觀察細胞信號傳導通路的組織晶片和細胞系晶片的製作方法
2023-06-18 07:28:46
專利名稱:觀察細胞信號傳導通路的組織晶片和細胞系晶片的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域：
。更具體地，涉及一種高通量檢測與分析不同細胞(如各種正常與疾病組織細胞)中信號傳導通路的組織與細胞(系)晶片。
背景技術：
人基因組學研究目前是國際上的熱點。隨著研究的進展，人們迫切發現在各種惡性腫瘤組織及細胞中信號傳導通路的變化並確定人類新基因和已知序列的基因，以及各種基因在各種細胞通路中所起的作用。
除人染色體DNA大規模測序，表達序列測序(EST)蛋白質組的方法外，還缺少一種高通量檢測細胞信號傳導通路改變的方法。現有的基因晶片也只是將DNA固定在基片上，形成微陣列，無法直接原位檢測某一細胞中一種或多種基因的表達變化情況。
因此，本領域迫切需要開發新的技術，以便能高通量地細胞原位檢測一種或多種基因表達變化。
發明內容
本發明的目的就是提供一種可高通量地細胞原位檢測一種或多種基因表達變化的晶片。
本發明的另一目的是提供所述晶片的製備方法和用途。
在第一方面，本發明提供了一種組織-細胞系晶片，它包括(a)一個基片；(b)位於所述基片的一個主表面上的石蠟切片，所述切片的厚度為1-20微米，並且具有4-1000個點樣孔，所述的每個點樣孔中固定有一種組織/細胞，且切片上有2種以上的組織/細胞。
在一優選例中，所述點樣孔的大小是直徑為0.25-1.5毫米，且所述點樣孔之間的間距是0.25-5毫米，按點樣孔中心之間的距離計。
在另一優選例中，所述的點樣孔密度是16-100點樣孔/平方釐米。
在另一優選例中，所述的組織/細胞選自正常細胞、腫瘤組織、癌旁組織、體外培養的細胞系、傳代細胞和/或原代細胞、體外培養的腫瘤細胞系、石蠟包埋的組織、石蠟包埋的細胞系。
在另一優選例中，所述的基片選自載玻片和塑料基片。
在第二方面，本發明提供了一種組織-細胞系晶片的製備方法，它包括步驟(a)提供一空白石蠟塊，所述的石蠟塊具有4-1000個點樣孔，所述點樣孔的大小是直徑為0.25-1.5毫米，且所述點樣孔之間的間距是0.25-5毫米，按點樣孔中心之間的距離計；(b)在步驟(a)中的石蠟塊的點樣孔中推入組織/細胞樣品，所述組織/細胞的種類為2種以上；(c)從步驟(b)中的石蠟塊切取1-20微米的石蠟切片；(d)將步驟(c)中的石蠟切片置於基片之上，形成組織-細胞系晶片。
在一優選例中，步驟(b)中，所述的組織/細胞樣品選自(i)固定和石蠟包埋的正常組織、腫瘤組織和/或癌旁組織；(ii)石蠟包埋裸鼠皮下移植瘤組織；(iii)固定和石蠟包埋的細胞系。
在另一優選例中，在步驟(b)中，用點陣儀供體穿刺針從包埋有組織/細胞樣品的石蠟母塊的定位處穿取組織/細胞，推入石蠟塊的點樣孔中，所述的穿刺針的直徑與點樣孔的直徑相符；且步驟(d)的基片是用聚-L-賴氨酸處理過的載玻片。
在第三方面，本發明提供了本發明所述的組織-細胞系晶片的用途，它們被用於觀察細胞信號傳導、細胞轉染、原位雜交、免疫細胞化學檢測、免疫螢光分析、原位PCR、篩選藥物或藥靶。
在第四方面，本發明還提供了一種檢測不同細胞間信號傳導通路中基因表達狀態和/或磷酸化狀態差異的方法，它包括以下步驟(i)提供第一和第二組織/細胞系晶片，所述的晶片包括(a)一個基片；
(b)位於所述基片的一個主表面上的石蠟切片，所述切片的厚度為1-20微米，並且具有4-1000個點樣孔，所述的每個點樣孔中固定有一種組織/細胞，且切片上有2種以上的組織/細胞；且第一和第二組織/細胞系晶片上的石蠟切片為相鄰的連續切片；(ii)在第一組織/細胞系晶片上用與信號傳導相關的基因磷酸化蛋白的抗體進行免疫組化檢測分析，並且在第二組織/細胞系晶片上用與信號傳導相關的總蛋白的抗體進行免疫組化檢測分析；(iii)比較第一和第二組織/細胞系晶片之間的免疫組化檢測結果。
