作標記或去標記。本發明還提供了一種核酸分子，其序列與含編碼mpl配體的核酸分子序列互補或在嚴緊或中度嚴緊條件下能與之雜交。優選的mpl配體核酸是編碼具有生物活性的mpl配體的RNA或DNA，其編碼產物與人mpl配體至少有75％的序列完全相同，相同序列分別達到至少80％、85％、90％、95％，則選用的優先程度依次提高。更優選的分離核酸分子是編碼具有生物活性的mpl配體的DNA序列，其來源有(a)哺乳動物mpl配體基因的編碼區DNA(如含有圖1[SEQ ID NO2]所示核苷酸序列的DNA分子及其片段)；(b)至少能在中度嚴緊條件下與(a)所述DNA雜交的DNA；以及(c)因遺傳密碼的簡併性所得到的(a)或(b)所述DNA的簡併DNA。我們期望本文中所述新的mpl配體是配體家族或細胞因子家族的一員，具有適當的序列一致性，以至在低於中度嚴緊條件下，它們的DNA(或其互補鏈或片段)能與圖1(SEQ ID NO2)所示的DNA雜交。因此，本發明更進一步的方面包括了在低於中度嚴緊條件下，與編碼mpl配體多肽的DNA雜交的DNA。
在本發明一個進一步的優選例子中，核酸分子是編碼mpl配體的cDNA，包含在一個可複製的載體上，其中cDNA可操作地結合於用該載體轉化的宿主能識別的控制序列。這方面又進一步包括了用該載體轉化的宿主細胞和用cDNA產生有效應的mpl配體的一種方法，該方法包括編碼mpl配體的cDNA在轉化宿主細胞培養物中的表達及從中回收。用該方法獲得的mpl配體為優選地基本同源的人mpl配體。產生mpl配體的優選宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
本發明還進一步包括了一個治療免疫性疾病或造血性疾病尤其是血小板生成減少的哺乳動物的方法，包括對該哺乳動物施以有效治療量的mpl配體。可選擇地，mpl配體可以以與細胞因子、尤其是集落刺激因子或白細胞介素結合的形式給藥。優選的集落刺激因子或白細胞介素包括成套配體、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、IL-1、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9或IL-11。III.製備方法一些作者長期以來認為血小板的產生是由多譜系的特定體液因子控制。假設認為，兩種被稱為巨核細胞集落刺激因子(meg-CSF)和血小板生成素的不同的活性細胞因子調節了巨核細胞生成和血小板生成作用(參見Williams等人，J.Cell Physiol.，110101-104；Williams等人，Blood Cell，15123-133；和Gor-den等人，Blood，80302-307)。根據這個假設，meg-CSF促進前體巨核細胞的增殖，而血小板生成素主要影響更多分化細胞的成熟和最終的血小板釋放。自60年代以來，大量文獻記載了出現血小板減少現象後，動物和人類的血漿、血清和尿中會誘發並形成meg-CSF和血小板生成素活性物(如Odell等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，108428-431；Nakeff等人，Acta Haematol.，54340-344；Specter，Proc.Soc.Exp.Biol.，108146-149；Schreiner等人，J.Clin.Invest.，491709-1713；Ebbe，Blood 44605-608；Hoffman等人，N.En-gl.J.Med.，305533；Straneva等人，Exp.Hematol.，171122-1127；Mazur等人，Exp.Hematol.，131164；Mazur等人，J.Clin.Invest.，68733-741；Sheiner等人，Blood 56183-188；Hill等人，Exp.Hema-tol.，20354-360；以及Hegyi等人，Int.J.Cell Cloning，8236-244)。根據報導，這兩種活性因子所屬的譜系不同於已知的細胞因子(參見Hil R.J等人，Blood 80346；Er-ickson-Miller C.L.等人，Brit.J.Haematol.，84197-203；Straneva J.E.等人，Exp.Hematol.，204750；以及Tsukada J.等人，Blood 81866-867)。迄今，從血小板減少的血漿或尿中提純meg-CSF和血小板生成素的工作還未獲成功。
與上述從血小板減少血漿中觀察到的現象一致，我們發現，從照射處理過的豬得到的發育不全豬血漿(APP)能夠在體外刺激人巨核細胞生成。我們發現，這一刺激活性可被c-mpl的可溶性胞外區所終止，從而證實APP是一般所認為的mpl配體(ML)的一個潛在來源。我們已經成功地從APP中純化出了mpl配體，並且胺基酸序列信息已經被用於分離鼠，豬和人MLcDNA。這些ML有同源於紅細胞生成素的序列，並同時具有meg-CSF和血小板生成素樣活性。
1.從血漿中鑑定和純化mpl配體如上述，有報導顯示來自不同物種的發育不全血漿有促進體外血細胞生成的活性；但是，以前的報導中還沒有發現從血漿中分離造血刺激因子的例子。發育不全血漿的一個來源是經照射性處理的豬。這種發育不全的豬血漿(APP)可以體外刺激人血細胞生成。判斷APP中是否含有mpl配體，可通過測定3H-胸苷摻入用人mpl P轉染(步驟見圖2)的Ba/F3細胞來分析其效應。APP可促進3H-胸苷摻入Ba/F3-mpl細胞，而不是Ba/F3對照細胞(即未用人mpl P轉染)。另外，在正常的豬血漿中，沒有發現類似的活性。上述結果說明，APP含有一個或多個因子，能通過mpl受體轉導一個增殖信號，也許就是該受體的天然配體。用可溶性mpl-IgG處理可阻斷APP對Ba/F3-mpl細胞促進效應的發現進一步地支持了該觀點。
APP中活性物是一種蛋白質，因為鏈黴蛋白酶、DTT或加熱都可以破壞APP活性(圖3)。這種活性物也是不能透析的。但是，這種活性物在低pH值(pH2.5，2小時)時保持穩定，並在一些凝集素親和柱上吸附和洗脫，顯示出是一種糖蛋白。為進一步明確這種活性物結構及其特性，可以利用mpl-IgG嵌合體從APP中進行親和純化。
APP的處理方法可依據實施例1和實施例2中的方案。簡而言之，mpl配體可使用疏水作用性色譜(HIC)、固定化染料色譜和mpl-親和色譜來純化。回收該活性物的每一個步驟見圖4，各步的純化倍數見表1。通過mpl-親和柱，該活性物總的回收率約10％。mpl-親和柱洗脫的活性物峰值組分(F6)有約9.8×106單位/毫克的活性。5升APP純化約4×106(從0.8單位/毫克到3.3×106單位/毫克)，蛋白質含量則稀釋了83×106倍(從250克到3微克)。估計從mpl-親和柱上洗脫的配體特異性活性約為3×106單位/毫克。
表1mpl配體的純化
通過Bradford測定確定蛋白質。mpl洗脫物組分5-7的蛋白質濃度的估計是根據銀染SDS凝膠中染色的強度。一個單位定義為引起Ba/F3-mpl細胞增殖的最大促進的50％。
在還原條件下通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(4-20％，Novex凝膠)分析mpl-親和柱中洗脫的組分，可發現存在幾種蛋白質(見圖5)。用高強度銀染顯示的蛋白質分子量約66,000、55,000、30,000、28,000和18,000-22,000。為證明哪些蛋白質促進了Ba/F3-mpl細胞培養物的增殖，可如實施例2所述將它們從凝膠中洗脫。
該實驗結果顯示，絕大多數從含蛋白質的凝膠薄片中洗脫下來的活性物分子量為28,000-32,000，而分子量18,000-22,000(圖6)的活性物較少。這些區域中只可見的蛋白質分子量為30,000、28,000和18,000-22,000。為了鑑定和得到這一凝膠區域中分離的蛋白質(即30、28和18-22千道爾頓的條帶)的序列，這些蛋白質被電印跡於PVDF上，並以如實施例3所述方法測序。獲得的氨基末端序列如表2所示。
表2mpl配體氨基末端序列
計算機輔助分析顯示，這些胺基酸序列是新發現的。由於所有這三種序列都是相同的，可認為這30千道爾頓，28千道爾頓和18千道爾頓的蛋白質是相關的，也許就是同一種新蛋白質的不同形式。而且，這種蛋白質可能就是一種自然存在的mpl配體。因為，該活性物可以在4-20％的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳的同一個區域內(28,000-32,000)分離。另外，當用Superose 12(Pharmacia公司)柱作凝膠過濾色譜時，部分純化的配體與17,000-30,000分子量的物質一起遷移。相信，配體的不同分子量形式只是蛋白水解化或糖基化差異的結果，或者是其他翻譯前後的修飾所造成的結果。
如前所述，反義人mplRNA能阻止富集CD34+母細胞的人骨髓培養物中的巨核細胞生成，但不影響其他造血細胞譜系的分化(Methia等人(同上))。這一結果表示，mpl受體也許在巨核細胞的體外增殖和分化過程中發揮作用。為了進一步闡明mpl配體在巨核細胞生成中的作用，可以比較APP和除去mpl配體的APP在體外人巨核細胞生成過程中的效應。APP對於人巨核細胞生成的效應通過液體懸浮巨核細胞生成分析的一個改進方法來測定，方法的描述見實施例4。該分析中，在mpl-IgG親和色譜的前後用APP處理人外周幹細胞(PSC)。GPIIbIIIa對巨核細胞生成的促進作用由抗體125I-anti-IIbIIIa來定量(見圖7)。如圖7所示，10％的APP能引起約3倍的促進作用，但除去mpl配體的APP沒有效應。顯然，除去mpl配體的APP不能誘導Ba/F3-mpl細胞的增殖。
在另一個實驗中，分別在第0，2，4天將可溶性人mpl-IgG加入含10％APP的培養物中，可以中和APP對人巨核細胞生成的促進作用(見圖8)。這些結果顯示，mpl配體在人巨核細胞生成的調節中發揮作用，因此也可能對血小板減少症的治療有用。
2.mpl配體的分子克隆根據從30千道爾頓，28千道爾頓和18-22千道爾頓蛋白質得到的氨基末端胺基酸序列(見上述表2)，已經設計並使用了兩個簡併寡核苷酸引物集合體用於通過PCR擴增豬基因組DNA。可以很合理地認為，如果氨基末端胺基酸序列由單一外顯子編碼，那么正確的PCR產物的長度應該為69bp。發現了一個該長度的DNA片段並亞克隆到pGEMT。PCR寡核苷酸引物以及得到的三個克隆序列見於實施例5。由PCR引物之間部分編碼的肽的胺基酸序列(PRLLNKLLR[SEQ ID NO33])完全等同於對豬配體氨基末端蛋白質測序後得到的序列(見上文所示28和30千道爾頓豬蛋白質序列的9-17殘基)。
一種根據PCR片段序列合成的寡核苷酸被用於篩選人基因組DNA文庫。一個稱為pR45的45聚體的寡核苷酸已經根據PCR片段的序列設計併合成出來。該寡核苷酸有以下序列5′GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3′(SEQ ID NO34)
參照實施例6，該脫氧寡核苷酸在低嚴緊雜交和洗滌條件下被用於篩選構建於λgeml2噬菌體中的人基因組DNA文庫。挑出陽性克隆，純化噬菌斑，用限制性圖譜和southern印跡法來分析。一個與45聚體雜交的390bp EcoRl-XBal片段被亞克隆於pBluescriptSK-。這一克隆的DNA測序表明，編碼豬mpl配體的人同系物的DNA已經被分離出來。人DNA序列和依此推斷的胺基酸序列如圖9(SEQ ID NO3和4)。基因組序列中內含子的預測位置由箭頭表示，並標出一個推斷的外顯子(「外顯子3」)。
根據人「外顯子3」序列合成了對應於外顯子3′端和5′端序列的寡核苷酸。從不同人組織中製備模板DNA，用這兩個引物進行PCR反應。所期望的正確PCR產物的大小為140bp。在12％的聚丙烯醯胺凝膠電泳中分析PCR產物後，可以在用成人腎、293胎兒腎細胞構建的cDNA文庫中和人胎兒肝製備的cDNA中檢測到期望大小的DNA片段。
接著，用同樣的45聚體寡核苷酸篩選構建於λDR2噬菌體中的胎兒肝cDNA文庫(7×106個克隆)，該45聚體寡核苷酸用於在低嚴緊雜並條件下篩選人基因組文庫和胎兒肝cDNA文庫。挑選陽性克隆，純化噬菌斑，並用PCR測定插入片段的大小。選擇含1.8kb插入片段的克隆以供進一步分析。運用實施例7所述程序，得到人mpl配體(hML)的核苷酸序列及依此推斷的胺基酸序列。這些序列見於圖1(SEQ ID NOS1和2)。
3.人mpl配體(hML)的結構人mpl配體(hML)cDNA序列(圖1[SEQ ID NO2])由1774個核苷酸構成，並有一個聚腺苷酸尾。它包括215個核苷酸的5′端非翻譯序列和498個核苷酸的3′端非翻譯區。在核苷酸位置216-218處的假定起始密碼子位於真核翻譯起始要求的共有序列內。開放讀框起始於核苷酸位置220，共有1059個核苷酸，並編碼長度為353個胺基酸殘基的多肽鏈。該預測胺基酸序列的氨基末端高度疏水，可能對應於某種信號肽。對預測的胺基酸序列進行計算機分析(vonHeijne等人，Eur.J.Biochem，.13317-21)顯示在殘基21和22之間，有一個信號肽酶的潛在切割位點。在這個位置上的切割會產生一個332個胺基酸殘基長度的成熟多肽，其起點是純化自豬血漿的mpl配體的氨基末端序列。預測該332個胺基酸殘基長度配體的未經糖基化分子量約38千道爾頓。共有6個潛在的糖基化位點和4個半胱氨酸殘基。
將mpl配體序列和Genbank序列資料庫比較發現成熟的人mpl配體和人紅細胞生成素(hEPO)氨基末端的153個殘基之間有23％完全相同(圖10[SEQ ID NOS6和7])。如果考慮保守性置換，hML和hEPO在這一區域相似性達到50％。hML和hEPO都有4個半胱氨酸。其中，包括第一個和最後一個在內的4個半胱氨酸中的3個在hML中是保守的。定點誘變實驗結果顯示，紅細胞生成素的第一個和最後一個半胱氨酸根據其功能的需要形成一個二硫鍵(Wang，F.F.等人，Endocrinology 1162286-2292)。類似地，hML的第一個和最後一個半胱氨酸可能也形成了一個重要的二硫鍵。在hML中沒有保守的糖基化位點。hML多肽所有潛在的N-糖基化位點都位於近羧基末端的一半處。
與hEPO類似，hML mRNA既沒有共有聚腺苷酸序列AAUAAA，也沒有調節元件AUUUA，AUUUA出現在許多細胞因子的3′端非翻譯區，並被認為影響mRNA的穩定性(Shawet等人，Cell，46659-667)。Northern印跡法分析顯示了在胎兒和成人肝中，單一的1.8kb hML RNA轉錄物水平低。在較長時間曝光之後，可以在成人的腎中檢測到相同大小的較弱條帶。經比較，人的紅細胞生成素在胎兒肝中表達，並且當低氧出現時，在成人的腎和肝中表達(Jacobs等人，Nature，313804-809和Bondurant等人，Molec.Cell.Biol.，62731-2733)。
hML羧基末端區的重要性還有待進一步闡述。根據6個潛在N-糖基化位點的存在和該配體能與凝集素親和柱結合的特點，hML的該區域可能被糖基化。在一些凝膠洗脫實驗中，我們觀察到活性物分辨的分子量約60,000，也許代表了全長的糖基化分子。因此，羧基末端區也許起了穩定和提高循環的hML半衰期的作用。就紅細胞生成素而言，其未經糖基化的形式在體外具有完整的生物活性，但與糖基化紅細胞生成素相比，血漿的半衰期明顯縮短(Takeuchi等人，J.Biol.Chem.，26512127-12130；Narhi等人，J.Biol.Chem.，26623022-23026和Spivack等人，Blood，790-99)。hML的羧基末端結構域有兩個雙鹼性的胺基酸序列[在153-154和245-246位置的Arg-Arg基序]，可作為潛在的加工位點。在這些位點的切割可能就是分離自APP的ML的30、28、18-22千道爾頓形式的來源。很重要地，Arg153-Arg154序列的出現是緊接著ML的紅細胞生成素樣結構域。這些現象說明，也許全長的ML是一種前體蛋白，經過有限蛋白酶解產生成熟的配體。
4.人mpl配體的同種型和變異體人mpl配體的同種型或剪接形式可通過成人肝的PCR檢測到。簡而言之，合成對應於hML編碼序列的兩端及選擇的內部區域的引物。如實施例10所述，這些引物被用於通過RT-PCR擴增成人肝RNA。除了稱為hML的全長形式外，還觀察到或推斷出其他三種形式，稱為hML2、hML3和hML4。推斷出的所有這四種同種型的成熟胺基酸序列如圖11(SEQ ID NOS6、8、9和10)所示。hML3在位置700處有116個核苷酸缺失，導致了胺基酸的缺失和移碼。cDNA編碼一條265個胺基酸長度的成熟多肽，從hML序列的第139個胺基酸殘基起趨異。最後，hML4既有在位點618後12個核苷酸缺失(也在鼠和豬序列中發現[見下文])，也有見於hML3的116bp的缺失。雖然在人中還沒有分離到只有12bp(緊接核苷酸位點619)缺失的克隆，但這種被稱為hML2同種型可能存在，因為在鼠和豬中都鑑定出了這樣的的同種型(見下文)，也因為已經發現其與缺失116個核苷酸的hML4相連同。
雙鹼性的Argl53-Arg154被兩個丙氨酸殘基替代的hML置換變異體和hML的一個「EPO結構域」截短形式被構建以判斷全長的ML是否為具有生物活性所必須。稱作hML(R153A、R154A)的Arg153-Arg154雙鹼性序列置換變異體用實施例10所述的PCR方法來構建。「EPO結構域」截短形式hML153，通過在Arg153後引入一個終止密碼子，也是用PCR來構建。
5.在瞬時轉染的人胚胎腎(293)細胞中重組人mpl配體(rhML)的表達為了證實克隆的人cDNA編碼mpl配體，在巨細胞病毒立即早期啟動子的控制下，使用表達載體pRK5-hML或pRK5-hML153，在哺乳動物293細胞中表達配體。已經發現，從瞬時轉染的人胚胎腎293細胞得到的上清液能促進3H-胸苷摻入Ba/F3-mpl細胞，但不是親代Ba/F3細胞(圖12A)。只用pRK載體轉染的293細胞的培養基則沒有這種活性。在培養基中加入mpl-IgG能夠消除這種促進作用(數據沒有顯示)。這些結果顯示，克隆的cDNA編碼一種功能性的人ML(hML)。
將hML的截短形式hML153在293細胞中表達，可以判斷單獨「EPO結構域」是否可以結合併激活mpl。轉染細胞的上清液與表達全長hML(圖12A)的細胞的上清液有相似的活性，表示ML的羧基末端結構域對於c-mpl的結合和激活並不是必須的。
6.mpl配體促進巨核細胞生成和血小板生成重組hML的兩種形式，全長的rhML和截短的rhML153都能在體外促進人巨核細胞生成(圖12B)。在不加入其他外源造血生長因子時，可以觀察到這種效應。除了IL-3以外，ML是唯一在檢測中顯示這種活性的造血生長因子。在我們的分析中，IL-11、IL-6、IL-1、紅細胞生成素、G-CSF、IL-9、LIF、成套配體(KL)、M-CSF、OSM和GM-CSF在單獨檢測時對巨核細胞生成都沒有效應(數據沒有顯示)。這個結果顯示了ML具有巨核細胞促進活性，也指出了ML在巨核細胞生成調節中的作用。
在鼠血小板增多回跳分析中，患血小板減少症動物的血漿中的血小板生成活性物顯示出促進血小板生成(McDonald，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，141006-1001和Mcdonald等人，Scand.J.Haematol.，16326-334)。在這個模型中，使用特異的抗血小板血清引發鼠急性血小板缺少，來導致預測中的血小板增多回跳。這種免疫血小板增多型鼠對於外源的血小板生成素樣活性物比普通的鼠更為敏感(McDonald，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，141006-1001)，就如同去除低氧的鼠對紅細胞生成素的敏感性比普通的鼠強(McDonald等人，J.Lab.Clin.Med.，77134-143)。為了判斷rML是否在體內刺激血小板生成，將部分純化的rhML注射入血小板增多回跳的鼠中。然後，計量血小板數以及摻入到血小板中的35S。將64,000或32,000單位的rML注射到鼠體內可顯著增加血小板生成，與只注射入賦行劑的對照鼠相比，血小板數增加約20％(對應的p＝O.0005和0.0001)，摻入血小板的35S增加約40％(p＝0.003)(圖12C)。這個刺激水平與我們在此模型中使用IL-6觀察到的情況相匹比(數據沒有顯示)。只以16,000單位的rML進行處理不能顯著地刺激血小板的生成。這些結果表明，ML以劑量依賴的方式刺激血小板的生成，因此具備了血小板生成素樣活性。
用上述hML同種型構建物轉染293細胞並用Ba/F3-mpl增殖來測定分析上清液(見圖13)。在分析中，hML2，hML3沒有顯示可測定的活性，但hML(R153A，R154A)的活性類似於hML和hMLl53，這一結果表明，在Arg153-Arg154雙鹼性位點的加工對於其活性既不是必須的，也不是不利的。
7.巨核細胞生成和mpl配體已經有假說認為，巨核細胞生成受多重細胞水平的調節(Williams等人，J.Cell Physiol.，110101-104和William等人，Blood Cell，15123-133)。這一假說的主要依據是，某些造血生長因子刺激巨核細胞前體的增殖，而另一些主要影響其成熟。本文中的結果提示ML同時以增殖和成熟因子發揮作用。有一系列證據支持ML對巨核細胞前體增殖的刺激作用。首先，APP能在體外刺激人巨核細胞前體的增殖和成熟，而其刺激作用可以被mpl-IgG完全抑制(圖7和圖8)。此外，c-mpl反義寡核苷酸對巨核細胞集落形成的抑制(Methia等人，Blood，821395-1401)以及c-mpl可將細胞內的增殖信號轉導入其被轉染對象中的發現(Skoda等人，EMBO，122645-2653和Vigon等人，Oncogene，82607-2615)也都表明了ML刺激增殖。在巨核細胞分化的所有時期中，c-mpl顯著的表達(Methia等人，Blood，821395-1401)以及重組ML在體內迅速刺激血小板生成的能力都表明了ML也影響成熟。由於可獲得重組ML，就可以對其在巨核細胞生成和血小板生成調節中的作用進行仔細的評估，以及它對其他造血細胞譜系的潛在影響。
8.人mpl配體(TPO)基因的分離在低嚴緊或高嚴緊條件下，使用一個與編碼mpl配體的人cD-NA 3′端一半序列對應的片段，篩選含有pR45的構建於λ-Gem12噬菌體中的人基因組文庫，分離到含TPO基因的人基因組DNA克隆。兩個跨越35kb的重疊λ克隆被分離出來。對含有完整TPO基因的兩個重疊片段(BamH1和EcoRI)進行亞克隆和測序。
人基因的結構為7kb基因組DNA中含有6個外顯子。所有外顯子和內含子連接邊界都與哺乳動物基因的共有基序一致(Shapiro，M.B.等人，Nucl.Acids Res.157155)。外顯子1和外顯子2含有5′端非翻譯序列和信號肽的4個起始胺基酸。分泌信號的殘基和成熟蛋白質的前26個胺基酸由外顯子3編碼。整個羧基結構域和3′非翻譯區以及紅細胞生成素樣結構域的約50個胺基酸由外顯子6編碼。涉及在hML-2(hTPO-2)中觀察到的缺失的4個胺基酸由外顯子6的5′末端編碼。
Southern印跡法分析人基因組DNA顯示，TPO基因以單拷貝形式存在。該基因在染色體上的位置由螢光原位雜交(FISH)定位於染色體3q27-28。
9. 293細胞TPO的表達與純化實施例19中詳細敘述了如何從293細胞製備和純化ML或TPO。簡單來說，就是用pRK5-hmpl I通過PCR來獲得對應於TPO整個開放讀框的cDNA。PCR產物純化後克隆入質粒pRK5tkneo(一種衍生自pRK5的載體，經過改造以在胸苷激酶啟動子控制下表達新黴素抗性基因)的限制性位點Clal和Xbal之間，以得到載體pRK5tkneo.ORF(一種編碼整個開放讀框的載體)。
第二種編碼EPO同源結構域的載體可用相同的方法製成，但使用不同的PCR引物，最後得到的構建物為pRK5-tkneoEPO-D。
這兩種構建物通過CaPO4法轉染入人胚胎腎細胞，挑選出新黴素抗性的克隆並使之生長到匯合。在條件培養基中通過Ba/F3-mpl增殖分析來評估這些克隆中ML153或ML332的表達。
rhML332的純化如實施例19所述。簡單來說，將293-rhML332的條件培養基上樣於Blue-Sepharose(Pharmacia公司)柱，接著用含2M尿素的緩衝液洗滌。柱的洗脫用含2M尿素和1MNaCl的緩衝液。Blue-Sepharose柱洗脫後的集合體再直接上樣於WGA-Sepharose柱，用含2M尿素和1MNaCl的10倍柱體積緩衝液洗滌，洗脫用同樣的緩衝液，但含0.5M的N-乙醯-D-葡糖胺。WGA-Sepharose的洗脫物再上樣於C4-HPLC柱(Synchrom，Inc.)，並以不連續的丙醇梯度來洗脫。通過SDS-PAGE，純化的293-rhML332在凝膠的68-80千道爾頓區以一個寬帶遷移。
rhML153的純化亦如實施例19所述。簡單來說，rhML153的條件培養基如rhML332一樣地在Blue-Sepharose柱上分離。Blue-Sepharose柱的洗脫物直接上樣於如前文所述的mpl親和柱。從mpl親和柱得到的rhML153洗脫物，在與rhML332相同的條件下，用C4-HPLC柱純化達到均一性。通過SDS-PAGE，純化的rhML153分離為2個主帶和2個次帶，分子量約18,000-22,000(見圖15)。
10.鼠mpl配體一個對應於人mpl配體編碼區的DNA片段通過PCR而獲得、凝膠純化後用32P-dATP和32P-dCTP標記。這一探針被用來篩選構建於λGT10噬菌體中的鼠肝cDNA文庫的106個克隆。一個含有1443個鹼基對插入片段的鼠克隆(圖16[SEQ ID NOS12和13])被分離並測序。在核苷酸位置138-141處的假定起始密碼子位於真核翻譯起始要求的共有序列內(Kozak，M.J.Cell Biol.，108229-241)。這一序列表明了一個1056個核苷酸的開放讀框，預示其能產生主要的長度為352個胺基酸翻譯產物。在這個開放讀框的兩端，有5′端的137個核苷酸和3′端的247個核苷酸的非翻譯區。在3′端非翻譯區後沒有聚腺苷酸尾，表示該克隆可能不完整。預測的胺基酸序列N末端高度疏水可能代表了一個信號肽。計算機分析(von Heijne，G.Eur.J.Biochem.13317-21)顯示，在殘基21-22之間有一個信號肽酶的潛在切割斷裂位點。在這個位置發生的切割產生一個成熟的331個胺基酸(35千道爾頓)的多肽，稱為mML331(由於以下原因也稱為mML2)。這一序列有4個半胱氨酸和7個潛在的N-糖基化位點，前者在人的序列中都是保守的，後者中有5個在人的序列中保守。而且，與hML一樣，所有7個潛在的N-糖基化位點都位於蛋白質C末端的一半處。
當與人ML相比較時，可以觀察到在這些ML的「EPO結構域」中，核苷酸及其推斷的胺基酸序列都有很大的相同性。然而，如果將人和鼠ML推斷的胺基酸序列排列作比較，可以在鼠序列的111-114殘基間發現一個四肽的缺失，對應於在人(見上文)和豬(見下文)cDNA中的核苷酸位置618後的12個核苷酸缺失。相應地，檢查其他克隆以檢測可能的鼠ML同種型。有一個克隆編碼335個胺基酸的推斷的多肽，其中含有缺失的四肽LPLQ。這種形式被確信為全長的鼠ML，稱為mML或mML335。mML的核苷酸序列及其推斷的胺基酸序列見圖17(SEQ ID NOS14和15)。這個cDNA克隆由1443個鹼基對構成，後接一個聚腺苷酸尾。它擁有一個1068bp的開放讀框，其兩側在5′端和3′端各有134個鹼基和241個鹼基的非翻譯區序列。假定的起始密碼子位於核苷酸位置138-140處。開放讀框編碼356個胺基酸的蛋白質，其中開始的21個高度疏水並有類似分泌信號的功能。
最後，又分離、測序到了第三種克隆，含有對應於bML3的116個核苷酸缺失。這種鼠同種型被定名為mML3。這兩種同種型推斷的胺基酸序列比較見圖18(SEQ ID NOS9和16)。
人和鼠ML的整個胺基酸序列的相同性為72％(圖19[SEQID NOS6和17])，但這種同源性並不是均勻地分布的。稱為「EPO結構域」(人胺基酸序列1-153，鼠胺基酸序列1-149)區域的保守性(同源性86％)要強於蛋白質的羧基末端區域(同源性62％)。這也許進一步表明，只有「EPO結構域」對蛋白質的生物活性是重要的。有趣地，在hML中找到的兩個雙鹼性胺基酸基序中，只有緊接「EPO結構域」的一個雙鹼性基序(殘基位置153-154)在鼠序列中發現。這一現象支持了這樣一種可能性全長的ML也許代表了一個前體蛋白質，經過有限蛋白酶解產生成熟的配體。也有可能，在Arg153-Arg154之間的蛋白酶解有助於分解hML。
如實施例1所述，一個含有mML完整編碼序列的表達載體被瞬時轉染到293細胞中。這些細胞的條件培養基能刺激3H-胸苷摻入表達鼠或人mpl的Ba/F3細胞。但對親代(少mpl)細胞系沒有效應。這表明，克隆的鼠ML cDNA編碼一個能激活鼠和人ML受體的功能性配體(mpl)。
11.豬mpl配體如實施例13所述，豬ML(pML)cDNA通過RACE PCR分離。已經在腎中發現並亞克隆了一個1342bp的PCR cDNA產物。經過測序，發現有幾個克隆能編碼一個332個胺基酸殘基的豬mpl配體，稱為pML或pML332。這些克隆的核苷酸序列及其推導的胺基酸序列如圖20(SEQ ID NOS18和19)所示。
另外，已經鑑定了第二種形式(見圖21[SEQ ID NO21])，稱為pML2，它編碼的蛋白質有4個胺基酸殘基缺失(228個胺基酸殘基)。比較pML和pML2可知，除了對應於殘基111-114的四肽QLPP缺失外，兩種形式完全一樣(見圖22[SEQ ID NOS18和21])。在鼠和豬ML cDNA中觀察到的4個胺基酸缺失都是精確地發生在假定蛋白質的同一位置。
比較人、鼠和豬的成熟ML假定的胺基酸序列(圖19[SEQ IDNOS6、17和18])，結果顯示，在整個序列相同性上，鼠和人之間為72％，鼠和豬之間為68％，而豬和人之間為73％。在ML氨基端的一半處(EPO同源結構域)，同源性明顯地增大。在以上物種的任何兩種之間，這一區域的同源性為80％至84％，而在羧基端的一半處(糖類結構域)，相同性僅有57％至67％。在紅細胞生成素同源結構域的羧基末端，有一個代表蛋白酶切割位置的雙鹼性胺基酸基序。這一位置上的該基序在三個物種之間是保守的(圖19[SEQ ID NOS6、17和18])。在人的序列位置245-246處出現的第二個雙鹼性位點在豬或鼠的序列中沒有出現。鼠和豬ML序列有4個半胱氨酸，都保留於人的序列中。在鼠配體和豬ML中，潛在的N-糖基化位點分別有7個和6個，其中5個保留於人的序列中。另外，所有潛在的N-糖基化位點都位於蛋白質羧基端的一半處。
12.中國倉鼠卵巢(CHO)細胞TPO的表達和純化用於轉染CHO細胞的表達載體稱為pSV15.ID.LL.MLORF(全長或TP0332)和pSV15.ID.LL.MLORF-D(截短的或TP0153)。這些質粒的相關特性見圖23和圖24。
