防止在玉米根蟲(根螢葉甲)中形成抗性的包括Cry34Ab/35Ab和Cry3Ba蛋白的組合的製作方法

2023-06-21 11:44:46

專利名稱：防止在玉米根蟲(根螢葉甲)中形成抗性的包括Cry34Ab/35Ab和Cry3Ba蛋白的組合的製作方法
防止在玉米根蟲(根螢葉甲)中形成抗性的包括Cry34Ab/35Ab和Cry3Ba蛋白的組合
背景技術：
人類為食物和能量應用而種植玉米。玉米是一種重要的作物。它在世界許多地區是食物、食品、和動物飼料的重要來源。昆蟲進食和損害植物，並由此破壞這些人類努力。每年花費數十億美元來控制昆蟲害蟲，並且它們造成的損害另外損失數十億。昆蟲害蟲引起的損害是世界玉米作物損失的一個主要因素，儘管使用了保護措施諸如化學殺蟲劑。鑑於這一點，已經通過遺傳工程將昆蟲抗性改造到作物諸如玉米中以控制昆蟲損害和降低對傳統化學殺蟲劑的需要。在美國，每年有超過I千萬英畝的玉米感染玉米根蟲物種聯合體(corn rootwormspecies complex)。玉米根蟲物種聯合體包括北方玉米根蟲(Diabrotica barberi)、南方 玉米根蟲(D. undecimpunctata howardi )、和西方玉米根蟲(D. virgifera virgifera)。(其它物種包括 Diabrotica virgifera zeae (墨西哥玉米根蟲)、Diabrotica balteata (巴西玉米根蟲)、和巴西玉米根蟲聯合體(Diabrotica viridula和Diabrotica speciosa)。這些根螢葉甲物種(Diabrotica species)的土棲幼蟲以玉米植物的根為食,引起倒伏。倒伏最終降低玉米產量，而且常常導致植物死亡。通過以玉米穗絲為食，成年甲蟲降低授粉，並因此對每株植物的玉米產量產生有害影響。另外，根螢葉甲屬的成蟲和幼蟲攻擊葫蘆科作物(cucurbit crops)(黃瓜、甜瓜(melons)、南瓜(squash)、等)和商業生產的許多蔬菜和田地作物以及宅園中種植的那些。合成有機化學殺蟲劑已經成為用於控制昆蟲害蟲的主要工具，但是生物學殺蟲劑(諸如自蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thruingiensis,Bt)衍生的殺蟲蛋白)已經在一些地區發揮重要作用。經由用Bt殺蟲蛋白基因轉化來生成昆蟲抗性植物的能力已經改革了現代農業，並且提高了殺蟲蛋白及其基因的重要性和價值。來自一些蘇雲金芽孢桿菌(B. t.)菌株的殺蟲晶體蛋白是本領域公知的。參見例如 Hofte 等人，Microbial Reviews, Vol. 53, No. 2, pp. 242-255 (1989)。這些蛋白質通常由細菌作為大約130kDa毒素原生成，然後在被昆蟲攝取後受到昆蟲中腸中的蛋白酶的切割以產生大致60kDa核心毒素。這些蛋白質稱作晶體蛋白，因為用一些B. t菌株的孢子能觀察到獨特晶體內含物。這些晶體內含物常常由數種獨特蛋白質構成。已經用於生成轉基因昆蟲抗性作物的一組基因是來自蘇雲金芽孢桿菌(B. t.)的德爾塔-內毒素。德爾塔-內毒素已經在作物植物(諸如棉花、馬鈴薯、稻、向日葵、以及玉米)中成功表達，而且已經證明對昆蟲害蟲提供卓越的控制。(Perlak,F. J.等人(1990)Bio/Technology 8,939-943 ；Perlak,F. J.等人(1993)Plant Mol. Biol. 22 :313-321 ；FujimotoH.等 A (1993) Bio/Technology 11 :1151-1155 ；Tu 等 A (2000) Nature Biotechnology18:1101-1104 ;PCT 申請號 WO 01/13731 ;及 Bing J W 等人(2000) Efficacy of CrylFTransgenic Maize,14th Biennial International Plant Resistance to InsectsWorkshop, Fort Collins, Colo. X迄今為止，已經使用數種Bt蛋白創建了昆蟲抗性轉基因植物，它們已經成功登記和商品化。這些包括玉米中的CrylAb、CrylAc、CrylF、Cry3Aa、和Cry3Bb,棉花中的CrylAc和Cry2Ab，及馬鈴薯中的Cry3A。還有玉米中的SMART STAX，它包含CrylA. 105和Cry2Ab。表達這些蛋白質的商業產品表達單一蛋白質，想要兩種蛋白質的組合殺蟲譜的情況(例如組合玉米中的CrylAb和Cry3Bb以分別提供對鱗翅目害蟲和根蟲的抗性)或蛋白質的獨立作用使得它們作為用於延遲在易感昆蟲群體中形成抗性的工具是有用的情況(例如組合棉花中的CrylAc和Cry2Ab以提供對菸草蚜蟲的抗性管理)除外。導致快速和廣泛採用這種技術的昆蟲抗性轉基因植物的一些性質也產生害蟲群體會對由這些植物生成的殺蟲蛋白形成抗性的擔憂。已經提出數種策略來保持基於Bt的昆蟲抗性性狀的效用，包括以高劑量部署各蛋白質並與庇護(refuge)組合，及與不同 毒素交替或共同使用(McGaughey 等人(1998), 「B. t. Resistance Management」，NatureBiotechnol. 16 :144_146)。為在昆蟲抗性管理(IRM)堆疊中使用而選擇的蛋白質應當是有活性的，使得對一種蛋白質形成的抗性不賦予對第二蛋白質的抗性(即沒有對各蛋白質的交叉抗性)。例如，如果為對「蛋白A」的抗性選擇的害蟲群體對「蛋白B」敏感，那麼會得出結論，沒有交叉抗性且蛋白A和蛋白B的組合會有效延遲對單獨的蛋白A的抗性。在抗性昆蟲群體缺失下，可以基於假設涉及交叉抗性潛力的其它特徵來進行評估。已經提出利用受體介導的結合來鑑定很可能不展現交叉抗性的殺蟲蛋白(vanMellaert等人，1999)。這種辦法中內在交叉抗性缺失的關鍵預示在於殺蟲蛋白在敏感昆蟲物種中不競爭受體。如果兩種Bt毒素競爭同一受體，那麼如果該受體在該昆蟲中突變，使得毒素之一不再結合該受體並因此不再對昆蟲有殺蟲活性，那麼情況可能是昆蟲也會對第二毒素(其競爭性結合同一受體)有抗性。就是說，昆蟲據說對兩種Bt毒素有交叉抗性。然而，如果兩種毒素結合兩種不同受體，那麼這可能指示昆蟲不會同時對那兩種毒素有抗性。在蘇雲金芽孢桿菌中發現了一種相對較新的殺蟲蛋白系統，如WO 97/40162中公開的。這種系統包含兩種蛋白質一一種大約15kDa,另一種約45kDa。還可參見美國專利No. 6，083，499和No. 6，127，180。這些蛋白質現在已經分派到它們自己的類，而且相應地分別得到 Cry 名稱 Cry34 和 Cry35。參見 Crickmore 等人的網站(biols. susx. ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。現在已經公開了這種類型的系統的許多其它相關蛋白質。參見例如美國專利No. 6，372，480 ；W0 01/14417 ;和WO 00/66742。還已經公開了經過植物優化的編碼此類蛋白質的基因，其中基因改造成使用植物中最優化表達的密碼子。參見例如美國專利 No. 6，218，188。Cry34/35系統的確切作用模式還有待確定，但是它看來在昆蟲腸細胞的膜中形成孔。參見 Moellenbeck 等人，Nature Biotechnology, vol. 19, p. 668 (July 2001) ；Masson等人，Biochemistry，43( 12349-12357)(2004)。確切作用機制仍然不清楚，儘管知道Cry34和Cry35蛋白的3D原子坐標和晶體結構。參見美國專利No. 7，524，810和No. 7，309，785。例如，不清楚這兩種蛋白質之一或二者是否結合典型類型的受體，諸如鹼性磷酸酶或氨肽酶。