在一優選例中，所述的不同細胞是病理組織的細胞和正常細胞。更佳地所述的不同細胞是腫瘤細胞、癌旁組織的細胞以及正常細胞。
圖1顯示了本發明的癌組織-細胞系晶片。
圖2顯示了本發明的癌組織-細胞系晶片的免疫組化切片照片，其中從上至下分別為用HE染色的組織-細胞系晶片、用phospho-Akt-1抗體處理的組織-細胞系晶片、和用Akt1/2總蛋白抗體處理的組織-細胞系晶片。
圖3顯示了本發明的癌組織-細胞系晶片的檢測結果。
具體實施方式
本發明經過廣泛而深入的研究，開發了製備組織-細胞系晶片的新工藝，在此基礎上完成了本發明。
可用於本發明的組織/細胞沒有特別限制。代表性的例子包括正常細胞、腫瘤組織、癌旁組織、體外培養的細胞系、傳代細胞和/或原代細胞、體外培養的腫瘤細胞系、石蠟包埋的組織、石蠟包埋的細胞系。
用於本發明的基片沒有特別限制，可以選用基因晶片領域常用的各種基片，例如載玻片、塑料基片。較佳地，基片是透明的、無色的。選用塑料基片時，塑料應不受有機溶劑腐蝕。一種特別優選的基片是用聚-L-賴氨酸處理過的載玻片。
在本發明的晶片中，點樣孔的大小、間距和或點樣密度沒有特別限制。通常取決於所選用的細胞類型、石蠟類型以及穿刺針等因素。一般，所述點樣孔的大小是直徑為0.25-1.5毫米或更大，較佳地為0.3-1.0毫米。所述點樣孔之間的間距是0.25-5毫米或更大，較佳地為0.3-4毫米，更佳地為0.4-3毫米，按點樣孔中心之間的距離計。而所述的點樣孔密度是16-100點樣孔/平方釐米。
至於本發明晶片上的點樣孔的數目，通常為4-10000個點樣孔或更多。點樣孔的數目一方面取決於點樣密度，另一方面也取決於基片的大小。當點樣孔較多時，可以選用表面積較大的基片。
在本發明中，固定在所述點樣孔的組織/細胞種類沒有特別限制，通常為2種至1000種細胞類型或更多。一種優選的情況是正常細胞、腫瘤組織、癌旁組織、各種細胞系。
用於本發明晶片的石蠟晶片的厚度沒有特別限制，通常為1-20微米，較佳地為2-15微米，更佳地為3-10微米。
在本發明中所用的組織/細胞固定技術、石蠟包埋技術、以及切片技術沒有特別限制，可以選用本領域的常規技術。
優選製備組織/細胞系樣品的方法包括(1)對於正常組織，腫瘤組織和瘤周非腫瘤組織(癌旁組織)行常規固定和石蠟包埋，石蠟切片經HE染色後選擇欲製備組織晶片的部位，並在切片上標記備用；(2)對於細胞系，可用貼壁細胞經固定後用細胞刮子刮下後洗滌，再用2％瓊脂懸浮冷凝後將其切成小塊常規石蠟包埋(用於體外狀態的檢測)，(3)對於腫瘤細胞系，可用裸鼠皮下移植瘤組織常規石蠟包埋；在一種優選例中，選用硬度適中的空白石蠟塊[稱為「晶片石蠟塊」或「受體塊」(Recipient block)]，並按設計打陣列孔。例如打孔針外徑，即實際受體石蠟孔孔徑為0.6mm，橫向和縱向孔距為0.6-0.9mm。
然後，根據各供體塊的組織定位信息，用點陣儀供體穿刺針(例如，穿刺針內徑，即實際供體石蠟包埋組織外徑也為0.6mm)從石蠟母塊的定位處穿取組織，推入晶片石蠟塊的坐標定位孔(即點樣孔)中，依次進行直至將所有標本點成陣列。常規製作連續石蠟切片(例如，5μm厚切片)粘貼在聚-L-賴氨酸處理過的載玻片上。
本發明晶片的應用範圍包括用於觀察細胞信號傳導、細胞轉染、原位雜交、免疫細胞化學檢測、免疫螢光分析、原位PCR、篩選藥物或藥靶。尤其是用於篩選影響腫瘤組織和細胞系中細胞信號傳導通路改變的關鍵基因及其蛋白質，從而發現具有診斷、治療價值的新基因及可作為藥靶的新基因。