轉染的過程如實施例20所述。簡單來說，通過PCR得到對應於TPO整個開放讀框的cDNA。PCR產物純化後克隆入pSV15.ID.LL質粒的兩個限制位點(Clal和Sall)之間，從而獲得載體pSV15.ID.LL.MLORF。對應於EPO同源結構域的第二種構建物以同樣方式產生，但使用不同的反義引物(EPOD.Sal)。編碼TPO的EPO同源結構域的載體的最終構建物稱為pSV15.ID.LL.MLEPO-D。
這兩種構建物以Notl消化使之線性化，並通過電穿孔法轉染入中國倉鼠卵巢細胞(CHO-DP12細胞，EP 307,247 1989年3月15日發表)。107個細胞在存在有10、25或50mg DNA時，用BRL電穿孔儀(350伏，330毫法，低電容)作電穿孔，(Andreason，G.L.J.Tissue Cult.Meth.15，56)。轉染後第二天，將細胞在DHFR選擇培養基(不含甘氨酸的高濃度葡萄糖DMEM-F125050、2mM穀氨醯胺、2-5％透析的小牛胚胎血清)中打勻。10至15天後，將單個集落轉移到96平板，使之生長至匯合。用Ba/F3-mpl增殖測定來評估來自這些克隆的ML153或ML332在條件培養基中的表達(如實施例1所述)。
從收穫的CHO細胞培養液中分離和純化TPO的步驟見實施例20。簡單來說，將收穫的CHO細胞培養液(HCCF)上樣於Blue-Sepharose柱(Pharmcia公司)，上樣的比例為每升樹脂約100升HCCF。接著，先用3至5倍柱體積的緩衝液洗滌柱，續之以3至5倍柱體積含2.0M尿素的緩衝液洗滌柱。然後，再用3至5倍柱體積含2.0M尿素和1.0MNaCl的緩衝液來洗脫TPO。
將含TPO的Blue-Sepharose洗脫集合物上樣於Wheat Germ(麥胚)凝集素-Sepharose柱(Pharmacia公司)，按每毫升樹脂8至16毫升Blue-Sepharose洗脫液的比例用Blue-Sepharose洗脫緩衝液來平衡柱。柱的洗滌用2至3倍柱體積的平衡緩衝液。TPO的洗脫採用2至5倍柱體積含2.0M尿素和0.5M N-乙醯-D-葡糖胺的緩衝液。
隨後，將含TPO的麥胚凝集素洗脫物酸化，並加入C12E8使終濃度為0.04％。再將得到的溶液上樣於C4反相柱，用0.1％TFA、0.04％C12E8平衡，裝載量為每毫升樹脂約0.2至0.5mg蛋白質。
在含0.1％TFA和0.04％C12E8的乙腈雙相線性梯度中洗脫蛋白質，並經SDS-PAGE後獲得一種集合物。
然後，將C4中的集合物稀釋，並在能使之截斷為10,000至30,000道爾頓分子量的Amicon YM之類的超濾膜上用6倍體積的緩衝液透濾。得到的透濾液可直接用於以後的操作或經超濾進一步地濃縮。通常，透濾/濃縮液用終濃度為0.01％吐溫-80來調節。
接著，將相當於柱體積2％至5％的全部或部分透濾/濃縮液上樣於Sephacryl S-300HR柱(Pharmacia公司)，平衡用含0.01％吐溫-80的緩衝液，然後進行色譜。不含聚合物和蛋白酶解的降解產物的TPO組分隨後經SDS-PAGE後獲得集合物。得到的集合物經過濾後保存於2-8℃。
13.在微生物中轉化和誘導TPO合成的方法以及從中分離、純化和重摺疊合成的TPO大腸桿菌TPO表達載體的構建在實施例21中有詳細的描述。簡單來說，設計質粒pMP21、pMP151、pMP41、pMP57和pMP202來表達一個短引導序列下遊的TPO前155個胺基酸，該引導序列因不同的構建物而有差異。這個引導序列主要提供高水平的翻譯起始和快速純化。又設計了質粒pMP210-1、-T8、-21、-22、-24、-25來表達TPO起始甲硫氨酸下遊的前153個胺基酸，這些質粒的不同僅僅在於針對TPO前6個胺基酸的密碼子的使用。pMP210-1中TPO的羧基末端延伸兩個胺基酸後，得到pMP251。在色氨酸啟動子的誘導下，上述的所有質粒將在大腸桿菌中產生高水平的細胞內TPO表達(Yansura，D.G.等，Methods in Enzymology[Goedded，D.V.，編輯]18554-60，Academic Press，SanDiego)。質粒pMP1和pMP172是上述TPO細胞內表達質粒構建中的過渡物。
通過CaCl2熱休克法，將上述TPO表達質粒轉化大腸桿菌(Mandel，M.等，J.Mol.Biol.，53159-162，)，其他轉化過程的描述見實施例21。簡單來說，首先將轉化細胞在37℃中培養直至培養物光密度達到約2-3。稀釋培養物，並在通氣條件下生長後，加入酸。然後，讓培養物繼續在通氣條件下生長15小時後，離心法收集細胞。
實施例22和實施例23描述了產生生物活性的、重摺疊的人TPO及其片段的分離、純化和重摺疊步驟；這些方法可應用於包括N末端和C末端延伸形式在內的任何TPO變異體的回收。其他適合於重摺疊重組體或合成的TPO的步驟可參見下列專利Builder等，U.S.專利號4,511,502；Jones等，U.S.專利號4,512,922；Olson，U.S.專利號4,518,526和Builder等，U.S.專利號4,620,948；其中大致敘述了以不溶性形式表達於大腸桿菌中的大量重組蛋白的回收和重摺疊方法。
A.不溶性TPO的回收將能表達由任何合適質粒編碼的TPO的微生物如大腸桿菌，在一定條件下發酵，要求TPO能夠以不溶性的「折射體」沉泥。可選擇地首先用細胞裂解緩衝液洗滌細胞。通常，用Polytron勻漿器將約100克的細胞重懸於10倍體積的細胞裂解緩衝液中(如10mMTris、5mM EDTA，pH8)，並以5000×g、30分鐘的條件離心細胞。然後，使用諸如張力休克、超聲處理、壓力循環、化學或酶法等常規技術裂解細胞。例如，上述經洗滌的細胞沉澱物可通過勻漿器重懸於10倍體積的另一種細胞裂解緩衝液中，並根據製造商的說明將細胞懸浮液流經LH Cell Disrupter(LH Inceltech公司)或Microflu-idizer(Microfluidics International公司)。含TPO的顆粒物從液相中被分離出來，並可選擇地以任何合適的液體洗滌。例如，一種細胞解裂物的懸浮液可以5,000g離心30分鐘，重懸後可選擇地進行第二次離心，最後得到經洗滌的折射體沉澱。這些經過洗滌的沉澱可立即使用或冰凍保存(如-70℃)。
B.單體TPO的增溶和純化折射體沉澱中不溶性TPO用增溶緩衝液來增溶。增溶緩衝液含有離液劑，通常在鹼性pH下起緩衝作用，並含有能提高單體TPO產量的還原劑。代表性的離液劑有尿素、鹽酸胍和硫氰酸鈉。而優選的離液劑為鹽酸胍。離劑的濃度通常為4-9M，優選地為6-8M。增溶緩衝液的pH值由合適的緩衝液維持在7.5-9.5範圍內，優選地為8.0-9.0，最為優選地為8.0。優選的增溶緩衝液中還含有還原劑以幫助形成TPO的單體形式。合適的還原劑包括游離的巰基(RSH)等有機化合物。代表性的還原劑包括二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、巰基乙醇、穀胱甘肽(GSH)、半胱胺和半胱氨酸。優選的還原劑是二硫蘇糖醇(DTT)。可選擇地，增溶緩衝液可包含一種溫和的氧化劑(如氧分子)和一種亞硫酸鹽以通過亞硫酸化形成單體TPO。在這個例子中，得到的TPO-S-磺酸鹽以後又在氧化還原緩衝液(如GSH/GSSG)中重摺疊以形成合適的摺疊TPO。
TPO蛋白質需要進一步純化，通常的方法如離心、凝膠過濾色譜和反相柱色譜。
以舉例的方法，通過下列步驟能得到合適產量的單體TPO。將折射體沉澱重懸於約5倍體積的增溶緩衝液(20mM Tris，pH8，6-8M胍和25mM DTT)中，攪拌1-3小時或4℃過夜，使TPO蛋白質增溶。也可以用高濃度的尿素(6-8M)，但與胍相比，產量要低一些。增溶後，溶液在30,000×g離心30分鐘，得到含變性單體TPO的透明上清液。然後，將上清液在Superdex 200凝膠柱(Phar-macia公司，2.6×60cm)上進行色譜，設定流速為2毫升/分鐘。蛋白質的洗脫條件為，20mM磷酸鈉pH6.0、10mMDTT。合併收集含變性單體TPO蛋白質洗脫液160至200毫升之間的組分。TPO蛋白質在半製備的反相柱(2×20cm VYDAC)上進一步純化。樣品以5毫升/分鐘上樣，柱的平衡用含30％乙腈的0.1％TFA(三氟乙酸)。蛋白質的洗脫採用乙腈的線性梯度(在60分鐘內，從30％到60％)。純化的還原性蛋白質在濃度約為50％乙腈時被洗脫下來。洗脫物用於重摺疊以得到具有生物活性的TPO變異體。
C.重摺疊TPO以產生生物活性形式TPO增溶和進一步純化之後，就要通過變性單體TPO在氧化還原緩衝液中的重摺疊來得到生物活性形式。由於TPO的高效價(約3pg/ml時，能在Ba/F3測定中達到最大刺激作用的一半)，通過多種不同的緩衝液、去垢劑和氧化還原條件得到生物活性物質是可能的。但是，在大多數情況下，只能得到少量合適的摺疊物質(＜10％)。用製造商推薦的程序，希望得到的重摺疊產物至少為10％，達到30％-50％更好，達到50％以上則最佳。已經發現的至少能產生一定量合適摺疊產物的去垢劑有很多Triton X-100、十二烷基-β-麥芽糖、CHAPS、CHAPSO、SDS、sarkosyl、吐溫20、吐溫80、Zwittergent及其他。但其中最為優選的去垢劑都屬於CHAPS家族(CHAPS和CHAPSO)，CHAOS家族去垢劑在重摺疊反應中的效果最佳並能限制蛋白質聚集和不適當的二硫鍵形成。CHAPS最為優選的濃度是大於1％。為得到最高產量，需要最適濃度0.1至0.5M的氯化鈉。為了限制在一些製備物中發現的由金屬催化的氧化作用(和聚集作用)，可在氧化還原緩衝液中加入EDTA(1-5mM)。最適的重摺疊條件需要濃度大於15％的甘油。為了得到最高產量，還必須在氧化還原緩衝液中含有一個由氧化和還原有機巰基(RSH)構成的氧化還原對。合適的氧化還原對有巰基乙醇、穀胱甘肽(GSH)、半胱胺、半胱氨酸以及它們相應的氧化形式。優選的氧化還原對是穀胱甘肽(GSH)氧化穀胱甘肽(GSSH)或半胱胺半胱氨酸。而最為優選的氧化還原對為穀胱甘肽(GSH)氧化穀胱甘肽(GSSH)。通常，當氧化還原對中氧化物的摩爾比等於或大於還原物時，可以得到更高的產量。這些TPO變異體重摺疊的最適pH值在7.5和約9之間。有機溶劑(如乙醇、乙腈，甲醇)的耐受濃度為10-15％或更低。更高濃度的有機溶劑增加了不合適摺疊形式的量。Tris和巰酸鹽緩衝液通常能起作用。4℃溫育也能增加TPO合適摺疊的量。
經過第一個C4步驟純化後，TPO的重摺疊產量通常為40-60％(根據用於重摺疊反應的還原和變性TPO的量)。雖然因為大量沉澱和在TPO重摺疊過程中非TPO蛋白質的幹擾產量會減少，但當製備物純化度較低(例如直接在Superdex 200柱或最初的折射體抽提之後)時，能夠得到活性物質。
因為TPO含有4個半胱氨酸殘基，這種個蛋白質可能形成3種不同的二硫鍵形式形式1二硫鍵位於半胱氨酸殘基1-4和2-3之間形式2二硫鍵位於半胱氨酸殘基1-2和3-4之間形式3二硫鍵位於半胱氨酸殘基1-3和2-4之間。
在確定重摺疊條件的最初實驗中，通過C4反相柱色譜得到了幾個不同的含TPO蛋白質的峰。在這些峰中，只有一個在Ba/F3測定中表現出明顯的生物活性。隨後，優化重摺疊條件以優先產生這一形式。在這些條件下，從增溶步驟得到的所有單體TPO的錯摺疊形式低於10-20％。
使用質譜法和蛋白質測序(從氨基末端起，依此給半胱氨酸編號)，確定了具有生物活性TPO的二硫鍵形式為1-4和2-3。這種半胱氨酸的交聯形式同已知的相關紅細胞生成素分子的二硫鍵形式一致。
D.重組體、重摺疊TPO的生物活性在體和離體測定中，重摺疊並純化的TPO都有活性。例如在Ba/F3測定中，3.3pg/ml(0.3pm)的TPO(Met-11-153)對胸苷摻入Ba/F3細胞的刺激作用達到最大值的一半。在基於mpl受體的酶聯免疫吸附測定(ELISA)中，濃度為1.9ng/ml(120pM)時，活性達到最大值的一半。在正常動物和經過近致死X射線處理的骨髓抑制動物中，重摺疊TPO(Met-11-153)高效地刺激新血小板生成(在劑量低達30ng/鼠時，可觀察到活性)。經上述步驟重摺疊後的TPO的其他形式中，也可以觀察到類似的生物活性。
14.測量血小板生成素活性的方法血小板活性的測量可通過多種方法，例如實施例1所述的Ba/F3mpl配體測定、體內血小板回跳合成測定、以針對人白血病成巨核細胞系(CMK)的抗血小板免疫(抗GPIIbIIIa)測定的血小板細胞表面抗原的誘導測定(參見Sato等，Brit.J.Heamatol.，72184-190)(亦參見實施例4所述液體懸浮液巨噬細胞生成測定)以及成巨核細胞系(DAMI)中的多倍體化的誘導(參見Ogura等，Blood(1)，7249-60)。從未成熟的、大多沒有DNA合成的巨噬細胞成熟為形態可鑑別的巨噬細胞的過程包括胞質內出現細胞器，獲取膜抗原(GPIIbIIIa)及如發明背景中所述的核內複製及釋放血小板。需要一個譜系特異的成熟巨核細胞的啟動子(如mpl配體)來誘導未成熟巨噬細胞在成熟過程中的至少一部分這樣的變化，從而導致釋放血小板及緩和血小板減少。因此，已經設計了一些實驗來檢測未成熟的巨噬細胞系即CMK和DAMI細胞中這些參數的出現。CMK測定(實施例4)檢測特異血小板標記GPIIbIIIa以及血小板釋放的出現。DAMI測定(實施例15)則檢測核內複製，因為倍性的增加是巨噬細胞成熟的標誌。可識別的巨噬細胞有2N、4N、8N、16N、32N等倍數值。最後，體內鼠血小板回跳測定(實施例16)可用來證明，施用測試化合物(此處是mpl配體)將導致血小板數的增加。
另外又發展了兩種離體測定法來檢測TPO活性。第一種是激酶受體激活(KIRA)酶聯免疫吸附測定，其中用mpl-Rse嵌合體轉染CHO細胞並在將嵌合體的mpl部分暴露於mpl配體以後，用酶聯免疫吸附測定檢測Rse的酪氨酸磷酸化(參見實施例17)。第二種是基於受體的酶聯免疫吸附測定，其中用包被兔抗人IgG的酶聯免疫吸附測定板來捕獲與待測mpl配體結合的人嵌合受體mpl-IgG。mpl配體的一個生物素標記的免多克隆抗體被用來檢測結合的mpl配體，並以實施例18所述鏈黴抗生物素蛋白-過氧化物酶來測定。
15.用TPO處理的正常鼠和經亞致死輻射的鼠的體內生物反應正常鼠和經亞致死輻射的鼠都用截短的和全長的TPO來處理，其中TPO從中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、大腸桿菌和人胚腎細胞(293)中分離。從這三種宿主中得到的TPO兩種形式都能刺激鼠的血小板生成，但是，分離自CHO的全長TPO表現出了最強的體內反應。這些結果表明，最適的體內活性可能需要在羧基末端結構域進行合適的糖基化。
(a)大腸桿菌-rhTPO(Met-1，153)每天，將大腸桿菌(參見實施例23)產生的EPO結構域的「Met」形式(-1位置的甲硫氨酸加上人TPO的前153個殘基)注射入正常的雌性C57 B6鼠，方法如圖25A、25B和25C的說明。這些圖顯示，由大腸桿菌產生並以上述方法重摺疊的TPO未糖基化截短形式能夠刺激正常鼠中血小板數量增加2倍，而不影響紅細胞和白細胞的數量。
如圖26A、26B和26C的說明，每天將同樣的分子注射入亞致死輻射(137Cs)的雌性C57 B6鼠，可刺激血小板的回覆以及提高水平，但對紅細胞或白細胞沒有效應。
(b)CHO-rhTPO332如27A、27B和27C的說明，每天將由CHO產生的TPO全長形式注射入雌性C57 B6鼠，能夠使正常鼠的血小板數量增加5倍，但對紅細胞和白細胞球的數量沒有效應。
(c)CHO-rhTPO332；大腸桿菌-rhTPO(Met-1，153)；293-rhTPO332和大腸桿菌-rhTPO155如圖28的說明，用rhTPO處理正常鼠構建劑量反應曲線，其中rhTPO來自不同細胞系(CHO-rhTPO332；大腸桿菌-rhTPO(Met-1，153)；293-rhTPO332；和大腸桿菌-rhTPO155)。這個圖顯示，這種分子的所有受測形式都能刺激血小板的生成，但CHO產生的全長形式具有最強的體內活性。
(d)CHO-rhTPO153；CHO-rhTPO「截短的」和CHO-rhT-PO332同樣，如圖29的說明，用CHO(CHO-rhTPO153；CHO-rhT-PO「截短的」和CHO-rhTPO332)產生的多種形式的rhTPO處理正常鼠構建劑量反應曲線。這個圖顯示，該分子的所有受測CHO形式都刺激血小板的生成，但全長的70千道爾頓形式有最強的體內活性。
16.mpl配體及變異體的一般重組製備優先採用標準重組程序製備mpl配體培養用表達mpl配體的核酸轉染(一般用一種表達載體轉化細胞)的細胞，產生mpl配體多肽，從細胞中回收多肽。但是，也可認為，mpl配體的產生是通過同源重組或者重組產生方法，其中後者是將控制元件引入已經含編碼mpl配體的DNA的細胞。例如，可將一個強啟動子/增強子元件、抑制基因、或外源轉錄調節元件插入到指定宿主細胞的基因組，插入位置的鄰近和方向足以影響編碼所需mpl配體多肽的DNA的轉錄。控制元件不編碼mpl配體，而該DNA是宿主細胞原有的。接著，可以根據需要進行篩選以得到產生本發明的受體多肽的細胞，或者得到表達水平增強或減低的細胞。
因此，本發明期待一種產生mpl配體的方法，要求該方法能將一個轉錄調節元件插入含mpl配體核酸分子的細胞基因組，插入位置的足夠鄰近和方向對該核酸分子的轉錄有影響。或者更進一步的步驟還應該包括培養含有轉錄調節元件和核酸分子的細胞。本發明還期待一種宿主細胞，其中含有的內源mpl配體核酸分子可操作地與被宿主細胞識別的外源控制序列結合。
A.編碼mpl配體多肽的DNA的分離編碼mpl配體多肽的DNA可以從任何cDNA文庫中得到，該cDNA文庫的製備是來自確信含有mpl配體mRNA並能以可檢測水平表達的組織。mpl配體基因也可以從某個基因組DNA文庫或者通過完整核苷酸或胺基酸序列的體外寡核苷酸合成而獲得。
用設計好的探針篩選文庫，以獲得目標基因及其編碼的蛋白質。對於cDNA表達文庫，合適的探針包括能識別和特異性結合mpl配體的單克隆或多克隆抗體。對於cDNA文庫，合適的探針包括長度約20-80個鹼基的寡核苷酸，能編碼來自相同或不同物種的mpl配體cDNA的已知或未知部分；也包括編碼相同或相似基因的互補或同源cDNA或其片段。篩選基因組DNA文庫的合適探針包括(但不限於)編碼相同或相似基因的寡核苷酸、cDNA或它們的片段和/或同源基因組DNA或其片段。Sambrook等(同上)的10-12章中所述的標準程序可作為用選定的探針篩選cDNA或基因組文庫的指導。
分離編碼mpl配體基因的另一個方法是PCR，如Sambrook等(同上)第14部分所述。這個方法需要使用能夠與編碼mpl配體的DNA雜交的寡核苷酸探針。選擇寡核苷酸的策略如下所述。
實踐本發明的一個優選方法是，用精心選擇的寡核苷酸序列篩選來自多種組織的cDNA文庫，較佳地那些組織是人或豬腎(成體或胚胎)或者肝細胞系。例如，人胚肝細胞系cDNA文庫用寡核苷酸探針篩選。或者，人基因組文庫用寡核苷酸探針篩選。
被選作探針的寡核苷酸序列應有足夠的長度，並且要有足夠的精確性使假陽性達到最小。通常，實際使用的核苷酸序列是根據mpl配體密碼子豐餘性最小的區域設計。該寡核苷酸可能在一個或幾個位置呈簡併性。對於從一個優選的密碼子使用是未知的物種中篩選文庫來說，簡併性寡核苷酸的使用是極其重要的。
該寡核苷酸必須被標記，從而使它能夠在與被篩選文庫的DNA雜交時被檢測出來。標記的優選方法是用ATP(如γ32P)和多聚核苷酸激酶放射性標記寡核苷酸的5′末端。但是，其他方法也可用於標記寡核苷酸，包括(但不限於)生物素或酶標記。
最令人感興趣的是能編碼全長mpl配體多肽的mpl配體核酸。在一些優選例子中，其核酸序列包括了天然mpl配體信號序列。使用推導的胺基酸序列篩選選擇的cDNA或基因組文庫，可以得到具有所有蛋白質編碼序列的核酸。
B.天然mpl配體的胺基酸序列變異體mpl配體的胺基酸序列變異體的製備方法為將適當的核苷酸變化引入mpl配體DNA中或通過所需mpl配體多肽的體外合成。例如這類變異體包括豬mpl配體胺基酸序列中殘基的缺失、插入或置換。例如可通過在體或離體的蛋白酶解切割作用或者通過克隆並表達一個片段或編碼全長mpl配體的DNA來去除成熟全長mpl配體的羧基末端部分，從而得到一個具有生物活性的變異體。只要最終的構建物有所需的生物活性，因此可將缺失、插入和置換任意組合來形成最終的構建物。胺基酸的變化也許還能改變mpl配體的轉譯後加工過程，例如改變糖基化位點的數量和位置。對於mpl配體胺基酸序列變異體的設計，突變位點和突變性質由將要被改變的mpl配體特性決定。突變位點的改變可每次一個或每次一系列，例如(1)根據需要達到的效果，首先保守地、然後更激進地作出選擇來置換；(2)去除靶殘基；(3)在指定的位點附近插入同類或不同類的殘基，或者將選擇1-3的組合。
如Cunningham和Wells，Science，在2441081-1085中所述，「丙氨酸掃描誘變」是確定mpl配體多肽的某些殘基或區域為誘變的優選位置的一個有用方法。在這裡，可以確定一個殘基或一組靶殘基(如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和穀氨酸等帶電殘基)並可被任何胺基酸替換(最好是丙氨酸或聚丙氨酸)，但如以中性或帶負電荷的胺基酸替換也較好。替換的結果影響了胺基酸與細胞內或細胞外的周圍水溶液環境的相互作用。對置換產生功能性敏感這些結構域，可通過在置換位點引入進一步的其他變異來將其精製。因此，當預先決定引入一個胺基酸序列變異的位點時，則突變本身的性質不需要被預定。例如，為了在某個指定位點優化突變行為，在靶密碼子或靶區域處實施丙氨酸掃描或隨機誘變並篩選出表達的mpl配體變異體以獲得所需活性的最佳組合。
在構建胺基酸序列變異體中，有兩個主要的變項突變位點的定位以及突變的性質。例如，mpl配體多肽的變異體包括mpl配體序列的變異體，並可能代表了自然形成的等位基因(不需要mpl配體DNA的操作)或預定的突變體形式(將DNA突變成自然界中未發現的等位基因或變異體)。通常，突變的位置和性質根據待修飾的mpl配體特性來選擇。
胺基酸序列缺失通常有約1-30個殘基，約1-10個殘基更好，而且殘基的缺失一般是連續的。或者，mpl配體的胺基酸序列缺失可能包括羧基末端糖基化結構域的一部分或全部。胺基酸序列的缺失也可能包括成熟蛋白質的最初6個氨基末端殘基中的一個或幾個。可選擇的胺基酸缺失包含存在於「螺旋束」之間的一個或多個環區域中的一個或多個殘基。連續的缺失通常為偶數殘基，但單個或奇數殘基的缺失也屬於這一範疇。在具有絕大部分序列一致性的mpl配體之間的低同源區可引入缺失以修飾mpl配體的活性。或者，在人mpl配體和具有與人mpl配體絕大部分序列一致性的其他哺乳動物mpl配體多肽之間的低同源區，也可引入缺失。在與另一哺乳動物mpl配體基本同源的某個哺乳動物mpl配體多肽區域引入缺失，更可能使該mpl配體的生物活性發生更顯著的變化。要選擇好連續缺失的殘基數目，以維持mpl配體效應結構域中的三級結構，如β摺疊或α螺旋。
胺基酸序列的插入包括氨基和/或羧基末端的融合，其長度可以從一個殘基到一百個甚至更多殘基的多肽；同時也包括了單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。序列內插入(即成熟mpl配體序列內的插入)一般有約1至10個殘基，1至5個殘基更好，最好有1至3個殘基。一個典型的融合發生在mpl配體或其片段與另一個細胞因子或其片段之間。末端插入的例子包括具有一個N-末端甲硫氨醯的成熟mpl配體、在重組細胞培養物中成熟mpl配體直接表達的人工構建物以及一個異源N-末端信號序列與成熟mpl配體分子N-末端的融合，後者可促進重組宿主分泌成熟的mpl配體。這種信號序列通常來自指定的宿主細胞種類，並與之同源。合適的序列包括大腸桿菌的STII或Ipp、酵母的α因子和病毒信號如哺乳動物細胞的皰疹gD。
其他mpl配體分子的插入變異體包括mpl配體N-末端或C-末端與具有免疫原性的多肽的融合體(即施用的融合體對宿主而言是外源的)，免疫原性多肽有細菌多肽如β乳糖酶或大腸桿菌trp基因座編碼的酶或酵母蛋白；還包括半衰期長的蛋白質與C末端的融合體，前者如免疫球蛋白恆定區(或其他免疫球蛋白區)、白蛋白或鐵蛋白，參見1989年4月6日發表的WO89/02922。
第三類變異體是胺基酸置換變異體。這些變異體中，至少有一個mpl配體分子的胺基酸殘基被去除並在原處插入一個不同的殘基。置換誘變最感興趣的位點包括確認是mpl配體活性位點的部位和下述部位。在這樣的部位中，由於側鏈的體積、帶電或疏水性，與其他類似物中的胺基酸基本不同；但對於選定的位點而言，多種mpl配體種類和/或某個mpl配體成員在多種動物的類似物之間，也存在高度的序列同一性。
在其他感興趣的位點中，來自多種家族成員或動物種類的mpl配體的特定殘基完全相同。這些位點以相對保守的方式進行置換，尤其是那些處於至少含有3個其他完全相同的保守位點的序列部位。這樣的保守置換參見表3中標題為優選置換的部分。如果這樣的置換導致生物活性的變化，那麼將引入更多實質性的變化並篩選出產物，這些實質性變化參見表3中典型置換部分或參考以下對胺基酸類型的進一步描述。
表3原來的殘基典型的置換 優選的置換Ala(A)Val；Leu；Ile ValArg(R)Lys；Gln；Asn LysAsn(N)Gln；His；Lys；Arg GlnAsp(D)Glu GluCys(C)Ser SerGln(Q)Asn AsnGlu(E)Asp AspGly(G)Pro ProHis(H)Asn；Gln；Lys；Arg ArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸LeuLeu(L)亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe IleLys(K)Arg；Gln；Asn ArgMet(M)Leu；Phe；Ile LeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala LeuPro(P)Gly GlySer(S)Thr ThrThr(T)Ser SerTrp(W)Tyr TyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；Ser PheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；Ala正亮氨酸 Leumpl配體功能或免疫一致性的基本修飾作用通過選擇置換來完成，這些置換根據其維持下列情況的效應而有顯著的差異(a)置換區域中多肽主鏈的結構，例如一個摺疊或螺旋構象，(b)靶位點處分子的帶電性或疏水性，或(c)側鏈的體積。根據一般的側鏈特性，天然形成的殘基被分成以下類型(1)疏水性正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸(2)中性親水性半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸(3)酸性天門冬氨酸、穀氨酸(4)鹼性天門冬醯胺、穀氨醯胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸(5)影響鏈方向的殘基甘氨酸、脯氨酸(6)芳香族色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸非保守的置換必須是由上述類型中的一個殘基替換另一個類型中的殘基。這樣的置換殘基也可被引入保守性置換位點或較佳地引入保留的(非保守性)位點。
在本發明的一個例子中，希望能使分子中存在的一個或多個蛋白酶切割位點失活。這些位點通過檢查編碼的胺基酸序列來確定，例如對於胰蛋白酶，就要尋找賴氨酸或精氨酸殘基。在確定了蛋白酶切割位點以後，就通過以下方法使它們對蛋白酶切割沒有作用靶殘基的置換，用於置換的殘基最好是鹼性殘基如穀氨醯胺或疏水性殘基如絲氨酸；去除該殘基；或者緊接該殘基後插入一個脯氨酸。
在另一例了中，除了信號序列的起始甲硫氨酸殘基以外的任何甲硫氨酸殘基以及位於每一該甲硫氨酸殘基N-末端或C-末端約3個殘基以內的任何殘基都被另一個殘基置換(最好依照表3)或被去除。或者，在該位點附近插入約1至3個殘基。
任何涉及維持mpl配體適當構象的半胱氨酸殘基也可以被置換，以提高分子的氧化穩定性和防止異常的交聯，用於置換的殘基通常為絲氨酸。已經發現，從氨基末端起的epo結構域中第一個和第四個半胱氨酸對於維持適當的構象是必需的，但第二個和第三個非必需。相應地，epo結構域中第二個和第三個半胱氨酸可以被置換。
編碼mpl配體變異體的核酸分子可以用本領域已知的多種方法製備。這些方法包括(但不限於)從自然來源分離(對於自然形成的胺基酸序列變異體)或以寡核苷酸介導的(或定位)誘變來製備、PCR誘變、以及對mpl配體多肽的一個已製備的變異體或非變異體形式進行盒式誘變。
寡核苷酸介導的誘變是製備mpl配體DNA的置換、缺失和插入變異體的一個優選方法。參見Adelman等，DNA，2183，這一技術已經廣為人知。簡單來說，通過將編碼所需突變的寡核苷酸與一個DNA模板雜交使mpl配體DNA發生變化，模板是含有mpl配體的未變或天然DNA序列的質粒或噬菌體的單鏈形式。雜交之後，使用DNA聚合酶合成完整的互補於模板的第二條鏈，由此，該鏈可以摻入寡核苷酸引物，並為mpl配體DNA中選定的變化而進行編碼。
通常，要使用長度至少有25個核苷酸的寡核苷酸。最適的寡核苷酸有12至15個核苷酸，並且在編碼突變的核苷酸兩邊，都與模板完全互補。這就確保了該寡核苷酸能與單鏈DNA模板分子正確地雜交。該寡核苷酸可以使用本領域上已知的技術容易地合成，參見Crea等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，755765。
DNA模板由載體產生，這些載體可以是噬菌體M13載體的衍生物(商購的M13mp18和M13mp19是合適的載體)，也可以是經過複製得到的單鏈噬菌體，參見Viera等，Meth.Enzymol.，1533。因此，可將需要突變的DNA插入上述一種載體中，從而產生單鏈模板。單鏈模板的產生參見Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY 1989)中4.21-4.41部分。
或者，單鏈DNA模板可以用標準技術通過變性雙鏈質粒或其他DNA而得到。
在合適的雜交條件下，將寡核苷酸雜交於單鏈模板可使天然的DNA序列發生變化(如產生胺基酸序列變異體)。然後，加入某種DNA聚合酶，通常是DNA聚合酶I的Klenow片段，合成模板的互補鏈，而該寡核苷酸則作為合成的引物。於是，就形成了一個異源雙鏈分子，其中一條DNA鏈編碼mpl配體的突變形式，另一條鏈(原始模板)則編碼mpl配體的天然的、未變序列。再將該異源雙鏈分子轉化到合適的宿主細胞，通常是原核細胞如大腸桿菌JM101。細胞經過生長以後，將其塗布於瓊脂糖平板，並用32P放射性標記的寡核苷酸引物進行篩選，以鑑定含有突變DNA的菌落。將突變區去除並置入合適的產生蛋白質的載體，通常這類表達載體用作轉化合適的宿主。