此外，因為昆蟲對Cry蛋白形成抗性存在不同的機制(諸如通過改變受體的糖基化[參見Jurat-Fuentes等人(2002)68 AEM 5711-5717]、通過去除受體蛋白[參見Lee等人(1995)61 AEM 3836-3842]、通過突變受體、或通過其它機制[參見Heckel等人，J. Inv.Pathol. 95 (2007) 192-197])，所以不可能先驗地預測Cry34/35與其它Cry蛋白之間是否會有交叉抗性。預測Cry34/35系統的競爭性結合還因Cry34/35 二元系統涉及兩種蛋白質的事實而進一步複雜化。再次，不清楚這些蛋白質是否和如何有效結合昆蟲腸/腸細胞，及它們是否和如何彼此相互作用或結合。用於控制鞘翅目的其它選擇包括下述蛋白質Cry3Bb、Cry3C、Cry6B、ET29、ET33及 ET34、TIC407、TIC435、TIC417、TIC901、TIC1201、ET29 及 TIC810、ET70、ET76 及 ET80、TIC851、等等。還已經提出了 RNAi辦法。參見例如Baum等人，Nature Biotechnology,vol. 25, no. 11 (Nov. 2007) pp.1322-1326。發明概述本發明部分涉及Cry34Ab/35Ab與Cry3Ba的組合。本發明部分涉及令人驚訝的發現，即Cry34Ab/Cry35Ab和Cry3Ba對於防止玉米根蟲(根螢葉甲(Diabrotica spp.))群體 形成抗性(對單獨的任一殺蟲蛋白系統)是有用的。正如本領域技術人員藉助此公開內容會認識到的，生成這些殺蟲Cry蛋白的植物對減輕會形成對單獨的任一這些殺蟲蛋白系統有抗性的玉米根蟲群體的擔憂會是有用的。本發明部分得到下述發現的支持，即這些Cry蛋白系統的各成分沒有彼此競爭對玉米根蟲腸受體的結合。本發明還部分涉及三種(或更多種)毒素系統的三重堆疊或「金字塔」，其中Cry34Ab/Cry35Ab和Cry3Ba作為基礎對。如此，生成這兩種殺蟲蛋白系統的植物(和種植此類植物的土地)包括在本發明的範圍內。附圖簡述對圖的詳細描述特別指附圖，其中


圖1A。作為輸入放射性標記的Cry毒素的函數，125I_Cry35Abl對自西方玉米根蟲幼蟲製備的BBMV的結合。特異性結合=總結合-非特異性結合，誤差條=SEM(均值的標準誤差)。
圖1B。作為輸入放射性標記的Cry毒素的函數，125I_Cry3BAal對自西方玉米根蟲幼蟲製備的BBMV的結合。特異性結合=總結合-非特異性結合，誤差條=SEM(均值的標準誤差)。圖2。在不同濃度的未標記競爭者的情況中，125I_Cry3Abl對自西方玉米根蟲幼蟲製備的 BBMV 的結合(log 0. 1=-1. 0，IoglO=L 0，logl00=2. 0，logl, 000=3. 0)。圖3A。在Cry34Abl缺失下，125I_Cry35Abl對自西方玉米根蟲幼蟲製備的BBMV的百分比結合。圖3B。在Cry34Abl存在下，125I_Cry35Abl對自西方玉米根蟲幼蟲製備的BBMV的百分比結合。圖4。在多個濃度的不同未標記競爭者存在下，125I_Cry3Bal對自西方玉米根蟲幼蟲製備的BBMV的百分比結合。序列簡述SEQ ID NO: I :全長,天然 Cry35Abl 蛋白序列。SEQ ID NO:2 :胰凝乳蛋白酶截短的Cry35Abl核心蛋白序列。
SEQ ID NO:3 :全長,天然 Cry3Bal 蛋白序列。SEQ ID N0:4 :Cry3Bal胰蛋白酶核心蛋白序列。SEQ ID NO:5 :全長,天然 Cry34Abl 蛋白序列。發明詳述Cry34Ab/35Ab蛋白的序列可以自例如蘇雲金芽孢桿菌隔離群PS149B1獲得。對於依照本發明使用的其它基因、蛋白質序列、和來源隔離群，參見例如Crickmore等人的網站(lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro, html)。本發明包括Cry34Ab/35Ab殺蟲蛋白與Cry3Ba毒素的組合保護玉米免於由可能對 單獨的任一這些Cry蛋白系統形成抗性(對另一種則不形成抗性)的玉米根蟲群體的玉米根蟲進食引起的損害和產量損失的用途。如此，本發明教導昆蟲抗性管理(IRM)堆疊以防止玉米根蟲對Cry3Ba和/或Cry34Ab/35Ab 形成抗性。本發明提供用於控制根蟲害蟲的組合物，其包含生成Cry3Ba毒素蛋白和Cry34Ab/35Ab毒素系統的細胞。本發明進一步包含經過轉化以生成Cry3Ba蛋白和Cry34Ab/35Ab 二元毒素的宿主，其中所述宿主為微生物或植物細胞。另外，本發明提供控制根蟲害蟲的方法，包括使所述害蟲或所述害蟲的環境與有效量的含有Cry3Ba蛋白且進一步含有Cry34Ab/35Ab 二元毒素的組合物接觸。本發明的一個實施方案包含玉蜀黍植物，其包含編碼Cry34Ab/35Ab 二元毒素的植物可表達基因和編碼Cry3Ba蛋白的植物可表達基因，及此類植物的種子。本發明的又一個實施方案包含玉蜀黍植物，其中編碼Cry34Ab/35Ab 二元毒素的植物可表達基因和編碼Cry3Ba蛋白的植物可表達基因已經漸滲入所述玉蜀黍植物中，及此類植物的種子。如實施例中描述的，使用放射性標記的Cry35Ab核心毒素蛋白的競爭性受體結合研究顯示Cry3Ba核心毒素蛋白在CRW昆蟲組織樣品中不競爭結合Cry35Ab所結合的。參見圖2。這些結果指示Cry3Ba和Cry34Ab/35Ab蛋白的組合是減輕CRW群體中對單獨的任一蛋白質系統形成抗性的有效手段。如此,部分基於上文和本文中別處描述的數據,可使用Cry34Ab/35Ab和Cry3Ba蛋白生成IRM組合來防止或減輕CRW形成抗性。例如，可將其它蛋白質添加至這種組合以擴展昆蟲控制譜。還可以在一些優選的「三重堆疊」或「金字塔」中與用於控制根蟲的又一種蛋白質(諸如Cry3Aa和/或Cry6Aa)組合使用(Cry34Ab/35Ab和Cry3Ba蛋白的)主題組合；此類附加的組合如此會提供針對根蟲的多重作用模式。針對根蟲的RNAi又是另一種選擇。參見例如 Baum 等人，Nature Biotechnology, vol. 25, No. 11 (Nov. 2007) pp. 1322-1326。根據USSN 61/327, 240 (2010 年 4 月 23 日提交)(涉及 Cry34Ab/35Ab 和 Cry3Aa蛋白的組合)、USSN 61/388，273(2010 年 9 月 30 日提交)(涉及 Cry34Ab/35Ab 和 Cry6Aa 蛋白的組合)、和USSN 61/477,447 (2011年9月20日提交)(涉及Cry3Aa和Cry6Aa蛋白的組合)的公開內容，本發明的一些優選的「三重堆疊」或「多重作用模式堆疊」包括Cry3Ba蛋白，其與Cry34Ab/35Ab蛋白組合,又與Cry6Aa蛋白和/或Cry3Aa蛋白一起。包含cry3Ba基因、cry34Ab/35Ab基因、和第三或第四毒素系統(例如cry3Aa和/或cry6Aa基因)的轉基因植物(包括玉米)包括在本發明的範圍內。如此，此類實施方案以至少三種作用模式靶向昆蟲。本發明的部署選項包括在根螢葉甲成問題的玉米種植地區使用Cry3Ba和Cry34Ab/35Ab蛋白。另一個部署選擇會是使用Cry3Ba和Cry34Ab/35Ab蛋白之一或二者，與其它性狀組合。 本領域技術人員會領會，Bt毒素(即使在某一類內，諸如Cry3Ba和Cry34Ab/35Ab)可以有一定程度的變化。基因和毒素。術語「分離的」指非天然發生構建體中的多核苷酸，或純化的或其它非天然發生狀態的蛋白質。依照本發明有用的基因和毒素不僅包括公開的全長序列，而且包括這些序列的片段、變體、突變體、和融合蛋白，它們保留本文中具體示例的毒素的特徵性殺蟲活性。如本文中使用的，術語基因的「變體」或「變異」指編碼相同毒素或編碼具有殺蟲活性的等同毒素的核苷酸序列。如本文中使用的，術語「等同毒素」指針對靶害蟲與要求保護的毒素具有相同或本質上相同的生物學活性的毒素。依照本發明，這適用於Cry3和Cry34/35,以及Cry6(如果在三重/多重堆疊中使用的話)。可以交換這些蛋白質的域/亞域以生成嵌合蛋白。關於Cry34/35蛋白，參見例如美國專利No. 