具體而言，本發明晶片可高通量地應用各種組織(正常組織、疾病組織如癌組織和癌旁組織)，各種細胞(正常細胞、原代細胞、傳代細胞及惡性腫瘤細胞)，用於不同方法如原位雜交(ISH)方法檢測各種基因在核酸水平的表達變化；用免疫組化(IHC)檢測各種基因表達產物(蛋白)的變化等；用免疫螢光(IF)技術進行基因的亞細胞定位。在一張組織-細胞系晶片上不僅用於檢測同種基因在各種組織中的表達差異；更重要的是檢測與分析同一基因的蛋白質(包括磷酸化蛋白和總蛋白)的變化狀況。
因此，本發明還提供了一種檢測觀察細胞信號傳導通路方法，其主要基於以下原理信號傳導過程中，蛋白質磷酸化普遍存在，如生長因子和細胞因子可使其相應受體磷酸化，而磷酸化的受體又可激活細胞質內蛋白激酶使之磷酸化；細胞周期進程中是由CDK的磷酸化和去磷酸化調節G1/S和G2/M的轉變；代謝過程中葡萄糖和糖原的互變及葡萄糖的運輸，也是由蛋白質磷酸化調節的。因此利用信號傳導分子的磷酸化抗體檢測疾病狀態下該細胞信號傳導分子的磷酸化程度，可以為研究疾病的發生機理提供重要線索。採用同時篩選大量信號傳導通路分子的磷酸化，再擇其磷酸化變化明顯者對該信號傳導分子的上遊調控基因或/和受該分子調控的下遊分子進行研究，或通過抑制該信號傳導分子的上遊調控分子來觀察其磷酸化狀態或活性的改變，這種新型研究方法將對疾病致病機理的研究甚或基因功能研究是一種可行和有效的研究手段。
本發明的檢測不同細胞間信號傳導通路中基因表達狀態和/或磷酸化狀態差異的方法，包括以下步驟(i)提供本發明的第一和第二組織/細胞系晶片，所述的晶片包括(a)一個基片；(b)位於所述基片的一個主表面上的石蠟切片，所述切片的厚度為1-20微米，並且具有4-1000個點樣孔，所述的每個點樣孔中固定有一種組織/細胞，且切片上有2種以上的組織/細胞；
且第一和第二組織/細胞系晶片上的石蠟切片為相鄰的連續切片；(ii)在第一組織/細胞系晶片上用與信號傳導相關的基因磷酸化蛋白的抗體進行免疫組化檢測分析，並且在第二組織/細胞系晶片上用與信號傳導相關的總蛋白的抗體進行免疫組化檢測分析；(iii)比較第一和第二組織/細胞系晶片之間的免疫組化檢測結果。
然後，根據檢測結果進行進一步的研究，例如(1)選擇發生改變的基因的信號通路上遊和下遊的基因，檢測其表達狀態和/或磷酸化狀態；(2)進行各種疾病組織(如各種腫瘤及相應正常組織)及各種癌細胞系不同通路的各種磷酸化和非磷酸化蛋白的對比檢測及其譜型；(3)觀察已知基因或新基因轉染細胞或轉基因動物組織中信號傳導的改變；(4)研究體內和體外化學藥物和生物藥物處理後細胞和組織中信號傳導的改變，進行藥靶篩選；(5)進行原位雜交檢測基因在mRNA水平的表達改變。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1Akt基因在正常肝組織、肝癌組織、癌旁肝組織及肝癌細胞系中的磷酸化狀態檢測1.材料和方法癌組織-細胞系晶片本研究採用的組織晶片由54對肝細胞癌和癌旁組織，9例意外死亡者正常肝組織和3株肝癌細胞系Hep3B，SMMC7721，BEL7402的裸鼠皮下移植瘤組織等組成(見表1和圖1)。
表1磷酸化Akt-1抗體免疫組化結果(組織-細胞系晶片) 日期2001.12.6
N細胞核 P細胞質 E內皮細胞 F成纖維細胞
2.結果Akt1磷酸化蛋白抗體及Akt1/2總蛋白抗體免疫組化結果(肝癌組織/細胞系晶片)為癌細胞中胞核內磷酸化Akt1呈異常強陽性，胞質內呈弱陽性；而癌旁肝和正常肝組織胞質和胞核均為中等程度的表達或低表達，SMMC7721，BEL7402和Hep3B只有核內高表達。癌旁肝組織中增生膽管上皮細胞核內也呈高表達。Akt1/2總蛋白在肝癌組織，癌旁肝和正常肝組織胞質均為高表達，胞核也呈陽性反應，但較胞質表達低；SMMC7721，BEL7402和Hep3B胞質和胞核內均為高表達(詳見表2和圖2)，圖3為圖2的部分和局部放大。