可將上述方法加以修飾，以產生同源雙鏈分子即質粒的兩條鏈都含有突變。修飾的方式如下所述。將單鏈寡核苷酸與上述的單鏈模板一起退火。將脫氧腺苷三磷酸(dATP)、脫氧胸苷三磷酸(dTTP)、脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)這三種脫氧核苷酸的混合物與被稱為dCTP-(aS)的硫代脫氧胞苷三磷酸(可從Amersham公司獲得)相結合。將混合物加入模板-寡核苷酸複合物。在得到的混合物中加入DNA聚合酶以後，就得到了與模板相同的一條DNA鏈，其中突變鹼基除外。另外，在新合成的DNA鏈中，dCTP-(aS)代替了dCTP，保護其不受限制性內切酶的消化。
使用合適的限制酶在該異源雙鏈的模板鏈上產生一個缺口，然後，用ExoIII核酸酶或其他不作用於突變位點區域的合適的核酸酶將模板鏈消化。反應終止後，得到一個部分單鏈的分子。在加入所有4種脫氧核苷三磷酸、ATP和DNA連接酶以後，使用DNA聚合酶以合成完整的DNA同源雙鏈分子。如上所述，該同源雙鏈分子可被轉化入合適的宿主細胞如大腸桿菌JM101。
編碼一個以上胺基酸置換的mpl配體突變體的DNA可由幾種方法中的某一個來產生。如果置換的胺基酸在多肽鏈上的位置彼此較近，可以用一個寡核苷酸將它們同時突變，只要該寡核苷酸能編碼所有預想被置換的胺基酸。但是，如果這些胺基酸的位置彼此有一定距離(被多於10個胺基酸分開)，產生單個能編碼所有預想變化的寡核苷酸就更困難。可使用下述兩個變通方法中的一個來解決。
第一個方法，產生一個分離的寡核苷酸來對應每一個被置換的胺基酸。將該寡核苷酸與單鏈模板DNA一起退火，從模板合成的第二條DNA可編碼所有預想的胺基酸置換。
第二種方法需要兩次或更多的誘變循環以得到預想的突變體。第一次循環過程與上述單突變型相同野生型DNA作為模板，編碼第一個預想胺基酸置換的寡核苷酸與模板一起退火，然後產生異源雙鏈DNA分子。誘變的第二次循環將第一次誘變循環產生的突變DNA作為模板。所以，該模板已經含有一個或多個突變。然後，將編碼其他預想胺基酸置換的寡核苷酸與該模板一起退火，於是就得到了一條DNA鏈能夠編碼第一次和第二次誘變循環中的突變。這樣得到的DNA就可以在第三次循環中作為模板，如此等等。
PCR誘變也適用於產生mpl配體多肽的胺基酸變異體。雖然以下討論僅指DNA，但應理解該技術同樣適用於RNA。PCR技術通常包括以下程序(參見Erlich，同上R.Higuchi所著章節的61至70頁)PCR中以少量模板DNA作為起始物質，使用與模板DNA相應區域的序列有輕微差異的引物，能夠產生相對大量的特異DNA片段，其序列僅在引物與模板不同的位置與模板有差異。為了將突變引入一個質粒DNA，需要設計一個引物與突變位置重疊並含有該突變；另一個引物的序列必須與質粒互補鏈的一部分序列完全相同，但該序列可以定位於質粒DNA上的任何位置。但是，第二個引物的序列最好定位於距離第一個引物序列200個核苷酸以內，這樣可使最後得到的與引物連接的整個DNA擴增區域能夠容易地被測序。正如上文所述，PCR擴增使用一對引物來產生大量的某個DNA片段，該DNA片段的差異可能在引物中特異的突變位置，也有可能在其他位置，因為模板的複製有時產生易錯。
如果模板與產物比率非常低，則絕大部分產生的DNA片段摻入了預想的突變。使用標準DNA技術，可將該產物替代作為PCR模板的質粒上的相應區域。在分開位置上的突變可同時引入，引入方法可以是使用一個突變型的第二種引物，也可以是用不同的突變型引物作第二次PCR並通過三步(或更多)連接反應將得到的兩個PCR片段同時連接於載體片段。
在PCR誘變的一個特殊例子中，模板質粒DNA(1微克)經限制性內切酶的消化作用而線性化，該限制性內切酶在質粒DNA被擴增區域以外的部分只有單一的識別位點。將100納克該產物加入含PCR緩衝液的PCR混合物中，在終體積為50微升的PCR混合物中，有GeneAmp配套試劑中(來自Perkin-Elmer Cetus公司，Norwalk，CT和Emeryville，CA)的四種脫氧核苷三磷酸和兩種寡核苷酸引物各25皮摩爾。用35微升礦物油覆蓋反應混合物。反應混合物在100℃變性5分鐘後，放置冰上並在礦物油層下加入1微升棲熱水生菌(Taq)DNA聚合酶(每微升5單位，購自Perkin-Elmer Cetus公司)。然後，將反應混合物置於DNA Thermal Cycler儀(購自Perkin-Elmer Cetus公司)中，如下設置程序2分鐘，55℃30秒，72℃，然後是以下步驟的19個循環30秒，94℃30秒，55℃和30秒，72℃。
在以上程序結束以後，反應小瓶取出thermal cycler儀，將水相轉移到新的小瓶中，酚/氯仿抽提(體積50∶50)，乙醇沉澱，並按標準程序回收DNA。接著，對該產物作適當的處理使之插入載體。
盒式誘變是另一種製備變異體的方法，其技術依據參見Wells等，Gene，34315。起始物質為含有將要被突變的mpl配體DNA的質粒(或其他載體)。在mpl配體DNA中，將要被突變的密碼子是確定的。在確定的突變位點的每一側都必須有單一的限制性內切酶位點。如果這樣的限制性位點不存在，可使用上述寡核苷酸介導的誘變方法將其引入到mpl配體DNA的合適位置。將限制性位點引入到質粒以後，在這些位點切割質粒使之線性化。用標準程序合成能編碼限制性位點之間DNA序列但含有預定突變的雙鏈寡核苷酸。兩條鏈分別合成，並以標準技術使之雜交。該雙鏈寡核苷酸被稱為盒。這個盒被設計成含有與線性化質粒末端相容的3′端和5′端，使之能直接與質粒連接。此時，該質粒已經含有mpl配體DNA序列。
C.可複製載體中核酸的插入將編碼天然或變異mpl配體多肽的核酸(如cDNA或基因組DNA)插入可複製的載體用於進一步的克隆(DNA的擴增)或表達。有許多可用載體，而合適載體的選擇是根據(1)是否該載體將用於DNA擴增或表達，(2)被插入載體的核酸大小和(3)將被該載體轉化的宿主細胞。每一種載體根據它的功能(DNA的擴增或表達)和與它相適應的宿主細胞可含有多種成份。載體的成份通常包括(但不局限於)下述的一種或幾種一個信號序列、一個複製起始點、一個或多個標記基因、一個增強子元件、一個啟動子和轉錄終止序列。
(i)信號序列成份本發明的mpl配體不僅能直接表達，而且能以與異源多肽的融合形式表達，該異源多肽最好是一個在成熟蛋白質或多肽的N-末端有一個特異性切割位點的信號序列或其他多肽。通常，該信號序列可以是載體的一個成份，或者是插入載體的mpl配體DNA的一部分。被選擇的異源信號序列必須能被宿主細胞識別或屬於宿主細胞(即能被一個信號肽酶斷裂)。對於不能識別或不具有天然mpl配體信號序列的原核宿主細胞，該信號序列被選定的原核信號序列替代，例如從一組鹼性磷酸酶、青黴素酶、Ipp或熱穩定腸毒素II前導區中選定信號序列。對於酵母的分泌，可以替代天然信號序列的例子有酵母轉化酶、α因子、酸性磷酸酶前導區、白色念珠菌葡糖澱粉酶(1990年4月4日出版的EP362,179)或1990年11月15日出版的WO90/13646中所述的信號。對於哺乳動物的表達，天然的信號序列(即指導體內天然哺乳動物細胞分泌mpl配體作的mpl配體前導序列)是令人滿意的，雖然其他哺乳動物的信號序列也可能是合適的，例如來自其他mpl配體多肽或來自一個不同動物種類的相同mpl配體的信號序列、來自一個mpl配體的信號序列、來自相同或相關物種的分泌多肽的信號序列、以及病毒分泌前導區如皰疹單顯性組合gD信號。
(ii)複製起始點成份表達和克隆載體都含有一個核酸序列，該序列使載體能在一個或幾個選擇的宿主細胞中複製。通常，在克隆載體中，該序列使載體獨立於宿主染色體細胞DNA而複製，並含有複製起點或自主性複製序列。這個序列廣泛分布於細菌、酵母和病毒之中。來自pBR322質粒的複製起始點適合於大多數革蘭氏陰性細菌；2μ質粒起始點適合於酵母菌；而多種病毒起始點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)則對哺乳動物細胞中的克隆載體有用。通常，哺乳動物表達載體不需要複製起始點成份(通常要使用SV40起始點，只是因為它含有早期啟動子)。
大多數表達載體是「穿梭」載體，即它們能在至少一類生物體中複製但能被轉染到另一種生物體中進行表達。例如，將一個載體在大腸桿菌中克隆，然後將同一個載體轉染到酵母菌或哺乳動物細胞中進行表達，即使它不能獨立於宿主細胞染色體而複製。
同樣可通過插入宿主基因組擴增DNA。這一過程可通過以桿菌作為宿主容易地完成，例如在載體中加入一個互補於桿菌基因組DNA上某個序列的DNA序列。用該載體轉染桿菌，產生桿菌基因組與插入的mpl配體DNA之間同源重組。然而，編碼mpl配體的基因組DNA的回收比外源複製載體的回收更複雜，因為需要限制酶的消化作用來切割mpl配體DNA。
(iii)選擇基因成份表達和克隆載體應該含有一個選擇基因，亦稱選擇標記。該基因編碼轉化宿主細胞在選擇培養基上存活和生長所必須的一個蛋白質。未經含選擇基因的載體轉化的宿主細胞不能在培養基上存活。典型的選擇基因編碼的蛋白質有(a)提供對抗生素或其他毒素抗性，如氨苄青黴素、新黴素、氨甲蝶呤或四環素，(b)互補營養缺陷型的缺陷或(c)提供複合培養基中沒有的重要營養物，如編碼桿菌D丙氨酸消旋酶的基因。
選擇計劃的一個例子是使用藥物以阻止宿主細胞的生長。那些用異源基因成功轉化的細胞表達一個藥物抗性的蛋白質並能在選擇條件下存活。這種優勢選擇的幾個例子使用的藥物為新黴素(South-ern等，J.Molec.Appl.Genet.1327)、黴酚酸(Mullgan等，Science，2091422)或潮黴素(Sugden等，Mol.Biol.，5410-413)。上述三個例子在真核控制下，使用細菌基因來表達對適當藥物的抗性，相應的藥物為G418或新黴素(遺傳黴素)、xgpt(黴酚酸)、潮黴素。
其他適合哺乳動物細胞的選擇性標記的例子是那些能鑑別細胞成份含有mpl配體核酸的標記，如二氫葉酸(DHFR)或胸苷激酶。哺乳動物細胞轉化體處於選擇性壓力下，只有轉化體由於含有標記而適應並存活。在培養基中連續地改變選擇試劑的濃度的條件下，對培養的轉化體施以選擇壓力，其結果是導致選擇基因和編碼mpl配體多肽的DNA都被擴增。在這樣的擴增過程中，連續傳代的重組細胞染色體中，因生長所必須的一種蛋白質需求量增加的基因以串聯形式重複。擴增的DNA使mpl配體合成的量增加。
例如，用DHFR選擇基因轉化的細胞的鑑定首先通過在含有一種DHFR競爭性拮抗劑氨甲蝶呤(Mtx)的培養物中，培養所有的轉化體。當運用野生型DHFR時，缺乏DHFR活性的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系是一種合適的宿主細胞，關於其製備與增殖，參見Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216。接著，將轉化細胞暴露於濃度增高的Mtx。這導致了多拷貝DHFR基因合成以及隨之而來的其他構成表達載體的DNA如編碼mpl配體的DNA的拷貝數增加。如果使用了對Mtx有高度抗性的突變型DHFR基因(EP117,060)，有內源的DHFR，這一擴增技術也可適用於任何其他合適的宿主，如ATCC No.CCL61 CHO-K1。或者，用編碼mpl配體、野生型DHFR蛋白質和另一種選擇性標記。如氨基糖苷類3′轉磷酸酶的DNA序列轉化或共轉化的宿主細胞[尤其是含有內源DHFR的野生型宿主]，可在含選擇劑的培養物中通過細胞生長所選擇，其中，用於選擇性標記的選擇劑為氨基糖苷類抗生素等，如卡那黴素、新黴素或G418。參見U.S.專利號4,965,199。
適合於酵母中使用的一個選擇基因是出現於酵母質粒YRp7的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，28239；Kingsman等，Gene，7141或Tschemper等，Gene，10157)。trp1基因將一個選擇標記提供給在色氨酸中生長能力缺失的酵母菌突變型株，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics，8512)。於是，酵母菌宿主細胞基因組中的trp1缺失提供了一種效應環境，用於通過在無色氨酸情況下的生長來檢測轉化。類似地，Leu2缺陷的酵母菌株(ATCC No.20,622或38,626)與已知的攜帶Leu2基因的質粒互補。
(iv)啟動子成份表達和克隆載體通常含有一個啟動子，可被宿主生物體識別並可操作地連接mpl配體核酸。啟動子是非翻譯序列，可操作地與一個結構基因(通常在約100至1,000bp之間)連接，並位於控制特定核酸序列如mpl配體核酸序列轉錄和翻譯的結構基因起始密碼子的上遊(5′)。這種啟動子通常分為誘導型和組成型兩類。誘導型啟動子能夠控制DNA轉錄，使轉錄水平開始增加，這種作用是隨培養條件中的某些變化如一種營養物的存在與否或者溫度的變化而出現。現在，已經知道了能被許多潛在的宿主細胞識別的大量啟動子。經限制性酶的消化作用將啟動子從源DNA上切除下來，將分離的啟動子序列插入載體，從而使這些啟動子可操作地連接編碼mpl配體的DNA。天然的mpl配體啟動子和許多異源啟動子都能用來指導mpl配體DNA的擴增和/或表達。但是，異源的啟動子更好一些，因為與天然的mpl配體啟動子相比較，它們通常能容許更強的轉錄和更高的mpl配體表達產量。
適用於原核宿主的啟動子包括β內醯胺酶和乳糖啟動子系統(Chang等，Nature，275615)、鹼性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(Goeddel，Nucleic Acid Res.，84057和EP36,776)和tac啟動子等雜交啟動子(deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25)。然而，其他已知的細菌啟動子是合適的。它們的核苷酸序列已經發表，因此，使用接頭或銜接子提供所需的限制性位點，一個熟練的工作人員可操作地將它們連接編碼mpl配體的DNA(siebenlist等，Cell，20269)。用於細菌系統的啟動子也含有一個Shine-Dalgarno(S.D.)序列，可操作地連接編碼mpl配體多肽的DNA。
真核細胞也有啟動子序列。實際上，所有真核基因轉錄起始位點上遊約25至30個鹼基處，都有一個AT富集區。在許多基因轉錄起始點上遊70至80個鹼基處，還發現了另一段序列稱為CXCAAT區，其中X可以是任何核苷酸。在大多數真核基因的3′末端有AATAAA的序列，也許是在編碼序列3′末端加入多聚A尾的信號。所有這些序列可以合適地插入真核表達載體。
酵母菌宿主使用的合適啟動序列的例子有3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.，2552073)或其他糖酵解酶(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.，7149和Holland，Biochemistry，174900)的啟動子，如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶和葡萄糖激酶。
其他酵母菌啟動子即由生長條件控制並有額外轉錄優勢的誘導型啟動子，是下列物質的啟動子區域乙醇脫氫酶2、異構細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶以及與麥芽糖和半乳糖使用有關的酶。關於酵母菌表達中使用的合適載體和啟動子的進一步描述參見Hitzeman等，EP73,657A。酵母菌增強子與酵母菌啟動子一起使用也是有利的。
舉例來說，哺乳動物宿主細胞中載體的mpl配體轉錄由啟動子控制，這裡的啟動子來自病毒基因組，如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日出版，UK2,211,504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、一種逆轉錄病毒、B型肝炎病毒、最好是猿猴病毒40(V40)；來自異源的哺乳動物啟動子，如肌動蛋白啟動子和免疫球蛋白啟動子；來自熱休克啟動子；也可來自通常與mpl配體相關的mpl配體序列，只要這些啟動子與宿主細胞系統相容。
SV40病毒的早期和晚期啟動子可以作為一個SV40限制性片段而方便地得到，其中還含有SV40病毒的複製起始(Fiers等，Na-ture，273113；Mulligan和Berg，Science，2091422-1427；Pavlakis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，787398-7402)。巨細胞病毒立即早期啟動子可以作為HindIIIE限制性片段方便地得到(Greenway等，Gene，18355-360)。以牛乳頭瘤病毒為載體在哺乳動物宿主中表達DNA的一個系統的描述參見U.S.專利號4,419,446。U.S.專利號4,601,978則是該系統的一個改進。其他還可參考Gray等，Nature，295503-508中關於在猿猴細胞中編碼免疫幹擾素cDNA的表達；Reyes等，Na-ture，297598-601中關於在皰疹單顯性組合病毒胸苷激酶啟動子的控制下，人β-幹擾素cDNA在鼠細胞中的表達；Canaani和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，795166-5170中關於人β1幹擾素基因在培養的鼠和兔細胞中的表達；以及Gorman等，Proc.Natl.Sci.USA，796777-6781中關於以Rous肉瘤病毒長末端重複序列為啟動子，細菌CAT序列在CV-1猿猴腎細胞、雞胚成纖維細胞、中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞和鼠NIH-3T3細胞中的表達。
(v)增強子成份在本發明中，經常通過在載體中插入一個增強子序列來增加較高等真核細胞中編碼mpl配體的DNA的轉錄。增強子是DNA的順式作用元件，通常約100至300bp，作用於一個增加其轉錄的啟動子。增強子的位置和方向相對獨立，在轉錄單位的5′端(Laimis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78993)和3′端(Lusky等，Mol.Cell Bio.，31108)都有發現，在一個內含子(Banerji等，Cell，33729)和它本身的編碼序列(Osborne等人，Mol.Cell Bio.，41293)之中也有發現。已知許多哺乳動物基因的增強子序列(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎兒球蛋白和胰島素)。但是，通常使用的增強子來自真核細胞病毒。例如，在複製起點晚期基因一側的SV40增強子(100-270bp)，巨細胞病毒早期啟動子增強子，在複製起點晚期基因一側的多瘤增強子和腺病毒增強子。參見Yaniv，Nature，29717-18中關於真核啟動子活化的增強元件。增強子可以被拼接到位於mpl配體編碼序列5′端或3′端的載體中，但優選的位點在啟動子的5′端。
(vi)轉錄終止成份真核宿主細胞(酵母菌、真菌、昆蟲、植物、動物、人或其他多細胞生物的含核細胞)中使用的表達載體也含有終止轉錄和穩定mRNA所需的序列。通常，這一序列來自5′端，偶爾來自真核細胞或病毒DNA或cDNA的3′端非翻譯區。這些區域含有在編碼mpl配體mRNA的非翻譯部分轉錄成多聚腺苷酸的核苷酸片段。
(vii)載體的構建和分析通過標準連接技術，構建含有以上所列成份中一個或多個的適用載體。對分離的質粒或DNA片段進行切割、改編和再連接，以預想的形式生成所需的質粒。
為分析確定構建質粒的正確序列，使用連接混合物轉化大腸桿菌K12菌株294(ATCC No.31,446)，根據情況以氨苄青黴素或四環素抗性來選擇成功的轉化體。用限制性內切酶消化製備、分析轉化體中的質粒和/或用Messing等，Nucleic Acids Res.，9309或Maxam等，Methods in Enzymology，65499中的方法測序。
(viii)瞬時表達載體在本發明的實施中特別有用的表達載體能提供哺乳動物細胞中編碼mpl配體多肽的DNA的瞬時表達。通常，瞬時表達要求使用一個能在宿主細胞中有效複製的表達載體，其有效的複製使宿主細胞中積累表達載體的許多拷貝，由此高水平地合成由表達載體編碼的所需多肽。參見Sambrook等，同上，pp.16.17-16.22。瞬時表達系統由合適的表達載體和宿主細胞組成，能方便地鑑定克隆DNA編碼的多肽並迅速地篩選該多肽以得到所需的生物和生理特性。因此，瞬時表達系統在本發明中對於鑑定具有mpl配體多肽生物活性的mpl配體多肽的類似物和變異體特別有用。
(ix)合適的脊椎動物細胞載體的例子在重組脊椎動物細胞培養物中，合成mpl配體的其他合適的方法、載體和宿主細胞參見Gething等，Nature，293620-625；Mantei等，Nature，28140-46；Levinson等，EP117,060和EP117,058。pRK5(EP307,247 U.S.專利號5,258,287)或pSVl6B(PCT出版號WO91/08291)是哺乳動物細胞培養物表達mpl配體的特別有用的質粒。D.宿主細胞的選擇和轉化上文所述的原核細胞、酵母菌或高等真核細胞都是克隆或表達本文中載體的合適宿主細胞。合適的原核細胞包括真細菌如革蘭氏陽性或陰性菌，例如大腸桿菌、枯草桿菌等桿菌、綠膿桿菌等假單胞菌、鼠傷寒沙門氏桿菌或粘質沙雷氏桿菌。雖然其他的菌株如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC No.31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC No.27,325)也是合適的，但大腸桿菌294(ATCC No.31,446)是優選的大腸桿菌克隆宿主。這些例子僅是用於說明，並非表示合適的宿主細胞只限於這些。較好地，宿主細胞分泌蛋白水解酶的量最少。另外，體外克隆方法如PCR或其他核酸聚合酶反應也是適用的。
除了原核細胞以外，真核微生物如絲狀真菌或酵母菌，是mpl配體編碼載體合適的宿主。釀酒酵母或普通的麵包酵母在低等真核宿主微生物中是最常用的。但是，通常可得到的一系列其它屬、種和菌株可用於本文中，如非洲粟酒裂殖酵母菌(Beach和Nurse，Na-ture，290140)；1985年5月2日發表的EP139,383)、克魯維酵母菌屬宿主(U.S.專利號4,943,529)如K.lactis(Louven-court等，J.Bacteriol.，737)、K.fragilis、K.bulgaricus、K.耐熱菌和K.marxianus、yarrowia(EP402,226)、Pichia pastoris(EP183,070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.，28265-278)、白色絲酵母、Trichoderma reesia(木黴菌屬)(EP244,234)、鏈孢黴crassa(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，765259-5263)和絲狀真菌如鏈孢酶屬、青黴屬、Tolypocladi-um(1991年1月10日出版的WO91/00357)和麴黴屬宿主如構巢麴黴(Ballance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112284-289；tilburn等，Gene，26205-221；Yelton等，Proc.Sci.USA，811470-1474)和黑麴黴(Kelly和Hynes，EMBO J.，4475-479)。表達糖基化mpl配體的適合宿主細胞來自多細胞生物。這類宿主細胞能完成複雜的加工並具糖基化活性。原則上，無論是來自脊椎動物還是無脊椎動物培養物，任何高等真核細胞培養物是可用的。無脊椎動物細胞的例子有植物和昆蟲細胞。已經鑑定到了大量的杆狀病毒株和變異體及相應的昆蟲允許宿主細胞，如草地夜蛾(毛蟲)、埃及伊蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、黃果蠅(果蠅)和家蠶。參見Luckow等，Bio/Technology，647-55；Miller等，Genetic Engineering，Setlow等編輯，Vol.8(Plenum出版，1986)，pp277-279和Maeda等，Na-ture，315592-594。可以從公共途徑獲得許多用於轉染的病毒株，如苜蓿銀紋夜蛾NPV的L-1變異體和家蠶NPV的Bm-5株系，這些病毒可以被本發明所使用，尤其是對於草地夜蛾細胞的轉染。
棉花、玉米、土豆、大豆、牽牛花、西紅柿和菸草的植物細胞培養物能被用作宿主。通常，植物細胞的轉染通過與根瘤土壤桿菌一起溫育，其中，後者已經過操作而含有mpl配體DNA。通過植物細胞與根瘤土壤桿菌一起的溫育，編碼mpl配體的DNA轉移到植物細胞宿主中使之受轉染，並在合適的條件下表達mpl配體DNA。另外，可得到與植物細胞相容的調節和信號序列，如胭脂鹼合成酶啟動子和多聚腺苷酸信號序列。參見Depicker等，J.Mol.Appl.Gen.，1561。另外，從T-DNA780基因上遊區域分離的DNA片段能激活或增加含重組DNA的植物組織中植物可表達基因的轉錄水平。參見1989年6月21日出版的EP321,196。
但是，最令人感興趣的是脊椎動物細胞。近年來，脊椎動物細胞在培養基(組織培養物)中的增殖已經成為一種常規操作(TissueCulture，Academic Press，Kruse和Patterson，editors)。有用的哺乳動物宿主細胞系有SV40轉化的猴腎CV1細胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細胞系(生長於懸浮培養物的293或293亞克隆細胞，參見Graham等，J.Gen virol.，3659)；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774261)；鼠足細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23243-251)；猴腎細胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人喉癌細胞(HELA，ATCCCCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝細胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W1 38，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；鼠乳汁腫瘤(MMT 060562，ATCCCCL51)；TRI細胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.38344-68)；MRC5細胞；FS4細胞和人肝癌細胞系(Hep G2)。
用上述本發明的表達載體或克隆載體轉染、最好是轉化宿主細胞，在常規的營養培養基中培養並配合誘導性啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所需序列的基因。無論實際上是否有編碼序列表達，轉染指宿主細胞取得一個表達載體。對於熟練的技術員來說，有大量轉染的方法是已知的，如磷酸鈣和電穿孔法。通常，在宿主細胞中發現該載體作用的任何跡象時，可以確認轉染成功。
轉化表示將DNA引入一種生物，使該DNA能夠以染色體外成份或染色體整合形式進行複製。根據被使用的宿主細胞，運用適合該細胞的標準技術來完成轉化。如Sambrook等，同上1.82部分所述，通常以氯化鈣對原核細胞和其他有細胞壁的細胞進行鈣處理。某些植物細胞的轉化通過根瘤土壤桿菌進行傳染，參見shaw等，Gene，23315和1989年6月29日出版的WO89/05859。另外，也可用超聲處理轉染植物。參見1991年1月10日出版的WO91/00358。對於沒有細胞壁的哺乳動物細胞，使用Graham和van derEb在Virology，52456-457中的磷酸鈣沉澱方法較好。Axel在1983年8月16日頒布的U.S.專利號4,399,216中敘述了哺乳動物細胞宿主系統轉化的一般情況。進行酵母菌轉化的通常方法參見Van Solingen等，J.Bact.，130946和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，763829。但是，也可用其他方法將DNA引入細胞，如核酸注射、電穿孔法或原生質融合。E.宿主細胞的培養如Sambrook等，(同上)的概述，本發明中用來產生mpl配體多肽的原核細胞在合適的培養基中培養。
本發明中用來產生mpl配體多肽的哺乳動物宿主細胞可在多種培養基中培養。商購的培養基如Ham′s F10(sigma公司)、基本必需培養基([MEM]sigma公司)、RPMI-1640(sigma公司)和Dul-beccos改進的Eagle′s培養基([MEM]sigma公司)都適合宿主細胞的培養。另外，下列文獻中所述的任何培養基可被用作宿主細胞的培養基Ham和Wallace，Meth.Enz.，5844，Barnes和Sato.Anal.Biochem.，102255，美國專利號4,767,704；4,657,866；4,927,762或4,560,655；WO90/03430；WO87/00195；美國專利Re.30,985或1990年10月3日同時歸檔的copending U.S.S.N.07/592,107或07/592,141，所有的文件在此一併作為參考。根據需要可以在這些培養基的任何一個中補充激素和/或其他生長因子(如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩衝液(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(如藥物慶大黴素)、微量元素(通常終濃度在微摩爾水平的無機物)和葡萄糖或相當的能源。本領域的熟練技術人員知道，還可加入適當濃度的其他任何必需補充物。溫度、pH值之類的培養條件與先前用於選擇表達宿主細胞的那些條件相同，這對一般的熟練技術人員也是很明顯的。