7，309, 785和7，524，810。』 785專利還教導截短的Cry35蛋白。本文中也示例截短的毒素。如本文中使用的，遵照「Revision of the Nomenclature for the Bacillusthuringiensis Pesticidal Crystal Proteins，，，N. Crickmore, D. R. Zeigler,J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum,和 D. H. Dean. Microbiology andMolecular Biology Reviews (1998)Vol 62 :807-813,邊界代表表不大約 95% (Cry3Ba 和Cry34Ab 和 Cry35Ab)、78% (Cry3B 和 Cry34A 和 Cry35A)、和 45% (Cry6 和 Cry34 和 Cry35)序列同一性。依照本發明，同樣適用於Cry3A和/或Cry6，如果例如在三重/多重堆疊中使用的話。對本領域技術人員應當顯然的是，編碼活性毒素的基因可以經由數種手段來鑑定和獲得。本文中示例的具體基因或基因部分可以自保藏於培養物保藏機構的隔離群獲得。這些基因或其部分或變體也可以合成構建，例如通過使用基因合成儀。基因的變異可以使用用於生成點突變的標準技術容易地構建。還有，這些基因的片段可以使用商品化外切核酸酶或內切核酸酶依照標準規程生成。例如，可以使用酶(諸如Bal31)或定點誘變自這些基因的末端系統切除核苷酸。編碼活性片段的基因也可以使用多種限制性酶來獲得。可以使用蛋白酶直接獲得這些蛋白質毒素的活性片段。保留示例毒素的殺蟲活性的片段和等同物會在本發明的範圍內。還有，由於遺傳密碼的冗餘，多種不同DNA序列可編碼本文中公開的胺基酸序列。創建這些編碼相同或本質上相同的毒素的備選DNA序列完全在本領域技術人員的技術內。這些變體DNA序列在本發明的範圍內。如本文中使用的，提到「本質上相同的」序列指具有對殺蟲活性沒有實質影響的胺基酸替代、刪除、添加、或插入的序列。編碼保留殺蟲活性的蛋白質的基因片段也包括在此定乂中。用於鑑定依照本發明有用的編碼毒素的基因和基因部分的又一種方法是經由使用寡核苷酸探針。這些探針是可檢測核苷酸序列。這些序列可以藉助適宜的標記物來檢測，或者可以製成內在發螢光的，如記載於國際申請號W093/16094。如本領域公知的，如果探針分子和核酸樣品通過在兩分子間形成強鍵而雜交，那麼可以合理假設探針和樣品具有實質性同源性。優選地，通過本領域公知的技術在嚴格條件下進行雜交，如記載於例如Keller，G. H. , M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N. Y. , pp. 169-170。鹽濃度和溫度組合的一些例子如下(以嚴格性升高的次序)2X SSPE或SSC，於室溫；1X SSPE或 SSC，於 42°C ；0. IX SSPE 或 SSC，於 42°C ；0. IX SSPE 或 SSC，於 65°C。探針的檢測提供用於以已知方式確定是否發生雜交的手段。此類探針分析提供用於鑑定本發明的毒素編碼基因的快速方法。依照本發明用作探針的核苷酸區段可使用DNA合成儀和標準規程來合成。這些核苷酸序列還可作為PCR引物用於擴增本發明的基因。變體毒素。本文中已經具體示例了本發明的某些毒素。由於這些毒素僅僅是本發明毒素的示例，應當顯而易見的是，本發明包含與示例毒素具有相同或相似殺蟲活性的變體或等同毒素(和編碼等同毒素的核苷酸序列)。等同毒素會與示例毒素具有胺基酸同源性。在一些實施方案中，這種胺基酸同一性通常會大於75%、或優選大於85%、優選大於90%、 優選大於95%、優選大於96%、優選大於97%、優選大於98%、或優選大於99%。胺基酸同一性通常會在毒素的關鍵區中最高，關鍵區負責生物學活性或涉及決定最終負責生物學活性的三維構型。在這點上，某些胺基酸替代是可接受的且可預期的，如果這些替代在對活性不是至關重要的區域中或是不影響分子三維構型的保守胺基酸替代的話。例如，可以將胺基酸歸入下述類別非極性的，不帶電荷的極性的，鹼性的，和酸性的。其中一個類別的胺基酸用同一類型的另一種胺基酸替換的保守替代落在本發明的範圍內，只要該替代沒有實質性改變化合物的生物學活性。表I提供屬於每一個類別的胺基酸實例的列表。表I :胺基酸的類別及屬於每一個類別的胺基酸的例子
胺基酸的類別胺基酸的例子
非極性Ala, Val, Leu, He, Pro, Met, Phe, Trp
不帶電荷的極性<51y，Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
酸性Asp，Glu
鹼性Lys，Arg，His在一些情況中，也可以進行非保守替代。關鍵因素是這些替代不能顯著降低毒素的生物學活性。重組宿主。可以將編碼本發明的毒素的基因導入極其多種微生物或植物宿主。毒素基因的表達直接或間接導致殺蟲劑的胞內生成和維持。可以使用接合轉移和重組轉移來創建表達本發明兩種毒素的Bt菌株。也可以用兩種毒素基因之一或二者轉化其它宿主生物體，然後用於實現協同效應。憑藉合適的微生物宿主，例如假單胞菌屬(Pseudomonas),可以將微生物應用於害蟲的地點，在那裡它們會繁殖和被攝取。結果是控制害蟲。或者，可以在延長毒素活性和穩定細胞的條件下處理包含毒素基因的微生物。然後可以將經過處理的保留毒素活性的細胞應用於靶害蟲的環境。來自本發明植物的不可再生/非全能植物細胞(包含至少一種主題IRM基因)包括在本發明內。
植物轉化。本發明的一個優選實施方案是用編碼主題殺蟲蛋白或其變體的基因轉化植物。依靠經轉化植物的細胞中控制量的主題殺蟲蛋白或其變體的存在，經轉化植物對昆蟲靶害蟲的攻擊有抗性。通過將編碼B. t.殺蟲毒素的殺蟲特性的遺傳材料併入特定昆蟲害蟲吃的植物的基因組中，成蟲或幼蟲會在食用植物食物之後死亡。已經轉化了單子葉植物和雙子葉植物分類的眾多成員。轉基因農作物以及水果和蔬菜是商業上感興趣的。此類作物包括但不限於玉蜀黍、稻、大豆、芸苔、向日葵、苜蓿、高粱、小麥、棉花、花生、番茄、馬鈴薯、等等。存在數種技術用於將外來遺傳材料導入植物細胞中，及用於獲得穩定維持並表達導入的基因的植物。此類技術包括加速包被到微粒上的遺傳材料直接進入細胞中(美國專利No. 4，945，050及美國專利No. 5，141，131)。可以使用土壤桿菌技術來轉化植物，參見美國專利No. 5，177，010 ;美國專利No. 5，104, 310 ;歐洲專利申請No. 0131624B1 ;歐洲專利申請No. 120516 ;歐洲專利申請No. 159418B1 ;歐洲專利申請No. 176112 ;美國專利 No. 5，149，645 ;美國專利 No. 5，469，976 ;美國專利 No. 5，464，763 ;美國專利No. 4，940, 838 ;美國專利No. 4，693，976 ;歐洲專利申請No. 116718 ;歐洲專利申請No. 290799 ;歐洲專利申請No. 320500 ;歐洲專利申請No. 604662 ;歐洲專利申請No. 627752 ；歐洲專利申請No. 0267159 ;歐洲專利申請No. 0292435 ;美國專利No. 5，231，019 ;美國專利No. 5，463，174 ;美國專利No. 4，762，785 ;美國專利No. 5，004，863 ;及美國專利 No. 5，159，135。其它轉化技術包括WHISKERS 技術，參見美國專利No. 5，302，523及美國專利No. 5，464，765。還已經使用電穿孔技術來轉化植物，參見WO 87/06614 ;美國專利No. 5，472，869 ;美國專利 No. 5，384，253 ；W0 9209696 ;及 WO 9321335。通過述及收錄所有這些轉化專利和出版物。在用於轉化植物的眾多技術之外，與外來基因接觸的組織的類型同樣可以變化。此類組織會包括但不限於胚胎發生組織、愈傷組織I和II型、下胚軸、分生組織、等等。