表2Akt1磷酸化蛋白抗體和Akt1/2總蛋白抗體免疫組化結果(肝癌組織/細胞系晶片)抗體 各種蛋白在組織中的陽性率(％)*結果說明名稱 肝癌組織 癌旁肝組織 正常肝組織 肝癌細胞系胞質 細胞核 胞質 細胞核 胞質 細胞核 胞質 細胞核 癌細胞中胞核內磷酸化+～ ++～ +～Akt1呈異常強陽性，胞質內±/- +～+++ ±/- +++ ±/- +++ ±/- +++弱陽性；而癌旁肝和正常肝磷酸化組織胞質和胞核均為中等程Akt-1度的陽性或弱陽性，(p-Akt1 90.6 90.6 100 100 100 100 100 100SMMC7721，BEL7402和(Ser473)) (48/53) (48/53) (54/54) (54/54) (9/9) (9/9) (3/3) (3/3)Hep3B只有核內高表達。癌旁肝組織中增生膽管上皮細胞核內也呈強陽性+～ +～ ++～ ++～Akt1/2總蛋白在肝癌組織，+++ ±/+ +～+++ + +++ + +++ +++癌旁肝和正常肝組織胞質均Akt-1 為強陽性，胞核呈弱陽性反總蛋白 100 100 100 100 100 100 100 100 應，較胞質陽性反應低；(Akt1/2) (53/53) (53/53) (54/54) (54/54) (9/9) (9/9) (3/3) (3/3) SMMC7721，BEL7402和Hep3B胞質和胞核內均為強陽性*免疫組化結果的判定主要依據各種腫瘤(癌旁和癌)組織中實質細胞的免疫化學反應結果(陽性細胞數和陽性細胞著色深淺)綜合判定的；具體標準是無陽性反應細胞，為「-」；陽性細胞數少於15％，為「+」；陽性細胞數約為15-25％，為「+」；陽性細胞數在25-50％，為「++」；在50-75％之間，為「+++」；大於75％，為 「++++」。表中陽性率以「+」以上計算。
實施例2Smad1基因在正常肝組織，肝癌組織，癌旁肝組織及肝癌細胞系中的磷酸化狀態檢測按實施例1中所述的方法，用Smad1磷酸化蛋白抗體和Smad1總蛋白抗體進行的免疫組織化學分析。
結果表明癌細胞中胞質內磷酸化Smad1呈弱陽性，陽性率為31.37％(16/51)，胞核內呈陰性；而癌旁肝和正常肝組織胞質均為中等程度的陽性反應，其陽性率均為100％(57/57；9/9)；SMMC7721，BEL7402和Hep3B胞質內均呈中等程度的陽性反應。
癌細胞中胞質內Smad1總蛋白呈弱陽性，陽性率為31.37％(16/51)，胞核也呈不同程度的陽性；而癌旁肝胞質內弱陽性率為100(54/54)，胞核內疑似陽性率為59.26％(32/54)；正常肝組織胞質和胞核均呈中等程度的陽性反應，其陽性率均為100％(9/9)；SMMC7721，BEL7402胞質胞核內均呈中等程度的陽性反應，Hep3B胞質陽性，胞核陰性(詳見表3)。
表3Smad1磷酸化蛋白抗體和Smad1總蛋白抗體免疫組化結果(肝癌組織/細胞系晶片)抗體 各種蛋白在組織中的陽性率(％)*結果說明名稱 肝癌組織 癌旁肝組織 正常肝組織 肝癌細胞系胞質 細胞 胞質 細胞 胞質 細胞 胞質 細胞 癌細胞中胞質內磷酸化Smad1核 核 核 核呈弱陽性，陽性率為+～ + +～ + ++～ + +～+++ ++++ +++ +++ +++ 31.37％(16/51)，胞核內呈陰性；而磷酸化癌旁肝和正常肝組織胞質均為中等31.37 0 100 0 100 0 100 0Smad1程度的陽性反應，其陽性率均為(16/51) (54/54) (9/9) (3/3)100％(57/57；9/9)SMMC7721，BEL7402和Hep3B胞質內均呈中等程度的陽性反應。