宿主細胞包括體外培養的細胞和宿主動物體內的細胞F.檢測基因擴增/表達在一個樣品中，基因擴增和/或表達的測量可直接通過下列方法定量mRNA轉錄的常規Southern印跡和Northern印跡法(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205)，斑點印跡(DNA分析)或原位雜交，並根據提供的序列使用合適的標記探針。有許多標記可以被使用，大多數是放射性同位素，尤其是32P。但是，也可運用其他技術，如將生物素修飾的核苷酸引入多聚核苷酸。然後，將生物素作為結合抗生物素蛋白或抗體的位點，後者可被許多種標記所標記，如放射性核素、螢光劑、酶或其他類似物。或者，可使用能識別特定雙鏈體的抗體，包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體、DNA-RNA雜交雙鏈體或DNA-蛋白質雙鏈體。反過來，可對抗體進行標記，並在雙鏈體與表面結合處進行分析，當在表面上形成雙鏈體時，可以檢測到與雙鏈體結合的抗體。
基因的表達也可用免疫方法測量，如用組織切片的免疫組織化學染色和細胞培養物或體液的分析來直接定量基因產物的表達。在免疫組織化學染色技術中，一般以脫水和固定方法製備細胞樣品，接著與特異於偶聯基因產物的標記抗體在通常能檢測到標記的位置發生反應，使用的標記如酶標記、螢光標記、發光標記和類似物。適用於本發明的一個特別敏感的染色技術見於Hsu等，Am.J.Clin.Path.，75734-738。
可用於免疫組織化學染色和/或樣品液體分析的抗體可以是單克隆或多克隆，可以在任何哺乳動物中製備。通常，抗體的製備通過針對天然mpl配體多肽或合成肽，其中，後者根據本文中提供的DNA序列而合成，進一步的敘述見下文。G.mpl配體多肽的純化雖然在沒有分泌信號而直接表達時，也能從宿主細胞裂解物中回收mpl配體，但最好還是以分泌多肽的形式從培養基中回收。
當mpl配體在非人源的重組細胞中被表達時，該mpl配體中完全不含人源蛋白質或多肽。但是，仍然有必要從其他重組細胞蛋白質或多肽中純化mpl配體，以得到與mpl配體本身基本同源的製備物。第一步，離心培養物或裂解物以除去微小的細胞碎片。然後，分離膜和可溶蛋白質部分。或者，可使用市售的蛋白質濃縮濾膜(如Amicon或Millipore Pellicon超濾單位)。於是，根據mpl配體是否與膜結合，可以從培養裂解物的可溶蛋白質部分和膜部分中提純到mpl配體。隨後，通過鹽析和使用多種凝膠基質的交換或色譜法程序，把mpl配體從雜質可溶蛋白質和多肽中提純出來。這些基質包括丙烯醯胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素和其他在蛋白質純化中常用的物質。適用於蛋白質純化的典型色譜法程序包括免疫親和(如抗hmpl配體Mab)、受體親和(如mpl-IgG或蛋白A Sepharose)、疏水性相互作用色譜(HIC)(如乙醚、丁基或苯基Toyopearl)、植物凝集素色譜法(如伴刀豆球蛋白A Sepharose和小扁豆植物凝集素Sepharose)、大小排阻(如Sephadex G-75)、陽離子和陰離子交換柱(如DEAE或羧甲基和磺丙基纖維素)以及反相高效液相色譜(RP-HPLC)(如參見Urdal等，J.Chromatog.，296171中所述，用兩個連續的RP-HPLC步驟純化重組的人IL-2)。其他可選用的純化步驟包括乙醇沉澱、硫酸銨沉澱、色譜聚焦法、製備SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳和其他類似方法。
考慮到發生的任何性質上的基本變化，有殘基缺失、插入和置換的mpl配體變異體可用與天然mpl配體同樣的方法回收。例如，一個mpl配體與另一個蛋白質或多肽如細菌或病毒抗原的融合體製備能促進純化；可用一個免疫親和柱吸附融合多肽，柱中含有對應該抗原的抗體。通過至少在一個剩餘的免疫表位的結合，兔多克隆抗mpl配體柱等免疫親和柱可用以吸附mpl配體變異體。或者，可用親和色譜純化mpl配體，其中使用與固定化(優選)的Affi-Gel 10(Bio-Rad，Richmond，CA)或類似樹脂偶聯的純化的mpl-IgG，該方法已經被廣為使用。苯甲基硫酸氟(PMSF)等蛋白酶抑制劑可在純化過程中用於抑制蛋白酶解的降解作用，並且可加入抗生素來防止意外汙染物的生長。本領域的熟練技術人員會認識到，適合天然mpl配體的純化方法也許需要修改以適應重組細胞培養物中表達的，mpl配體及其變異體性質的變化。H.mpl配體多肽的共價修飾本發明範疇中包括了mpl配體多肽的共價修飾。天然的mpl配體和mpl配體的胺基酸序列變異體都能被共價修飾。mpl配體片段是本發明範疇中共價修飾的一種類型。胺基酸殘基多達約40個的變異mpl配體多肽片段能夠方便地製備，其方法有化學合成或者酶法或化學切割全長或變異mpl配體多肽。通過mpl配體及其片段的靶胺基酸殘基與一種有機衍生劑的反應，將其他類型的mpl配體及其片段的共價修飾引入分子，該試劑能與選擇的側鏈或N-或C-末端的殘基反應。
半胱氨醯殘基通常與α滷代乙酸(和相應的胺)如氯代乙酸或氯代乙醯胺反應，以獲得羧甲基或羧醯胺甲基衍生物。半胱氨醯殘基的衍生來自與下列物質的反應，溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-imidozoyl-)丙酸、磷酸氯乙醯、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對-氯汞苯甲酸、2-氯汞-4-硝基酚或氯-7-硝基苯-2-oxa-1，3-二唑。
組氨醯殘基的衍生通過在pH5.5-7.0時與焦磷酸二乙酯的反應，因為該試劑對組氨醯側鏈有相對的特異性。也可用對溴苯醯甲基溴化物；優選的反應條件為pH6.0時0.1M的卡夫基酸鈉。
賴胺醯和氨基末端殘基與琥珀酸或其他羧酸的酸酐反應。使用這些試劑進行的衍生作用可起反轉賴胺醯殘基電荷的效應。其他適用於含氨基殘基的衍生試劑有亞氨酸酯如亞基picolinimidate、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2，4-戊二酮和含乙醛酸鹽的轉氨酶催化反應。
精胺醯殘基的修飾通過與一個或幾個常規試劑的反應，如苯基乙醛醯、2，3-丁二酮、1，2-環己二酮和茚三酮。由於胍功能基團的高pKa值，精氨酸殘基的衍生需要在反應在鹼性條件下進行。另外，這些試劑還可以與賴氨酸的基團和精氨酸的ε氨基反應。
酪氨醯殘基的特異性修飾通過與芳香族的重氮化合物或四硝基甲烷的反應，其主要的目的在於將特殊的標記引入到絡氨醯殘基。在大多數情況下，使用N-乙醯咪唑和四硝基甲烷相應地得到O-乙醯酪氨醯種類和3-硝基衍生物。用125I或131I碘化酪氨醯殘基以製備用於放射免疫測定的標記蛋白質，如上所述的氯胺T方法適用於該操作。
天冬氨醯和穀氨醯的羧基側基通過與碳化二亞胺(R-N＝C＝N-R′)的反應有選擇地修飾，其中，R和R′是不同的烷基，如1-環乙基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮陽離子-4，4-二甲基戊基)碳化二亞胺。另外，通過與銨離子的反應，天冬氨醯和穀氨醯殘基轉化成天冬醯胺醯和穀氨醯胺醯殘基。
用雙功能試劑進行的衍生可用於將mpl配體交聯到抗mpl配體抗體純化方法中使用的水不溶性支持介質或表面上。反過來也是這樣。常用的交聯劑包括1，1-二(重氮乙基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯如4-疊氮水楊酸酯、同源雙功能亞胺酯包括雙琥珀醯亞胺酯如3，3′-二硫代bis(琥珀醯亞胺丙酸)、以及雙功能的馬來醯亞胺如二-N-馬來醯亞胺基-1，8-辛烷。衍生試劑如甲基-3-[(p-疊氮苯基)二硫代]propioimidate產生能在光照下形成交聯的光敏中間物。或者，反應的不溶於水的介質如溴化氰激活的碳水化合物和反應的底物如美國專利號3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537和4,330,440中所述，可用於蛋白質的固定。
天冬醯胺醯和穀氨醯胺醯殘基經常脫氨而成為相應的天冬氨醯和穀氨醯殘基。這些殘基的脫氨是在中性或鹼性條件下進行。這些殘基的脫氨形式在本發明的範疇之內。
其他修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥化，絲氨醯或蘇氨醯殘基羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈α氨基的甲基化(T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.FreemanCo.，San Francisco，pp.79-86)，N-末端氨基的乙醯化和任何C-末端羧基的醯胺化。
改變多肽的天然糖基化形式是本發明範疇中另一個類型的mpl配體多肽共價修飾。這裡的變化指除去一個或多個天然mpl配體的糖類部分和/或加入一個或多個天然mpl配體中沒有的糖基化位點。
多肽的糖基化通常是N-結合或O-結合。N-結合指糖類部分與一個天冬醯胺殘基側鏈的連接。糖類部分與天冬醯胺側鏈的酶催化的結合識別序列為三肽序列天冬醯胺-X-絲氨酸和天冬醯胺-X-蘇氨酸，其中X表示除脯氨酸以外的任何胺基酸。因此，當多肽中出現這些三肽序列中的一個時，同時也就形成了一個潛在的糖基化位點。O結合的糖基化指糖與羥胺基酸的結合，其中，前者如N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖，後者一般為絲氨酸或蘇氨酸，5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸也可用。
在mpl配體多肽中加入糖基化位點一般是通過改變胺基酸序列，使之含有一個或多個上述的的三肽序列(對於N-結合的糖基化位點)。這種改變也可以通過在天然mpl配體序列中加入或置換入一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基(對於O-結合的糖基化位點)。為了方便一些，最好通過DNA水平的變化來改變mpl配體胺基酸序列，尤其是通過使編碼mpl配體多肽的DNA在預選的鹼基發生突變而得到能翻譯出所需胺基酸的密碼子。DNA突變的方法可以根據上述標題為「mpl配體的胺基酸序列變異體」的內容進行。
在mpl配體中增加糖類部分數量的另一個方法是通過化學或酶法使糖基與多肽偶聯。這些程序的優點在於它們不要求在一個對N-或O-結合糖基化有能力的宿主細胞中產生多肽。根據偶聯的形式，糖類可以被連接於(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離的羧基，(c)游離的巰基如半胱氨酸的巰基，(d)游離的羥基如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基，(e)芳香族殘基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香族殘基，或者(f)穀氨醯胺的醯胺基。這些方法可參見1987年9月11日出版的WO87/05330和in Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306。
可以用化學或酶法除去mpl配體多肽中的糖類部分。化學的去糖基化需要將多肽置於三氟甲烷磺酸或類似的化合物。這種處理將導致除結合糖類(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)以外的大多數或全部糖類斷裂，但對多肽鏈沒有影響。化學去糖基化的方法可參見Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophy.，25952和Edge等，Anal.Biochem.，118131。多肽中糖類部分的酶法斷裂可使用多種內源或外源糖苷酶，參見Thotakura等，Meth.enzy-mol.，138350。
可以用化合物衣黴素來防止潛在糖基化位點的糖基化，參見Buskin等，J.Biol.Chem.，2573105。衣黴素能阻止蛋白質-N-糖苷鍵的形成。
mpl配體共價修飾的另一種類型是通過將mpl配體多肽與多種非蛋白質多聚體中的一個相連，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧烷，參見美國專利號4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337。與上述多聚體共價連接的mpl配體多肽被稱作聚合化的mpl配體多肽。
在優選情況下，需要對回收的mpl配體進行一些篩選來選擇出最佳的變異體，用以與mpl結合併具有上述的免疫和/或生物活性。可以對下列特性進行篩選在重組細胞培養物或血漿中的穩定性(如對抗蛋白酶解的斷裂作用)、對於一個mpl成員的高親和性，氧化穩定性，以提高的產量被分泌的能力和其他類似的特性。例如，mpl配體多肽中免疫性質的某個變化，如對指定抗體的親和性，由競爭性免疫分析來測量。蛋白質或多肽性質的其他潛在變化如氧化還原或熱穩定性、疏水性或對蛋白酶解降解作用的敏感性，都可以用本領域已知的方法來分析。17.製備mpl配體的抗體的一般方法抗體製備(i)多克隆抗體mpl配體多肽或片段的多克隆抗體的製備通常是將mpl配體和一個佐劑多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射到某個動物體內。很有用地是將含有靶胺基酸序列的mpl配體或一個片段共軛於在被免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質，如匙孔血藍蛋白、血清白蛋白、甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。連接需使用一種雙功能或衍生試劑，如順丁烯二醯亞胺苯甲醯磺基琥珀醯亞胺酯(通過半胱氨酸殘基共軛結合)、N-羥基琥珀醯亞胺(通過賴氨酸殘基)、glytaralde-hyde、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基。
由mpl配體多肽或片段、具有免疫原性的共軛物或衍生物來免疫動物，是通過將1毫克或1微克的肽或共軛物(對應於兔或鼠)與3倍體積的Freund′s完全佐劑混合併將溶液皮內注射於多個部位。一個月以後，將原來量的1/5到1/10肽或共軛物與Freund′s完全佐劑混合在多個部位皮下注射以加強免疫。7至14天後，將動物放血並分析血清中mpl配體抗體的效價。繼續加強免疫直至效價曲線到達平臺區。優選地，使用相同mpl配體的共軛物加強免疫，但可共軛於一種不同的蛋白質並/或通過一個種同的交聯試劑。共軛物也可以作為蛋白質融合體在重組細胞培養物中製成。另外，明礬等聚集劑可用以提高免疫應答。(ii)單克隆抗體單克隆可以來自一個基本同源抗體的群落，即除了可能存在的出現概率極小的自發突變體外，構成群落的每個抗體都是相同的。因此，修飾詞「單克隆」是指抗體的特性，並非指獨立抗體的混合物。
例如，本發明中mpl配體單克隆抗體的製備可用雜交瘤方法或重組DNA方法，前者由Kohler和Milstein，Nature，256495首先描述，後者參見美國專利號4,816,567(Cabilly等)。
在雜交瘤方法中，用上述方法免疫一個鼠或其他合適的宿主動物如倉鼠，以引出淋巴細胞，這些淋巴細胞產生或能夠產生的抗體可以與用作免疫的蛋白質特異性結合。或者，可在體外免疫淋巴細胞。然後，使用一種合適的融合劑如聚乙二醇，將淋巴細胞融合到骨髓瘤細胞中形成雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinci-ples and Practice，pp.59-103[Academic Press，1986])。
將這樣製備好的雜交瘤細胞在合適的培養基中接種並生長，培養基中最好含有能抑制未融合的親代骨髓瘤細胞的生長或存活的一種或幾種物質。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺少次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，通常就可以使雜交瘤培養基中含有次黃嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶脫氧核苷(HAT培養基)，從而基本抑制了HGPRT缺陷細胞的生長。
優選的骨髓瘤細胞的特點是能有效地融合、支持選出的抗體生成細胞以穩定的高水平表達抗體和對HAT等培養基敏感。其中，優選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，如來自Salk Institute Cell Distri-bution Center，San Diego，California USA的MOPC-21和MPC-11鼠腫瘤細胞和來自American Type Culture Collection，Rockville，Maryland USA的SP-2細胞。也有記載將人骨髓瘤和鼠-人異源骨髓瘤細胞系用於產生人單克隆抗體(Kozbor，J.Im-munol.，1333001；Brodeur等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Application，pp.51-63，MarcelDekker，Inc.，New York，1987)。
對雜交瘤細胞生長的培養基進行分析，以確定直接對應mpl配體的單克隆抗體的產量。在優選情況下，雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的結合特異性由免疫沉澱法或離體結合分析如放射免疫分析(RIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA)，來決定。
單克隆抗體的結合親和性可用例如Scatchard analysis ofMunsonPollard，Anal.biochem.，107220中所述的方法來決定。
在確定了雜交瘤細胞能產生具有所需的特異性、親和性和/或活性的抗體後，可通過極限稀釋程序將克隆亞克隆化並以標準方法使之生長(Goding，同上)。能達到這個目的合適的培養基包括Dulbec-co′s Modified Eagle′s培養基或RPMI-1640培養基。另外，雜交瘤細胞可以在動物體內以腹水腫瘤的形式生長。
將亞克隆分泌的單克隆抗體適當地與培養基、腹水或血清分離，分離採用常規的免疫球蛋白純化程序如蛋白A Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
使用常規程序可以方便地分離並測序本發明的編碼單克隆抗體的DNA(如通過使用能與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。本發明的雜交瘤細胞是作為這種DNA的一個優選來源。一旦被分離，DNA可被置入到表達載體中，然後隨載體一起轉染宿主細胞如猴腎COS細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不再產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞，以獲得重組宿主細胞中單克隆抗體的合成。還可對DNA進行修飾，如以鼠的同源序列置換編碼人重鏈和輕鏈恆定區的序列(Cabilly等，同上；Morrison等Proc.Nat.Acad.Sci.，816851)或將所有或部分非免疫球蛋白多肽鏈的編碼序列共價結合於免疫球蛋白的編碼序列。
通常，這樣的非免疫球蛋白多肽鏈被用來置換本發明的一種抗體的恆定區，或者，被用來置換本發明的一種抗體的一個抗原結合位點的可變區，以形成一個嵌合雙價抗體，其中一個抗原結合位點特異於mpl配體，另一個則特異於不同的抗原。
嵌合或雜交抗體也可在體外製備，使用已知的蛋白質合成化學方法，包括那些涉及交聯劑的方法。例如，可使用二硫鍵交換反應或通過形成一個硫酯鍵來構建一個免疫毒素。為達到這個目的所需的合適的試劑包括亞氨基硫醇鹽和甲基-4-mercaptobutyrimidate。
由於診斷的需要，本發明的抗體通常用一個可測部分作標記。對該可測部分的唯一要求是能夠直接或間接生成一個可測信號。例如，該可測部分可以是一個放射性同位素，如3H、14C、32P、35S或125I，一個螢光或化學發光化合物，如螢光素異硫氰酸鹽、若丹明或蟲螢光素，放射性同位素標記，如125I、32P、14C或3H，或者某種酶，如鹼性磷酸酶、β半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶。
本領域任何已知的可將抗體單個地共軛於可測部分的方法都可使用，包括下列文獻中所述的方法Hunter等，Nature，144945；David等，Biochemistry，131014；Pain等，J.Immunol.Meth.，40219和Nygren，J.Hisrochem.andCytochem.，30407。
本發明的抗體可用於任何已知的分析方法，如競爭性結合分析、直接或間接夾層分析和免疫沉澱分析。參見Zola，Monoclonal Anti-bodiesA Manual of Techniques，pp.147-158(CRC Press，Inc.，1987)。
競爭性結合分析是依據一個被標記的標準物(可以是mpl配體或其免疫反應部分)與實驗樣品被分析物(mpl配體)競爭與有限數量的抗體結合的能力。實驗樣品中mpl配體的量與結合抗體的標準物的量成反比。為了更快決定結合的標準物的量，通常要在競爭之前或之後固化抗體，從而能夠方便地將結合抗體的標準物和被分析物從游離的標準物和被分析物中分離出來。
夾層分析涉及兩個抗體的使用，每個抗體都能結合至待測蛋白質(mpl配體)的不同致免疫部位，即抗原決定部位。在夾層分析中，實驗樣品被分析物結合到固定於一個固體支持物的第一個抗體，隨後，第二個抗體結合於被分析物，於是就形成了一個不溶性三元複合物。參見David和Greene，美國專利號4,376,110。第二個抗體可以本身可測部分標記(直接夾層分析)或以被可測部分標記的抗免疫球蛋白抗體來測定(間接夾層分析)。例如，ELISA分析是夾層分析的一種類型，其中的可測部分是一種酶(如辣根過氧化物酶)。(iii)人源化抗體和人抗體人源化非人體抗體的方法是本領域中廣為人知的。通常，一個人原化抗體中有引入的一個或多個非人源來源的胺基酸殘基。這些非人源的胺基酸殘基經常被稱作「輸入」殘基，一般來自一個「輸入」可區。人源化過程的基本操作根據Winter及其合作者的方法(Jones等，Nature，321522-525；Riechmann等，Nature，332323-327；Verhoeyen等，Science，2391534-1536)，以鼠CDRs或CDR序列置換相應的人抗體序列。於是，這種「人源化」抗體屬於嵌合抗體(Cabilly等，同上)，其中，少於一個完整人可變區的序列被來自非人物種的相應序列所置換。實際上，人源化抗體一般是人抗體的一些CDR殘基和可能的一些FR殘基被來自鼠抗體中類似位點的殘基置換。
為減少抗原性，對用於製備人源化抗體重鏈和輕鏈的人可變區的選擇是非常重要的。根據所謂的「最適」方法，對已知的人可變區序列的完整文庫篩選鼠抗體可變區的序列。於是，與鼠序列最接近的人序列被當作了人源化抗體的骨架(FR)(Sims等，J.Immunol.，1512296；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196901)。另一個方法使用一個特殊的骨架，該骨架來自所有人抗體的共有序列，是重鏈或輕鏈的一個特殊亞型。相同的骨架可用於幾個不同的人源化抗體(Carter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285；Presta等，J.Immnol.，1512623)。
更重要的是，人源化的抗體應保留對抗原的高親和性和其他優化的生物特性。為了達到這個目標，根據一個優選方法，人源化抗體的製備通過用親代和人源化序列的三維模型分析親代序列和多種概念性的人源化產物。三維免疫球蛋白模型是很常見的，並且對於本領域的技術人員是很熟悉的。可以獲得電腦程式來顯示選出的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構象結構。通過檢查這些顯示內容就可以對殘基在候選免疫球蛋白序列功能中的可能作用進行分析，即對殘基對候選免疫球蛋白結合其抗原能力的影響進行分析。通過這個方法，可以從共有和輸入序列中選出FR殘基，以得到所需的抗體特性，如增加對靶抗原的親和性。通常，CDR殘基直接和在大多數時候基本上影響抗原結合。進一步的細節參見1992年8月21日歸檔的美國申請系列號07/934,373，而該文件部分延續了1991年7月14日歸檔的申請系列號07/715,272。
或者，現在已經能產生轉基因動物(如鼠)，能在免疫接種後，在缺少內源免疫球蛋白產物時，生成一個人抗體的完整庫。例如，已經有這樣的描述，在嵌合和種系突變鼠中的抗體重鏈連接區(JH)基因的純合缺失會導致內源抗體生成的完全抑制。在這種種系突變型鼠中，人種系免疫球蛋白基因排列的轉入將根據抗原的攻擊導致產生人抗體。參見Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551-255；Jakobovits等，Natjuer，362255-258；Bruggermann等，Year in Immune.，733。人抗體也可以在噬菌體顯示文庫中生成(Hoogenboom和Winter，J.Mol.biol.227,381；Marks等，J.Mol.Biol.222,581)。(iv)雙重特異性抗體雙重特異性抗體是單克隆的，最好是人或人源化的抗體，對至少兩個不同的抗原有結合特異性。本領域已知製備雙重特異性抗體的方法。
傳統上，雙重特異性抗體的重組產物是基於兩個免疫球蛋白重-輕鏈對的共表達，其中，兩個重鏈有不同的特異性(Millstein和Cuello，Nature，305537-539)。由於免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機組合，這些雜交瘤(四聯瘤)產生一個有10個不同抗體分子的潛在混合物，但其中只有一個有正確的雙重特異性結構。一般通過親和色譜步驟來純化該正確的分子，但純化過程相當笨重，且得率低。類似的程序參見PCT出版號WO93/08829(1993年5月13日出版)和Traunecker等，EMBO，103655-3659。
依照一個不同的但更好的方法，將帶有所需結合特異性的抗體可變區與免疫球蛋白恆定區序列融合。融合的部位最好是免疫球蛋白重鏈的恆定區，其中至少含有部分鉸鏈區、CH2和CH3區。最好使含有輕鏈結合所需的位點的第一個重鏈恆定區在至少一個融合體中出現。編碼免疫球蛋白重鏈融合體以及(如有需要)免疫球蛋白輕鏈的DNA被插入到獨立的表達載體並被共轉染到合適的宿主生物中。這樣，就提供了在對各例子中三條多肽鏈相互比例的調節上具有很大的彈性，而結構中這三條多肽鏈的不相等比例能獲得最佳的產量。但是，當至少兩條相等比例的多肽鏈的表達導致高產量或當比例不是特別重要時，就有可能將兩條或所有三條多肽鏈的編碼序列插入到一個表達載體中。在本方法的一個優選例子中，雙重特異性抗體的構成為，在一條臂上有具備第一個結合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈和在另一條臂上有一個雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供了第二個結合特異性)。已經發現這種不對稱結構促進了所需的雙重特異性成份從不需要的免疫球蛋白複合鏈上分離下來，如同只有一半雙重特異性分子上有一條免疫球蛋白輕鏈時，分離更容易一些。本方法參見1992年8月17日歸檔的copending申請序列號07/931,811。
生成雙重特異性抗體的進一步細節參見Suresh等，Methodsin Enzymology，121210等。(v)異源共軛抗體異源共軛抗體也屬於本發明範疇之內。異源共軛抗體由兩個共價結合的抗體構成。例如這種抗體的作用使免疫系統細胞針對不需要的細胞(美國專利號4,676,980)和治療HIV感染(PCT出版號WO91/00360和WO92/00373；EP03089)。異源共軛抗體可使用傳統的交聯方法來製成。合適的交聯試劑在本領域廣為人知，可參見美國專利號4,676,980，其中還包括有一系列交聯技術。IV.巨核細胞生成蛋白mpl配體在治療上的應用有造血效應子功能和在這裡被稱為巨核細胞生成或血小板生成蛋白(TPO)的生物活性mpl配體可用於無菌的藥物製備配方，以促進病人的巨核細胞生成和血小板生成活性，該種病人為由血小板生成受損、隔離或破壞增加引起的血小板減少。本發明的合成物可有效地治療血小板減少相關的骨髓發育不全(如化學治療或骨髓移植後的發育不全貧血)以及各種病症如瀰漫性血管內凝血(DIC)、免疫性血小板減少(包括HIV誘導的或非HIV誘導的ITP)、慢性特發性血小板減少、先天性血小板減少、骨髓發育不良和血栓血小板減少。另外，這些巨核細胞生成蛋白也可用於治療骨髓增生性血小板疾病以及炎症條件和缺鐵血小板情況下的。
本發明的巨核細胞生成和血小板生成蛋白(TPO)的優選用途在於用於白血病或實體瘤的骨髓毒化學治療、用於自體或同種異體骨髓移植的化學治療、骨髓發育不全、特發性發育不全貧血、先天性血小板減少和免疫性血小板減少。
本發明的巨核細胞生成蛋白還能用於一些其他疾病的治療，如藥物、中毒或人工表面活化引起的血小板缺陷或破壞。在這些情況下，迫切需要一種化合物能促進新的「未破壞」血小板的「流出」。一個有效應用的更完整的表參見「背景」(同上)，尤其是(a)至(f)部分以及本文提及的參考文獻。
本發明的巨核細胞生成蛋白用於治療上述疾病或狀況時，可單獨使用，也可與其他的細胞因子、紅細胞生成素、白細胞介素、生長因子或抗體結合使用。因此，該迫切需要的化合物可與其他有血小板生成活性的蛋白質或肽結合使用，如G-CSF、GM-CSF、LIF、M-CSF、IL-1、IL-3、紅細胞生成素(EPO)、成套配體、IL-6和IL-11。
本發明的巨核細胞生成蛋白的製備在一個含有藥學上可接受的載體的混合物中進行。治療組合物的給藥通過靜脈注射或經過鼻或肺。根據需要，這些組合物還可胃腸外或皮下給藥。當系統地給藥時，治療組合物應該不含熱原，並處在pH、等滲性和穩定性都合適的胃腸外可接受溶液中。這些條件是本領域已知的。簡而言之，製備本發明的化合物的劑量配方後，將有所需純度的化合物與生理上可接受的載體、賦行劑或穩定劑混合地儲存或給藥。在使用的劑量和濃度方面，這些物質對於受體是無毒的，這些物質中還包括緩衝液如磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽和其他有機酸鹽；抗氧化劑如抗壞血酸；低分子量(約少於10個殘基)肽如聚精氨酸，蛋白質如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；疏水性多聚物如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸如甘氨酸、穀氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、二糖和其他糖類如纖維素及其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨糖；平衡離子如鈉和/或非離子表面活性劑如吐溫、普魯蘭尼克或聚乙二醇。
根據可行的製藥實踐需要，將約0.5至500毫克的巨核細胞生成蛋白質(以游離酸或鹼形式或藥學上可接受的鹽形式存在)化合物或混合物與生理上可接受的媒介、載體、賦行劑、黏合劑、防腐劑、穩定劑、調味劑等等複合。在這些組合組中，活性成份的量應該能在指定的範圍內可得到合適的劑量。
加入注射所需的無菌成份是根據傳統的製藥實踐。例如，也許需要將活性成份在媒介中溶解或懸浮，媒介如水、天然植物油如芝麻、花生或棉籽油或者合成脂肪媒介如乙基油酸或類似物。緩衝液、防腐劑、抗氧化劑和類似物可根據可行的製藥實踐結合到其中。
緩釋製劑的合適例子包括含多肽的固體疏水多聚物的半透性基質，該基質以有形形式存在，如薄膜或微型膠囊。緩釋基質的例子包括聚酯、水凝膠[如Langer等，J.biomed.Mater.Res.，15167-277和Langer，Chem.Tech.，1298-105中所述的聚(2-羥乙基-異丁烯酸)或聚乙烯乙醇]、聚丙交酯(美國專利號3,773,919，EP58,481)、L-穀氨酸和γ乙基-L-穀氨酸的共聚物(Sid-man等，Biopolymers，22547-556)、不可降解的乙烯-乙烯乙酸(Langer等，同上)、可降解的乳酸-乙二酸共聚物如Lupron De-potTM(由乳酸-乙二酸共聚物和leuprolide乙酸鹽組成的可注射微球)和多聚D-(-)-3-羥基丁酸(EP133,988)。
如乙烯-乙烯乙酸和乳酸-乙二酸這樣的多聚物能夠使分子的釋放超過100天，而某些水凝膠在較短的時間內釋放蛋白質。如果被裝在膠囊中的蛋白質在體內保留一段長時間，這些蛋白質也許會如同37℃時暴露於潮溼條件下一樣地變性或聚集，而導致生物活性的丟失和可能的致免疫性變化。根據所涉及的機制，可以設計出合理的策略來維持蛋白質的穩定。例如，如果發現聚集的機制是由於分子間二硫鍵的互換而形成的S-S鍵，穩定的實現就可以通過修飾羥基殘基、從酸溶液中凍幹、控制溼度、使用合適的附加劑和開發特殊的多聚物基質成份。
緩釋巨核細胞生成蛋白組合物也包括了脂質體中的巨核細胞生成蛋白。含有巨核細胞生成蛋白的脂質體的製備方法根據DE3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688-3692；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774030-4034；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949；EP142,641；日本專利申請83-118008；美國專利號4,485,045和4,544,545和EP102,324。通常，脂質體是小的(約200-800埃)單層類型，其液體內容物中膽固醇的含量大於約30摩爾％，這是一個被調整到最佳巨核細胞生成蛋白治療的比例。
劑量的多少由醫生根據多種因素的考慮來確定，已知能改變藥物作用的因素有疾病的類型和嚴重程度、體重、性別、飲食、給藥的方式和時間、施用的其他藥物以及其他相關的臨床因素。通常，每天的用量在每公斤體重0.1至100微克之間。較合適地，用量在每公斤體重0.1至50微克之間。更合適地，初期的用量在1至5微克/公斤/天之間。或者，劑量的範圍與其他細胞因子相同，尤其是G-CSF、GM-CSF和EPO。治療的有效劑量可通過離體或在體方法確定。
實施例在沒有進一步說明的情況下，通過使用以下所描述和說明的實施例，可以相信本領域一般技術人員可以最大程度地利用和實現本發明。以下的實施例是本發明極好的具體表現，但本發明的範圍並不局限於這些。
實施例1豬mpl配體的部分純化由正常的或再生障礙性貧血的豬收集缺少血小板的血漿。通過使用4mEV線性加速器對豬進行900cGy的照射使豬發育不全。照射後的豬通過肌肉注射cefazolin繼續維持6-8天。然後在一般的麻醉法下取出它們的全部血液，肝素抗凝，並在1800×g下離心30分鐘來產生缺少血小板的血漿。巨核細胞刺激活性在照射6天後達到高峰。
取自照射後豬的再生障礙性豬血漿用4M NaCl處理，並於室溫下攪拌30分鐘。通過在Sorvall RC3B上以3800rpm(轉/分)離心以除去所得的沉澱，並將上清液移至一個用含有4M NaCl的10mMNaPO4平衡的Phenyl-Toyoperal柱中(220ml)。該柱用此緩衝液洗滌至A280＜0.05並用重蒸水(dH2O)洗脫。洗脫的蛋白峰用重蒸水溶解至傳導率15mS並上樣至一用PBS平衡的(Blue-Sepharose)柱中(240ml)。然後，柱用分別含有2M尿素的5倍體積PBS和10mM NAPO4(pH7.4)洗滌。用含有2M尿素和1M NaCl的10mMNaPO4(pH7.4)將蛋白質從柱中洗脫。洗脫的蛋白峰用0.01％正辛基葡糖苷(正辛基β-D-葡糖吡喃糖苷)和1mM的EDTA和Pefa-bloc(Boehinges Mannheim公司)處理，然後直接上樣於串聯的CD4-IgG(Capon，D，.J.等Nature 337525-531)和mpl-IgG Ultralink(Pierce)柱(見下述)。當樣品被裝入並且mpl-IgG(4ml)柱被用10倍體積的PBS和含有2M NaCl的PBS洗滌並且用0.1M pH2.25的甘氨酸-HCl洗脫後，去除CD4-IgG柱(2ml)。洗脫組分懼於1/10體積的1M Tris-HCl(pH8.0)中。
通過在還原條件下進行SDS-PAGE(4-10％，Novex膠)電冰來分析由mpl-親和柱洗脫的蛋白組分。結果顯示存在幾種蛋白質。蛋白質通過銀染法證明了幾種蛋白質的分子量為66,000、55,000、30,000、28,000和14,000。為了確定這些蛋白質中哪種能夠促進Ba/F3-mpl細胞培養物的增殖，這些蛋白用如下實施例2中描述的方法從膠中洗脫。
Ultralink親和柱10-20mg溶解於PBS的mpl-IgG或CD4-IgG與0.5克的Ul-tralink樹脂(Pierce)偶聯(根據製造商的說明)。
mpl-IgG的構建和表達一種包含人mpl的全部胞外結構域(胺基酸1-491)的人IgG1的Fc區域的嵌合分子在293細胞中表達。一個編碼人mpl的胺基酸1-491的cDNA片段通過從人巨核細胞CMK細胞cDNA庫中進行PCR而獲得並進行測序。在5′端插入一個Cla1位點，3′端插入一個BstEII位點。因為在DNA編碼的mpl胞外結構域中有2個BstEII位點，該PCR產物被部分消化後克隆於Bluescropt載體上Cla1和BstEII之間的IgG1Fc編碼區域的上遊。mpl PCR產物3′端引入的BstE11位點是用於與Fc區域一起位於mpl胞外結構域的框架中。所得的構建物被亞克隆入pRK5-tkneo載體的ClaI和XbaI位點之間並通過磷酸鈣法轉染入293人胚腎細胞。通過用0.4mg/ml的G418篩選轉化細胞並分離單個克隆。通過使用人Fc特異的ELISA來確定分離克隆的mpl-IgG表達。最好的表達克隆具有1-2mg/ml的mpl-IgG表達水平。
Ba/F3 IgG P表達細胞一個相應於人mpl P完整編碼區域的cDNA被克隆入pRK5-tkneo，然後用NotI使之線性化並通過電穿孔法(1×107細胞，9605F，250伏)將其轉染入IL-3依賴的細胞系Ba/F3中，三天後，用2mg/ml G418開始篩選。通過在96孔板中的有限稀釋來篩選集合的或單個的克隆。篩選的細胞保持於含有15％FBS、1mg/ml G418、20mM穀氨醯胺、10mM HEPES和100μg/ml Pen-Strep的RPMI中。通過使用抗mpl P兔多克隆抗體進行FACS分析來確定篩選克隆中的mpl P的表達。
Ba/F3 mpl配體檢測mpl配體的檢測如圖2所示。為了確定各種來源的mpl配體的存在，mpl P Ba/F3細胞在缺乏IL-3時以5×105細胞/ml的密度在溼度培養箱中(37℃，5％的CO2和空氣)培養24小時。IL-3飢餓處理後以每200μl培養基50,000細胞的密度將細胞置於96孔培養板上，其中含有或不含有洗脫的樣品，在細胞培養箱中培養24小時。在最後的6-8小時，20μl沒有RPMI培養基但含有1μCi3H-胸苷的血清被加於各孔中。然後用96孔GF/C過濾板收集細胞，並用水洗滌5次。過濾物在40μl閃爍液體(Microsciut 20)存在下用PackardTop Count計數儀計數。
實施例2高度純化的豬mpl配體膠洗脫步驟等體積親和純化的mpl配體(洗脫自mpl-IgG柱的組分6)和2倍Laemmli樣品緩衝液在沒有還原試劑存在的情況下室溫混合併儘可能快地上樣於Novex 4-2％聚丙烯醯胺凝膠中。樣品不用加熱。作為對照，沒有配體的樣品緩衝液在鄰近的泳道電泳。凝膠在4-6℃於135伏電泳2小時15分鐘。電泳緩衝液開始時為室溫。凝膠從凝膠盒中移出並且凝膠板置於移出凝膠的一面。
如下將締造膠複製於硝酸纖維膜上一張硝酸纖維素膜被用無菌水溼潤後小心置於暴露的凝膠面上，趕走氣泡。準標被置於硝酸纖維膜和凝膠板上，以便在染色後準確地進行複製物的重定位。大約2分鐘後，小心移去硝酸纖維素膜，用塑料膜包封凝膠並置於冰箱中。硝酸纖維素膜用Biorad′s fold tolal prorcin stain染色，首先將膜在3×10ml 0.1％ Tween 20＋0.5M NaCl，+0.1M Tris-HCl pH7.5中攪動超過45分鐘，接著在3×10ml純水中超過5分鐘。然後加入gold stain直至標準品出現條帶。再用水漂洗膜上的複製物，將其置於凝膠的塑料膜上，小心與準標對齊，標記凝膠上Novex標準樣品的位置並且劃線指示需切割的部分。棄去硝酸纖維膜和塑料膜，用一鋒利剃刀沿指示線切割凝膠。所切割的部分應超過樣品泳道以便當膠被染色時可以用來確定切割部分位置。當移去切割部分後，剩餘的膠進行銀染並測量標準樣品和切割部分的位置。由Novex標準樣品來確定與切割部分相對應的分子量。
12個凝膠部分被置於Biorad型號422的電洗脫儀的槽中。12-14K分子量截斷膜蓋被用於槽中。50mM碳酸氫銨和0.05％SDS(大約pH7.8)是洗脫緩衝液。一升緩衝液在使用前於冷室中(4-6℃)預冷約1小時。凝膠切割部分在4-6℃冷室中於10ma/槽(初始40伏)進行冼脫。洗脫大約需4小時。小心移去槽並用移液器移去孔上的液體。用移液器移去截斷膜蓋上的液體並保存，將50微升等分的純水置於膜蓋上，攪動SDS晶體溶解後移去。這些液體與以上所保存的液體一起。每個凝膠部分的全部洗脫樣品體積約為300-500μl。樣品被置於預先已於純水中浸泡數小時的10mm Spec-trapor 4 12-14K截斷透析管中。它們在4-6℃下每六個樣品對600ml磷酸鹽緩衝液(PBS大約是4mM鉀離子)透析過夜。第二天替換緩衝透析2.5小時，從透析袋中移去樣品，並置於微型離心管中，離心管在冰上置放1小時後，於14,000 2pm離心3分鐘，小心自SDS沉澱上移出上清，然後將上清在冰上放置約1小時或更長並再次離心4分鐘，上清稀釋於磷酸鹽緩衝液中以進行活力測定，其餘的樣品凍存於-70℃。
實施例3豬配體微測序由mpl-IgG親和柱得到的組分6(2.6ml)在Microcon-10(Amicou)上濃縮。為了防止mpl配體吸附於Microcon，用1％SDS漂洗膜並且將5μl 10％SDS加至組分6中。在Microcon上濃縮後(2μl)，將2倍樣品緩衝液(20μl)加至組分6中，所有體積(40μl)被加入4-20％丙烯醯胺梯度凝膠(Novex)的單個泳道內。凝膠按Novex程度電泳。然後將凝膠平衡5分鐘，於包含10％甲醇的10mM 3-環己基氨基-1-丙磺酸(CAPS)緩衝液(pH11.0)中電印跡。電印跡至Immobilon-PSQ膜(Millipore)進行45分鐘，於250mA恆定電流下在Biohad Trans-Blot transfer call中進行。PVDF膜在溶於40％甲醇、0.1％乙酸的0.1％考馬斯亮藍R-250溶液中染色1分鐘。然後用溶於50％甲醇中的10％乙酸脫色2-3分鐘。唯一可見的在印跡的分子量18,000-35,000範圍內的蛋白質分子量為30,000、28,000和22,000。
30、28和22KDa的蛋白條帶被進行測序，自動蛋白測序於配備一個PTH分析儀的470型號apploed Biosystem測序儀上。測序儀被改進為注入80-90％的樣品(rodrignez，J.Chromatogr.，350217-225(1985))。丙酮(約12μl/l)被加入溶劑A以平衡紫外(UV)吸收。電印跡的蛋白質於Blott膠片中測序。蛋白峰通過NelsonAnalytical 970界面進入Justice lnnovation軟體。序列譯解分析於VAX5900上進行(Henzel et al.，J.Chromatogr.，40441-52(1987))N-末端序列(用一個字母表示括號內不確定殘基)和所得材料的數量(方括號內)結果見表2′。
表2′mpl配體氨基端序列
實施例4液體懸浮巨核細胞生成檢測人外周幹細胞(PSC)(取自經同意的病人)用IMDM培養液(Gibco公司)稀釋5倍，然後於室溫下以800×g離心15分鐘，細胞沉澱重新懸浮於IMDM培養基並且鋪板於60％的Percoll上(密度為1.077mg/ml)(Pharmacia公司)並於800×g離心30分鐘。位於界面的低密度單核細胞被抽出並用IMDM洗二次，然後鋪於含30％FBS(終體積為1ml)的IMDM中(密度為1－2×106細胞/ml)，置於24孔組織培養板(Costar公司)。App或缺少APP的mpl配體被加至10％，並且培養物於溼度培養箱中(37℃，含5％CO2和空氣)培養12-14天。在培養天數0、2、4時在含有0.5μg mpl-IgG的10％APP存在下繼續培養。通過mpl-IgG親和柱來去除mpl配體中的APP。
為了定量分析這些液體懸浮培養物中的巨核細胞生成，採用Solberg等改進的方法以及利用放射性標記的針對GPIIbIIIa的鼠IgG單克隆抗體(HP1-1D)(由Nichols博士提供，Mayo Cilinic)100μg的HP1-1D(參見Grant，B等，Blood 691334-1339(1987))用1mCi Na125I根據製造商說明的酶珠法(Enzymobeads)(Biorad，Richmond，CA)進行放射性標記。放射性標記的HP1-1D儲存於含0.01％正辛基-葡糖苷的PBS中，存放於-70℃。典型的特異性活力為1－2×6cpm/μg(由12.5％三氯乙酸沉澱時超過95％)。
液體懸浮培養物在每個實驗步驟進行三次。12-14天培養後，1ml培養物被轉移至1.5ml的Eppendorf管中並於室溫下以800×g離心10分鐘。所得的細胞沉澱重懸浮於含有0.02％EDTA和20％小牛血清的100μl PBS中。50μl的檢測緩衝液(含10ng1251-HP1-1D)被加至重懸浮的培養物中並於室溫下孵育60分鐘，偶而搖動。然後，通過以800×g在室溫下離心10分鐘來收集細胞。並用檢測緩衝液洗2次。沉澱用γ計數器(Packazd公司)計數1分鐘。非特異性結合通過在加入標記的HP1-1D前加入1μg非標記的HP1-1D(60分鐘)來確定。特異性結合通過用總的1251-HD1-1D的結合減去在過量非標高HP1-1D存在下的結合來確定。
實施例5寡核苷酸PCR引物基於由30kDa、28kDa和20kDa所得的氨基-末端的胺基酸順序，簡併性寡核苷酸被設計用於聚合酶鏈反應(PCR)的引物(見表4)。兩個引物集合物被合成，正義10聚體集合物編碼胺基酸殘基2-8(mpl 1)，反義21聚體集合物編碼胺基酸18-24(mpl 2)。
表4簡併寡核苷酸引物集合物
由豬外周血液淋巴細胞分離的豬基因組DNA被用做PCR的模板。50μl的反應體系包括0.8μg溶於10mM Tris-HCl(pH8.3)中的豬基因組DNA、50mM KCl、3mM MgCl2、100μg/ml BSA、400μM dNTPs、1μM各個引物集合物和2.5單位Taq聚合酶。初始模板變性為94℃8分鐘，然後35個循環為94℃45秒、55℃1分鐘、72℃1分鐘。最後一個後接72℃延伸10分鐘。PCR產物於12％聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離並用溴化乙銀染色來鑑別。如果氨基末端的胺基酸由單一密碼子來編碼，正確的PCR產物應為69鹼基。這種大小的一個DNA片段被從膠中洗脫並亞克隆入pGEMT(Promega公司)。三個克隆的序列見下表5。
表569bp豬基團組DNA片段
序列中有下劃線的鹼基為PCR引物的位置。這些結果證實了對30kDa、29kDa和20kDa蛋白質的胺基酸9-17所得到的N-末端序列並且指出這個序列由豬DNA的單一密碼子編碼。
實施例6人mpl配體基因基於實施例5的結果，一個被稱為pR45的45聚體的脫氧寡核苷酸被設計和合成用來篩選基團組文庫。45聚體具有以下序列5′GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3′(SEQ ID No28)這個寡核苷酸用(γ32P)-ATP和T4激酶進行32P-標記並且三物在低嚴緊雜交和洗滌條件(實施例7)下對人基團組文庫進行篩選。陽性克隆被挑選出並且純化噬菌斑，通過限制酶切圖譜和Southern印跡進行分析。克隆#4被選擇出以進行進一步的分析。
一個2.8kb的可與45聚體雜並的Bam HI-XbaI片段被亞克隆入pBlupscript sk-。通過使用豬mpl配體DNA序列特異的寡核苷酸引物對這個克隆的DNA序列進行部分測序。所得的序列證明，與豬mpl配體同源的人DNA序列已被分離。序列中的一個EcoRI限制酶切位點被確定，從而可從2.8kb的Bam HI-XbaI片段上分離出來一個390bp的EcoRI-XbaI片段，並亞克隆入pBluescript sk-。
這個片段的雙鏈都已被測序，人DNA序列及推導的胺基酸序列如圖9(SEQ ID NOS 3和4)。用剪頭指示出基團組序列中預測的內含子位置，並確定了一個假定的外顯子(「外顯子3」)。
對預測胺基酸序列的檢測證實了一個絲氨酸殘基是成熟mpl配體的第一個胺基酸，這與由胺基酸直接分析所得結果相同。緊接這個密碼子上遊序列的預測胺基酸很可能是涉及成熟mpl配體分泌的信號序列。這個信號序列的編碼區域可能在核苷酸位置68處被一個內含子中斷。
在3′方向上，外顯子中止於核苷酸196。這個外顯子編碼一段42個胺基酸的序列，其中16個可能是信號序列的部分，26個是人成熟mpl配體的部分。
實施例7全長人mpl配體cDNA基於人的「外顯子3」的序列(實施例6)，合成2個與「外顯子3」序列3′和5′端相對應的非簡併寡核苷酸。
表6人cDNA非簡併PCR寡核苷酸引物
這兩個引物被用於PCR反應，其中的模板DNA為來自於不同的cDNA文庫或通過如實施例5所描述的來源於不同組織的1ngQuick Clone cDNA(Clonefeoh公司)。正確的PCR產物的預期大小為140bp。在12％聚丙烯醯胺凝膠上對PCR產物進行分析之後，一個來源於成人腎cDNA文庫的預期大小的DNA片段被確定，該cDNA文庫分別來自成人腎、293胎腎細胞和人胎肝(ClonerdchCat.#7171-1)。
篩選人基因組文庫的45聚體寡核苷酸被用來篩選一個λDR2中的胎肝cDNA文庫。使用T4多聚核苷酸激酶將(γ32-P)-ATP標記寡核苷酸。在低嚴緊雜交條件下對文庫進行篩選。膜首先預雜交2小時，然後在20％甲醯胺、5×SSC、10×Denhardt′s、0.05M磷酸鈉(pH6.5)、0.1％焦磷酸鈉、50μg/ml鮭魚精子DNA中於42℃與探針雜交過夜。然後用2×SSC漂洗膜，在42℃下於0.5×SSC、0.1％SDS中洗膜一次。然後膜與kodak X-Ray片曝光過夜。挑選陽性克隆純化噬菌斑，用λDR2(clonetech cat.#6475-1)克隆中BamHI-XbaI兩側的寡核苷酸進行PCR來確定插入片段的大小。5μl的噬菌體儲液用做模板。初始變性為94℃7分鐘。然後進行30個循環的擴增(94℃1分鐘；52℃1分鐘和72℃1.5分鐘)，最後延伸為72℃15分鐘，clone#Fl2b有一個1.8kb的插入片段並被選擇出進行進一步的分析。
根據製造商的說明獲得包含於λDR2噬菌體臂中的質粒pDR2(clonetech，λDR2和pDR2克隆和表達系統，實驗室手冊，p42)(clonerech，λDR2和pDR2克隆和表達系統。實驗室手冊p29-30)。用BamHI和XbaI對質粒pDR2-FL2b進行限制酶分析表明在大約650位置的插入片段中有一個BamHI限制酶切位點。用BanHI-XbaI對質粒進行消化，將插入片段切出2個片段，一個為0.65kb，另一個為1.15kb。對由質粒pDR2-FL2b得到的三種不同的模板進行序列測定，用AB1371(applied Biosystems，Foster City，California)自動螢光DNA測序儀，使用染料標記的雙脫氧核苷三磷酸終止子(染料-終止子)的標準方法和傳統的合成步移引物(Sanger等，Proc.Natl.Acad，Sci.USA，745463-5467(1977))；Smith等，Natwre，321674-679(1986))進行雙鏈質粒DNA測序。質粒的PCR擴增產物的直接測充通過使用傳統的引物和染料-終止子反應在AB1373測序儀上進行。單鏈模板用M13 Janus載體產生(DNASTAR公司，Madison，Wisconsin)(Burland等，Nucl，AcidsRes.，21；3385-3390(1993))。BamHI-XbaI(1.15kb)和BamHI(0.65kb)自段從質粒pDR2-FL2b中分離得到，在脫氧核苷酸存在下，其片段末端用T4 DNA聚合酶填平。然後亞克隆入M13 Janus的SmaI位點。用染料標記的M13的通用和反向引物或步移引物和染料終止子通過標準程序進行測序。使用步移引物和標準的雙脫氧終止子化學(Sanger等，Proc.Natl.Acad，Sci，USA，745463-5467(1977))、33P標記的α-dATP和測序酶(United States Biochen-ital Corp.，Clevcland，Ohio)，通過單鏈M13 DNA進行人工測序反應。用Sequencher V2.1b12(Gene Codes Corporation，Ann Ar-bor，Michigem)進行DNA序列分布分析。核苷酸和推導的hML序列見圖1(SEQ ID NO1)。
實施例8人mpl配體(TPO)基因的分離用pR45質粒對λ-Gem12中的人基因組文庫進行篩選來分離人TPO基因的基因組DNA克隆，pR45是一個前文已描述過的寡核苷酸探針，它在低嚴緊條件下(見實施例7)或高度嚴緊條件下都可與一個對應於人mpl配體cDNA3′一半的片段雜交(從BamHI位點至3′端)。分離出兩個跨度為35kb的重疊克隆。亞克隆含整個TPO基因的兩個重疊片段(BamHI和EcoRI)並測序。該人基因的結構由7kb基因組DNA內的6個外顯子構成(圖14A，B和C)。所有外顯子/內含子的連接邊界都與哺乳動物的共有序列一致(Shapiro，M.B.等，Nucl.Acids Res.157155(1987))。外顯子1和外顯子2含5′非翻譯序列和信號肽的最初4個胺基酸。分泌信號的其餘部分和成熟蛋白的前26個胺基酸由外顯子3編碼。完整的羧基結構域和3′非翻譯結構域以及紅細胞生成素樣結構域的～50個胺基酸由外顯子6編碼。與在ML-2(hTPO-2)中觀察到的缺失相關的4個胺基酸由外顯子6的5′末端編碼。
實施例9人mpl配體(hML)的瞬時表達為了亞克隆含於pDR2-FL2b內的全長插入片段，用XbaI將質粒消化完全，然後用BamHI部分消化。凝膠電泳純化對應於1.8kb插入片段的DNA片段並將其亞克隆入pRK5(pRK5-hmpl 1)(有關pRK5的構建參見美國專利No.5,258,287)並使其置於巨細胞病毒立即早期啟動子的調控下。來自構建物pRK5-hmpl 1的DNA是通過PEG法製備的，並被轉染入人胚腎293細胞，該細胞被培養於補充有F-12營養混合物、20mM Hepes(pH7.4)和10％胎牛血清的Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM)中。用磷酸鈣法(Gorman，C.(1985)在DNA Cloning中A Practical Approach(Glover，D.M.，編)Vol.II，pp.143-190，IRL Press，Woshing-ton，D.C.)轉染細胞。轉染後36小時，在增殖測定中，分析轉染細胞上清液中的活性(實施例1)。只用pRK載體轉染的293細胞的上清液對Ba/F3或Ba/F3-mpl細胞無刺激作用(圖12A)。用pRK5-hmpl 1轉染的細胞的上清液對Ba/F3細胞無作用但極大地刺激了Ba/F3-mpl細胞的增殖(如12A)，由此表明該cDNA編碼了一種有功能活性的人mpl配體。
實施例10人mpl配體同種型hML2，hML3和hML4為了鑑定hML的可變剪接形式，合成了對應於hML編碼序列各末端的引物。這些引物被用於RT-PCR以擴增成人肝RNA。另外，構建了選定的目標區域側翼的內引物(如下)並進行同樣的使用。PCR產物末端的直接測序揭示了精確對應於分離自人胚肝基因文庫cDNA序列的一段單一序列(見圖1(SEQ ID NO1)。但是，靠近EPO結構域C端一段區域(在PCR產物的中部)表現出一種複合序列形式，表明該區域中存在著可能的剪接變異體。為了分離這些剪接變異體，表7中提供的目標區域側翼的引物在PCR中被用作成人肝cDNA的模板。
表7人ML同種型PCR引物
將PCR產物以平末端亞克隆入M13。對各亞克隆的測序揭示至少存在3種ML同種型。其中之一是hML(也稱為hML332)，它是最長的形式，與分離自胚肝文庫的序列精確對應。(圖11(SEQ IDNO6、8、9、10)給出了所列的從最長hML到最短hML-4這4種人mpl配體同種型的序列。
實施例11人Mpl配體同種型和取代性變異體的構建和瞬時表達hML2、hML3和hML(R153A，R154)利用重組PCR技術(Russell Higuchi，PCR Protocols，Aguide to Methods and Applications，Acad.Press，M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.SninskyT.J.White編)，由hML重建同種型hML2和hML3以及取代性變體hML(R153A，R154)。
在所有的構建中，所用的「外」引物列於表8，「重疊」引物列於表9。
表8外引物
表9重疊引物
全部PCR擴增都用克隆的Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司)，以下列條件進行最初的模板變性為94℃、7分鐘，然後循環30次(94℃，1分鐘；55℃，1分鐘；72℃，1.5分鐘)。最後一輪在72℃延伸10分鐘。用ClaI-XbaI消化PCR終產物，凝膠電泳純化並克隆入pRK5tkneo。用各種構建物如前所述轉染293細胞，用Ba/F3-mpl增殖測定分析上清液。在該測定中，hML-2和hML-3沒有表現出可測得的活性，但是hML(R153A，R154A)的活性與hML相似表明在該雙鹼性位置的加工並不是活性所必須的(見圖13)。
實施例12鼠mpl配體cDNAmML、mML-2和mML-3mML cDNA的分離利用PCR獲得一段對應於人mpl配體全編碼區域的DNA片段，凝膠電泳純化並利用有32P-dATP和32P-dCTP存在的隨機引物法進行標記。將該探針用於篩選λGT10中的鼠肝cDNA文庫的106克隆(Clontech cat# ML3001a)。
取複製的濾膜在35％甲醯胺、5×SSC、10×Denhardt′s、0.1％SDS，0.05M磷酸鈉(pH6.5)、0.1％焦磷酸鈉、100μg/ml超聲波粉碎的鮭精子DNA中與探針雜交過夜。在2×SSC中漂洗濾膜、然後在0.5×SSC、0.1％SDS中42℃洗滌一次。純化噬菌斑以得到雜交噬菌體，將cDNA插入片段亞克隆入Bluestript SK-質粒的Eco RI位置。挑選出帶1.5kb的插入片段的「LD」克隆用於進一步的分析，如前述對人ML cDNA進行雙鏈測序。圖14(SEQ ID NO1和11)提供了LD克隆的核苷酸序列和推導的胺基酸序列。推導的來自該克隆的成熟ML序列長331個胺基酸殘基，確定為mML331(或出於下文的某些原因稱為mML-2)。在這些ML的EPO樣結構域中觀察到了核苷酸序列和推導的胺基酸序列的高度一致性。但是，將人和鼠的ML的推導胺基酸序列對齊時，鼠的序列表現出有一個人殘基111-114之間的四肽缺失，對應於在人(見上文)和豬(見下文)的cDNA都見到的618位核苷酸後的一段12個核苷酸缺失。所以，檢查了另外的克隆以查找可能的鼠ML同種型。克隆「L7」有包含「丟失」四肽LPLQ的一段335胺基酸推導序列的一個1.4kb的插入片段。這種形式據信是全長鼠ML，被稱為mML或mML335。圖16(SEQ ID NO12和13)給出了mML的核苷酸和推導的胺基酸序列。最後，分離出克隆「L2」並測序。該克隆有與hML3對應的116個核苷酸的缺失，所以命名為mML3。圖16顯示了這兩者同種型的推導胺基酸序列的比較。重組mML的表達鼠ML的表達載體的製備與實施例8中所述基本相同。編碼mML和mML-2的克隆被亞克隆入pRK5tkneo，這是一個可以在CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化信號調控下表達的表達載體。利用磷酸鈣法將所得的表達載體mML pRK5tkneo和mML2pRK5tkneo瞬時轉染入293細胞。瞬時轉染後，在條件培養基中培養5天。將細胞維持於補充有10％胎牛血清的高葡萄糖DMEM培養基中。鼠mpl(mmpl)在Ba/F3細胞中的表達用mmpl pRK5tkneo轉染來獲取表達c-mpl的穩定細胞系，與實施例1中所述的對人mpl進行的方法基本相同。簡而言之，利用電穿孔(5×106個細胞，250V，960μF)將含有鼠mpl的全編碼序列(Skoda，R.C.等，EMBO J.122645-2653(1993))的表達載體(20μg；線性化的)轉染入Ba/F3細胞，然後用2mg/ml G418進行新黴素抗性選擇。用兔抗鼠mpl-IgG抗血清，通過流式細胞術分析評價mpl的表達。Ba/F3細胞被維持於來自作為IL-3源的WEHI-3B細胞的RPMI 1640培養基中。如實施例1所述，在轉染了mmpl和hmpl的Ba/F3細胞中分析來自用mML和mML-2瞬時轉染的293細胞的上清液。
實施例13豬mpl配體cDNApML和pML-2利用RACE PCR分離豬ML(pML)cDNA。簡而言之，根據編碼純化自再生障礙性貧血豬血清ML氨基端的豬ML基因的外顯子序列，設計一段寡聚dT引物和2段特異性引物。獲取由各種再生障礙性豬組織中製備的cDNA，並擴增。在腎中發現了一種1342bp的PCR cDNA產物並將其亞克隆。對幾個克隆進行了測序，發現它們編碼成熟的豬mpl配體(不包括完整的分泌信號肽)。該cDNA被發現編碼一段具有圖18(SEQ ID NO9和16)所示序列的332胺基酸的成熟蛋白pML332。
方法pML基因和cDNA的分離用pR45篩選EMBL3(Clontech Inc)中的豬基因組文庫來分離豬ML基因的基因組克隆。基因文庫的篩選基本同實施例7所述。分離出幾個克隆並對編碼相同於得自純化的ML胺基酸序列的外顯子進行了測序。利用RACE PCR改進程序獲取豬ML cDNA。根據豬ML基因序列設計兩段特異性引物。基本如前所述，由再生障礙性貧血豬的腎分離聚腺苷酸化的mRNA。用與mRNA的聚腺苷酸尾直接相對的BamdT引物逆轉錄製備cDNA。
(BamdT5′GACTCGAGGA TCCATCGATT TTTTTTTTTT TTTTT 3′)(SEQ ID NO55)用ML特異性的h-正向-1引物(h-正向-15′GCTAGCTCTA GAAATTGCTC CTCGTGGTCA TGCTTCT 3′)(SEQ ID NO43)和BAMAD引物(BAMAD5′GACTCGAGGA TCCATCG 3′)(SEQ ID NO56)在100ml反應體積中(50mM KCl、1.5mM MgCl、10mM Tris pH8.0、0.2mM dNTP，0.05U/ml Amplitaq聚合酶[Perkin ElmerInc.])進行PCR初擴增(循環28次95℃60秒，58℃60秒，72℃90秒)。然後用ClaI消化PCR產物，用苯酚-氯仿(1∶1)抽提，乙醇沉澱，連接到已用ClaI和KpnI切割的Bluestript SK-載體(StratageneInc.)上。室溫下培育2小時後，1/4的連接混合物被直接加入使用第二種特異性的前-1引物(正向-15′GCTAGCTCTA GAAGCCCGGC TCCTCCTGCC TG 3′)(SEQ ID NO57)和T3-21(與Bluestript SK-載體內多克隆區域附近的一段序列結合的一段寡核苷酸)
5′CGAAATTAAC CCTCACTAAA G 3′(SEQ ID NO58)的第二輪PCR(如前所述循環22次)。得到的PCR產物用XbaI和ClaI消化，並亞克隆入Bluestript SK-。對得自獨立PCR反應的幾個克隆進行了測序。
又重複了一次，鑑定出第二種形式pML-2，它編碼帶4胺基酸殘基缺失(328個胺基酸殘基)的蛋白質(見圖21[SEQ ID NO21])。pML和pML-2胺基酸序列的比較顯示，後一種形式除了缺失對應於殘基111-114(包括端值)的QLPP四肽外完全一致(見圖22[SEQ ID NO18和21]。在鼠、人和豬中觀察到的4胺基酸缺失出現在預測蛋白內完全相同的部分。
實施例14血小板生成素(TPO)對血小板抗原GPIIbIIIa表達的誘導作用的CMK測試CMK細胞被維持於補充有10％胎牛血清和10mM穀氨醯胺的RMPI1640培養基(Sigma公司)中。在測試的準備階段，收穫細胞，洗滌，並將其在補以5mg/l牛胰島素，10mg/l脫鐵運鐵蛋白、1×微量元素的無血清GIF培養基中重懸成5×105細胞/ml。在一96孔平底板中，在每一孔中加入按適當比例稀釋的100μl TPO標準或實驗樣品。將100μl CMK細胞懸浮液加入每一孔，將板在37℃、5％CO2的培養箱中培養48小時。培養後，板以100rpm在4℃離心5分鐘。棄去上清液，在每一孔中加入FITC共軛的GPIIbIIIa單克隆2D2抗體。在4℃培養1小時後，測試板以1000rpm再離心5分鐘。棄去含未結合抗體的上清液，在每一孔中加入200μl0.1％BSA-PBS洗液。0.1％BSA-PBS洗滌步驟重複三次。在FASCAN上利用測定相對螢光強度的單參數分析法分析細胞。
實施例15
通過在96孔微量滴定板上測定DAMI細胞核內有絲分裂活性進行血小板生成素(TPO)的DAMI測定DAMI細胞被維持於補充有10mM穀氨醯胺、100ng/ml青黴素G和50μg/ml鏈黴素的IMDM＋10％馬血清(Gibco公司)中。在測試準備階段，收穫細胞，洗滌，並在IMDM＋1％馬血清中重懸成1×106細胞/ml。在一96孔圓底測試板中，將100μl TPO標準或測試樣品加入DAMI細胞懸浮液。然後在37℃、5％CO2培養箱中培養48小時。培養後，測試板在Sorvall 6000B離心機上以1000rpm、4℃離心5分鐘。棄去上清液，重複200μl PBS-0.1％BSA的洗滌步驟。加入200μl冰冷的70％乙醇-PBS來固定細胞，並利用通氣重懸。在4℃培養15分鐘後，測試板以2000rpm離心5分鐘，在每一孔中加入150μl含0.1mg/ml碘丙錠(propidim iodide)的1mg/mlRNAse(RNA酶)和0.05％Tween-20。在37℃培養1小時後，通過流式細胞術測定DNA含量變化。如下測定和定量多倍性正常化的多倍體比(NPR)＝加TPO的(＞G2＋M的細胞％/＜G2＋M的細胞％)/對照的(＞G2＋M的細胞％/＜G2＋M的細胞％)實施例16血小板生成素的體內測試(鼠血小板回跳測試)用於血小板生成的體內35S確定的測定在第一天給C57BL6鼠(得自Charles River)腹膜內(IP)注射1ml羊抗鼠血小板血清(6amps)以產生血小板減少。在第5天和第6天，給鼠IP兩次注射因子或作為對照的PBS。在第7天，靜脈注射溶於0.1ml生理鹽水的30μCiNa235SO4，測定得自接受治療和作為對照的鼠血樣中注射劑量中的35S摻入循環血小板中百分比。同時對取自後眶竇血樣中的血小板和白細胞進行計數。
實施例17通過測定mpl-Rse.gD嵌合受體磷酸化進行血小板生成素(TPO)的KIRA ELISAVigon等(PNAS，USA 895640-5644(1992))已揭示了人mpl受體。含mpl受體胞外結構域(ECD)和Rse的跨膜結構域(TM)以及胞內結構域(ICD)的嵌合受體(Mark等，J.of Biol.Chem.269(14)10720-10728)與一種羧基端尾(flag)多肽一起被用於此處所述的KIRA ELISA。有關該測試的圖示說明可參見圖30和31。
(a)俘獲劑的製備用一種取自單純皰疹病毒糖蛋白D的肽來產生單克隆抗gD(克隆5B6)(Paborsky等，Protein Engineering 3(6)547-553)。將純化的儲備液在磷酸鹽緩衝液(PBS)中調至3.0mg/ml、pH7.4，分成1.0ml的等份，保存於-20℃。
(b)抗磷酸酪氨酸抗體的製備從UBI(Lake Placid，NY)購得單克隆抗磷酸酪氨酸抗體即克隆4G10，並利用長臂生物素-N-羥基琥珀醯胺(Biotin-X-NHS，Research Organics，Cleveland，OH)進行生物素標記。
(c)配體利用本文所述的重組技術製備mpl配體。將純化的mpl配體製成儲備液保存於4℃。
(d)Rse.gD核酸的製備合成的雙鏈寡核苷酸被用於重建人Rse C端10個胺基酸(880-890)的編碼序列並另外加上21個胺基酸，其中含抗體5B6的抗原決定基和一個終止密碼子。表10表示了這種融合基因合成部分的最終序列。
表10人Rse融合基因的合成雙鏈部分
該合成DNA在PstI與HindIII位置與編碼人Rse的1-880胺基酸的cDNA連接，PstI位點起始於公開的人Rse cDNA序列第2644位核苷酸，而HindIII位點則在表達載體pSV17.ID.LL(參見圖32，SEQ ID NO22)的多接頭中，連接後構建成表達質粒pSV.ID.Rse.gD。簡而言之，該表達質粒含有一個二順反子原初轉錄產物，其中含有由5′剪切供體和3′剪切受體內含子剪接位置界定的DHFR編碼序列，其後是編碼Rse.gD的序列。全長(非剪接的)信使RNA含有作為最初開放讀框的DHFR，所以，可產生用於挑選穩定轉化體的DHFR蛋白。
(e)mpl-Rse.gD核酸的製備修飾如上產生的表達質粒pSV.ID.Rse.gD以生成質粒pSV.ID.M.tmRd6，該質粒含有與Rse.gD(胺基酸429-911)跨膜結構域和胞內結構域融合的人mplECD(胺基酸1-491)的編碼序列。在Mark等，J.Biol.Chem.26726166-26171(1992)中所述的兩步PCR克隆反應中，用合成有寡核苷酸連接人mpl胞外結構域的一部分編碼序列與Rse.gD編碼序列。第一步PCR反應對mplcDNA模板所用的引物是M1
(5′-TCTCGCTACC GTTTACAG-3′)(SEQ ID NO61)和M2(5′-CAGGTACCCA CCAGGCGGTC TCGGT-3′)(SEQ ID NO62)對Rse模板所用的引物是R1(5′-GGGCCATGAC ACTGTCAA-3′)(SEQ ID NO63)和R2(5′-GACCGCCACC GAGACCGCCT GGTGGGTACC TGTGGTCCTT-3′)(SEQ ID NO64)。
該融合連接體的PvuII-SmaI部分被用於構建全長嵌合受體。
(f)細胞的轉化用已在質粒構架的單一NotI位置打開成線形的pSV.ID.tm-Rd6電穿孔DP12.CHO細胞(1989年3月15日公告的EP307,247)。在酚/氯仿抽提後，乙醇沉澱DNA並重懸在20μl 1/10 TrisEDTA中。然後，在以400V、330μf電穿孔前將10μg DNA與107個CHO DP12細胞在冰上孵育10分鐘。在非選擇性培養基上鋪平板前將細胞重新在冰中放10分鐘。24小時後，給細胞補料以無核酸的培養基以挑選穩定的DHFR+克隆。
(g)用於KIRA ELISA的轉化細胞的挑選用檢測gD決定基的抗體5B6通過SDS-PAGE對整個細胞裂解液的分離組分進行western印跡來鑑定表達mpl/Rse.gD的克隆。
(h)培養基細胞在F12/DMEM 50∶50(Gibco/BRL，Life Technologies，Grand Island，NY)中生長。培養基被補以10％透濾過的FBS(Hy-Clone，Logan，Utah)、25mM HEPES和2mM L-谷胺醯胺。
(i)KIRA ELISA將mpl-Rse.gD轉化的DP12.CHO細胞加入平底96孔培養板，各孔為100μl培養基(3×104個/格)，在37℃、5％CO2中培養過夜。次日早晨，傾析法去除上清液，將培養板置於紙巾上。每孔加入含實驗樣品或200、50、12.5、3.12、0.78、0.19、0.048或0ng/ml mpl的50μl培養基。在37℃刺激細胞30分鐘，傾析法棄去上清液，再將培養板在紙巾上輕輕壓幹。為了裂解細胞並溶解嵌合受體，每孔加入100μl裂解緩衝液。裂解緩衝液由含50mM HEPES(Gibco)的150mM NaCl溶液、0.5％Triton-X 100(Gibco)、0.01％硫柳汞、30KIU/ML抑肽酶(ICN Biochemicals，Aurora，OH)、1mM 4-(2-氨基乙基)-苯磺醯基氟化氫(AEBSF；ICN Biochemicals)、50μM亮肽素(ICN Biochemicals)和2mM正釩酸鈉(Na3VO4；Sigma Chemi-cal Co.St.Louis，MO)組成，pH7.5。培養板在培養板振蕩器(Bell-co Istruments，Vineland，NJ)上室溫下溫和攪拌60分鐘。
溶解細胞的同時，包被有4℃過夜的5B6單克隆抗體(在50mM碳酸鹽緩衝液中配成5.0μg/ml，pH9.6，100μl/格)的ELISA微量滴定板(Nunc Maxiscorp，Inter Med，Denmark)傾去上清液，在紙巾上壓幹，用150μl/孔封閉緩衝液(含0.5％BSA(Intergen Compa-ny，Purchansa，NY)和0.01％硫柳汞的PBS)室溫下封閉60分鐘，同時溫和攪拌。60分鐘後，包被有抗gD56的試驗板用自動洗板器(ScanWasher300，Skatron Instruments，Inc.Sterling，VA)以洗滌緩衝液(含0.05％Tween-20和0.01％硫柳汞的PBS)洗滌6次。
將含有從細胞培養物微量滴定孔中溶解的MPL/Rse.gD的裂解液(85μl/格)轉移至包被有抗gD56且被封閉的ELISA孔中，室溫下孵育2小時，同時溫和攪拌。用洗滌緩衝液洗去未結合的mpl-Rse.gD，並在每孔中加入100μl按1∶18000稀釋在稀釋緩衝液(含0.5％BSA，0.05％Tween-20，5mMEDTA和0.01％硫柳汞的PBS)中的生物素標記的4G10(抗磷酸酪氨酸)，即每孔加入56ng/ml。室溫下孵育2小時後，洗板並每孔加入按1∶60000稀釋在稀釋緩衝液中的辣根過氧化物酶(HRPO)共軛的鏈黴親和素(Zymed實驗室，S.San Francisco，CA)。室溫下，溫和攪拌，孵育30分鐘。游離的親和素共軛物被洗去，每孔加入100μl新製備的底物溶液(N-四甲聯苯胺(TMB)；2組份底物套配試劑；Kirkegaard和Perry，Gaighersburg，MD)。反應10分鐘，然後加入100μl/孔1.0mMH3PO4終止顯色反應。參照650nm處的吸光度讀出450nm處的值(ABS450/650)，使用的是用Macintosh Centris650(Apple計算機，Cupertino，CA)和DeltaSoft軟體(BioMetallics，Inc，Princeton，NJ)控制的vmax板讀數器(Molecular Divices，Plao Alto CA)。
用200、50、12.5、3.12、0.78、0.19、0.048或0ng/ml mpl配體刺激dp12.trkA、B或C.gD細胞，利用DeltaSoft程序繪製成ng/mlTPO對平均ABS450/650±標準差的標準曲線。利用內插法由吸光度在標準曲線上讀取樣品濃度，表示為ng/mlTPO活性。
mpl-配體被發現能夠以濃度依賴性或配體特異性方式激活mpl-Rse.gD嵌合受體。另外，mpl-Rse.gD KIRA-ELISA被發現能耐受高達100％的人血清(已顯示)或100％的血漿(未顯示)，從而使該測試可用於方便地篩選病人和pK樣品。
293-產生的TPO332標準曲線
TPO EC50′s的概括
實施例18
用於血小板生成素的基於受體的ELISAELISA板包被以於pH9.6碳酸鹽緩衝液中的兔F(ab′)2抗人IgG(Fc)，於4℃放置過夜。用溶於PBS中的0.5％牛血清白蛋白室溫下封閉1小時。在試驗板上加含嵌合受體，mpl-IgG，的發酵器收穫物並孵育2小時。在試驗板中加入標準品(由293細胞產生的TPO332，其濃度由定量胺基酸分析確定)的兩倍連續稀釋液和在0.5％牛血清白蛋白、0.05％Tween20中連續稀釋的樣品，孵育2小時。用純化的蛋白A、在E.coli中產生的TPO155的生物素標記的免抗體檢測結合的TPO(孵育1小時)，然後加入鏈黴親和素-過氧化物酶(孵育30分鐘)並以3，3′，5，5′-四甲聯苯胺為底物。讀取450nm處的吸光度。在每步之間都要洗滌試驗板。為了進行數據分析，利用Kaleidagraph的4參數曲線擬合程序擬合一條標準曲線。由標準曲線計算樣品的濃度。
實施例19293細胞TPO的表達與純化1. 293細胞表達載體的製備通過以下列寡核苷酸為引物的PCR，可以得到相應於TPO整個開放讀框的一個cDNA。
表11293PCR引物
在加入pfuDNA聚合酶(Stratagene公司)的反應中，PRK5-hmplI(參見實施例9)被用作模板。在最初的94℃7分鐘變性之後，續以25個擴增循環(94℃，1分鐘；55℃，1分鐘和72℃，1分鐘)。最後的延伸為72℃，15分鐘。純化PCR產物並在質粒pRK5tkneo的限制性位點Clal和Xbal之間克隆產物以獲得載體pRK5tkneo.ORF，pPK5tkneo是修飾pRK5後得到的載體，能在胸苷激酶啟動子的控制下表達新黴素抗性。相應於epo同源結構域的第二個構建物由同樣的方法生成，但所用的引物正向為Cla.FL.F，反向為Arg.STOP.Xba5′TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GCA GAG GGT GGA CC 3′(SEQ ID NO66)最後的構建物稱為pRK5-tkneoEPO-D。這兩個構建物的序列參見實施例7。2.人胚腎細胞的轉染用CaPO4方法將這兩個構建物轉染到人胚腎細胞中，參見實施例9。轉染後24小時，在0.4mg/ml的G418中，開始選擇對新黴素抗性的克隆。10至15天後，將單個的集落轉移到96孔板中並使之生長至匯合。來自這些克隆的ML153和ML332在條件培養基中的表達可通過Ba/F3-mpl增殖測定來評估(參見實施例1)。3.rhML332的純化將293-rhML332培養基上樣於在10mM磷酸鈉pH7.4(緩衝液A)中平衡的Blue-Sepharose(pharmacia公司)柱。隨後，各以10倍柱體積的緩衝液A和含2M脲的緩衝液A洗滌柱。然後，用含2M脲和1MNaCl的緩衝液A洗脫柱。接著，將Blue-Sepharose柱的洗脫集合物直接上樣於用緩衝液A平衡的麥胚凝集素Sepharose柱。麥胚凝集素Sepharose柱的洗滌用10倍柱體積含2M脲和1MNaCl的緩衝液A，而洗脫用同樣的緩衝液但還含有0.5M N-乙醯-D-葡糖胺。麥胚凝集素Sepharose柱的洗脫物上樣於在0.1％TFA中平衡的C4高效液相色譜柱(synchrom公司)。C4高效液相色譜柱是用不連續的丙醇梯度來洗脫(0-25％、25-35％、35-70％)。發現rhML332在28-30％丙醇梯度區域被洗脫。通過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，被提純的rhML332在凝膠的68-80千道爾頓區域以一條寬帶遷移(參見圖15)。4.rhML153的純化293-rhML153條件培養基以與rhML332相同的方式在Blue-Sepharose上被分離。與上述方法相同，Blue-Sepharose洗脫物被直接上樣於一個mpl親和柱。在與上述rhML332相同的條件下，使用一個C4高效液相色譜柱純化從mpl親和柱上洗脫下來的rhML153，使之達到均一性。通過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，再將被純化的rhML153分離成兩條主帶和兩條次帶，分子量約18,000-21,000(參見圖15)。
實施例20CHO的TPO表達與純化1.CHO表達載體的描述在下述的電穿孔法方案中使用的表達載體已經被指明pSV15.ID.LL.MLORF(全長的或hTPO332)，和pSV15.ID.LL.MLEPO-D(截短的或hTPO153)。有關這些質粒的性質見圖23和圖24。2.CHO表達載體的製備通過以表12所示的寡核苷酸為引物的PCR，可以得到相應於TPO整個開放讀框的一個cDNA。
表12CHO表達載體PCR引物
在加入pfuDNA聚合酶(Stratagene公司)的反應中，PRK5-hmplI(參見實施例7和9)被用作模板。在最初的94℃、7分鐘變性之後，續以25個擴增循環(94℃，1分鐘；55℃，1分鐘和72℃，1分鐘)。最後的延伸為72℃，15分鐘。純化PCR產物並在質粒pSV15.ID.LL的限制性位點Clal和Sall之間克隆產物以獲得載體pSV15.ID.LL.MLORF。相應於epo同源結構域的第二個構建物由同樣的方法生成，但所用的引物正向為Cla.FL.F2，反向為EPOD.Sal 5′AGT CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC 3′(SEQ ID NO68)最後的構建物被稱為pSV15.ID.LL.MLEPO-D。這兩個構建物的序列都參見實施例7和9。
本質上，全長和截短配體的編碼序列被引入CHO表達載體pSV15.ID.LL的多克隆位點。該質粒含有SV40的早期啟動子/增強子區域、一個含有鼠DHFR cDNA的修飾剪接單位、一個引入所需基因的多克隆位點(這裡，TPO的序列已被描述)、一個SV40的聚腺苷酸化信號和複製起點，以及細菌中用於質粒選擇和擴增的β內醯胺酶基因。3.建立穩定的表達重組人TPO332和TPO153的CHO細胞系的方法a.CHO親代細胞系的描述本文所述用於TPO分子表達的宿主CHO(中國倉鼠卵巢)細胞系已知為CHO-DP12(參見1989年3月15日出版的EP307,247)。為了得到對胰島素需求降低的克隆，用表達前胰島素原的一個載體轉染親代系(CHO-K1 DUX-B11(DHFR-)-，經Dr.L.Chasin同意，從史丹福大學的Dr.Frank Lee處得到)，從克隆中選擇出這個哺乳動物細胞系。這些細胞也是DHFR缺陷的，且通過在缺少核苷補充(甘氨酸、次黃嘌呤和胸苷)的培養基上的生長，對DHFR cDNA載體序列存在的選擇而獲得克隆。這一作為穩定表達CHO細胞系的選擇系統是通常所使用的。
b.轉染方法(電穿孔法)TPO332和TPO153表達細胞系經電穿孔法轉染DP12細胞而產生(參見如Andreason，G.L.J.Tiss.Cult.Meth.，15，56)，並相應地使用線性化質粒pSV15.ID.LL.MLORF或pSV.ID.LL.MLEPO-D。對每一個質粒的切割建立了三個限制性酶反應10微克、25微克和50微克載體及酶NOTI，並用標準的分子生物學方法。該限制性位點只在載體中發現一次，位於線性化區域3′和TPO配體轉錄單位以外(參見圖23)。建立100微升反應體系並37℃溫育過夜。第二天，用酚-氯仿-異戊醇(50∶49∶1)抽提一次並在乾冰上用乙醇沉澱約1小時。然後，經15分鐘微量離心分離和乾燥收集沉澱物。將線性化的DNA重懸於50微升補充了標準抗生素和2mM穀氨醯胺的Ham′s DMEM-F12 1∶1培養基中。
收集懸浮生長的DP12細胞，在用於重懸DNA的培養基中洗滌一次並最終以每750微升107細胞的濃度重懸於同樣的培養基中。細胞的等分試樣(750微升)和每個線性化DNA混合物一起在室溫中溫育1小時，然後轉移到一個BRL電穿孔槽中。接著，在350伏特、330微法和低電容的標準BRL電穿孔儀中電穿孔每一個反應混合物。在電穿孔之後，可將細胞在儀器中再放置5分鐘，然後在冰上再培育10分鐘。將電穿孔的細胞轉移到60毫米細胞培養皿中，其中含有5毫升用於培養CHO細胞的標準完全培養基(High葡萄糖DMEM-F12 50∶50，不含甘氨酸，補充了1X GHT、2mM穀氨醯胺和5％胎牛血清)，並在5％CO2細胞培養恆溫箱中生長過夜。
c.選擇和篩選方法第二天，細胞以標準方法從平板上被胰酶消化並被轉移到含有DHFR選擇培養基的150毫米組織培養皿中(Ham′s DMEM-F12，1∶1培養基，如上所述，補充了2％或5％的透析胎牛血清，但缺少甘氨酸、次黃嘌呤和胸苷，這是我們所使用的標準DHFR選擇培養基)。來自每一個60毫米平板的細胞隨後被重新塗布到5/150平板。然後，細胞在37℃/5％CO2中溫育10至15天(中間換一次培養基)直到克隆出現且達到適合轉移到96孔板的大小。在過了4至5天後，用設置為50毫升的無菌移液管將細胞系轉移到96孔板上。使細胞生長至匯合後(通常3至5天)，胰酶消化培養皿並複製出原來培養皿的兩個拷貝。這兩個拷貝被短期儲存於冷凍器，且每個孔中的細胞都稀釋於50微升含10％FCS的DMSO中。通過基於Ba/F3細胞的活性測定，從第三個培養皿中的匯合生長孔測定5天不含血清的條件培養基中樣品的TPO表達。基於這一測定的最高表達克隆從儲存中復甦，並被擴大到兩個匯合生長的150毫米T-燒瓶中，用於為了懸浮適應性、再測定和儲存而進行的細胞培養物組的轉移。
d.擴增方案通過上述選擇得到的幾個最高效價的細胞系隨後經標準氨甲喋呤擴增方法而生成更高效價的克隆。CHO細胞克隆被擴展並塗布於10釐米培養皿，其中有4個氨甲喋呤濃度(如50nM、100nM、200nM和400nM)，2至3個細胞數量(每皿105、5×105和106個細胞)。然後，將這些培養物37℃/5％CO2溫育，直至克隆形成且適合於轉移到96孔板進行進一步的分析。從這一選擇中得到的幾個高效價克隆再被加入到更高濃度(如600nM、800nM、1000nM和1200nM)的氨甲喋呤中並如前所述，抗性克隆可以形成並被轉移到96孔板中用於測定。4.培養表達重組人TPO332和TPO153的穩定CHO細胞系儲存的細胞被解凍，且在不含血清或含血清的培養基中，以標準的細胞生長方法將細胞群擴展。在擴展到足夠的細胞密度後，洗滌細胞以除去不再使用的細胞培養基。然後，用任何標準方法培養細胞，包括分批培養、補料分批培養或者在25-40℃、中性pH值、溶氧含量不低於5％的條件下連續培養直至組成型分泌的TPO聚集。隨後，以離心等機械方法將細胞培養液與細胞分離。5.來自CHO培養液的重組人TPO的純化收集到的細胞培養液(HCCL)被直接上樣於Blue Sepharose 6Fast Flow柱(Pharmacia公司)，柱的平衡用0.01M pH7.4的磷酸鈉和0.15M NaCl，在直線流速約50毫升/小時/平方釐米時，按每升樹脂約100升HCCL的比率來上樣。然後，用3至5倍柱體積平衡液、續以3至5倍柱體積的0.01M磷酸鈉pH7.4、2.0M脲和1.0MNaCl來洗滌柱。
然後，將含TPO的Blue Sepharose集合物上樣於麥胚凝集素Sepharose 6MB柱(Pharmacia公司)，柱的平衡用0.01M磷酸鈉pH7.4，2.0M脲和1.0MNaCl，在直線流速約50毫升/小時/平方釐米時，按每毫升樹脂約8至16毫升Blue Sepharose集合物的比率來上樣。隨後，以2至3倍柱體積的平衡緩衝液洗滌柱。接著，TPO的洗脫用2至5倍柱體積的0.01磷酸鈉pH7.4、2.0M脲和0.5MN-乙醯-D-葡糖胺。
然後，將麥胚凝集素集合物的終濃度調整到0.04％C12E8和0.1％三氟醋酸(TFA)。得到的集合物被上樣於C4反相柱(Vydac214TP1022)，柱的平衡用0.1％TFA和0.04％C12E8，在流速為157毫升/小時/平方釐米時，按每毫升樹脂約0.2至0.5毫克蛋白質的比率上樣。
蛋白質在含0.1％TFA和0.04％C12E8的乙腈雙相線性梯度中洗脫。第一相由15分鐘內0-30％的乙腈線性梯度構成。第二相由60分鐘內30-60％的乙腈線性梯度構成。在乙腈濃度約50％時，TPO被洗脫。在SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳的基礎上獲得一個集合物。
然後，用2倍體積的0.01M磷酸鈉pH7.4和0.15M NaCl稀釋C4集合物，並以約6倍體積的0.01M磷酸鈉pH7.4和0.15M Na-Cl在一個Amicon YM或有一個10,000至30,000道爾頓分子量截斷的類透濾膜上透濾。得到的透濾液可隨後經超濾進一步濃縮。透濾液/濃縮液被調整到一個0.01％吐溫80的終濃度。
隨後，等於總和柱體積2-5％的全部或部分透濾液/濃縮液被上樣於Sephacryl S-300 HR柱(Phamacia公司)，柱的平衡用0.01M磷酸鈉、pH7.4、0.15M NaCl和0.01％吐溫80，並以17毫升/小時/平方釐米的速率進行色譜分析。含有無聚集體或蛋白水解降解產物組分的TPO通過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳被集合。得到的集合物用0.22μ濾紙、Millex-GV或類似物過濾，並儲存於2-8℃。
實施例21大腸桿菌中TPO蛋白合成的轉化與誘導1.大腸桿菌TPO表達載體的構建質粒pMP21、pMP151、pMP41、pMP57和pMP202都被設計成用於表達在一個短前導區下遊的，TPO前155個胺基酸，該短前導區因不同的構建物而有變化。這個前導區主要提供高水平的翻譯起始和快速純化。質粒pMP210-1、-T8、-21、-22、-24和-25被設計用於表達在一個起始甲硫氨酸下遊的TPO前153個胺基酸，它們的區別僅在於對TPO前6個胺基酸的密碼子的用法，其中質粒pMP251是pMP210-1的一個在TPO羧基末端延伸兩個胺基酸而得到的衍生物。在色氨酸啟動子的誘導下，所有的上述質粒能在大腸桿菌中產生高水平的TPO細胞內表達(Yansura，D.G.等，Method in Enzymology(Goeddel，D.V.，編輯)18554-60，A-cademic Press，San Diego)。質粒pMP1和pMP172是上述TPO細胞內表達質粒構建中的中間物。
(a)質粒pMP1質粒pMP1是TPO前155個胺基酸的一個分泌型載體，它的構建是通過如圖33所示的將5個DNA片段連接在一起。其中的第一個片段是已經除去短MluI-BamHI片段的pPho21載體。pPho21是phGH1(Chang，C.N.等，Gene 55189-196)的一個衍生物，其中人生長激素基因已經被大腸桿菌phoA基因替代，且在胺基酸20-21處的STII信號序列的編碼序列中，已經插入一個Mlul限制性位點。
接下來的兩個片段中，一個是來自pRK5-hmplI(實施例9)的258個鹼基對的DNA HinfI-PstI片段，編碼TPO胺基酸19-103，另一個是下述的編碼胺基酸1-18的合成DNA5＇-CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCATTTGACGAAGCACTGA-5′(SEQ ID NO69)(SEQ ID NO70)這兩個片段以T4 DNA連接酶預先連接，接著以PstI切割。第四個片段是一個來自pRK5hmpl I的152個鹼基對的PstI-HaeIII片段，編碼TPO的104-155位置的胺基酸。最後一個片段是一個來自pdh108的412個鹼基對的StuI-BamHI片段，含有如上述的轉錄終止子λ(Scholtissek，S.等，NAR 153185)。
(b)質粒pMP21質粒pMP21是為了表達TPO的前155個胺基酸而設計出來的，該表達過程需要一個包含部分STII信號序列的13個胺基酸的前導區的幫助。如圖34所示，該質粒的構建是通過將3個DNA片段連接在一起。其中的第一個是除去了短XbaI-SphI片段的載體pVEG31。載體pVEG是pHGH207-1(de Boer，H.A.等，in Pro-moter Structure and Function(Rodriguez，R.L.and Chamber-lain，M.J.，編輯)，462，Praeger，New York)的一個衍生物，其中的人生長激素基因被血管內皮生長因子基因所替代(同樣的載體片段可以從稍後的質粒獲得)。
連接的第二部分是有下述序列的合成DNA雙螺旋5′-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAATTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5′(SEQ ID NO71)(SEQ ID NO72)最後一個片段是來自pMP1的1072個鹼基對的MluI-SphI片段，編碼TPO的155胺基酸。
(c)質粒pMP151質粒pMP151是為了表達一個前導區下遊的TPO前155個胺基酸而設計的，該前導區由STII信號序列的7個胺基酸、8個組氨酸和一個因子Xa斷裂位點組成。如圖35所示，pMP151通過三個DNA片段的連接而構建。其中的第一個就是上述的除去XbaI-SphI片段的載體pVEG31。第二個是有下列序列的合成DNA雙螺旋5＇-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAAGGTCGTAGCCTTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTCCAGCAT-5′(SEQ ID NO73)(SEQ ID NO74)最後一個是來自pMP11的1064個鹼基對的BglI-SphI片段，編碼TPO的154胺基酸。除了在STII信號序列(該片段可從pMP1中獲得)中一些密碼子的變化外，質粒pMP11與pMP1完全一樣。
(d)質粒pMP202除了前導區中的因子Xa斷裂位點被一個凝血酶斷裂位點替代外，質粒pMP202與表達載體pMP151非常相似。如圖36所示，pMP202通過連接3個DNA片段而構建。其中的第一個就是上述的除去短XbaI-SphI片段的pVEG31。第二個是有下述序列的DNA雙螺旋5′-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAACCACGTAGCCTTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTGGTGCAT-5′ (SEQ ID NO75)(SEQ ID NO76)最後一個片段是來自上述質粒pMP11的1064個鹼基對的BglI-SphI片段。
(e)質粒pMP172質粒pMP172是TPO前153個胺基酸的一個分泌型載體，也是構建pMP210的中間物。如圖37所示，pMP172的製備通過將3個DNA片段連接在一起。其中的第一個是除去了短EcoRI-HindIII部分的載體pLS32lamB。第二個是來自上述質粒pMP11的946個鹼基對的EcoRI-HgaI片段。最後一個片段是下述的合成DNA雙螺旋。5′-TCCACCCTCTGCGTCAGGT (SEQ ID NO77)GGAGACGCAGTCCATCGA-5′ (SEQ ID NO78)(f)質粒pMP210質粒pMP210是為了表達在一個翻譯起始甲硫氨酸後的TPO前153個胺基酸而設計的。該質粒實際上被製成一個質粒庫，其中TPO前6個密碼子中的每一個都在第三個位置隨機變化。如圖38所示，該質粒由三個DNA片段通過連接而構建。其中的第一個是如上述的除去短XbaI-SphI片段的載體pVEG31。第二個是合成DNA雙螺旋，首先用DNA聚合酶(Klenow)處理，然後用XbaI和HinfI消化，編碼起始甲硫氨酸和TPO前6個隨機密碼子，其序列如下5′-GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGAACACTGGAGGCT
GTTCTCAGTAAA(SEQ ID NO79)CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5′(SEQ ID NO80)第三個片段是來自pMP172的890個鹼基對的HinfI-SphI片段，編碼TPO的19-153胺基酸。
約3700個克隆的質粒pMP210庫被重新轉化到高四環素(50微克/毫升)LB平板上以選出高翻譯起始克隆(Yansura，D.G.等，MethodsA Companion to Methods in Enzymology 4151-158)。在8個培養於高四環素平板的集落中，選出5個TPO表達最好的進行DNA測序，其結果如圖39所示(SEQ ID NOS23、24、25、26、27和28)。
(g)質粒pMP41質粒pMP41是為了表達TPO前155個胺基酸而設計的，其中TPO已融入了由7個胺基酸的STII信號序列後接一個因子Xa斷裂位點而組成的前導區。如圖40所示，該質粒通過將3個DNA片段連接在一起而構建。其中的第一個是如上述的切除短XbaI-SphI片段的載體pVEG31。第二個是如下述的合成DNA雙螺旋5′-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGT CGTAGCC (SEQ ID NO81)TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT (SEQ ID NO82)最後的一個片段是來自上述質粒pMP11的1064個鹼基對的BglI-SphI片段。
(h)質粒pMP57質粒pMP57表達由9個胺基酸的STII信號序列和雙鹼性位點Lys-Arg構成的前導區下遊的TPO前155個胺基酸。該雙鹼性位點提供了一個用蛋白酶ArgC除去前導區的方法。如圖41所示，該質粒通過三個DNA片段的連接而構建。其中的第一個是上述的除去短XbaI-SphI片段的載體pVEG31。第二個是如下所示的合成DNA雙螺旋5′-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAAA CGTAGCC(SEQ ID NO83)TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5′ (SEQ ID NO84)第三個片段是來自上述質粒pMP11的1064個鹼基對的BglI-SphI片段。
(i)質粒pMP251質粒pMP251是pMP210-1的一個衍生物，其中，在TPO的羧基末端加入兩個胺基酸。如圖42所示，該質粒由兩個DNA片段連接而構建。其中的第一個是上述的除去短XbaI-SphI片段的pMP21。連接的第二部分是來自pMP210-1的316個鹼基對的XbaI-ApaI片段。2.帶有TPO表達載體的大腸桿菌的轉化和誘導使用氯化鈣熱休克法(Mandel，M.等，J.Mol.Biol.，53159-162，)，上述的TPO表達質粒可用於轉化大腸桿菌菌株44C6(w3110 tonAΔrpoHtslonΔclpPΔgalE)。首先，使轉化細胞在37℃和含50微克/毫升羧苄青黴素的LB培養基中生長，直到培養物的光密度(600納米)達到約2至3。然後，在含0.49％酪蛋白胺基酸(w/v)和50微克/毫升羧苄青黴素的M9培養基中將LB培養基稀釋20倍。在30℃換氣條件下生長1小時後，加入吲哚-3-乙酸使終濃度為50微克/毫升。然後，使培養物在30℃和換氣條件下繼續生長15小時，最後用離心法收集細胞。
實施例22大腸桿菌中生物活性TPO(Met-1 1-153)的產生下述產生具有生物活性的重摺疊TPO(Met-11-153)的程序可類似地應用於包括N和C末端延伸形式在內的其他TPO變異體的回收(參見實施例23)。A.不溶性TPO(Met-11-153)的回收以上述方法發酵表達由質粒pMP210-1編碼的TPO(Met-11-153)的大腸桿菌。通常，用Polytron勻漿器，使約100克細胞重懸於1升(10倍體積)細胞裂解緩衝液(10mM Tris、5mM EDTA，pH6)，並以5,000×g離心細胞30分鐘。再次用Polytron勻漿器將經洗滌的細胞沉澱重懸於1升細胞裂解緩衝液，並根據使用手冊，使細胞懸浮液通過一臺LH Cell Disrupter(LH Inceltech公司)或一臺Microfluidizer(Microgluidics International公司)。將懸浮液5,000g離心30分鐘後，再次重懸和離心以得到一個經洗滌的折射體沉澱。該經洗滌的沉澱需立即使用或冷凍儲存於-70℃。B.單體TPO(Met-11-153)的增溶和純化由上述步驟得到的沉澱重懸於5倍體積(按重量計算)的20mMTris pH8，加入6-8M胍和25mM DTT(二硫蘇糖醇)，並在4℃下，攪拌1至3小時或過夜使TPO蛋白質增溶。也可使用高濃度的脲(6-8M)，但與胍相比，通常得到的產量較低。增溶之後，30,000xg離心溶液30分鐘以得到含變性單體TPO蛋白質的上清液。然後，將上清液以2毫升/分鐘的流速在Superdex×200凝膠過濾柱(Pharmacia公司，2.6×60釐米)上色譜，並用含10mM DTT的200mM磷酸鈉pH6.0洗脫。在160和200毫升之間洗脫的含單體變性TPO的組分被收集。TPO蛋白質在半製備的C4反相柱(2×20釐米VYDAC)上被進一步純化。樣品以5毫升/分鐘的速率上樣於用含30％乙腈的0.1％TFA(三氟醋酸)平衡的柱。以乙腈的線性梯度(60分鐘內30-60％)洗脫蛋白質。在約50％乙腈濃度時，純化的還原蛋白質被洗脫。該產物經重摺疊後獲得生物活性的TPO變異體。C.生物活性TPO(Met-11-153)的產生在40毫升0.1％TFA/50％乙腈中的約20毫克單體、還原性和變性TPO蛋白質被稀釋於360毫升重摺疊緩衝液，其中最好含有下列試劑50mM Tris0.3M NaCl5mM EDTA2％CHAPS去垢劑25％甘油5mM氧化穀胱甘肽1mM還原穀胱甘肽pH調節到8.3在混合以後，4℃下溫和攪拌重摺疊緩衝液12至48小時，從而獲得以正確的二硫鍵形式(參見下文)重摺疊的TPO最高產量。然後，以終濃度0.2％TFA使溶液酸性化，經0.45或0.22微米的濾紙過濾溶液，並加入1/10體積的乙腈。該溶液隨即被直接泵入C4反相柱並以與上文所述相同的梯度洗脫純化的重摺疊TPO(Met-11-153)。在這些條件下，有生物活性的重摺疊TPO在乙腈濃度約45％時被洗脫。不適當的二硫鍵的TPO形式被較早地洗脫下來。經SDS凝膠和C4反相色譜分析的評估，最終的TPO(Met-11-153)純度大於95％。對於動物研究，C4純化的物質被透析入生理性可容緩衝液。使用含150mM NaCl和0.01％吐溫80的等滲緩衝液(10mM乙酸鈉pH5.5，10mM琥珀酸鈉pH5.5或10mM磷酸鈉pH7.4)。
由於TPO在Ba/F3測定中的高效價(約3皮克/毫升時達到最大刺激的一半)，有可能使用許多不同的緩衝液、去垢劑和氧化還原條件來得到生物活性物質。但是，在大多數情況下，只能得到少量(＜10％)適當摺疊的物質。對於商業性製造過程，希望重摺疊的產量至少10％，30至50％更好，而大於50％則最好。已經評估了許多不同的去垢劑(Triton X-100、十二烷基-β-麥芽苷、CHAPS、CHAPSO、SDS、十二烷基肌氨酸鈉、吐溫20和吐溫80、Zwittergent3-14和其他去垢劑)對支持高重摺疊產量的效能。在這些去垢劑中，只發現CHAPS家族(CHAPS和CHAPSO)通常能用於在重摺疊反應中限制蛋白質聚集和不適當的二硫鍵形成。高於1％CHAPS的水平最起作用。最佳的產量需要氯化鈉，其最適水平在0.1M和0.5M之間。加入EDTA(1-5mM)能限制某些製備物中的一些金屬催化氧化作用(和聚集作用)。大於5％的甘油濃度提供了最適的重摺疊條件。為了得到最高的產量，必需同時加入氧化和還原穀胱甘肽或者氧化和還原半胱氨酸作為氧化還原對。通常，在氧化還原對中的氧化劑等於或多於還原劑時，可觀察到更高的產量。這些TPO變異體重摺疊的最適pH值在7.5和約9之間。濃度為10至15％或更低的有機溶劑(如乙醇、乙腈和甲醇)可以被耐受。更高水平的有機溶劑增加不適當摺疊形式的量。Tris和磷酸鹽緩衝液通常是有用的。4℃溫育也能得到適當摺疊的TPO的更高水平。
通過第一個C4步驟純化的TPO製備物中通常有40至60％的重摺疊產量(根據用於重摺疊反應的還原和變性TPO量)。在低純度的製備物中(如直接在Superdex200柱或最初的折射體抽提之後)可以得到活性物質，雖然會因為TPO重摺疊過程中過多的沉澱作用和非TPO蛋白質的幹擾而使產量減少。
由於TPO(Met-11-153)含有4個半胱氨酸殘基，它可能生成該蛋白質的三個不同的二硫鍵形式形式1二硫鍵在半胱氨酸殘基1-4和2-3之間形式2二硫鍵在半胱氨酸殘基1-2和3-4之間形式3二硫鍵在半胱氨酸殘基1-3和2-4之間。
在確定重摺疊條件的最初嘗試中，通過C4反相色譜分離出了幾個含TPO蛋白質的不同峰。用Ba/F3測定法確定了其中只有一個峰有顯著的生物活性。隨後，調整重摺疊條件以得到該形式的最高產量。在這些條件下，得到的全部單體TPO中，錯誤摺疊形式低於10-20％。
通過質譜法和蛋白質測序，已經確定生物活性TPO的二硫鍵形式為1-4和2-3(即形式1)。多種C4分離峰的等分試樣(5-10納摩爾)用胰蛋白酶消化(胰蛋白酶與蛋白質的摩爾比為1∶25)。在DTT還原作用之前或之後，通過基質輔助的雷射解吸質譜法，分析消化混合物。在還原作用之後，檢測對應於TPO的大多數較大胰酶解肽的團塊。在非還原樣品中，這些團塊中的一些消失了而新的團塊可觀察到。新峰的團塊基本上對應於涉及二硫鍵對的單個胰酶解肽的數目。因此，有可能明確地確認重摺疊、重組、生物活性的TPO的二硫鍵形式是1-4和2-3。這與相關的紅細胞生成素分子已知的二硫鍵形式是一致的。D.重組、重摺疊TPO(Met-11-153)的生物活性重摺疊和純化的TPO(Met-11-153)在體內和體外的測定中都有活性。在Ba/F3測定中，在3.3皮克/毫升(0.3pM)時，摻入Ba/F3細胞的胸苷的刺激達到最大的一半。在基於mpl受體的ELISA中，1.9納克/毫升時，達到最大活性的一半。在正常的和用低致死X射線處理的骨髓抑制動物中，TPO(Met-11-153)有刺激新的血小板生成的高潛力(在劑量低達30納克/鼠時可見到活性)。
實施例23大腸桿菌中其他生物活性TPO變異體的產生下文提供了在大腸桿菌中產生的被純化和重摺疊成生物活性形式的三種不同TPO變異體。
(1)來自細菌的信號序列STII的MLF-13殘基被融入TPO的N-末端結構域(殘基1-155)。得到的序列為MKKNIAFLLNAYASPAPPAC……CVRRA(SEQ ID NO85)其中的前導序列為下劃線部分，而C……C代表從半胱氨酸7到半胱氨酸151。該變異體的構建提供一個酪氨酸用於受體和生物研究的TPO放射性碘化作用。
(2)由STII序列、8個組氨酸殘基和因子Xa酶斷裂序列IEGR組成的H8MLF-7殘基被融入TPO的N-末端結構域(殘基1-155)。其序列為MKKNIAFHHHHHHHHIEGRSPAPPAC……CVRRA(SEQ ID NO86)其中的前導序列為下劃線部分，而C……C代表從半胱氨酸7到半胱氨酸151。當被純化和重摺疊時，該變異體可用酶因子Xa處理，因子Xa在序列IEGR的精氨酸殘基後進行斷裂，以產生一個長度為155個殘基、有天然絲氨酸N-末端胺基酸的TPO變異體。
(3)除了一個凝血酶敏感序列IEPR被融入TPO的N末端結構域外，T-H8MLF-以與上述變異體(2)相同的方法製備。得到的序列為MKKNIAFHHHHHHHHIEPRSPAPPAC……CVRRA(SEQ ID NO87)其中的前導序列為下劃線部分，而C……C代表從半胱氨酸7到半胱氨酸151。在純化和重摺疊之後，可用凝血酶處理該變異體以得到一個155個殘基長度的TPO天然N-末端變異體。A.單體的生物活性TPO變異體(1)、(2)和(3)的回收、增溶和純化在大腸桿菌中能表達所有的變異體。如關於TPO(Met-11-153)的實施例22中所述，在折射體中發現了大多數變異體。可以用與實施例22所述相同的程序回收、增溶和純化單體TPO變異體。使用與TPO(Met-11-153)所用相同的重摺疊條件可獲得30至50％的總產量。在重摺疊之後，用如上文所述的乙腈梯度，通過0.1％TFA中的C4反相色譜，提純TPO變異體。根據Ba/F3測定的評估，所有的TPO變異體(在它們的非蛋白水解形式)有生物活性，2-5pM時達到最大活性的一半。B.產生真N-末端TPO(1-155)的變異體(2)和(3)的蛋白水解過程上述的變異體(2)和(3)被設計成在TPO的正常N-末端胺基酸殘基前帶有一個可酶致斷裂的前導肽。在上述的變異體(2)和(3)的重摺疊和純化之後，每一個都被合適的酶消化。對於每一個變異體，通過向溶液中吹入緩氣流氮來除去C4反相步驟中的乙腈。隨後，如下文所述，用因子Xa或凝血酶處理兩種變異體。
對於TPO變異體(2)，將pH8的1M Tris緩衝液加入不含乙腈的溶液，使終濃度為50mM，且如有必要，將pH調節到8。加入NaCl和CaCl2，使濃度相應為0.1M和2mM。加入因子Xa(New EnglandBiolabs公司)使酶和變異體的摩爾比為1∶25到1∶100。室溫溫育樣品1至2小時使斷裂達到最大值，通過表明前導序列丟失的SDS凝膠上的遷移變化可以評估出這個最大值。隨後，用與上述正確摺疊變異體的純化相同的梯度和條件，通過C4反相色譜純化反應混合物。通過這些條件，未斷裂的變異體B與斷裂的變異體(2)分離。N-末端胺基酸為SPAPP，表示N-末端前導序列被成功地除去。因子Xa也在TPO結構域內產生不同數量的內部斷裂；在位置118的精氨酸殘基生成一個額外的N-末端序列TTAHKDP(SEQ ID NO88)後，可以觀察到斷裂。在非還原SDS凝膠上，對應於因子Xa斷裂的變異體，可以觀察到約17,000道爾頓的單一條帶；在還原SDS凝膠上，對應於在精氨酸118的斷裂，可以觀察到分子量約12,000和5,000道爾頓的兩個條帶。這一觀察也證實了，該分子的兩個部分通過第一和第四個半胱氨酸間的二硫鍵連在一起，這與上文所述胰酶消化實驗結果的推斷是一致的。在Ba/F3生物測定中，除去N-末端前導序列和帶有內部斷裂的純化TPO(1-155)變異體能在0.2至0.3pM時達到最大活性的一半。
對變異體(3)來說，消化緩衝液含有pH8的50mM Tris、2％CHAPS、0.3M NaCl、5mM EDTA和人或牛凝血酶(Calbiochem公司)，其中後者(酶)和TPO變異體蛋白質的重量比為1∶25至1∶50。消化作用為室溫下2-6小時。通過上述的因子Xa斷裂反應的SDS凝膠來評估消化進程。通常，大於90％的前導區斷裂發生在這一時間。得到的TPO用如上所述的C4反相柱提純並通過胺基酸測序顯示出有所需的N-末端。如上述的通過因子Xa在精氨酸-蘇氨酸鍵之間的內部斷裂只得到很少量(＜5％)。得到的TPO蛋白質有高生物活性，在Ba/F3測定中，0.2-0.4pM蛋白質能達到最高應答值的一半。在基於mpl受體的酶聯免疫吸附測定中，2-4納克/毫升的純化蛋白質(120-240pM)能達到最高應答值的一半，而含有前導序列的完整變異體在兩個測定中的效能都要降低5至10倍。對於動物研究，HPLC純化的斷裂蛋白質被透析入生理性可容的緩衝液，其中含有150mM NaCl、0.01％吐溫80和pH5.5的10mM琥珀酸鈉、或pH5.5的10mM乙酸鈉、或pH7.4的磷酸鈉。通過HPLC和SDS凝膠，純化的蛋白質在4℃保存中可穩定幾個星期。在正常的和骨髓抑制的鼠中，這一有真N-末端序列的純化TPO是具有高度活性的，在低達30納克/鼠的低劑量下，能促進血小板的生成。
實施例24合成mpl配體雖然通常用重組方法製備人mpl配體(hML)，但是也可以通過合成的肽片段的酶促連接來合成，其方法如下文所述。hML的合成生產允許非天然胺基酸或合成功能物如聚乙二醇的摻入。以前，已經設計出了一個絲氨酸蛋白酶枯草蛋白酶DPN的突變體。構建枯草連接酶(subtiligase)(8221C/P225A)，可用以有效地在水溶液中連接肽酯(Abrahmsen等，Biochem.，304151-4159)。現在，已經表明，合成肽能夠按順序地被酶促連接並產生具有酶促活性的長肽和蛋白質如核糖核酸酶A(Jackson等，Science，)。該技術使我們得以化學合成長的蛋白質，而在以前，長的蛋白質只能用重組DNA技術來製得。更詳細的細節如下文所述。
使用枯草連接酶合成hML153的一般策略如方案1所示。以相應於蛋白質C-末端片段的完全去保護的肽為起點，將一條N-末端已保護的，C-末端激活的酯肽與枯草連接酶一起加入。當反應結束後，通過反相高效液相色譜分離出產物，並將保護基團從N-末端除去。連接下一個肽片段和去保護並使用一系列肽來重複這個過程直至得到全長的蛋白質。這個過程類似於這樣的固相方法一個N-末端被保護的、C-末端被激活的肽連接到前一個肽的N-末端，並使蛋白質按照C→N的方向合成。雖然因為每次配對將導致多達50個殘基的加入且產物在每一次連接後被分離，但是較長的高純度蛋白質能夠以一個合理的產量被合成。
方案1.用枯草連接酶合成hML的策略R-NH-肽2-CO-R′+H2N-肽1-CO2↓1)枯草連接酶R-NH-肽2-CO-NH-肽1-CO2↓2)Zn/CH3CO2HH2N-肽2-CO-NH-肽1-CO2↓3)重複1+2H2N-肽3-CO-NH-肽2-CO-NH-肽1-CO2
根據對枯草連接酶序列特異性以及對hML生物活性「EPO結構域」胺基酸序列的認識，我們將hML153分割成長度18至25個殘基的7個片段。合成測試的連接四肽用以確定18至25聚體的合適的連接接合點。表13顯示了這些測試連接的結果。
表13hML測試連接。在22℃、100mM麥黃酮中，溶解供體和親核體肽，使濃度為10mM。從1.6mg/ml(約70μM)的儲備液中，取出連接酶並加入溶液，使終濃度為10μM。連接過程可過夜。產量根據相對於供體肽水解的連接百分率計算。
根據這些實驗，表14所示的連接肽應該被枯草連接酶有效地連接。對於每個供體酯肽都需要一個合適的N末端保護基團來防止自身連接。我們選擇異煙醯(iNOC)保護基團(Veber等，J.Org.Chem.，423286-3289)，因為它是水溶性的，能在固相肽合成的最後一步被摻入，並且它在用於去保護和將肽從固相樹脂上分離下來的無水HF中能保持穩定。另外，在弱還原條件下(鋅/乙酸)，它能夠在每一次連接之後從肽上被除去，從而生成一個用於隨後連接反應的游離N末端。羥乙酸鹽-賴氨醯-醯胺(glc-K-NH2)酯被用作激活C-末端，其根據是以前的實驗顯示它能被枯草連接酶有效地醯化(Abrahmsen等，Biochem.，304151-4159)。被iNOC保護和被glc-K-amide激活的肽能使用標準的固相方法來合成，其要點見於方案2。然後，將肽按順序連接直至生成完整的蛋白質，並且終產物在體外被重摺疊。根據與EPO的同源性，相信在半胱氨酸殘基7和151以及28和85之間會形成二硫化物對。只需在氧化環境中攪拌該還原物幾個小時，就能使二硫化物氧化。重摺疊產物隨後用高效液相色譜法純化並將含活性蛋白質的組分合併且凍幹保存。另外，可用不同的方法來保護二硫化物以控制在特定的二硫化物對之間的一系列氧化作用。用乙醯胺甲基(acm)基團對半胱氨酸7和151的保護保證了28和85的氧化作用。隨後，可將acm基團除去並將殘基7和151氧化。反之，在需要一系列氧化作用來使摺疊正確時，可將殘基28和85用acm保護並氧化。或者，半胱氨酸28和85可被另一個除半胱氨酸以外的天然或非天然胺基酸置換，以保證半胱氨酸7和151的正確氧化。
表14.用枯草連接酶進行合成完整hML所使用的肽片段片段序列1(SEQ ID NO110)iNOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NH2(1-22)2(SEQ ID NO111)iNOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NH2(23-46)3(SEQ ID NO112)iNOC-HN-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-glc-K-NH2(47-69)4(SEQ ID NO113)iNOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-glc-K-NH2(70-90)5(SEQ ID NO114)iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-K-NH2(90-106)6(SEQ ID NO115)iNOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NH2(107-128)7(SEQ ID NO116)H2N-LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO2(129-153)完成肽連接的條件為25℃，100mM麥黃酮pH8(新鮮製備並經5μM濾紙的真空過濾排氣)。通常，C-末端片段被溶解於緩衝液(2-5mM肽)中，且加入枯草連接酶10×儲備液(pH8的100mM麥黃酮中，濃度1mg/ml)使最終的酶濃度達到約5μM。3至5摩爾的過量glc-K-NH2激活的供體肽隨後以不溶性的固體形式加入並使混合物於25℃靜止。連接的監測通過反相C18高效液相色譜分析(0.1％三氟醋酸中的CH3CN/H2O梯度)。連接產物通過製備的高效液相色譜純化並凍幹。異煙醯(iNOC)的去保護通過在乙酸中將由鹽酸活化的鋅屑與被保護的肽一起攪拌。鋅屑通過過濾除去，乙酸則通過真空蒸發。得到的肽能直接用於下一步連接並重複上述過程。合成的hML153能夠以類似上文所述的步驟連接於合成的或重組hML154-332，從而產生合成或半合成的全長hML。
合成的hML相對於重組體有很多優勢。可以引入非天然的側鏈以提高效能或特異性。可以摻入多聚體功能物如聚乙二醇，以增加作用的延續時間。例如，在一步或多步連接完成之前或之後，聚乙二醇可以被連接於個別片段的賴氨酸殘基(表14)。蛋白酶敏感肽鍵可以被除去或改變以提高在體內的穩定性。另外，可以合成重原子衍生物以幫助確定結構。
方案2.用於片段連接的肽片段的固相合成 a)賴氨醯-對甲基苯hydrylamine(MBHA)樹脂1(0.63meq./gm.，Advanced ChemTech)在甲基乙醯胺(DMA)溶液中和25℃時，與溴乙酸(5eq.)和二異丙基碳化二亞胺(5eq.)一起攪拌1小時，從而得到溴乙酸衍生物2。b)用DMA大量洗滌樹脂並在二甲基甲醯胺(DMF)中和50℃時，與二碳酸鈉一起攪拌24小時以酯化單個的Boc保護的胺基酸，從而得到相應的羥乙酸鹽-苯丙氨醯-氨醯-樹脂3。氨基乙醯化樹脂用DMF(3×)和二氯甲烷(CH2Cl2)(3×)洗滌並可在室溫保存數月。隨後，可將樹脂3上樣於一臺自動肽合成儀(Ap-plied Biosystems 430A)並使用標準固相程序(5)使肽延伸。c)用45％三氟乙酸的CH2Cl2溶液除去N-α-Boc基團。d)隨後的Boc保護胺基酸(5eq.)預先用DMA中的苯並三唑-1-yl-oxy-tris-(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP，4eq.)和N-甲基嗎啉(NMM，10eq.)激活並偶聯1至2小時。e)除去最後的N-α-Boc基團(TFA/CH2Cl2)以得到4，並且如前文所述，通過在DMA中和25℃時與4-異煙醯-2-4-二硝基苯碳酸鹽(3eq.)和NMM(6eq.)一起攪拌24小時，引入異煙醯(iNOC)保護基團。f)通過0℃無水HF(5％苯甲醚/5％乙基甲基sufide)處理1小時，使肽斷裂和去保護，從而得到iNOC保護的，羥乙酸鹽激活的肽5，並用反相C1 8高效液相色譜(CH3CN/水梯度，0.1％TFA)純化。所有底物的鑑定由質譜法來完成。
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *補充的可實現性根據上述的說明和易獲得的參考文獻以及起始材料，可以實現權利要求書所提出的本發明內容。不過，申請人已經在AmericanType Culture Collection，Rockville，Md.，USA(ATCC)中保存了下列細胞系大腸桿菌，DH10B-pBSK-hmpl I 1.8，ATCC登記號CRL69575，1994年2月24日保存；質粒，pSV15.ID.LL.MLORF，ATCC登記號75958，1994年12月2日保存；和CHO DP-12細胞，ML 1/50 MCB(標記#1594)，ATCC登記號CRL11770，1994年12月6日保存。
該保存物是在Budapest Treaty的規定下，受到微生物保存的國際性認可，並以專利程序及其規則(Budapest Treaty)為目的而製成的。這保證了自保存之日起，能維持有活力的培養物30年。在Bu-dapest Treaty規定的期限內，依據申請人和ATCC之間的協議，可以從ATCC得到所需的生物，其中ATCC應在有關的美國專利的保證下，確保不受限制的可獲得性。被保存菌株的可獲得性不能解釋為在違反由任何政府依據其專利法而授予的權利時對本發明的應用。
* * * * * * * * * * * * * * * * * * *雖然本發明的描述必然要結合優選例子和特定的操作性實施例，但是在閱讀了前述的說明以後，只要不偏離本發明的精神和範疇，一名普通的技術人員將可以實現本文中所述的多種變化、等價物的置換和題材的變更。因此，本發明可以實現的方法不僅僅是本文中所特別描述的那些。因而，希望此處由書面專利賦予的保護只受本文所附權利要求書及其等價物的限制。
所有在本文中被引用的參考內容都籍此一併作為參考。
序列表(1)一般信息(i)申請人Genetech，Inc.
Eaton，Dan L.
de Sauvage，Frederic J.(ii)發明名稱血小板生成素(iii)序列數目144(iv)通信地址(A)地址Genentech，Inc.
(B)街道460 Point San Bruno Blvd(C)城市South San Francisco(D)州加利福尼亞(E)國家美國(F)郵編94080(v)計算機可讀形式(A)記錄介質類型3.5英寸，1.44Mb軟盤(B)計算機IBM PC兼容型(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體WinPatin(Genentech)(vi)本申請數據(A)申請號08/374540(B)申請日03-5月-1995(C)分類(vii)在先申請數據(A)申請號PCT/US94/14553(B)申請日28-12月-1994(vii)在先申請數據
(A)申請號08/249376(B)申請日25-5月-1994(vii)在先申請數據(A)申請號08/223263(B)申請日04-4月-1994(vii)在先申請數據(A)申請號08/196689(B)申請日15-2月-1994(vii)在先申請數據(A)申請號08/348658(B)申請日02-12月-1994(vii)在先申請數據(A)申請號08/185607(B)申請日21-1月-1994(vii)在先申請數據(A)申請號08/348657(B)申請日02-12月-1994(vii)在先申請數據(A)申請號08/176553(B)申請日03-1月-1994(viii)律師/代理人信息(A)姓名Winter，Daryl B.
(B)登記號32,637(C)卷宗/檔案號P0871P5(ix)通訊信息(A)電話415/225-1249(B)傳真415/952-9881
(C)電傳910/371-7168(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度353個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO1Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr1 5 1015Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu202530Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser354045Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val505560Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln657075Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu808590Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr95100 105Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu110 115 120Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro125 130 135Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu140 145 150Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu155 160 165Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr
170 175 180Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu185 190 195Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser200 205 210Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe215 220 225Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu230 235 240Asp Gln Ile Pro Cly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn245 250 255Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly260 265 270Ala Pro Asp Ile Ser Ser Cly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro275 280 285Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro290 295 300Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr305 310 315Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro320 325 330Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His335 340 345Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly350 353(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度1795鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO2TCTTCCTACC CATCTGCTCC CCAGAGGGCT GCCTGCTGTG CACTTGGGTC 50CTGGAGCCCT TCTCCACCCG GATAGATTCC TCACCCTTGG CCCGCCTTTG 100CCCCACCCTA CTCTGCCCAG AAGTGCAAGA GCCTAAGCCG CCTCCATGGC 150CCCAGGAAGG ATTCAGGGGA GAGGCCCCAA ACAGGGAGCC ACGCCAGCCA 200GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG TGGTCATGCT 250TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCCAG CCCGGCTCCT CCTGCTTGTG 300ACCTCCGAGT CCTCAGTAAA CTGCTTCGTG ACTCCCATGT CCTTCACAGC 350AGACTGAGCC AGTGCCCAGA GGTTCACCCT TTGCCTACAC CTGTCCTGCT 400GCCTGCTGTG GACTTTAGCT TGGGAGAATG GAAAACCCAG ATGGAGGAGA 450CCAAGGCACA GGACATTCTG GGAGCAGTGA CCCTTCTGCT GGAGGGAGTG 500ATGGCAGCAC GGGGACAACT GGGACCCACT TGCCTCTCAT CCCTCCTGGG 550GCAGCTTTCT GGACAGGTCC GTCTCCTCCT TGGGGCCCTG CAGAGCCTCC 600TTGGAACCCA GCTTCCTCCA CAGGGCAGGA CCACAGCTCA CAAGGATCCC 650AATGCCATCT TCCTGAGCTT CCAACACCTG CTCCGAGGAA AGGTGCGTTT 700CCTGATGCTT GTAGGAGGGT CCACCCTCTG CGTCAGGCGG GCCCCACCCA 750CCACAGCTGT CCCCAGCAGA ACCTCTCTAG TCCTCACACT GAACGAGCTC 800CCAAACAGGA CTTCTGGATT GTTGGAGACA AACTTCACTG CCTCAGCCAG 850AACTACTGGC TCTGGGCTTC TGAAGTGGCA GCAGGGATTC AGAGCCAAGA 900TTCCTGGTCT GCTGAACCAA ACCTCCAGGT CCCTGGACCA AATCCCCGGA 950TACCTGAACA GGATACACGA ACTCTTGAAT GGAACTCGTG GACTCTTTCC 1000TGGACCCTCA CGCAGGACCC TAGGAGCCCC GGACATTTCC TCAGGAACAT 1050CAGACACAGG CTCCCTGCCA CCCAACCTCC AGCCTGGATA TTCTCCTTCC 1100CCAACCCATC CTCCTACTGG ACAGTATACG CTCTTCCCTC TTCCACCCAC 1150CTTGCCCACC CCTGTGGTCC AGCTCCACCC CCTGCTTCCT GACCCTTCTG 1200CTCCAACGCC CACCCCTACC AGCCCTCTTC TAAACACATC CTACACCCAC 1250TCCCAGAATC TGTCTCAGGA AGGGTAAGGT TCTCAGACAC TGCCGACATC 1300AGCATTGTCT CATGTACAGC TCCCTTCCCT GCAGGGCGCC CCTGGGAGAC 1350AACTGGACAA GATTTCCTAC TTTCTCCTGA AACCCAAAGC CCTGGTAAAA 1400GGGATACACA GGACTGAAAA GGGAATCATT TTTCACTGTA CATTATAAAC 1450CTTCAGAAGC TATTTTTTTA AGCTATCAGC AATACTCATC AGAGCAGCTA 1500GCTCTTTGGT CTATTTTCTG CAGAAATTTG CAACTCACTG ATTCTCTACA 1550TGCTCTTTTT CTGTGATAAC TCTGCAAAGG CCTGGGCTGG CCTGGCAGTT 1600GAACAGAGGG AGAGACTAAC CTTGAGTCAG AAAACAGAGA AAGGGTAATT 1650TCCTTTGCTT CAAATTCAAG GCCTTCCAAC GCCCCCATCC CCTTTACTAT 1700CATTCTCAGT GGGACTCTGA TCCCATATTC TTAACAGATC TTTACTCTTG 1750AGAAATGAAT AAGCTTTCTC TCAGAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 1795(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度42個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO3Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu1 5 1015Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys202530Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu3540 42(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度390鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO4GAATTCCTGG AATACCAGCT GACAATGATT TCCTCCTCAT CTTTCAACCT 50CACCTCTCCT CATCTAAGAA TTGCTCCTCG TGGTCATGCT TCTCCTAACT 100GCAAGGCTAA CGCTGTCCAG CCCGGCTCCT CCTGCTTGTG ACCTCCGAGT 150CCTCAGTAAA CTGCTTCGTG ACTCCCATGT CCTTCACAGC AGACTGGTGA 200GAACTCCCAA CATTATCCCC TTTATCCGCG TAACTGGTAA GACACCCATA 250CTCCCAGGAA GACACCATCA CTTCCTCTAA CTCCTTGACC CAATGACTAT 300TCTTCCCATA TTGTCCCCAC CTACTGATCA CACTCTCTGA CAAGAATTAT 350TCTTCACAAT ACAGCCCGCA TTTAAAAGCT CTCGTCTAGA 390(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度390鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO5TCTAGACGAG AGCTTTTAAA TGCGGGCTGT ATTGTGAAGA ATAATTCTTG 50TCAGAGAGTG TGATCAGTAG GTGGGGACAA TATGGGAAGA ATAGTCATTG 100GGTCAAGGAG TTAGAGGAAG TGATGGTGTC TTCCTGGGAG TATGGGTGTC 150TTACCAGTTA CGCGGATAAA GGGGATAATG TTGGGAGTTC TCACCAGTCT 200GCTGTGAAGG ACATGGGAGT CACGAAGCAG TTTACTGAGG ACTCGGAGGT 250CACAAGCAGG AGGAGCCGGG CTGGACAGCG TTAGCCTTGC AGTTAGGAGA 300AGCATGACCA CGAGGAGCAA TTCTTAGATG AGGAGAGGTG AGGTTGAAAG 350ATGAGGAGGA AATCATTGTC AGCTGGTATT CCAGGAATTC 390(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特徵(A)長度332個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO6Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu1 5 1015Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro202530Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp354045Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala505560Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met657075Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu808590Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln95100 105Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala110 115 120His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu125 130 135Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu140 145 150Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr155 160 165Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly170 175 180Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser185 190 195Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly200 205 210Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr215 220 225Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe
230 235 240Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser245 250 255Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly260 265 270Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu275 280 285Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His290 295 300Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser305 310 315Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln320 325 330Glu Gly332(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特徵(A)長度166個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO7Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr1 5 1015Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala202530Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys354045Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala505560Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu657075Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro808590Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu95100 105Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser110 115 120Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala125 130 135Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg140 145 150Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp155 160 165Arg166(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特徵(A)長度328個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO8Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu1 5 1015Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro202530Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp354045Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala
505560Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met657075Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu808590Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln95100 105Ser Leu Leu Gly Thr Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro110 115 120Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val125 130 135Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg140 145 150Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu155 160 165Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr170 175 180Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys185 190 195Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln200 205 210Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile215 220 225His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser230 235 240Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp245 250 255Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser260 265 270Pro Thr His Pro Pro Thr Cly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro275 280 285Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro
290 295 300Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn305 310 315Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly320 325 328(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特徵(A)長度265個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO9Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu1 5 1015Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro202530Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp354045Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala505560Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met657075Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu808590Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln95100 105Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala110 115 120His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu125 130 135Arg Gly Lys Asp Phe Trp Ile Val Gly Asp Lys Leu His Cys Leu140 145 150Ser Gln Asn Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Glu Val Ala Ala Gly Ile155 160 165Gln Ser Gln Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn Leu Gln Val Pro170 175 180Gly Pro Asn Pro Arg Ile Pro Glu Gln Asp Thr Arg Thr Leu Glu185 190 195Trp Asn Ser Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gln Asp Pro Arg200 205 210Ser Pro Gly His Phe Leu Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro Ala215 220 225Thr Gln Pro Pro Ala Trp Ile Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser230 235 240Tyr Trp Thr Val Tyr Ala Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His245 250 255Pro Cys Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ser260 265(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特徵(A)長度261個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO10Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu1 5 1015Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro202530Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp
354045Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala505560Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met657075Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu808590Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln95100 105Ser Leu Leu Gly Thr Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Proll0 115 120Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Asp125 130 135Phe Trp Ile Val Gly Asp Lys Leu His Cys Leu Ser Gln Asn Tyr140 145 150Trp Leu Trp Ala Ser Glu Val Ala Ala Gly Ile Gln Ser Gln Asp155 160 165Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn Leu Gln Val Pro Gly Pro Asn Pro170 175 180Arg Ile Pro Glu Gln Asp Thr Arg Thr Leu Glu Trp Asn Ser Trp185 190 195Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gln Asp Pro Arg Ser Pro Gly His200 205 210Phe Leu Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro Ala Thr Gln Pro Pro215 220 225Ala Trp Ile Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser Tyr Trp Thr Val230 235 240Tyr Ala Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His Pro Cys Gly Pro245 250 255Ala Pro Pro Pro Ala Ser260 261(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特徵(A)長度7849鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO11CCCAGCCTCC TTTCTCTTGT TCCCTGGTCA TGCCTGCCTC CCTGTCTCCT 50GTCTCTCCCT CCCACACACA CCCACTATCC TCCCAGCTAT CCCTACACCC 100TCCTTCCTAA TCTTGGGAGA CATCTCGTCT GGCTGGACGG GAAAATTCCA 150GGATCTAGGC CACACTTCTC AGCAGACATG CCCATCCTTG GGGAGGAGGA 200ACAGGAGAGA GCCTGAGGAA GTTCTGGGGG ACAGGGGGAT GATGGGATCA 250AGGTCAGGCC AGGAAGCCCC TGAGGACAGA GACTGTGGGG AGACTGGGAC 300TGGGAAGAAA GCAAAGGAGC TAGAGCCAGG GCCAAAGGAA AAGGGGGGCC 350AGCAGGGAGG TATTTGCGGG GGAGGTCCAG CAGCTGTCTT TCCTAAGACA 400GGGACACATG GGCCTGGTTA TTCCTCTTGT CACATGTGGA ACGGTAGGAG 450ATGGAAGACG GAGACAGAAC AAGCAAAGGA GGGCCCTGGG CACAGAGGTC 500TGTGTGTGTA GCCATCCAAG CCACTGGACC CCAGCAGACG AGCACCTAAG 550CTCAGGCTTA ACCCAGTGCA CGTGTGCGCA CATACATGTG CCCCGCACCT 600GACAGTCCAC TCAACCCGTC CAAACCCTTT CCCCATAACA CCAACCCATA 650ACAGGAGATT TCTCTCATGT GGGCAATATC CGTGTTCCCA CTTCGAAAGG 700GGGAATGACA AGATAGGACT CCCTAGGGGA TTACAGAAAG AAAAGCAGGA 750AAGCAAGCAT CCTGTTGGAT TTCAGCAGCA GGTATGATGT 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(i)序列特徵(A)長度328個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO21Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu1 5 1015Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Gly Arg Leu Ser Gln Cys Pro202530Asp Ile Asn Pro Leu Ser Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp354045Phe Thr Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Thr Lys Ala505560Gln Asp Val Leu Gly Ala Thr Thr Leu Leu Leu Glu Ala Val Met657075Thr Ala Arg Gly Gln Val Gly Pro Pro Cys Leu Ser Ser Leu Leu808590Val Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln95100 105Asp Leu Leu Gly Met Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro110 115 120Ser Ala Ile Phe Leu Asn Phe Gln Gln Leu Leu Arg Gly Lys Val125 130 135Arg Phe Leu Leu Leu Val Val Gly Pro Ser Leu Cys Ala Lys Arg140 145 150Ala Pro Pro Als Ile Ala Val Pro Ser Ser Thr Ser Pro Phe His155 160 165Thr Leu Asn Lys Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr170 175 180Asn Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Phe Leu Lys185 190 195Arg Leu Gln Ala Phe Arg Ala Lys IlePro Gly Leu Leu Asn Gln200 205 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(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO29Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu1 5 10 15Leu Arg Asp Asp His Val Leu His Gly Arg20 25(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特徵(A)長度26個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO30Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu1 5 10 15Leu Arg Asp Asp Xaa Val Leu His Gly Arg Leu20 25 26(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特徵(A)長度25個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO31Ser Pro Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu1 5 10 15Leu Arg Asp Asp His Val Leu His Gly Arg20 25(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特徵(A)長度14個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO32Xaa Pro Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Xaa Asn Lys1 5 10 14(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO33Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg1 5 9(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特徵(A)長度45鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO34GCCGTGAAGG ACGTGGTCGT CACGAAGCAG TTTATTTAGG AGTCG 45(2)SEQ ID NO35的信息
(i)序列特徵(A)長度20鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO35CCNGCNCCNC CNGCNTGYGA 20(2)SEQ ID NO36的信息(i)序列特徵(A)長度21鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO36NCCRTGNARN ACRTGRTCRT C 21(2)SEQ ID NO37的信息(i)序列特徵(A)長度69鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO37CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 50TGACCACGTT CAGCACGGC69(2)SEQ ID NO38的信息(i)序列特徵
(A)長度69鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO38GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCACT 50ACTGGTGCAA GTCGTGCCG69(2)SEQ ID NO39的信息(i)序列特徵(A)長度69鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO39CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50CGACCACGTC CATCACGGC69(2)SEQ ID NO40的信息(i)序列特徵(A)長度69鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO40GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACT 50GCTGGTGCAG GTAGTGCCG 69(2)SEQ ID NO41的信息(i)序列特徵(A)長度69鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO41CCAGCACCGC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50CGATCATGTC TATCACGGT 69(2)SEQ ID NO42的信息(i)序列特徵(A)長度69鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO42GGTCGTGGCG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACT 50GCTAGTACAG ATAGTGCCA 69(2)SEQ ID NO43的信息(i)序列特徵(A)長度37鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO43GCTAGCTCTA GAAATTGCTC CTCGTGGTCA TGCTTCT 37(2)SEQ ID NO44的信息(i)序列特徵(A)長度22鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO44CAGTCTGCCG TGAAGGACAT GG 22(2)SEQ ID NO45的信息(i)序列特徵(A)長度24鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO45TGTGGACTTT AGCTTGGGAG AATG 24(2)SEQ ID NO46的信息(i)序列特徵(A)長度22鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO46GGTCCAGGGA CCTGGAGGTT TG 22(2)SEQ ID NO47的信息(i)序列特徵(A)長度31鹼基對
(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO47ATCGATATCG ATAGCCAGAC ACCCCGGCCA G 31(2)SEQ ID NO48的信息(i)序列特徵(A)長度36鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO48GCTAGCTCTA GACAGGGAAG GGAGCTGTAC ATGAGA 36(2)SEQ ID NO49的信息(i)序列特徵(A)長度24鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO49CTCCTTGGAA CCCAGGGCAG GACC 24(2)SEQ ID NO50的信息(i)序列特徵(A)長度24鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性
(xi)序列描述SEQ ID NO50GGTCCTGCCC TGGGTTCCAA GGAG 24(2)SEQ ID NO51(i)序列特徵(A)長度27鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO51CTGCTCCGAG GAAAGGACTT CTGGATT 27(2)SEQ ID NO52(i)序列特徵(A)長度27鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO52AATCCAGAAG TCCTTTCCTC GGAGCAG 27(2)SEQ ID NO53(i)序列特徵(A)長度28鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO53CCCTCTGCGT CGCGGCGGCC CCACCCAC 28(2)SEQ ID NO54
(i)序列特徵(A)長度28鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO54GTGGGTGGGG CCGCCGCGAC GCAGAGGG 28(2)SEQ ID NO55(i)序列特徵(A)長度35鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO55GACTCGAGGA TCCATCGATT TTTTTTTTTT TTTTT 35(2)SEQ ID NO56(i)序列特徵(A)長度17鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO5 6GACTCGAGGA TCCATCG 17(2)SEQ ID NO57(i)序列特徵(A)長度32鹼基對(B)類型核酸
(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO57GCTACCTCTA GAAGCCCGGC TCCTCCTGCC TG 32(2)SEQ ID NO58(i)序列特徵(A)長度21鹼(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO58CGAAATTAAC CCTCACTAAA G 21(2)SEQ ID NO59(i)序列特徵(A)長度103鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO59TGCAGCAAGG GCTACTGCCA CACTCGAGCT GCGCAGATGC TAGCCTCAAG 50ATGGCTGATC CAAATCGATT CCGCGGCAAA GATCTTCCGG TCCTGTAGAA 100GCT103(2)SEQ ID NO60(i)序列特徵(A)長度103鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈
(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO60AGCTTCTACA GGACCGGAAG ATCTTTGCCG CGGAATCGAT TTGGATCAGC 50CATCTTGAGG CTAGCATCTG CGCAGCTCGA GTGTGGCAGT AGCCCTTGCT 100GCA 103(2)SEQ ID NO61(i)序列特徵(A)長度18鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO61TCTCGCTACC GTTTACAG 18(2)SEQ ID NO62(i)序列特徵(A)長度25鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO62CAGGTACCCA CCAGGCGGTC TCGGT 25(2)SEQ ID NO63(i)序列特徵(A)長度18鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性
(xi)序列描述SEQ ID NO63GGGCCATGAC ACTGTCAA 18(2)SEQ ID NO64(i)序列特徵(A)長度40鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO64GACCGCCACC GAGACCGCCT GGTGGGTACC TGTGGTCCTT 40(2)SEQ ID NO65(i)序列特徵(A)長度32鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO65ATCGATATCG ATCAGCCAGA CACCCCGGCC AG 32(2)SEQ ID NO66(i)序列特徵(A)長度35鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO66TCTAGATCTA GATCACCTGA CGCAGAGGGT GGACC 35(2)SEQ ID NO67
(i)序列特徵(A)長度33鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO67AGTCGACGTC GACGTCGGCA GTGTCTGAGA ACC 33(2)SEQ ID NO68(i)序列特徵(A)長度36鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO68AGTCGACGTC GACTCACCTG ACGCAGAGGG TGGACC 36(2)SEQ ID NO69(i)序列特徵(A)長度62鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO69CGCGTATGCC AGCCCGGCTC CTCCTGCTTG TGACCTCCGA GTCCTCAGTA 50AACTGCTTCG TG 62(2)SEQ ID NO70(i)序列特徵
(A)長度61鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO70ATACGGTCGG GCCGAGGAGG ACGAACACTG GAGGCTCAGG AGTCATTTGA 50CGAAGCACTG A 61(2)SEQ ID NO71(i)序列特徵(A)長度37鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO71CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAA 37(2)SEQ ID NO72(i)序列特徵(A)長度37鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO72TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGAAGA ATTGCGC 37(2)SEQ ID NO73(i)序列特徵(A)長度69鹼基對
(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO73CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50CACATCGAAG GTCGTAGCC69(2)SEQ ID NO74(i)序列特徵(A)長度62鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO74TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGTAGT GGTAGTGGTA GTGGTAGTGT 50AGCTTCCAGC AT 62(2)SEQ ID NO75(i)序列特徵(A)長度69鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO75CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50CACATCGAAC CACGTAGCC69(2)SEQ ID NO76
(i)序列特徵(A)長度62鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO76TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGTAGT GGTAGTGGTA GTGGTAGTGT 50AGCTTGGTGC AT 62(2)SEQ ID NO77(i)序列特徵(A)長度19鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO77TCCACCCTCT GCGTCAGGT 19(2)SEQ ID NO78(i)序列特徵(A)長度18鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO78GGAGACGCAG TCCATCGA 18(2)SEQ ID NO79(i)序列特徵
(A)長度62鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO79GCAGCAGTTC TAGAATTATG TCNCCNGCNC CNCCNGCNTG TGACCTCCGA 50GTTCTCAGTA AA 62(2)SEQ ID NO80(i)序列特徵(A)長度49鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO80ACACTGGAGG CTCAAGAGTC ATTTGACGAA GCACTGAGGG TACAGGAAG 49(2)SEQ ID NO81(i)序列特徵(A)長度45鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO81CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTA TCGAAGGTCG TAGCC 45(2)SEQ ID NO82(i)序列特徵(A)長度38鹼基對
(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO82TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAATAGCT TCCAGCAT 38(2)SEQ ID NO83(i)序列特徵(A)長度45鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO83CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAAACG TAGCC 45(2)SEQ ID NO84(i)序列特徵(A)長度38鹼基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO84TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGAAGA ATTTGCAT 38(2)SEQ ID NO85(i)序列特徵(A)長度25個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO85Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Asn Ala Tyr Ala Ser Pro1 5 10 15Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg Ala20 25(2)SEQ ID NO86(i)序列特徵(A)長度31個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO86Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe His His His His His His His His1 5 10 15Ile Glu Gly Arg Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg20 25 30Ala31(2)SEQ ID NO87(i)序列特徵(A)長度31個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO87Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe His His His His His His His His1 5 10 15Ile Glu Pro Arg Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg20 25 30Ala31(2)SEQ ID NO88(i)序列特徵(A)長度7個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO88Thr Thr Ala His Lys Asp Pro1 5 7(2)SEQ ID NO89(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO89His Val Leu His1 4(2)SEQ ID NO90(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO90Ser Arg Leu Ser1 4(2)SEQ ID NO91(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO91Ser His Val Leu1 4(2)SEQ ID NO92(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO92His Ser Arg Leu1 4(2)SEQ ID NO93(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO93Ala Val Asp Phe1 4(2)SEQ ID NO94
(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO94Ser Leu Gly Glu1 4(2)SEQ ID NO95(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO95Ala Val Thr Leu1 4(2)SEQ ID NO96(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO96Leu Leu Glu Gly1 4(2)SEQ ID NO97(i)序列特徵
(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO97Leu Ser Ser Leu1 4(2)SEQ ID NO98(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO98Leu Gly Gln Leu1 4(2)SEQ ID NO99(i)序列特徵(A)長度5個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO99Cys Xaa Leu Ser Ser1 5(2)SEQ ID NO100(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸
(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO100Leu Leu Gly Gln1 4(2)SEQ ID NO101(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO101Ser Ser Leu Leu1 4(2)SEQ ID NO102(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO102Gly Gln Leu Ser1 4(2)SEQ ID NO103(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸
(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO103Cys Leu Ser Ser1 4(2)SEQ ID NO104(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO104Leu Gln Ser Leu1 4(2)SEQ ID NO105(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO105Leu Gly Thr Gln1 4(2)SEQ ID NO106(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性
(xi)序列描述SEQ ID NO106Ala Leu Gln Ser1 4(2)SEQ ID NO107(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO107Leu Leu Gly Thr1 4(2)SEQ ID NO108(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO108Asn Ala Ile Phe1 4(2)SEQ ID NO109(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO109Leu Ser Phe Gln1 4(2)SEQ ID NO110(i)序列特徵(A)長度22個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO110Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu1 5 10 15Leu Arg Asp Ser His Val Leu20 22(2)SEQ ID NO111(i)序列特徵(A)長度24個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO111His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr1 5 10 15Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe20 24(2)SEQ ID NO112(i)序列特徵(A)長度23個胺基酸
(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO112Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln1 5 10 15Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu20 23(2)SEQ ID NO113(i)序列特徵(A)長度21個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO113Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr1 5 10 15Cys Leu Ser Ser Leu Leu20 21(2)SEQ ID NO114(i)序列特徵(A)長度16個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO114Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln1 5 10 15Ser16(2)SEQ ID NO115(i)序列特徵(A)長度22個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO115Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His1 5 10 15Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe20 22(2)SEQ ID NO116(i)序列特徵(A)長度25個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO116Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met1 5 10 15Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg20 25(2)SEQ ID NO117(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性
(xi)序列描述SEQ ID NO117Met Pro Pro Ala1 4(2)SEQ ID NO118(i)序列特徵(A)長度5個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO118Met Ala Pro Pro Ala1 5(2)SEQ ID NO119(i)序列特徵(A)長度6個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO119Met Pro Ala Pro Pro Ala1 5 6(2)SEQ ID NO120(i)序列特徵(A)長度7個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO120Met Ser Pro Ala Pro Pro Ala1 5 7(2)SEQ ID NO121(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO121Ala Pro Pro Ala1 4(2)SEQ ID NO122(i)序列特徵(A)長度5個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO122Pro Ala Pro Pro Ala1 5(2)SEQ ID NO123(i)序列特徵(A)長度6個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO123Ser Pro Ala Pro Pro Ala1 56(2)SEQ ID NO124(i)序列特徵(A)長度4個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO124Val Arg Arg Ala1 4(2)SEQ ID NO125(i)序列特徵(A)長度5個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO125Val Arg Arg Ala Pro1 5(2)SEQ ID NO126(i)序列特徵(A)長度6個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO126Val Arg Arg Ala Pro Pro1 5 6(2)SEQ ID NO127(i)序列特徵(A)長度7個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO127Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr1 5 7(2)SEQ ID NO128(i)序列特徵(A)長度8個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO128Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr1 5 8(2)SEQ ID NO129(i)序列特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO129Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala1 5 9(2)SEQ ID NO130(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO130Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val1 5 10(2)SEQ ID NO131(i)序列特徵(A)長度11個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO131Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro1 5 10 11(2)SEQ ID NO132(i)序列特徵(A)長度12個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO132Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser1 5 10 12(2)SEQ ID NO133
(i)序列特徵(A)長度13個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO133Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg1 5 10 13(2)SEQ ID NO134(i)序列特徵(A)長度14個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO134Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr1 5 10 14(2)SEQ ID NO135(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO135Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO136(i)序列特徵
(A)長度16個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO136Val Arg Arg Ara Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu16(2)SEQ ID NO137(i)序列特徵(A)長度17個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO137Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu Val17(2)SEQ ID NO138(i)序列特徵(A)長度18個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO138Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu Val Leu18(2)SEQ ID NO139(i)序列特徵(A)長度19個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO139Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu Val Leu Thr19(2)SEQ ID NO140(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO140Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu Val Leu Thr Leu20(2)SEQ ID NO141(i)序列特徵(A)長度21個胺基酸
(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO141Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu Val Leu Thr Leu Asn20 21(2)SEQ ID NO142(i)序列特徵(A)長度22個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO142Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu20 22(2)SEQ ID NO143(i)序列特徵(A)長度23個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO143Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu20 23(2)SEQ ID NO144(i)序列特徵(A)長度24個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO144Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro20 2權利要求
1.一種分離的、基本均一的mpl配體多肽。
2.如權利要求1所述的mpl配體多肽，其特徵在於，它選自下組(a)片段多肽；(b)變異多肽；和(c)嵌合多肽。
3.如權利要求1所述的mpl配體多肽，其特徵在於，它選自下組(a)從哺乳動物分離出的多肽；(b)通過重組手段製得的多肽；和(c)通過合成手段製得的多肽。
4.如權利要求1所述的mpl配體多肽，其特徵在於，它選自下組(a)人的多肽；和(b)人的非免疫原性多肽。
5.一種分離的、基本均一的mpl激動劑，其特徵在於，(a)該激動劑刺激標記的核苷(3H-胸苷)摻入用人mplP轉染的、IL-3依賴型Ba/F3細胞的DNA中；或(b)該激動劑在血小板回跳測定中刺激35S摻入循環的血小板。
6.如權利要求2所述的片段多肽，其特徵在於，該片段多肽由以下結構式表示X-hTPO(7-151)-Y其中的hTPO(7-151)表示人TPO(hML)中Cys7至Cys151之間的胺基酸序列(包括首尾)；X表示Cys7的氨基或選自下組的氨基-末端胺基酸殘基M，MA，MPA，MPPA，(SEQ ID NO117)MAPPA，(SEQ ID NO118)MPAPPA，(SEQ ID NO119)MSPAPPA，(SEQ ID NO120)A，PA，PPA，APPA，(SEQ ID NO121)PAPPA，(SEQ ID NO122)SPAPPA，(SEQ ID NO123)Y表示Cys151的羧基端基團或選自下組的羧基-末端胺基酸殘基V，VR，VRR，VRRA，(SEQ ID NO124)VRRAP，(SEQ ID NO125)VRRAPP，(SEQ ID NO126)VRRAPPT，(SEQ ID NO127)VRRAPPTT，(SEQ ID NO128)VRRAPPTTA，(SEQ ID NO129)VRRAPPTTAV，(SEQ ID NO130)VRRAPPTTAVP，(SEQ ID NO131)VRRAPPTTAVPS，(SEQ ID NO132)VRRAPPTTAVPSR，(SEQ ID NO133)VRRAPPTTAVPSRT，(SEQ ID NO134)VRRAPPTTAVPSRTS，(SEQ ID NO135)VRRAPPTTAVPSRTSL，(SEQ ID NO136)VRRAPPTTAVPSRTSLV，(SEQ ID NO137)VRRAPPTTAVPSRTSLVL，(SEQ ID NO138)VRRAPPTTAVPSRTSLVLT，(SEQ ID NO139)VRRAPPTTAVPSRTSLVLTL，(SEQ ID NO140)VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLN，(SEQ ID NO141)VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNE，(SEQ ID NO142)VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNEL，(SEQ ID NO143)VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNELP，(SEQ ID NO144)氨基-末端胺基酸殘基延伸物含有圖1所示的人ML(SEQ ID NO1)及其聚合化形式的殘基176-332中的一個或多個。
7.如權利要求6所述的片段多肽，其特徵在於，該多肽選自TPO(1-153)和TPO(1-245)組成的組。
8.如權利要求2所述的片段多肽，其特徵在於，該片段多肽的胺基酸序列含有SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL，(SEQ ID NO110)HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF，(SEQ ID NO111)SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL，(SEQ ID NO112)LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL，(SEQ ID NO113)GQLSGQVRLLLGALQS，(SEQ ID NO114)LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF，(SEQ ID NO115)LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR，(SEQ ID NO116)及其組合。
9.如權利要求6所述的多肽，其特徵在於，該多肽是未糖基化的。
10.一種分離的多肽，它由核酸編碼，其特徵在於，該核酸具有能在中度嚴緊條件下與具有圖1所示核酸序列(SEQ ID NO2)的核酸分子雜交的序列。
11.如權利要求11所述的多肽，其特徵在於，它具有生物活性。
12.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於，它選自下組hML、hML153、hML(R153A、R154A)、hML2、hML3、hML4、mML、mML2、mML3、pML和pML2。
13.如權利要求2所述的多肽，其特徵在於，多肽的胺基酸序列含有圖1(SEQ ID NO1)中的胺基酸殘基1至X，其中X選自下組153、155、164、174、191、205、207、217、229、245和332。
14.一種分離的、基本均一的mpl配體多肽，其特徵在於，它與權利要求13所述的多肽至少有80％序列相同。
15.如權利要求13所述的多肽，其特徵在於，X為153。
16.一種嵌合體，其特徵在於，它含有與異源多肽融合的權利要求13所述的mpl配體。
17.如權利要求16所述的嵌合體，其特徵在於，異源多肽是免疫球蛋白多肽。
18.如權利要求16所述的嵌合體，其特徵在於，異源多肽是白細胞介素多肽。
19.一種嵌合體，其特徵在於，它含有hML的N末端殘基1至約153-157，並被一個或多個但不包括全部的人EPO殘基取代，其中在對應於圖10所示的排列中位置處加入或取代入hML的N-末端殘基。
20.一種能夠與權利要求13所述的mpl配體多肽結合的抗體。
21.一種產生權利要求20所述的抗體的雜交瘤細胞系。
22.一種分離的、編碼權利要求1所述的mpl配體多肽的核酸分子。
23.一種分離的、編碼權利要求13所述的mpl配體多肽的核酸分子。
24.一種分離的核酸分子，其特徵在於，含有圖1所示的開放讀框核酸序列(SEQ ID NO2)。
25.如權利要求24所述的分離的核酸分子，其特徵在於，它編碼選自下組的mpl配體多肽hML、hML153、hML(R153AR154A)、hML2、hML3、hML4、mML、mML2、mML3、pML和pML2。
26.一種分離的核酸分子，其特徵在於，該分子選自下組(a)含有mpl配體基因編碼區域核苷酸序列的cDNA克隆；(b)能在嚴緊條件下與(a)克隆雜交的DNA序列；(c)編碼具有天然存在的mpl配體多肽生物性能的多肽的任何(a)和(b)DNA序列的基因變異體。
27.一種分離的DNA分子，其特徵在於，它具有能夠在中度嚴緊條件下與圖1所示DNA序列(SEQ ID NO2)雜交的序列，而且該DNA分子編碼具有生物活性的mpl配體多肽。
28.如權利要求25所述的核酸分子，其特徵在於，還含有可操作地連於核酸分子的啟動子。
29.一種表達載體，其特徵在於，它含有權利要求25所述的核酸序列，該序列可操作地連於被該載體轉化的宿主細胞所識別的調控序列。
30.用權利要求29所述的載體轉化的宿主細胞。
31.一種用編碼mpl配體多肽的核酸分子以產生mpl配體多肽的方法，其特徵在於，培養權利要求30所述的宿主細胞。
32.如權利要求31所述的方法，其特徵在於，從宿主細胞中回收該mpl配體多肽。
33.如權利要求31所述的方法，其特徵在於，從宿主細胞培養基中回收該mpl配體多肽。
34.一種確定mpl配體多肽存在的方法，其特徵在於，包括用編碼mpl配體多肽的DNA與測試樣品核酸進行雜交，以及確定mpl配體多肽DNA的存在。
35.一種擴增核酸測試樣品的方法，其特徵在於，用編碼mpl配體多肽的核酸引發核酸聚合酶鏈反應。
36.一種組合物，其特徵在於，含有權利要求1所述的mpl配體多肽和藥物上可接受的載體。
37.一種治療患有或可能患有血小板減少的哺乳動物的方法，其特徵在於，向需要治療的哺乳動物施用有效治療量的權利要求36所述的組合物。
38.如權利要求36所述的組合物，其特徵在於，還含有有效治療量的選自下組的試劑細胞因子、集落刺激因子和白細胞介素。39.如權利要求38所述的組合物，其特徵在於，該試劑選自KL、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、IL-1、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9和IL-11。
40.一種生物合成人mpl配體多肽的方法，該多肽具有一種人mpl配體多肽的胺基酸序列例如圖1中所公開的序列，其特徵在於，包括(a)培養含有編碼人mpl配體多肽的DNA分離物的宿主細胞培養物，(b)從培養物中回收人mpl配體多肽，和(c)純化mpl配體多肽從而獲得基本均一的、具有生物活性的人mpl配體多肽。
全文摘要
本發明公開了分離的血小板生成素(TPO)、分離的編碼TPO的DNA以及製備和純化TPO的重組或合成方法。已表明，各種不同形式的TPO會影響血細胞尤其是巨核細胞和巨核細胞遠祖細胞的複製、分化或成熟。因此，這些化合物可用於治療血小板減少。
文檔編號C12N15/12GK1141061SQ94194751
公開日1997年1月22日 申請日期1994年12月28日 優先權日1994年1月3日
發明者D·L·伊頓, F·J·德索瓦熱 申請人:基因技術股份有限公司