可以使用技術人員技術之內的適宜技術在去分化期間轉化幾乎所有植物組織。可以使用本領域公知的多種技術將編碼任何主題毒素的基因插入植物細胞中，如上文公開的。例如，包含容許選擇經轉化微生物細胞的標誌物和在大腸埃希氏菌/大腸桿菌(Escherichia coli)中有功能的複製系統的多種克隆載體可用於製備和修飾外來基因，用於插入高等植物中。此類操作可包括例如計劃用途期望的插入突變、截短、添加、或替代。載體包括例如pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184、等。因而，可以在合適限制性位點處將編碼Cry蛋白或變體的序列插入載體中。將所得質粒用於轉化大腸桿菌細胞，在合適的營養培養基中培養其細胞，然後收穫並裂解，從而回收可工作數量的質粒。一般進行序列分析、限制性片段分析、電穿孔、和其它生物化學-分子生物學方法作為分析方法。在每次操作之後，可以切割使用的DNA序列，並連接至下一種DNA序列。可以在相同或不同的質粒中克隆每種操作的DNA序列。含有T-DNA的載體用於轉化植物細胞的用途已經在EP 120516 ;Lee和Gelvin(2008) ；Fraley等人(1986);及An等人(1985)中深入研究及充分記載,而且是本領域完善
建立的。一旦插入的DNA整合入植物基因組中，它在整個後續世代中是相對穩定的。用於轉化植物細胞的載體通常含有編碼賦予經轉化植物細胞以對除草劑或抗生素諸如雙丙氨憐(bialaphos)、卡那黴素、G418、博來黴素、或潮黴素、等等的抗性的蛋白質的選擇標記基因。各個採用的選擇標記基因因而應當容許選擇經轉化細胞，而不含插入的DNA的細胞的生長受到選擇化合物的阻抑。多種技術可用於將DNA插入宿主植物細胞中。那些技術包括用通過根癌土壤桿菌或髮根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)作為轉化劑投遞的T-DNA進行的轉化。另夕卜，可採用植物原生質體與含有要投遞的DNA的脂質體的融合、DNA直接注射、生物射彈轉化(微粒轟擊)、或電穿孔，以及其它可能的方法。在本發明的一個優選實施方案中，會用其中蛋白質編碼區的密碼子選擇已經為植物優化的基因轉化植物。參見例如美國專利No. 5380831，通過述及將其收入本文。還有，有利地，會使用編碼截短型毒素的植物。截短型毒素通常會編碼全長毒素的約55%至約80%。用於創建合成B. t.基因以用於植物的方法是本領域已知的(Stewart，2007) 。不管轉化技術，優選將基因併入通過在載體中包括植物啟動子而適合於在植物細胞中表達B. t.殺蟲毒素基因和變體的基因轉移載體中。在植物啟動子之外，可以在植物細胞中有效使用來自多種來源的啟動子來表達外來基因。例如，可以使用細菌起源的啟動子，諸如章魚鹼合酶啟動子、胭脂鹼合酶啟動子、和甘露鹼合酶啟動子。在一些優選的實施方案中可以使用非蘇雲金芽孢桿菌啟動子。可以使用植物病毒起源的啟動子，例如花椰菜花葉病毒的35S和19S啟動子、來自木薯葉脈花葉病毒的啟動子、等等。植物啟動子包括但不限於核酮糖-1，6_ 二磷酸(RUBP)羧化酶小亞基(ssu)、^ -伴球蛋白(conglycinin)啟動子、菜豆蛋白啟動子、ADH (醇脫氫酶)啟動子、熱休克啟動子、ADF (肌動蛋白解聚因子)啟動子、遍在蛋白啟動子、肌動蛋白啟動子、和組織特異性啟動子。啟動子也可以含有某些可改善轉錄效率的增強子序列元件。典型的增強子包括但不限於ADHl-內含子I和ADHl-內含子
6。可使用組成型啟動子。組成型啟動子指導幾乎所有細胞類型中及幾乎所有時間時的連續基因表達(例如肌動蛋白、遍在蛋白、CaMV 35S)。組織特異性啟動子負責特定細胞或組織類型，諸如葉或種子中的基因表達(例如玉米醇溶蛋白、油質蛋白、油菜籽蛋白(napin)、ACP(醯基載體蛋白)啟動子)，而且也可以使用這些啟動子。也可以使用在植物發育的某些階段期間有活性的以及在特定植物組織和器官中有活性的啟動子。此類啟動子的實例包括但不限於根特異性的、花粉特異性的、胚特異性的、玉米穗絲特異性的、棉纖維特異性的、種子胚乳特異性的、韌皮部特異性的啟動子、等等。在某些情況下，可能希望使用誘導型啟動子。誘導型啟動子負責基因響應特定信號的表達，所述信號諸如物理刺激(例如熱休克基因);光(例如RUBP羧化酶);激素(例如糖皮質激素);抗生素(例如四環素);代謝產物；和應激(例如乾旱)。可以使用在植物中發揮功能的其它期望的轉錄和翻譯元件，諸如5'非翻譯前導序列、RNA轉錄終止序列和聚腺苷酸添加信號序列。眾多植物特異性基因轉移載體是本領域已知的。含有昆蟲抗性(IR)性狀的轉基因作物遍及北美洲流行於玉米和棉花植物，而且這些性狀的使用正在全球擴大。多家種子公司已經開發了組合IR和除草劑耐受(HT)性狀的商業轉基因作物。這些包括由B.t.殺蟲蛋白賦予的IR性狀和HT性狀的組合，所述HT性狀諸如對乙醯乳酸合酶(ALS)抑制劑諸如磺脲類、咪唑啉酮類、三唑並嘧啶、磺醯苯胺類、等等，穀氨醯胺合成酶(GS)抑制劑諸如雙丙氨磷、草銨膦(glufosinate)、等等，4-輕基苯基丙酮酸酯雙加氧酶(HPPD)抑制劑諸如甲基磺草酮(mesotrione)、異口惡唑草酮(isoxaf Iutole)、等等,5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合酶(EPSPS)抑制劑諸如草甘磷(glyphosate)等等,和乙醯輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑諸如氟卩比氯禾靈/氟卩比甲禾靈(haloxyfop)、喹禾靈(quizalofop)、氯甲草/禾草靈(diclofop)、等等的耐受。知道其它實例，其中轉基因提供的蛋白質給植物提供對除草劑化學類別諸如苯氧基酸除草劑和吡啶基氧乙酸酯生長素除草劑(參見WO 2007/053482 A2)，或苯氧基酸除草劑和芳基氧苯氧基丙酸酯除草劑(參見WO 2005/107437 A2，A3)的耐受。經由IR性狀控制多種害蟲問題的能力是一個有價值的商業產品概念，而且如果在同一植物中組合昆蟲控制性狀和雜草控制性狀的話，這個產品概念的便利得到增強。另外，可以經由B.t.殺蟲蛋白(諸如本發明的)賦予的IR性狀與一種或多種別的HT性狀(諸如上文提到的)，加上一種或多種別的輸入性狀(例如由B. t.衍生的或其它的殺蟲蛋白賦予的其它昆蟲抗性、由諸如RNAi等等機制賦予的昆蟲抗性、線蟲抗性、疾病抗性、應激耐受、改善的氮利用、等等)或輸出性狀(例如高油含量、健康油組成、營養改善、等等)的單一植物組合獲得提高的價值。可以或者經由常規育種(育種堆疊)或者共同作為涉及同時導入多種基因的一個新穎轉化事件(分子堆疊)獲得此類組合。好處包括作物植物中管理昆蟲害蟲的能力和改善的雜草控制，這給生產者和/或消費者提供次級好處。如此，本發明可用於與其它性狀組合以提供作物品質改善的完整農業包，其具有靈活且划算地控制任何數目的農業問題的能力。
經過轉化的細胞以通常的方式在植物內部生長。它們能形成生殖細胞並將轉化的性狀傳遞給後代植物。此類植物可以以正常方式種植並與具有相同轉化遺傳因子或其它遺傳因子的植物雜交。所得雜種個體具有相應的表型特性。在本發明的一個優選實施方案中，會用已經為植物優化了密碼子選擇的基因轉化植物。參見例如美國專利No. 5，380，831。另外，用於創建供植物中使用的合成Bt基因的方法是本領域已知的(Stewart和Burgin, 2007)。優選的經過轉化的植物的一個非限制性例子是包含編碼Cry3Ba蛋白的植物可表達基因且進一步包含編碼Cry34Ab/35Ab蛋白的第二組植物可表達基因的能育玉蜀黍植物。Cry3Ba和Cry34Ab/35Ab決定性狀進入近交玉蜀黍系的轉移(或漸滲)可通過輪迴選擇育種來實現，例如通過回交。在這種情況中，首先將期望的輪迴親本與攜帶Cry決定性狀的適宜基因的供體近交系(非輪迴親本)雜交。然後將這次雜交的後代與輪迴親本回交，接著在所得後代中選擇要自非輪迴親本轉移的期望性狀。在與輪迴親本三、優選四、更優選五或更多代回交及選擇期望性狀後，後代對控制所轉移性狀的基因座會是雜合的，但是對大多數或幾乎所有其它基因會像輪迴親本(參見例如Poehlman和Skper (1995)BreedingField Crops,第4版，172-175 ；Fehr( 1987)Principles of Cultivar Development,Vol. I Theory and Technique,360-376)。昆蟲抗件管理(IRM)策略。例如，Roush等人概述了用於管理殺蟲轉基因作物的兩毒素策略，也稱作「堆金字塔」或「堆疊」 (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond.B. (1998) 353,1777-1786)。在他們的網站上，美國環境保護局(epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006. htm)公布了提供非轉基因(即非B. t.)庇護(一片非Bt作物/玉米)與生成針對靶害蟲有活性的單一 Bt蛋白的轉基因作物一起使用的下述要求。「玉米姓蟲防護Bt (CrylAb或CrylF)玉米產品的具體結構化要求如下
結構化庇護玉米帶中20%非鱗翅目Bt玉米庇護；棉花帶中50%非鱗翅目Bt庇護片內部(SP，在Bt田地內)外部卿，距Bt田地1/2英裡(1/4英裡，如果可能的話)內的分開田地以使隨機交配最大化)田地中的條條必須寬至少4行(優選6行)以降低幼蟲移動的影響」另外，國家玉米種植者聯合會在他們的網站上(ncga. com/insect-resistance-ma nagement-fact-sheet-bt-corn)也提供了關於庇護要求的類似指導。例如「玉米蛀蟲IRM的要求-種植你們玉米耕地的至少20%以庇護雜種-在棉花生產區，庇護必須為50%-必須距庇護雜種1/2英裡內種植-庇護可以在Bt田地內種植成條；庇護條必須寬至少4行-只有當對於靶昆蟲達到經濟閾值時，可以用常規殺蟲劑處理庇護-基於Bt的可噴灑殺蟲劑不得用於庇護玉米-必須在每一塊有Bt玉米的農田上種植適宜庇護」如Roush等人所述(例如第1780頁和第1784頁右欄)，用各自針對靶害蟲有效且沒有或幾乎沒有交叉抗性的兩種不同蛋白質堆疊或堆金字塔可容許使用更小的庇護。Roush提出，對於成功的堆疊，少於10%庇護的庇護尺寸能提供與單一(非堆金字塔型)性狀的約50%庇護相當的抗性管理。對於當前可得的堆金字塔型Bt玉米產品，美國環境保護局要求比單一性狀產品(一般20%)顯著更少的(一般5%)種植非Bt玉米的結構化庇護。有多種方式來提供IRM庇護效應,包括田地中的各種幾何種植樣式(如上文提到的)和袋中種子混合物，如Roush等人(見上文),和美國專利No. 6, 551, 962進一步討論的。上述百分比或類似的庇護比率可用於主題雙重或三重堆疊或金字塔。因為本發明提供針對根蟲靶昆蟲的多重、非競爭性作用模式，所以本發明能提供「零庇護」，就是說，沒有庇護植物(因為不需要它們)的田地。超出約10英畝的典型B.t.轉基因田地通常需要許可。因此，本發明包括具有「零庇護」或沒有Bt植物的10英畝或更大的田地；這種尺寸的田地先前會要求具有顯著的非Bt庇護。通過述及完整收錄本文中提到或引用的所有專利、專利申請、臨時申請、和出版物，到它們與本說明書中的清楚教導不矛盾的程度。下文是例示用於實施本發明的規程的實施例。這些實施例不應解釋為限制。除非另外註明，所有百分比以重量計，而且所有溶劑混合比例以體積計。所有溫度以攝氏度計。除非明確指明或暗示，術語「一個」、「一種」、和「所述」表示「至少一個/種」，如本文中使用的。
實施例實施例I-編碼Cry34Abl> Cry35Abl、和Cry3Bal全長毒素的表達質粒的構建
使用標準克隆方法來構建改造成分別生成全長Cry34Abl、Cry35Abl、和Cry3BalCry蛋白的突光假單胞菌(Pf)表達質粒。使用來自New England BioLabs (NEB ；Ipswich,MA)的限制性內切核酸酶進行DNA消化，並且使用來自Invitrogen的T4 DNA連接酶進行DNA連接。使用質粒Midi試劑盒(Qiagen)遵循供應商的說明書實施質粒製備。瓊脂糖Tris-乙酸鹽凝膠電泳後使用Millipore Ultrafree⑩-DA筒(Billerica,MA)純化DNA片段。基本克隆策略使得分別將全長Cry34Abl和Cry35Abl蛋白的編碼序列(⑶S)亞克隆入PMYC1803中，在SpeI和XhoI(或XbaI)限制性位點處，並將全長Cry3Bal蛋白的CDS亞克隆A PMYC1050中，在KpnI和XbaI限制性位點處，由此分別將它們置於來自質粒pKK223_3(PLPharmacia,Milwaukee,WI)的Ptac啟動子和rrnBTlT2終止子的表達控制之下。pMYC1803為中拷貝質粒，在可引入含有蛋白編碼區的DNA片段的限制酶識別位點前面有RSF1010複製起點、四環素抗性基因、和核糖體結合位點(美國專利申請No. 2008/0193974)。通過電穿孔將表達質粒轉化入螢光假單胞菌菌株MB214中，在SOC-大豆水解產物培養基中恢復，並在含有20 ii g/ml四環素的Lysogeny肉湯(LB)培養基上塗板。微生物操作的詳情 可見美國專利申請No. 2006/0008877 ;美國專利申請No. 2008/0193974 ;和美國專利申請No. 2008/0058262，通過述及收入本文。通過微量製備質粒DNA的限制性消化來篩選菌落。通過與商業測序商諸如MWG Biotech (Huntsville, AL)的合同對含有插入物的選定克隆的質粒 DNA 測序。使用 Sequencher 軟體(Gene Codes Corp. ,Ann Arbor,MI)裝配和分析序列數據。實施例2-牛長和表汰通過搖瓶培養的包含表達構建體(例如Cry34Abl的克隆pMYC2593、Cry35Abl的PMYC3122、和Cry3Bal的pMYC1177)的螢光假單胞菌菌株實現了供表徵(包括Bt受體結合和昆蟲生物測定法)用的Cry34Abl、Cry35Abl、和Cry3Bal毒素的搖瓶生產中的生長和表達分析。使用在補充有20 ii g/ml四環素的LB培養基中培養的種子培養物來接種200mL含20 ii g/ml四環素的相同培養基。於30°C在搖動中初始溫育24小時後通過添加異丙基-0-D-I-硫代吡喃型半乳糖苷(IPTG)來誘導Cry34Abl、Cry35Abl、和Cry3Bal毒素經Ptac啟動子的表達。在誘導時及在誘導後的多個時間對培養物取樣。通過600nm光密度(0D_)來測量細胞密度。實施例3-搖瓶樣品的細胞分級和SDS-PAGE分析在每一個取樣時間，將樣品的細胞密度調節至0D_=20並將ImL等分試樣以
14,OOOx g離心5分鐘。將細胞團粒冷凍於_80°C。使用EasyLyse 細菌蛋白質提取解決方案(EPICENTRE Biotechnologies，Madison, WI)自冷凍搖瓶細胞團粒樣品生成可溶性和不溶性級分。將每一份細胞團粒在ImL EasyLyse 溶液中重懸並在裂解緩衝液中進一步1:4稀釋並在搖動中於室溫溫育30分鐘。將裂解物於4°C以14，OOOrpm離心20分鐘並作為可溶性級分回收上清液。然後將團粒(不溶性級分)在等體積的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS ；
11.9mM Na2HPO4,137mM NaCl,2. 7mM KC1，pH7. 4)中重懸。將樣品與含有P _巰基乙醇的2X Laemmli樣品緩衝液I: I混合併煮沸5分鐘，之後加載到NuPAGE Novex 4-20%Bis-Tris凝膠(Invitrogen, Carlsbad, CA)上。在推薦的XT MOPS緩衝液中實施電泳。將凝膠用SimplyBlue 安全染料依照製造商(Invitrogen)的方案染色並使用Typhoon成像系統(GEHealthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA)成像。_6] 實施例4-包含體製備對來自生成不溶性B. t.殺蟲蛋白(通過SDS-PAGE和MALDI-MS (基質輔助雷射解吸/電離質譜術)證明)的螢光假單胞菌發酵的細胞實施了 Cry蛋白包含體(IB)製備。在37°C水浴中融化螢光假單胞菌發酵團粒。將細胞在裂解緩衝液[50mM Tris pH 7. 5,200mMNaCl,20mM EDTA 二鈉鹽(乙二胺四乙酸)，l%Triton X-100，和5mM 二硫蘇糖醇(DIT)]中重懸至25%w/v ;並在臨使用前添加5mL/L細菌蛋白酶抑制劑混合物(P8465 Sigma-Aldrich,St. Louis, MO)。使用勻眾器以最低設置(Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc.,Bartlesville，OK)使細胞懸浮。通過用金屬刮刀混合，將溶菌酶(25mg的Sigma L7651，來自雞蛋清)添加至細胞懸浮液，並將懸浮液於室溫溫育I小時。將懸浮液在冰上冷卻15分鐘，然後使用Branson Sonifier 250進行超聲處理(I分鐘時間，兩次，50%工作循環，30%輸出)。通過顯微術來檢查細胞裂解。在必要時另添加25mg溶菌酶，並重複溫育和超聲處理。當經顯微術確認了細胞裂解時，裂解物以11，500x g離心25分鐘(4°C)以形成IB團粒，並丟棄上清液。將IB團粒用IOOmL裂解緩衝液重懸，用手持式混合儀勻漿並如上所述離心。 將IB團粒反覆清洗，即重懸(在50mL裂解緩衝液中)、勻漿、超聲處理、並離心，直至上清液變成無色且IB團粒變得堅實且顏色為灰白色(off-white)。對於最後一次清洗，將IB團粒在含有2mM EDTA的無菌過濾(0. 22 u m)蒸餾水中重懸，並離心。將最終的團粒在含有2mMEDTA的無菌過濾蒸餾水中重懸，並以ImL等分試樣保存於_80°C。實施例5-SDS-PAGE分析和定量進行IB製備物中蛋白質的SDS-PAGE分析和定量，即融化IB團粒的ImL等分試樣並用無菌過濾蒸餾水1:20稀釋。然後將稀釋樣品與4X還原樣品緩衝液[250mM Tris,pH6. 8，40% 甘油(v/v)，0. 4% 溴酚藍(w/v)，8%SDS (w/v)和 8%3 -巰基乙醇(v/v)] —起煮沸並加載到用IX Tris/甘氨酸/SDS緩衝液(Invitrogen)運行的Novex⑩4-20%Tris-甘氨酸12+2孔凝膠(Invitrogen)上。將凝膠以200伏運行大約60分鐘,然後遵循SimplyBlue 安全染料(Invitrogen)規程染色並脫色。進行祀條帶的定量,即將條帶的密度測定值與同一凝膠上運行、以生成標準曲線的牛血清清蛋白(BSA)樣品比較,使用Bio-Rad QuantityOne⑩軟體進行。實施例6-包含體的溶解將IOmL來自螢光假單胞菌克隆MR1253、MR1636、和MR816的包含體懸浮液(分別含有 50_70mg/mL Cry34Abl、Cry35Abl、和 Cry3Bal 蛋白)以 Eppendorf 5415C型微量離心機的最高設置(大約14，OOOx g)離心以使內含物成團粒。除去貯存緩衝液上清液並分別在50mL錐形管中用25mL IOOmM乙酸鈉緩衝液pH 3. 0 (用於Cry34Abl和Cry35Abl 二者)和IOOmM碳酸鈉緩衝液PHll (用於Cry3Bal)替換。使用移液器將內含物重懸並渦旋振蕩以徹底混合。將管在溫和搖動的平臺上於4°C放置過夜以提取全長Cry34Abl、Cry35Abl、和Cry3Bal蛋白。將提取物於4°C以30，OOOx g離心30分鐘，並保存所得(含有溶解的全長Cry蛋白的)上清液。實施例7-全長毒素原的截短將全長Cry35Abl和Cry3Bal用胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶消化或截短以生成胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶核心片段(它們是該蛋白質的活性形式)。具體地，將溶解的全長Cry35Abl與胰凝乳蛋白酶(牛胰)(Sigma, St. MO)一起(以50: I=Cry蛋白酶，w/w)在IOOmM乙酸鈉緩衝液pH 3. O中(實施例6)於4°C在溫和搖動中溫育2-3天，而將全長Cry3Bal與胰蛋白酶(牛胰)(Sigma, St. MO)—起(以20: I=Cry蛋白酶,w/w)在IOOmM碳酸鈉緩衝液PHll中(實施例6)於室溫溫育1-3小時。通過SDS-PAGE分析確認了完全蛋白水解加工。全長Cry35Abl和Cry3Bal的分子量約等於44和約等於73kDa,而它們的胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶核心分別約等於40和約等於55kDa。Cry35Abl的全長和胰凝乳蛋白酶核心的胺基酸序列作為SEQ ID NO: I和SEQ ID NO:2提供，而Cry3Bal的全長和胰蛋白酶核心的胺基酸序列作為SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4提供。Cry34Abl的胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶核心均不可得，並因此使用全長Cry34Abl進行結合測定法。全長Cry34Abl的胺基酸序列作為SEQ ID NO:5 提供。實施例8-截短的毒素的純化純化胰凝乳蛋白酶消化的Cry35Abl和胰蛋白酶消化的Cry3Bal核心片段。具體 地，將消化反應物於4°C以30，OOOx g離心30分鐘以去除脂質，並使用Amicon Ultra-15再生纖維素離心過濾裝置(10，000分子量截留；Millip0re)將所得上清液濃縮5倍。然後使用一次性F1D-IO柱(GE Healthcare, Piscataway, NJ)或透析來將樣品緩衝液換成20mM乙酸鈉緩衝液pH 3. 5 (用於Cry34Abl和Cry35Abl 二者)和IOmM CAPS [3-(環己氨基)I-丙磺酸]pH 10. 5(用於Cry3Bal)。使用相應緩衝液將終體積調節至15ml，以使用ATKA Explorer液相層析系統(Amersham Biosciences)進行純化。對於Cry35Abl,緩衝液A為20mM乙酸鈉緩衝液pH 3. 5且緩衝液B為緩衝液A+1M NaCl pH 3.5。使用HiTrap SP(5ml)柱(GE)。使用緩衝液A使柱完全平衡後，以流速5ml/min將Cry35Abl溶液注射入柱中。使用緩衝液B的梯度0-100%以5ml/min實施洗脫，Iml/級分。對於Cry3Bal，緩衝液A為IOmM CAPS緩衝液 pH 10. 5 且緩衝液 B 為 IOmM CAPS 緩衝液 pH 10. 5+1M NaCl0 使用 Capto Q，5ml(5ml)柱(GE)，而且所有其它規程與用於Cry35Abl的類似。SDS-PAGE分析選定級分以進一步選擇含有質量最好的靶蛋白的級分後，合併那些級分。對於純化的Cry35Abl胰凝乳蛋白酶核心，如上所述，將緩衝液換成20mM Bist-Tris,pH 6.0。對於純化的Cry3Bal胰蛋白酶核心，使用一次性PD-10柱(GEHealthcare, Piscataway, NJ)或透析來去除鹽。使用SDS-PAGE和Typhoon成像系統(GE)分析定量(BSA作為標準品)後，將樣品保存於4°C，用於稍後的結合測定法。實施例9-BBMV製備物昆蟲的刷狀緣膜囊(BBMV)製備物已經廣泛用於Cry毒素受體結合測定法。本發明中使用的BBMV製備物是使用Wolferberger等人(1987)描述的方法自第三齡西方玉米根蟲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)的分離中腸製備的。使用亮氨酸氨肽酶作為製備物中膜蛋白的標誌物，而且如先前所述(Li等人，2004a)測定粗製勻漿物和BBMV製備物的亮氨酸氨肽酶活性。使用Bradford方法(1976)測量BBMV製備物的蛋白質濃度。實施例IO-mI標記使用125I標記純化的全長Cry34Abl、胰凝乳蛋白酶消化的Cry35Abl、和胰蛋白酶消化的Cry3Bal供飽和和同源競爭結合測定法用。為了確保放射性標記不消除Cry毒素的生物學活性，使用 NaI 遵循 Pierce 碘化珠(Pierce Biotechnology, Thermo Scientific,Rockford IL)的說明書進行冷碘化。生物測定法結果指示碘化的Cry35Abl胰凝乳蛋白酶核心保持了針對西方玉米根蟲的幼蟲的活性，但是碘化滅活了 Cry34Abl。沒能檢測到放射性標記的125I-Cry34Abl對昆蟲BBMV的特異性結合，因此需要另一種標記方法來評估Cry34Abl的膜受體結合。由於胰蛋白酶消化的Cry3Bal針對西方玉米根蟲具有有限的活性，因此認為使用冷碘化的Cry3Bal胰蛋白酶核心用玉米根蟲進行的生物測定法難以評估活性變化。另外，檢測到125I_Cry3Bal對BBMV的特異性結合，儘管水平較低。忽略Cry3Bal的冷碘化及其毒性測定法。經由碘化用Pierce 碘化珠(Pierce)和Na125I獲得了放射性標記的125I_Cry35Abl和125I_Cry3Bal。使用Zeba 脫鹽旋轉柱(Pierce)自碘化的蛋白質去除未摻入的或游離的Na125L碘化的Cry蛋白的比放射性範圍為l_5uCi/ug。進行了多批標記和結合測定法。實施例11-飽和結合測定法如先前所述(Li等人，2004b)使用125I標記的Cry毒素實施特異性或飽和結合測定法。為了測定Cry35Abl和Cry3Bal對昆蟲BBMV的特異性結合及評估結合親和力(解離 常數，Kd)和結合位點濃度(Bmax)，將一系列漸增濃度的125I_Cry35Abl或125I_Cry3Bal分別與給定濃度(0. lmg/ml)的昆蟲BBMV —起在150ul補充有0. 1%BSA的20mM Bis-Tris pH
6.0、150mM KCl中於室溫在溫和搖動中溫育I小時。通過以20，000 x g於室溫離心8分鐘將懸浮液中結合至BBMV的毒素與游離的毒素分開。將團粒用(冰冷的)900ul含有0. 1%BSA的相同緩衝液清洗2次。用C0BRAII自動伽馬計數器(Packard, a Canberra company)測量團粒中保留的放射性並作為總結合。並排設置另一系列結合反應，並在每一個結合反應中包括500-1，000倍過量的未標記的相應毒素以完全佔據BBMV上的所有特異性結合位點，這用於測定非特異性結合。通過總結合減去非特異性結合來估算特異性結合。通過運行 GraphPad Prism 5. 01 (GraphPad Software, San Diego, CA)使用特異性結合針對所使用的經標記毒素濃度來估算這些毒素的Kd和Bmax值。使用Microsoft Excel或GraphPad Prism軟體製作圖表。實驗重複至少4次並將結果繪製在圖IA (125I_Cry35Abl對BBMV的結合)和圖IB (125I-Cry3Bal對BBMV的結合)的曲線圖中。這些結合實驗證明7 125I-Cry35Abl 和 125I_Cry3Bal 都能夠特異性結合 BBMV (圖 IA 和 IB)。125I_Cry35Abl 和125I-Cry3Bal分別具有結合親和力Kd=Il. 66± 11. 44，7. 35±3.81 (nM)，而且分別具有結合位點濃度 Bmax=O. 78±0. 46，0. 55±0. 13 (pmole/mg BBMV)。在未標記Cry34Ab I 存在下(1:50=125I_Cry35Abl: Cry34Abl,摩爾比)進行125I-Cry35Abl的特異性結合。沒有獲得結合參數(Kd和Bmax)，因為125I_Cry35Abl的特異性結合不飽和(圖2)。然而，125I-Cry35Abl的特異性結合佔未標記Cry34Abl存在下總結合的大約90%。實施例12-竟爭結合測定法進行競爭結合測定法以確定分開的Cry34Abl和Cry35Abl,加上它們的混合物(作為二元毒素)是否與Cry3Bal分享同一組結合位點。對於Cry3Bal的同源競爭結合測定法，首先將漸增量(0-2，500nM)的未標記Cry3Bal與5nM125I_Cry3Bal混合，然後分別與0. Img/ml的昆蟲BBMV —起於室溫溫育I小時，以容許它們競爭BBMV上的推定受體。類似地，分別在未標記的Cry34Abl缺失或存在下(1:50=125I_Cry35Abl:Cry34Abl,摩爾比)並在0. 03mg/ml的BBMV的情況中用5nM 125I-Cry35Abl完成Cry35Abl同源競爭。對每一個反應測定與BBMV結合的125I-Cry3Bal或125I_Cry35Abl的百分比，與未標記競爭物缺失下的初始總(或特異性)結合比較。
在未標記的Cry34Abl缺失或存在下進行125I_Cry35Abl和未標記Cry3Bal之間的異源競爭結合測定法以鑑定它們是否分享同一組結合位點。這是通過提高未標記 Cry3Bal 作為競爭物與單獨 125I_Cry35Abl 或 125I_Cry35Abl+Cry34Abl(l:50=125I-Cry35Abl:Cry34Abl，摩爾比)競爭結合來實現的。類似地，還進行反異源競爭結合測定法，這是通過提高單獨的未標記的Cry35Abl和Cry34Abl,或Cry35Abl+Cry34Abl(I 50=Cry35Abl: Cry34Abl，摩爾比)混合物的量作為反應中包括的一種或兩種競爭物分別與經標記Cry3Bal競爭結合來實現的。實驗重複至少3次並將結果繪製在圖3A (單獨的125I-Cry35Ab的百分比結合)和圖3B (在Cry34Abl存在下125I_Cry35Abl的百分比結合)的曲線圖中。實驗結果證明了 Cry35Abl能夠競爭掉125I_Cry35Abl的特異性結合，不管Cry34Abl的缺失(圖3A)或存在(圖3B)。然而，在Cry34Abl的存在或缺失下，Cry3Bal都不能競爭掉125I_Cry35Abl的特異性結合。在反競爭結合測定法中，Cry3Ba也能夠置換自身，超過總結合的20%，這反映它完全競爭掉它的特異性結合，因為特異性結合只佔小部分(見圖 1B)。單獨的 Cry34Abl 或 Cry35Abl 任一或 Cry35Abl+Cry34Abl (1:10)的混合物都 不能置換125I_Cry3Bal。這些數據指示了單獨的Cry35Abl或Cry35Abl+Cry34Abl的混合物不與Cry3Bal分享受體結合位點。參考文獻Bradford, Μ. Μ. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitationof microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding, Anal. Biochem. 72，248-254.Li，H.，Oppertj B.，Higgins, R. A.，Huang, F.，Zhuj K. Y.，Buschmanj L.L.，2004a. Comparative analysis of proteinase activities of Bacillusthuringiensis-resistant and -susceptible Ostrinia nubilalis (Lepidoptera:Crambidae). Insect Biochem. Mol. Biol. 34，753-762.Li，H.，Oppert，B.，Gonzalez-Cabreraj J.，Ferre, J.，Higgins，R.
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B.，HanozetjG.M.，1987. Preparation and partial characterization of amino acidtransporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of thecabbage butterfly (Pieris brassicae). Comp. Biochem. Physiol. 86A，301-308.美國專利申請No. 20080193974. 2008. BACTERIAL LEADER SEQUENCES FORINCREASED EXPRESSION美國專利申請No. 20060008877, 2006. Expression systems with sec-systemsecretion.美國專利申請No. 20080058262，2008. rPA optimization.
權利要求
1.一種轉基因植物，其生成Cry34蛋白、Cry35蛋白、和Cry3B殺蟲蛋白。
2.權利要求I的轉基因植物，所述植物進一步生成選自Cry3A和Cry6A的第四殺蟲蛋白。
3.依照權利要求1-2任一項的植物的種子，其中所述種子包含所述DNA。
4.一種植物田地，其包含多個依照權利要求1-2任一項的植物。
5.權利要求4的植物田地，所述田地進一步包含非Bt庇護植物，其中所述庇護植物佔所述田地中所有作物植物的少於40%。
6.權利要求5的植物田地，其中所述庇護植物佔所述田地中所有作物植物的少於30%。
7.權利要求5的植物田地，其中所述庇護植物佔所述田地中所有作物植物的少於20%。
8.權利要求5的植物田地，其中所述庇護植物佔所述田地中所有作物植物的少於10%。
9.權利要求5的植物田地，其中所述庇護植物佔所述田地中所有作物植物的少於5%。
10.權利要求4的植物田地，其中所述田地沒有庇護植物。
11.權利要求5的植物田地，其中所述庇護植物成片或條。
12.—種種子混合物，其包含來自非Bt庇護植物的庇護種子和多個權利要求3的種子，其中所述庇護種子佔該混合物中所有種子的少於40%。
13.權利要求12的種子混合物，其中所述庇護種子佔該混合物中所有種子的少於30%。
14.權利要求12的種子混合物，其中所述庇護種子佔該混合物中所有種子的少於20%。
15.權利要求12的種子混合物，其中所述庇護種子佔該混合物中所有種子的少於10%。
16.權利要求12的種子混合物，其中所述庇護種子佔該混合物中所有種子的少於5%。
17.—種種子袋或容器，其包含多個權利要求3的種子，所述袋或容器具有零個庇護種子。
18.—種管理昆蟲形成對Cry蛋白的抗性的方法，所述方法包括種植種子以生成權利要求5或10的植物田地。
19.權利要求5-11任一項的田地，其中所述植物佔地超過10英畝。
20.權利要求1-2任一項的植物，其中所述植物為玉蜀黍植物。
21.權利要求1-2任一項的植物的植物細胞，其中所述Cry35蛋白與選自SEQID NO: I和SEQ ID NO:2的序列至少95%相同，所述Cry3B殺蟲蛋白與選自SEQ ID NO:3和SEQ IDNO: 4的序列至少95%相同，且所述Cry34蛋白與SEQ ID NO: 5至少95%相同。
22.權利要求1-2任一項的植物，其中所述Cry35蛋白包含選自SEQID NO:l和SEQID NO:2的序列，所述Cry3B殺蟲蛋白包含選自SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4的序列，且所述Cry34蛋白包含SEQ ID NO: 5。
23.一種生成權利要求21的植物細胞的方法。
24.—種控制根蟲昆蟲的方法,其通過使所述昆蟲與Cry34蛋白、Cry35蛋白、和Cry3B殺蟲蛋白接觸。
25.權利要求I的植物，其中所述Cry34蛋白為Cry34A蛋白，所述Cry35蛋白為Cry35A蛋白，且所述Cry3B蛋白為Cry3Ba蛋白。
26.權利要求I的植物，其中所述Cry34蛋白為Cry34Ab蛋白且所述Cry35蛋白為Cry35Ab 蛋白。
27.權利要求2的植物，其中所述Cry3A蛋白為Cry3Aa蛋白且所述Cry6A蛋白為Cry6Aa 蛋白。
28.權利要求24的方法，其中所述Cry34蛋白為Cry34A蛋白，所述Cry35蛋白為Cry35A蛋白，且所述Cry3B蛋白為Cry3Ba蛋白。
29.權利要求24的方法，其中所述Cry34蛋白為Cry34Ab蛋白且所述Cry35蛋白為Cry35Ab 蛋白 。
全文摘要
本發明部分涉及Cry34Ab/35Ab與Cry3Ba的組合。本發明部分涉及令人驚訝的發現，即Cry34Ab/Cry35Ab和Cry3Ba對於防止玉米根蟲(根螢葉甲)群體形成抗性(對單獨的任一殺蟲蛋白系統)是有用的。正如本領域技術人員藉助此公開內容會認識到的，生成這些殺蟲Cry蛋白的植物對減輕會形成對單獨的任一這些殺蟲蛋白系統有抗性的玉米根蟲群體的擔憂會是有用的。本發明部分得到下述發現的支持，即這些Cry蛋白系統的各成分沒有彼此競爭對玉米根蟲腸受體的結合。本發明還部分涉及三種(或更多種)毒素系統的三重堆疊或「金字塔」，其中Cry34Ab/Cry35Ab和Cry3Ba作為基礎對。因此，生成這兩種殺蟲蛋白系統的植物(和種植此類植物的土地)包括在本發明的範圍內。
文檔編號A01H5/00GK102970862SQ201180031211
公開日2013年3月13日 申請日期2011年4月22日 優先權日2010年4月23日
發明者K.E.納瓦, T.米德, K.J.芬希爾, H.李, T.D.海伊, A.T.伍斯利, M.B.奧爾森 申請人:陶氏益農公司