+～ +～++ +～++ ±/+ +～++ + ++～ +～++″癌細胞中胞質內Smad1總蛋白+++ +++呈弱陽性，陽性率31.37％(16/51)，31.37 11.32 100 59.26 100 100 100 66.67胞核也呈不同程度的陽性；而癌旁Smad1(16/51) (6/53) (54/54) (32/54) (9/9) (9/9) (3/3) (2/3) 肝胞質內弱陽性率為100(54/54)，胞總蛋白核內疑似陽性率為59.26％(32/54)；正常肝組織胞質和胞核均呈中等程度的陽性反應，其陽性率均為100％(9/9)；SMMC7721，BEL7402胞質胞核內均呈中等程度的陽性反應。
″*免疫組化結果的判定主要依據各種腫瘤(癌旁和癌)組織中實質細胞的免疫化學反應結果(陽性細胞數和陽性細胞著色深淺)綜合判定的；具體標準是無陽性反應細胞，為「-」；陽性細胞數少於15％，為「+」；陽性細胞數約為15-25％，為「+」；陽性細胞數在25-50％，為「++」；在50-75％之間，為「+++」；大於75％，為「++++」。表中陽性率以「+」以上計算。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求
書所限定的範圍。
權利要求
1.一種檢測不同細胞間信號傳導通路中基因表達狀態和/或磷酸化狀態差異的方法，其特徵在於，包括以下步驟(i)提供第一和第二組織/細胞系晶片，所述的晶片包括(a)一個基片；(b)位於所述基片的一個主表面上的石蠟切片，所述切片的厚度為1-20微米，並且具有4-1000個點樣孔，所述的每個點樣孔中固定有一種組織/細胞，且切片上有2種以上的組織/細胞；且第一和第二組織/細胞系晶片上的石蠟切片為相鄰的連續切片；(ii)在第一組織/細胞系晶片上用與信號傳導相關的基因磷酸化蛋白的抗體進行免疫組化檢測分析，並且在第二組織/細胞系晶片上用與信號傳導相關的總蛋白的抗體進行免疫組化檢測分析；(iii)比較第一和第二組織/細胞系晶片之間的免疫組化檢測結果。
2.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述點樣孔的大小是直徑為0.25-1.5毫米，且所述點樣孔之間的間距是0.25-5毫米，按點樣孔中心之間的距離計。
3.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述的點樣孔密度是16-100點樣孔/平方釐米。
4.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述的組織/細胞選自正常細胞、腫瘤組織、癌旁組織、體外培養的細胞系、傳代細胞和/或原代細胞、體外培養的腫瘤細胞系、石蠟包埋的組織、石蠟包埋的細胞系。
5.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述的基片選自載玻片和塑料基片。
6.如權利要求
1所述的方法，其特徵在於，所述的基片是用聚-L-賴氨酸處理過的載玻片。
專利摘要
本發明提供了一種高通量檢測與分析各種正常與疾病組織的細胞中信號傳導通路的組織與細胞晶片。所述晶片包括(a)一個基片；(b)位於所述基片的一個主表面上的石蠟切片，所述切片的厚度為1-20微米，並且具有4-1000個點樣孔，所述的每個點樣孔中固定有一種組織/細胞，且切片上有2種以上的組織/細胞。本發明還提供了所述晶片的製法和用途，尤其是用於檢測不同細胞間信號傳導通路中基因表達狀態和/或磷酸化狀態差異。
文檔編號C12Q1/02GKCN1193101SQ02111667
公開日2005年3月16日 申請日期2002年5月15日
發明者顧健人, 李錦軍 申請人:上海新世界基因技術開發有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan