控制昆蟲的組合物和方法

2023-06-18 06:12:56 3

專利名稱：控制昆蟲的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及與控制昆蟲有關的組合物，方法，細胞系和報告。
背景技術：
動物具有化學感受和機械感受系統，能夠識別多種環境刺激，產生行為反應。已進行了行為學研究以了解這些系統的遺傳學。嗅覺系統在一些物種，包括昆蟲的生存和生活中具有重要的作用。
果蠅是研究感覺系統的一種模式生物，這是由於它能夠通過分子技術進行突變分析，進行行為學分析和電生理學分析，並且它的嗅覺系統與哺乳動物的對應系統相當。
數年來已經研究了各種化學藥物或混和劑的殺蟲活性，其目的是得到一種對無脊椎動物例如昆蟲具有選擇性，但是對脊椎動物如哺乳動物、魚、家禽和其它物種幾乎沒有或完全沒有毒性，並且另外在環境中不存留也不破壞環境的產品。
大部分具有足夠的殺蟲活性的已知的和商業化的產品對於不是該產品的靶的哺乳動物、魚、家禽或其它物種都具有毒性或有害作用。例如有機磷化合物和氨基甲酸酯在昆蟲以及所有種類的動物中都可抑制乙醯膽鹼酯酶的活性。殺蟲脒和相關的甲脒已知可作用於昆蟲的章魚胺受體，但是由於它們使脊椎動物有心臟中毒的可能，對動物具有致癌性並且對不同的昆蟲作用不同，因而已撤出市場。其它對哺乳動物和其它非靶定物種具有較小毒性的化合物往往難以鑑別。
發明概述本發明包括控制昆蟲的組合物以及使用這些組合物的方法。本發明包括控制昆蟲的組合物，其包括一種或多種植物香精油，以及使用這些組合物的方法。所述植物香精油當組合使用的時候具有協同效果。所述組合物可以包括不揮發性油，其是一種非揮發性的沒有香味的植物性油。此外，這些組合物可由一般認為安全的(GRAS)化合物組成。
本發明包括含有一種或多種植物香精油和昆蟲控制試劑的組合物，以及使用這些組合物的方法。昆蟲控制試劑的實例包括DEET和D-丙烯除蟲菊酯。所述植物香精油和所述昆蟲控制試劑組合使用的時候具有協同效果。例如，29％DEET的昆蟲控制效果在本發明的組合物中用5％的DEET就可以獲得。
本發明包括篩選具有昆蟲控制活性的組合物的方法。本發明包括用酪胺受體(TyrR)，Or83b嗅覺受體(Or83b)，或Or43a嗅覺受體穩定轉染的細胞系，其可用於篩選具有昆蟲控制活性的組合物。
本發明包括產生鑑別一種或多種具有昆蟲控制活性的組合物的報告的方法。術語「報告」指存在於列印的文件，資料庫，計算機系統或其它介質中的記錄或說明。
為簡單起見，本申請將通篇使用術語「昆蟲」；但是，應當理解術語「昆蟲」不僅指昆蟲，還指蜘蛛綱動物，幼蟲以及類似的無脊椎動物。而且為本申請的目的，術語「昆蟲控制」是指具有驅除效果，殺蟲效果或者同時具有兩個效果。「驅除效果」是指這樣的效果，其中與沒有用所述組合物處理過的對照宿主或區域相比，有更多的昆蟲被排除在用所述組合物處理過的宿主和區域之外。在一些實施方案中，驅除效果是指這樣的效果，其中至少有大約75％的昆蟲被排除在用所述組合物處理過的宿主和區域之外。在一些實施方案中，驅除效果是指這樣的效果，其中至少有大約90％的昆蟲被排除在用所述組合物處理過的宿主和區域之外。「殺蟲效果」是指這樣的效果，其中用組合物處理導致至少大約1％的昆蟲死亡。在這一點上，LC1到LC100(致死濃度)或LD1到LD100(致死劑量)的組合物可引起殺蟲效果。
在一些實施方案中，所述殺蟲效果是這樣的效果，其中用組合物處理導致至少大約5％的暴露的昆蟲死亡。在一些實施方案中，所述殺蟲效果是這樣的效果，其中用組合物處理導致至少大約10％的暴露的昆蟲死亡。在一些實施方案中，所述殺蟲效果是這樣的效果，其中用組合物處理導致至少大約25％的昆蟲死亡。在一些實施方案中所述殺蟲效果是這樣的效果，其中用組合物處理導致至少大約50％的暴露的昆蟲死亡。在一些實施方案中所述殺蟲效果是這樣的效果，其中用組合物處理導致至少大約75％的暴露的昆蟲死亡。在一些實施方案中所述殺蟲效果是這樣的效果，其中用組合物處理導致至少大約90％的暴露的昆蟲死亡。在本發明的一些實施方案中，用這種濃度或劑量處理可以將昆蟲在數秒到數分鐘之間擊倒。
本發明的組合物可用於控制昆蟲，或者直接處理宿主，或者處理宿主所位於的區域，例如室內的生活空間，室外的院子或花園。為本申請的目的，宿主定義為植物，人或其它動物。
附圖簡述

圖1顯示了用酪胺受體轉染的Schneider細胞的受體特異性結合；圖2顯示了用能表達酪胺受體的Schneider細胞製備的膜在存在或不存在未標記的酪胺的條件下與不同濃度的3H-酪胺培育之後的3H-酪胺飽和結合曲線；圖3顯示了用能表達酪胺受體的Schneider細胞製備的膜在存在或不存在不同濃度的未標記的酪胺的條件下與3H-酪胺培育之後的3H-酪胺抑制結合曲線；圖4顯示了用能表達酪胺受體的Schneider細胞製備的膜在存在或不存在不同濃度的未標記的配體酪胺(TA)，章魚胺(OA)，多巴胺(DA)，和血清胺(SE)的條件下的3H-酪胺抑制結合曲線；圖5顯示了用能表達酪胺受體的Schneider細胞製備的膜在存在或不存在不同濃度的公丁香油(LFO)和黑籽油(BSO)的條件下與3H-酪胺培育之後的3H-酪胺抑制結合曲線；圖6顯示了用能表達酪胺受體的Schneider細胞製備的膜在存在或不存在LFO或BSO的條件下或與不同濃度的未標記的酪胺(TA)的條件下與3H-酪胺培育之後，3H-酪胺(3H-TA)與所述膜的抑制結合；
圖7顯示了在存在或不存在forskolin和酪胺的條件下表達酪胺受體的Schneider細胞中cAMP水平依賴於酪胺的變化；圖8顯示了在存在或不存在forskolin和酪胺的條件下用公丁香油和黑籽油處理的能表達酪胺受體的Schneider細胞中cAMP水平依賴於酪胺的變化；圖9顯示了在存在或不存在酪胺，公丁香油和黑籽油的條件下用forskolin處理的能表達酪胺受體的Schneider細胞中cAMP水平依賴於酪胺的變化；圖10顯示了3H-酪胺與用能表達Or83b受體的Schneider細胞製備的膜的飽和結合曲線；圖11顯示了3H-酪胺與用能表達Or43a受體的Schneider細胞製備的膜的飽和結合曲線；圖12顯示了在能表達Or83b受體的Schneider細胞中cAMP水平依賴於forskolin的變化；圖13顯示了在能表達Or83b受體的Schneider細胞中胞內Ca2+水平依賴於ionomycin的變化；圖14顯示了在能表達Or43a受體的Schneider細胞中胞內Ca2+水平依賴於ionomycin的變化；圖15顯示了在對照Schneider細胞，能表達Or83b受體的Schneider細胞，和能表達Or43a受體的Schneider細胞中胞內Ca2+水平依賴於酪胺的變化；
圖16顯示了在能表達嗅覺受體的Schneider細胞與3H-酪胺培育之後其中各種植物香精油，包括，LFO，胡椒醛，酞酸二乙酯，和α-松油醇與Or83b和Or43a受體之間的相互作用；圖17顯示了在能表達嗅覺受體的Schneider細胞與3H-酪胺培育之後其中各種植物香精油，包括，BSO，奎寧，檜萜，α-側柏酮，α-松萜，d-檸檬烯，和p-百裡香素與Or43a受體之間的相互作用；圖18顯示了在能表達嗅覺受體的Schneider細胞與3H-酪胺培育之後其中各種植物香精油，包括，BSO，奎寧，檜萜，α-側柏酮，α-松萜，d-檸檬烯，和p-百裡香素與Or83b受體之間的相互作用；圖19顯示了在能表達嗅覺受體的Schneider細胞與3H-酪胺培育之後其中各種植物香精油，包括，香葉醇，鄰氨基苯甲酸沉香酯，苯乙醛，沉香醇，α-松油醇，t-茴香腦，松油烯900，菩提醇，和丁香酚與Or83b和Or43a受體之間的相互作用；圖20顯示了在能表達嗅覺受體的Schneider細胞與3H-酪胺培育之後其中各種植物香精油，包括，百裡香油，香芹酚，和百裡酚與Or83b和Or43a受體之間的相互作用；圖21顯示了在能表達嗅覺受體的Schneider細胞與3H-酪胺培育之後其中各種植物香精油，包括，胡椒醛，胡椒醇，醋酸胡椒酯，和胡椒胺與Or83b和Or43a受體之間的相互作用；圖22顯示了在能表達Or43a受體的Schneider細胞中ionomycin，酪胺，和鄰氨基苯甲酸沉香酯對於胞內Ca2+水平的效果；
圖23顯示了在能表達Or43a受體的Schneider細胞中沉香醇，紫蘇子醇，t-茴香腦，香葉醇，苯乙醛和丁香酚對於胞內Ca2+水平的效果；圖24顯示了在能表達Or43a受體的Schneider細胞中胡椒醇，醋酸胡椒酯，和胡椒胺對於胞內Ca2+水平的效果；圖25顯示了在能表達Or43a受體的Schneider細胞中α-松油醇，菩提醇，和松油烯900對於胞內Ca2+水平的效果；圖26顯示了在能表達Or43a受體的Schneider細胞中百裡香油，百裡酚，和香芹酚對於胞內Ca2+水平的效果；圖27顯示了在能表達Or43a受體或Or83b受體的Schneider細胞中LFO對於胞內Ca2+水平的效果；圖28顯示了在能表達Or43a受體或Or83b受體的Schneider細胞中BSO，α-松萜，p-百裡香素，d-檸檬烯，檜萜，奎寧，l-香芹酮，d-香芹酮，和α-側柏酮對於胞內Ca2+水平的效果；圖29顯示了在存在或不存在酪胺，LFO和BSO的條件下在能表達Or83b受體的Schneider細胞中cAMP水平依賴於酪胺的變化；圖30顯示了在存在或不存在酪胺和forskolin的條件下在用LFO和BSO處理的能表達Or83b受體的Schneider細胞中cAMP水平依賴於酪胺的變化；圖31A和31B顯示了酪胺受體的核苷酸序列和肽序列；
圖32A和32B顯示了Or43a嗅覺受體的核苷酸序列和肽序列；以及圖33A和33B顯示了Or83b嗅覺受體的核苷酸序列和肽序列發明詳述本發明涉及與控制昆蟲有關的組合物，方法，細胞系和報告。所述昆蟲的控制與一種或多種受體有關，包括酪胺受體(TyrR)，Or83b嗅覺受體(Or83b)，和Or43a嗅覺受體(Or43a)。
本發明包括篩選具有昆蟲控制活性的組合物的方法。本發明包括被TyrR，Or43a，或Or83b穩定轉染的果蠅Schneider細胞系，其可用於篩選具有昆蟲控制活性的組合物。TyrR的核酸序列和肽序列如圖31A和圖31B所示。Or43a的核酸序列和肽序列如圖32A和圖32B所示。Or83b的核酸序列和肽序列如圖33A和圖33B所示。
可以通過檢測表達TyrR，Or83b，和/或Or43a的細胞系中檢測組合物與各受體的親和力鑑別可能存在的昆蟲控制活性。也可通過檢測用檢測組合物處理後的表達TyrR，Or83b，和/或Or43a的細胞系中胞內cAMP和/或Ca2+來鑑別可能存在的昆蟲控制活性。不同的昆蟲物種的TyrR受體，Or83b受體和Or43a受體之間具有相似性。同樣地，表達這些受體的果蠅Schneider細胞系可用於篩選對不同的昆蟲物種具有昆蟲控制活性的組合物。
本發明包括控制昆蟲的組合物以及使用這些組合物的方法。本發明包括控制昆蟲的組合物，其包括一種或多種植物香精油，以及使用這些組合物的方法。植物香精油組合使用的時候具有協同效果。本發明的組合物可以包括下述油中的任何一種，或其混合物t-anthole白檸檬油 胡椒基黑籽油(BSO) d-檸檬烯 醋酸胡椒酯莰烯 鄰氨基苯甲酸鹽沉香酯胡椒醇香芹酚 沉香醇胡椒胺d-香芹酮 lindenol 苯醌l-香芹酮 檸檬酸甲酯檜萜1，8-桉樹腦 二氫茉莉酮酸甲酯 α-松油烯p-百裡香素 香葉烯松油烯900酞酸二乙酯 紫蘇子醇 α-松油醇丁香酚 苯乙醛γ-松油醇香葉醇 α-松萜 2-叔丁基-p-苯醌枸櫞酸異丙酯 β-松萜 α-側柏酮檸檬草油 胡椒醛百裡香油公丁香油(LFO) 麝香草酚本發明的組合物還可以包括下述油中的任何一種，或其混合物烯丙基硫β-欖香烯 水楊酸孟酯烯丙基三硫 γ-欖香烯 桃金孃烯醛烯丙基二硫 Elmol 乙酸橙花醛二甲酯茴香腦 草蒿腦 橙花叔醇乙酸蒿醇酯 2-乙基-2-己烯-1-醇 壬酮乙酸苄酯 丁香酚乙酸酯1-辛醇苯甲醇 α-法呢烯 E羅勒烯酮香檸檬烯 (Z，E)-β-法呢烯Z羅勒烯酮氧化紅沒藥烯 葑酮羅勒烯α-紅沒藥醇 呋喃二烯呋喃桉葉-1，乙酸辛酯氧化紅沒藥醇 3-二烯 薄荷油氧化紅沒藥醇β 呋喃桉葉-1，4-二烯 α-水芹烯醋酸冰片酯 呋喃大牻牛兒1，10(1 β-水芹烯β-波旁老鸛草烯 5)-二烯-6-酮胡椒醛α-杜松醇呋喃倍半萜烯 Prenal莰烯 香葉醇 胡薄荷酮α-龍腦烯乙酸香葉醇酯 檜萜α-龍腦烯乙醛大根香葉烯D 乙酸檜酯樟腦 大根香葉烯B α-檀香萜氧化丁香烯 α-古香油烯 檀香腦母菊蘭烯 α-蛇麻烯Sativen肉桂醛 α-紫羅蘭酮 δ-蛇床烯順馬鞭烯醇 β-紫羅蘭酮 β-sesquphelandrene檸檬醛A 異冰片 斯巴醇檸檬醛B 異呋喃大根香葉烯 萬壽菊酮香茅醛 異薄荷酮 α-松油烯香茅醇 異胡薄荷酮 4-松油醇乙酸香茅酯 茉莉酮α-異松油烯甲酸香茅酯 公丁香油 α-乙酸松油酯α-古巴烯 檸檬烯α-側柏烯野薄荷油 沉香醇百裡酚甲醚α-廣木香醇乙酸沉香酯反丁香烯隱酮 香樟烯松香芹醇莪朮酮 甲基烯丙基三硫化物反馬鞭草烯醇d-香芹酮 薄荷醇馬鞭草烯酮l-香芹酮 2-甲氧基呋喃二烯 Yomogi醇印蒿酮 薄荷酮姜烯二烯丙基三硫醚 乙酸孟酯 Dihydrotagentone二氫焦莪朮酮 肉桂酸甲酯在那些含有多於一種油的組合物中，每種油按重量計構成所述組合物混合物的大約1％到大約99％。例如，本發明的一種組合物包括大約1％的百裡酚和大約99％的香葉醇。任選地，所述組合物還可以含有不揮發性油，其是非揮發性的沒有香味的植物性油。例如，所述組合物可以包括一種或多種下述不揮發性油蓖麻油 礦物油紅花油玉米油 橄欖油芝麻油枯茗油 花生油大豆油例如，本發明的一種組合物包括大約1％的百裡酚，大約50％的香葉醇和大約49％的礦物油。另外，這些組合物可由一般認為安全的(GRAS)化合物組成，例如百裡香油，香葉醇，檸檬草油，公丁香油，黑籽油，白檸檬油，丁香酚，蓖麻油，礦物油，和紅花油。
本發明包括的組合物含有一種或多種植物香精油和昆蟲控制試劑，例如，DEET，和D-alletlirin，以及使用這些組合物的方法。所述植物香精油和所述昆蟲控制試劑組合使用的時候具有協同效果。例如，29％DEET的昆蟲控制效果在本發明的組合物中用5％的DEET就可以獲得。
本發明的組合物可以含有兩種或多種植物香精油化合物和/或其衍生物，天然的和/或合成的，包括其外消旋混合物，對映異構體，非對映異構體，水合物，鹽，溶劑化物和代謝物，並且它們與適當的載體和任選的適當的表面活性劑混和在一起。
適當的載體可以包括本領域公知的適用於植物香精油的任何載體，只要該載體對本發明的組合物沒有不良影響。這裡所用的術語「載體」是指惰性或液體物質，其可以是無機物或有機物，合成的或天然的，它與活性化合物相混和或者它被製成適用於容器或硬紙盒或其它要處理的物體的形式，或者適於儲存、運輸和/或操作的形式。一般而言，通常用於製備驅除劑，殺蟲劑，除草劑或殺真菌劑的任何物質都是合適的。本發明的組合物可以單獨使用，或者與固體和/或液體分散劑載體和/或其它已知的合適的活性試劑例如其它驅除劑、殺蟲劑、或殺蟎劑、殺線蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑、滅鼠劑、除草劑、肥料、生長調節劑混和使用，如果需要，也可以製成特定應用的特定製劑，例如製成溶液、乳劑、懸液、粉末、膏劑、和顆粒以備用。本發明的組合物可以與傳統的惰性殺蟲劑稀釋劑或傳統昆蟲控制試劑中使用的稀釋劑混和使用，例如傳統的分散載體如氣體、溶液、乳劑、懸液、濃縮乳劑、噴霧粉、膏劑、可溶性粉末、隔離劑、顆粒、泡沫、膏劑、片劑、氣溶膠、充滿活性化合物的天然和合成物質、微膠囊、用在種子上的包覆組合物，以及燃燒用製劑，例如燻蒸盒，燻蒸罐和燻蒸盤，以及ULV冷霧和暖霧製劑。
本發明的組合物進一步可以包括表面活性試劑。可用於本發明的表面活性試劑，即傳統的載體助劑的實例包括乳化試劑，例如非離子和/或陰離子乳化試劑(例如脂肪酸的聚環氧乙烷酯，脂肪醇的聚環氧乙烷醚，烷基硫酸鹽，烷基磺酸鹽，芳基磺酸鹽，清蛋白水解物等，特別是烷基芳基聚乙二醇醚，硬脂酸鎂，油酸鈉等)；和/或分散試劑例如木質素，亞硫酸鹽廢液，甲基纖維素等。
本發明的組合物可用於控制昆蟲，可以直接用於處理宿主，或者用於處理宿主所在的區域。例如。可以直接用霜劑或噴霧處理宿主，可以外用或局部用於例如人的皮膚。組合物應用於宿主，例如人的時候，可以製成多種個人產品或化妝品以用於皮膚或頭髮上。例如，可以用下述物質香水，著色劑，色素，染料，古龍水，護膚霜，潤膚液，除臭劑，滑石粉，沐浴油，肥皂，洗髮劑，護髮素以及定型劑。
對於動物，人或非人的宿主，也可以通過口服遞送組合物製劑直接進行治療。例如，組合物可以包裹在液體膠囊中吞咽。
可以用本發明的組合物處理某個區域，例如，通過噴霧劑，例如氣溶膠或泵送噴霧劑，或者燃燒劑，例如蠟燭或含有所述組合物的薰香。當然，可以使用不同的處理方法而不會背離本發明的精神和範圍。例如，組合物可以含於家用產品中，例如空氣清新劑(包括「加熱的」空氣清新劑，其中驅昆蟲劑通過加熱，例如電加熱，或燃燒而釋放)；硬表面清潔劑；或洗衣用品(例如含有組合物的洗衣劑，調節劑)。
本發明通過下述特定的但非限制性的實施例作進一步舉例說明。雖然在實施例中包括數值，結果和/或數據，但下述實施例都是預言性的。實施例1到5涉及能表達酪胺受體(TyrR)的細胞系的製備以及用該細胞系對組合物的篩選。實施例6到11涉及能表達Or83b受體的細胞系的製備，能表達Or43a受體的細胞系的製備，以及用這些細胞系對組合物的篩選。實施例l2到34涉及確定組合物的驅除效果和/或殺蟲效果。
實施例1用酪胺受體(TyrR)穩定轉染的Schneider細胞系的製備A.黑腹果蠅酪胺受體的PCR擴增和亞克隆從得自the Berkeley Drosophila Genome Project(Baumann，A.，1999，Drosophila melanogaster mRNA for octopamine receptor，splice variant 1B NCBI direct submission，AccessionAJ007617)的黑腹果蠅的頭cDNA噬菌體文庫GH中擴增酪胺受體。TyrR的核酸序列和肽序列如圖31A和31B所示。從該文庫的液體培養溶解產物中純化噬菌體DNA。(Baxter，et al.，1999，Insect Biochem Mol Biol 29，461-467)。用於擴增果蠅酪胺受體(TyrR)的開放閱讀框架(Han，et al.，1998，J Neurosci 18，3650-3658；von Nickisch-Rosenegk，et al.，1996.Insect BiochemMol Biol 26，817-827)的寡核苷酸為5′寡核苷酸5′gccgaattcgccaccATGCCATCGGCAGATCAGATCCTG 3′和3′寡核苷酸5′taatctagaTCAATTCAGGCCCAGAAGTCGCTTG 3′。大寫字母表示與酪胺受體匹配。下劃線的核苷酸表示加入的Kozak序列(Grosmaitre，X.，Jacquin-Joly，E.，2001 Mamestra brassicae putative octopamine receptor(OAR)mRNA，complete cds.NCBI direct submission，Accession AF43878)。5′寡核苷酸還包括一個EcoR I位點，3′寡核苷酸包括一個Xba I位點。用Vent聚合酶(New England Biolabs)在下述條件下進行PCR大約95℃，大約5分鐘進行大約1個循環；大約95℃，大約30秒；大約70℃，大約90秒進行大約40個循環；大約70℃，大約10分鐘進行大約1個循環。
將PCR產物用EcoR I和Xba I消化，亞克隆到pCDNA 3(Invitrogen)中，通過自動DNA測序(Vanderbilt Cancer Center)對兩條鏈進行測序。由此開放閱讀框架翻譯的蛋白質能夠正確匹配已經公開的酪胺受體序列(Saudou，et al.，The EMBOJournal vol 9 nol，6-617)。為了在果蠅Schneider細胞中表達，將此TyrR ORF從CDNA3切割出來，通過Eco RI和Xba I限制性位點插入到pAC5.1/V5-His(B)[pAc5(B)]中。
為了轉染，將果蠅Schneider細胞用pAc5(B)-TyrR ORF通過如Invitrogen的果蠅表達系統(DES)的操作手冊所述的磷酸鈣-DNA共沉澱方法穩定轉染。共沉澱方法對於暫時或穩定轉染都是一樣的，除了穩定轉染時要使用有抗生素抗性的質粒。從中選擇出至少十個穩定轉染細胞的克隆並單獨繁殖。用3H-酪胺進行全細胞結合/吸收以選擇出表達所述受體的穩定克隆。在此檢測中，將細胞洗滌並收集在昆蟲鹽水(170mM NaCl，6mMKCl，2mM NaHCO3，17mM葡萄糖，6mM NaH2PO4，2mM CaCl2，和4mM MgCl2)中。將大約1mL昆蟲鹽水中的大約3百萬個細胞與4nM3H-酪胺在23℃共培育大約5分鐘。將細胞離心大約30秒，吸去結合溶液。將細胞沉澱用大約500μL昆蟲鹽水洗滌，將細胞重懸並轉至閃爍液中。反應中包含50μM未標記的酪胺以確定非特異性結合。用液體閃爍β-計數器(Beckman，Model LS1801)對結合進行放射性定量計數。
B.選擇具有最高水平的功能活性酪胺受體蛋白的克隆進行酪胺受體結合/吸收以確定轉柒的克隆中哪個具有最高水平的功能活性酪胺受體蛋白。用大約10個營養繁殖系進行酪胺受體實驗，用大約2個pAc(B)作為對照。用3H-酪胺(大約4nM/反應)作為示蹤劑，其中含有或不含50μM未標記的酪胺作為特異性競爭劑。在此檢測中，在平皿上培養細胞，並收集在大約3ml介質中進行細胞計數，調整細胞數目至大約3×106個細胞/ml。同時使用大約兩個pAcB克隆作為對照。每個反應中使用大約1ml細胞懸液。在特異性結合中，有大約3個克隆表達高水平的活性酪胺受體蛋白。選取具有最高的特異性酪胺受體結合的克隆進行進一步研究。使選取的克隆增殖並貯存在液氮中。培養選取的克隆的等分試樣以進行全細胞結合，並製備質膜以進行動力學和篩選研究。對照pAcB與酪胺受體沒有任何特異性結合。
C.用酪胺受體轉染的Schneider細胞用於篩選能和酪胺受體相互作用的組合物的功效在多孔板上的每個孔內培養用酪胺受體(大約1×106個細胞/ml)轉染的細胞。接種細胞後大約24小時，除去培養基，代之以大約1ml昆蟲鹽水(大約23℃)。加入不同濃度的3H-酪胺(大約0.1-10nM)，其中含有或不含10μM未標記的酪胺，並在室溫(RT)培育。培育大約20分鐘後，快速吸去鹽水以終止反應，用大約2ml昆蟲鹽水(大約23℃)洗滌至少一次。在RT下將細胞溶解在大約300ml 0.3M的NaOH中大約20分鐘。將溶解的細胞轉至大約4ml液體閃爍溶液(Liquid Scintillation Solution)(LSS)中，劇烈旋轉大約30秒，然後用液體閃爍β-計數器(Beckman，Model LS1801)(LSC)進行放射性計數。
參照圖1，受體特異性結合數據表示為每1×106個細胞特異性結合的fmol量，並測定為3H-酪胺濃度的函數。缺乏10μM未標記的酪胺的條件下的值與存在10μM未標記的酪胺的條件下的值之間的差值即為特異性結合值。如圖1所示，在大約5nM3H-酪胺下具有最大特異性結合。未轉染的細胞即使在酪胺濃度高達大約100μM的時候也沒有反應。
為了研究用pAcB-TyrR穩定轉染的細胞中酪胺受體的動力學，從轉染的細胞製備膜組分的粗提物，用於計算平衡解離常數(Kd)，最大結合能力(Bmax)，平衡抑制解離常數(Ki)和EC50(對結合有50％的抑制的有效濃度)。進行初步的研究以確定具有受體結合活性的最佳膜蛋白濃度。在此研究中，不同濃度的蛋白(大約10-50μg/反應)在大約1ml結合緩衝液(50mM Tris，pH7.4，5mM MgCl2和2mM抗壞血酸)中培育。加入大約5nM3H-酪胺以起始反應，其中含有或不含大約10μM未標記的酪胺。在室溫培育大約1小時後，通過GF/C過濾器(VWR)過濾以終止反應，過濾器事先浸泡在大約0.3％的聚乙烯亞胺(PEI)中。用大約4ml冰冷卻的Tris緩衝液洗滌過濾器一次，在用LSC測量殘留的放射活性之前將其風乾。用曲線擬合(GraphPad軟體，Prism)分析結合數據。數據證明在酪胺受體的特異性結合上，大約10，20，30和50μg蛋白/反應之間沒有差異。因此，使用大約10μg蛋白/反應。
為了測定表達WyrR的膜上酪胺受體(TyrR)的Bmax和Kd值，進行飽和結合試驗。簡短來講，將大約10μg蛋白與不同濃度(大約0.2-20nM)的3H-酪胺一起培育。用曲線擬合(GraphPad軟體，Prism)分析結合數據，確定酪胺與其受體結合的Kd。
為了確定幾種配體對TyrR的親和力，檢測了幾種化合物在濃度漸增時對大約2nM3H-酪胺結合的抑制的能力。對於飽和和抑制檢測，分別在不存在和存在大約10μM未標記的酪胺的條件下確定總的結合和非特異性結合。受體結合反應是在限光條件下在室溫(RT)培育1個小時。通過GF/C過濾器(VWR)過濾以終止反應，在用LSC測量殘留的放射活性之前將其風乾。用曲線擬合(GraphPad軟體，Prism)分析結合數據。
參照圖2，其中顯示了3H-酪胺(3H-TA)與從表達酪胺受體的Schneider細胞製備的膜的飽和結合曲線，3H-酪胺對用pAcB-TyrR穩定轉染的細胞中的酪胺受體具有高的親和力，測定的Kd大約是1.257nM，測定的Bmax大約是0.679pmol/mg蛋白。
參照圖3，其中顯示了3H-酪胺(3H-TA)與從表達酪胺受體的Schneider細胞製備的膜在存在或不存在不同濃度的未標記的酪胺(TA)的條件下的抑制結合，酪胺對表達酪胺受體的Schneider細胞中的酪胺受體的EC50和Ki分別是大約0.331μM和0.127μM。
為了確定酪胺受體(TyrR)的藥理學模式，檢測了許多可能的神經遞質代替表達酪胺受體的膜結合3H-酪胺(3H-TA)的能力。參照圖4，其中顯示了3H-酪胺與從表達酪胺受體的Schneider細胞製備的膜在存在或不存在不同濃度的未標記的配體(包括酪胺(TA)，章魚胺(OA)，多巴胺(DA)，和血清胺(SE))的條件下的抑制結合。酪胺對果蠅TyR表現出最高的親和力(Ki是大約0.127μM，EC50是大約0.305μM)。章魚胺，多巴胺和血清胺在代替3H-酪胺結合上不如酪胺有效。
參照表A，列出了配體的Ki和EC50，其按能力排次序為酪胺＞章魚胺＞多巴胺＞血清胺，這表明很可能穩定轉染的Schneider細胞表達具有功能活性的酪胺受體。
同樣地，表達酪胺受體的Schneider細胞可有效作為研究和篩選能和酪胺受體相互作用的組合物的模型。
實施例2表達酪胺受體的細胞的處理以及組合物對於胞內[cAMP]的效果細胞在平皿上培養，在處理前一天更換培養基。當細胞達到近似95％匯合的時候，吸去培養基，用5ml大約27℃的昆蟲鹽水(170mM NaCl，6.0mM KCl，2.0mM NaHCO3，17.0mM葡萄糖，6.0mM NaH2PO4，2.0mM CaCl2，4.0mM MgCl2；pH7.0)洗滌細胞一次。加入大約20ml昆蟲鹽水，輕刮收集細胞。用血細胞計數器對細胞的等分試樣進行計數，然後將細胞1000RPM離心大約5分鐘。將細胞重懸為3×106個細胞/ml。加入IBMX使之濃度為大約200μM。然後分出大約1ml細胞懸液進行處理。加入Forskolin(cAMP誘導試劑)，酪胺或不同的候選組合物，將細胞在大約27℃培育大約10分鐘。
將處理的細胞在大約13000g離心大約10秒。吸去溶液，加入大約1ml大約-20℃的70％的乙醇。旋轉打碎細胞沉澱，將樣品置於-20℃過夜。用乙醇抽提後，在大約13000g離心大約5分鐘以沉澱細胞碎片。將上清轉至試管中，用旋轉乾燥儀冷凍乾燥。將得到的提取物重懸於大約100μl TE中，用於cAMP檢測。
cAMP檢測是基於內源cAMP和3H-cAMP對cAMP結合蛋白的競爭性結合。用3H-cAMP Biotrak系統(Amersham Biosciences)進行該檢測，根據製造商的說明操作。簡短來講，將大約50μl細胞提取物與大約50μl3H-cAMP和大約100μl cAMP結合蛋白冰浴培育大約2-4小時。然後加入活性炭(大約100μl)，將溶液在大約4℃離心大約3分鐘。取大約200μl反應混合物，用閃爍計數測定3H-cAMP的水平。用大約每反應0到16pmol的冷cAMP的標準曲線計算細胞中內源cAMP的水平。
實施例3表達酪胺受體的細胞的處理以及組合物對於胞內[Ca2+]的效果用螢光指示劑呋喃-2的乙醯氧基甲基(AM)酯測定胞內鈣離子濃度([Ca2+]i)(Enan，et al.，Biochem.Pharmacol vol 51，447-454)。在此研究中，在標準條件下培養能表達酪胺的細胞。周檢測緩衝液(140mM NaCl，10mM HEPES，10mM葡萄糖，5mM KCl，1mM CaCl2，1mM MgCl2)製備細胞懸液，調整細胞數目至每ml大約2×106個細胞。簡短來說，將大約1.0ml懸液(大約2×106個細胞)與5μM呋喃2/AM在大約28℃一起培育大約30分鐘。培育後，室溫3700rpm離心大約10秒以沉澱細胞，然後重懸於大約1.5ml檢測緩衝液中。在存在或不存在檢測的化合藥品的條件下用螢光分光光度計分析[Ca2+]i的變化。激發波長為大約340nm(由結合Ca2+的呋喃-2產生)和大約380nm(相應於不含Ca2+的呋喃-2)。監測大約510nm的發射波長的螢光密度。使用任何化合物的時候都沒有觀察到任何人工的螢光吸收。計算大約340/380nm的比值，並繪製成時間的函數。
實施例4在表達酪胺量體的細胞中公丁香油和黑籽油對於酪胺受體結合活性的效果為了確定特定的油，即，公丁香油(LFO)和黑籽油(BSO)是否能與酪胺受體相互作用以及是否能調節酪胺受體的功能性表達，用從穩定轉染和未轉染的Schneider細胞製備的膜分析3H-酪胺的結合。
對於在受體部位上與3H-酪胺的結合，使用上述的結合實驗方案。進行了LFO和BSO(大約1-100μg/ml)的劑量反應實驗以確定它們對於3H-酪胺與從能表達酪胺受體的Schneider細胞製備的膜的抑制結合的效果。參照圖5，其中顯示了3H-酪胺用用能表達酪胺受體的Schneider細胞製備的膜在存在或不存在不同濃度的LFO和BSO的條件下的抑制結合，證明了用LFO和BSO處理以劑量依賴的方式導致3H-酪胺與其受體的抑制。LFO和BSO的EC50值分別接近10μg/ml和20μg/ml。
現在看圖6，其中顯示了3H-酪胺與用能表達酪胺受體的Schneider細胞製備的膜在存在或不存在LFO或BSO的或與大約1和10μM未標記的酪胺一起的條件下的抑制結合，LFO(大約25μg/ml)單獨即可抑制3H-酪胺與其受體的結合。這種效果對於大約10μM(大約1.74μg/ml)的未標記的酪胺的作用並不確定。除此之外，只有當使用的未標記的酪胺的濃度為大約1μM的時候，LFO才增強了未標記的酪胺抑制3H-酪胺結合的能力。從另一方面來講，BSO(大約25μg/ml)抑制3H-酪胺結合的能力比LFO差。但是不管未標記的酪胺的濃度是多少，BSO都能顯著增加未標記的酪胺抑制3H-酪胺結合的能力。這兩種油對於未轉染的Schneider細胞中的3H-酪胺結合沒有任何效果。
同樣地，LFO和BSO與酪胺受體的相互作用是不同的。不希望受到任何理論和機制的限制，很可能LFO和酪胺在同一個結合位點競爭，而BSO作用在與內源配體(酪胺)不同的受體位點。特定的其它油，包括那些明確在本申請中列出的油也可以和酪胺受體相互作用。
實施例5公丁香油和黑籽油對於能表達酪胺受體的細胞中胞內[cAMP]的效果為了研究酪胺受體依賴於檢測化學物質的偶聯，使pAcB-TyrR在Schneider細胞中穩定表達。用酪胺(大約10μM)，LFO(大約25μg/ml)和BSO(大約25μg/ml)在存在或不存在forskolin(FK)(大約10μM)的條件下處理轉染和未轉染的細胞。如上所述用3H-cAMP檢測試劑盒(Amersham)測定cAMP的產生。
為了確保在此細胞模型中的cAMP級聯是具有功能活性的，使用forslcolin，一種cAMP誘導劑作為標準試劑。如圖7到9所示，其中顯示了用LFO(大約25μg/ml)和BSO(大約25μg/ml)在存在或不存在酪胺(大約10μM)和forskolin(大約10μM)的條件下處理之後的表達酪胺受體的Schneider細胞中cAMP水平依賴於酪胺的變化，僅在轉染的細胞中在用forskolin處理以後cAMP水平與僅用溶劑(乙醇)處理的細胞中cAMP的基線水平相比增加了大約19倍。
另一方面，酪胺使得cAMP的產生有輕微降低。但是，酪胺顯著拮抗表達酪胺的細胞中forskolin刺激的cAMP水平，這表明酪胺受體在存在酪胺的條件下與Gαi/o偶聯，如圖7所示。僅在轉染的細胞中在用LFO和BSO處理後發現cAMP水平分別降低了大約34％和25％(圖8)。而酪胺增強了LFO對於酪胺受體轉染細胞中的cAMP產生的作用，用BSO和酪胺一起處理的時候除了BSO自身的效果之外cAMP水平沒有任何變化，如圖8所示。在表達酪胺受體的Schneider細胞中LFO和BSO導致的cAMP水平降低的現象在存在forskolin的條件下減少了，如圖9所示。
用其它特定的植物香精油，包括那些明確在本申請中列出的油處理都可以導致表達酪胺受體的細胞中的胞內cAMP水平的改變。
實施例6製備用嗅覺受體(Or83b和Or43a)穩定轉染的Schneider細胞A.黑腹果蠅嗅覺受體Or83b和Or43a的RT-PCR擴增和亞克隆用Trizol試劑(Invitrogen)從野生型黑腹果蠅的頭和觸角中提取總RNA。將其連同Trizol在用馬達驅動的特富龍杵和玻璃勻漿器中勻漿。然後根據製造商的說明書提取RNA，包括通過沉澱除去蛋白多糖和多糖。用oligo-dT作為引物用MuLV反轉錄酶(Applied Biosystems)對總RNA進行反轉錄。使用下述寡核苷酸進行開放閱讀框架的PCR擴增Or83b有義方向5′taagcggccgcATGACAACCTCGATGCAGCCGAG 3′；Or83b反義方向5′ataccgcggCTTGAGCTGCACCAGCACCATAAAG 3′；Or43a有義方向5′taagcggccgcATGACAATCGAGGATATCGGCCTGG 3′；以及Or43a反義方向5′ataccgcggTTTGCCGGTGACGCCACGCAGCATGG 3′。大寫字母表示與Or83b和Or43a受體序列完全匹配。有義方向的寡核苷酸包括Not I位點，反義方向的寡核苷酸包括SacII位點。兩個限制性位點由下劃線的核苷酸表示。反義方向的寡核苷酸不包括終止密碼子，因此pAC 5.1質粒的V5表型與翻譯蛋白相接。對於Or83b的PCR擴增，使用Vent聚合酶(New England Biolabs)，反應條件如下大約95℃，大約5分鐘進行大約1個循環；大約95℃，大約30秒；大約70℃，大約90秒進行大約40個循環；大約70℃，大約10分鐘進行大約1個循環。對於Or43a的PCR擴增，使用Failsafe PCR Premix Selection試劑盒(Epicentre Technologies)，反應條件如下大約95℃，大約5分鐘進行大約1個循環；大約95℃，大約30秒；大約60℃，大約30秒和大約70℃，大約90秒進行大約40個循環；大約70℃，大約10分鐘進行大約1個循環。Failsafe預混緩衝液F產生正確大小的產物。將PCR產物用Sac II和Not I消化，凝膠純化並連接到pAC 5.1/V5 His B(Invitrogen)上。用自動螢光測序儀(Vanderbilt Cancer Center)對兩條鏈上的插入物進行測序。Or83b開放閱讀框架和Or43a開放閱讀框架編碼的的蛋白與PubMed上的和在網站上的基因組序列中找到的序列信息是相同的。Or43a的核苷酸序列和肽序列如圖32A和32B所示。Or83b的核苷酸序列和肽序列如圖33A和33B所示。
用磷酸鈣-DNA共沉澱方法進行轉染，如上述的InvitrogenDrosophila Expression System(DES)操作手冊所述，用pAc5(B)-Or83b ORF或pAc5(B)-Or43a ORF穩定轉染果蠅Schneider細胞。挑取至少大約十個Or83b或Or43a穩定轉染細胞的克隆，分別培養。用RT-PCR方法對穩定的克隆進行分析以檢測它們是否表達相應的mRNA。用Trizol從細胞中提取RNA，根據製造商的說明書操作。用MuLV反轉錄酶對總RNA進行反轉錄。用Vent聚合酶和下述引物進行PCROr83b有義方向引物和Or83b反義方向引物；Or43a有義方向引物和Or43a反義方向引物。用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，並與用於RT-PCR的對照Schneider細胞RNA比較。用一個高度表達Or83b-mRNA或Or43a-mRNA的克隆做進一步研究，以研究用酪胺和特定的植物香精油處理後的蛋白表達(Western blot)，和信號傳導(cAMP產物和[Ca2+])。
用RT-PCR確定哪些克隆表達Or83b和Or43a基因。瓊脂糖凝膠分析表明對於Or83b，在大約10個克隆中有大約4個克隆產生大約1.46kb的大小正確的產物。對於Or43a，大約2個克隆產生大約1.1kb的大小正確的產物。對對照Schneider細胞進行PCR的時候沒有得到這些產物。選擇能表達所述mRNA的克隆進行有關受體的其它研究。
B.用Or83b受體或Or43a受體轉染的Schneider細胞系用於篩選能與Or83b和Or43a受體相互作用的組合物的能力為了研究Or83b受體和Or43a受體是否含有酪胺的特異性結合位點，如上所述從能表達兩種受體的細胞製備能表達Or83b受體或Or43a受體的膜，用於與3H-酪胺競爭性結合。結合檢測的方法與表達TyrR的細胞完全一樣，如上所述。如圖10所示，其中顯示了3H-酪胺與從能表達Or83b受體的Schneider細胞製備的膜在存在或不存在大約20μM未標記的酪胺的條件下的飽和抑制曲線，以及圖11中顯示了表達Or43a受體的細胞同樣的實驗結果，3H-酪胺與Or83b和Or43a受體特異性結合。如表B中所示，酪胺與Or83b受體結合的Kd大約是96.90nM，Bmax大約是4.908pmol/mg蛋白。對於Or43a，相應的值是Kd為大約13.530nM，Bmax大約為1.122pmol/mg蛋白。
表B實施例7表達嗅覺受體的細胞中cAMP的產生為了確保在此細胞模型中的cAMP級聯是具有功能活性的，用forskolin，一種cAMP誘導劑作為標準試劑。用上述實施例2中所述的cAMP檢測測定環AMP水平。如圖12所示，其中顯示了表達Or83b受體的細胞中cAMP水平依賴於forskolin的變化，在用大約10μM的forskolin在室溫處理了大約10分鐘的細胞中比基線cAMP水平增加了大約13倍。表達Or43a受體的細胞也得到了類似的結果。同樣地，表達嗅覺受體的細胞具有功能活性的cAMP級聯。
實施例8表達嗅覺受體的細胞中Ca2+的胞內波動用上述實施例3中所述的方法測定胞內Ca2+水平。在表達Or83b或Or43a受體的細胞中用ionomycin(一種Ca2+誘導試劑)和酪胺處理以後發生鈣波動。特別是，參照圖13和14，當在表達Or83b或Or43a的細胞中加入大約2μM ionomycin的時候，340nm和380nm激發的螢光比與胞內鈣水平相互關聯，觀察到胞內鈣顯著地增加。在表達Or83b和Or43a的細胞中，在用ionomycin處理以後，鈣分別增加了大約3.8倍和7倍。參照圖15，大約10μM的酪胺也能在表達Or83b和Or43a的細胞中分別誘導胞內鈣增加大約1.18倍和3.5倍。
總體上，藥理學分析數據證明這些用Or83b受體基因或Or43a受體基因轉染的細胞模型能表達有功能的蛋白受體。
實施例9不同的植物香精油對於嗅覺受體的結合活性以及受體下遊的信號傳導途徑的作用用表達一種嗅覺受體的細胞研究植物香精油與這些受體之間的相互作用以及每種受體下遊的信號傳導級聯。
對於結合活性，將從每種細胞模型製備的膜用於研究植物香精油與受體結合位點之間的相互作用。參照圖16，下述油與嗅覺受體發生相互作用公丁香油(LFO)，酞酸二乙酯，α-松油醇，和胡椒醛。
同樣地，參照圖17和18，下述油與嗅覺受體相互作用黑籽油(BSO)，α-松萜，苯醌，p-百裡香素，檜萜，α-側柏酮和d-檸檬烯。
類似地，參照圖19到21，下述油也能與嗅覺受體相互作用香葉醇，鄰氨基苯甲酸沉香酯，苯乙醛，沉香醇，α-松油醇，t-茴香腦，松油烯900，lindenol，丁香酚，百裡香油，香芹酚，百裡酚，胡椒醛，胡椒醇，醋酸胡椒酯，和胡椒胺。
特定的其它油，包括那些在本申請中明確指出的，也可以和嗅覺受體相互作用。
實施例10不同的植物香精油對於表達Or43a受體的細胞中的Ca2+的胞內波動的作用為了確定不同的植物香精油對於胞內鈣波動的作用，用每種細胞模型的完整細胞進行檢測，如上所述。根據處理之前和處理之後大約150秒的340/380螢光比值之差計算胞內Ca2+水平的變化。如圖22所示，用ionomycin和酪胺處理可誘導對照細胞中Ca2+的波動，但在表達Or43a受體的細胞中只能很微小地增加胞內Ca2+的水平。
參照圖22到28，下述油在表達Or43a受體的細胞中能夠致使鈣波動鄰氨基苯甲酸沉香酯，沉香醇，紫蘇子醇，t-茴香腦，香葉醇，苯乙醛，丁香酚，胡椒醇，醋酸胡椒酯，胡椒胺，α-松油醇，lindenol，松油烯900，百裡香油，百裡酚，香芹酚，LFO，BSO，α-松萜，p-百裡香素，d-檸檬烯，檜萜，奎寧，l-香芹酮，d-香芹酮，和α-側柏酮。最後，如圖24所示，用胡椒醛處理會在表達Or43a受體的細胞中減少胞內Ca2+水平。
用特定的其它植物香精油，包括那些在本申請中明確指出的精油處理也能在表達Or43a受體的細胞中引起胞內Ca2+水平的變化。
此外，用特定的其它植物香精油，包括那些在本申請中明確指出的精油處理在表達Or83b受體的細胞中能引起胞內Ca2+水平的變化。
實施例11不同的植物香精油對於表達嗅覺受體的細胞中cAMP的產生的作用為了確定不同的植物香精油對於胞內cAMP產生的作用，以及在表達一種嗅覺受體的細胞中cAMP依賴於酪胺的變化，將每種細胞模型的細胞用LFO(大約50μg/ml)和BSO(大約50μg/ml)在存在或不存在酪胺(大約20μM)和forskolin(大約10μM)的條件下處理，然後用實施例2中所述的檢測方法確定胞內cAMP。
如圖29和30所示，用下述油處理在表達Or43a受體的細胞中能夠導致cAMP水平增加酪胺；LFO；BSO；LFO和酪胺；BSO和酪胺；forskolin；酪胺和forskolin；LFO和forskolin；LFO，forskolin和酪胺；BSO；和BSO，酪胺和forskolin。
仍然參照圖29和30，在用大約20μM酪胺，大約50μg LFO/ml和大約50μg BSO/ml處理以後表達Or83b受體的細胞中cAMP的產生分別增加了大約34％，32％和64％。用酪胺和LFO一起處理與用每一種單獨處理的效果相比對cAMP的產生具有拮抗作用(大約24％)。另一方面，用BSO和酪胺一起處理對cAMP的產生具有協同作用(大約增加300％)。
在存在forskolin(大約10μM)的條件下，cAMP的產生增加了大約3000倍。當對用forskolin預處理的細胞給予酪胺或LFO的時候，除了forskolin自身的效果之外，cAMP的產生只增加了大約10-13％。向用forskolin預處理的細胞加入BSO，在這些細胞中除了forskolin誘導的cAMP產生之外，cAMP的水平只增加了大約22％。
還有，用某些其他植物精油處理，如包括在本申請中明確列出的植物精油，使得表達Or43a或Or83b受體的細胞中的細胞內cAMP的量變化。
實施例12組合物對於黑腹果蠅的毒性製備組合物的兩種丙酮溶液(大約1％和10％)。向玻璃瓶(大約5ml)中加入檢測濃度的丙酮溶液，在從瓶底面計大約3cm做標記。旋轉玻璃瓶，使得除了標記處與瓶頸之間的區域以外的玻璃瓶的內表面上都留有檢測溶液膜。將所有的玻璃瓶風乾10秒以保證丙酮完全蒸發，然後將果蠅置於處理的玻璃瓶中。待丙酮完全蒸發了以後，向每個瓶子中加入大約10隻成年的混和性別的果蠅，用棉塞塞住瓶子。大約24小時後觀察到死亡。
實施例13公丁香油(LFO)和黑籽油(BSO)對於野生型果蠅和酪胺受體突變果蠅的毒性可以用野生型黑腹果蠅和酪胺受體突變果蠅作為模型確定LFO和BSO的毒性。用上述實施例12中所述的方法研究這些油的毒性。參照下面的表C和D，兩種化學物質對於野生型果蠅都有毒性。LFO對果蠅的毒性是BSO的大約300倍。LFO的LC50大約是25-30ng/mm2，BSO的相應值是大約94μg/cm2。另一方面，LFO對於酪胺受體突變果蠅的毒性比BSO少大約1000倍。兩種化學物質對於果蠅的毒性可以通過酪胺受體調節。酪胺受體的突變顯著減少了LFO對於果蠅的毒性，而同一個突變體果蠅對於BSO卻變得更易感。
表C
表D
實施例14組合物對于田蟻的驅除效果任意選擇成年昆蟲用於檢測組合物的驅除效果，對昆蟲不進行單獨標記。每次進行重複的時候使用大約5個昆蟲。每次處理大約重複3次。未處理的對照檢測是在相同條件下進行的，只是對等量的群體/重複僅使用溶劑(丙酮)。用所述組合物(大約100mg，在300ml丙酮中)處理濾紙(大約80cm2)。風乾大約3分鐘後，將濾紙置於盤上，對昆蟲進行驅除。將昆蟲放置在盤上，一次在盤子的遠端放置一個昆蟲。用一個或多個秒表記錄在每個濾紙或盤子的未處理表面上所用的時間，直至大約300秒。按如下公式計算驅除率(RR)RR＝[(對照表面上所用時間-處理表面上所用時間)/檢測的總時間]。如果RR＞0，則視為所述組合物具有驅除效果，也就是說在處理表面上比對照表面上有更多的昆蟲被驅除；如果RR＜0則所述組合物被視為沒有驅除效果。
實施例15公丁香油(LFO)和黑籽油(BSO)對于田蟻的驅除效果用上述實施例14中所述的方法研究LFO(大約1.4mg/cm2)和BSO(大約1.4mg/cm2)對于田蟻的驅除效果。如表E和F所示，證明BSO對于田蟻比LFO驅除性更強。LFO和BSO對于田蟻的驅除性分別為90％和100％。此外，LFO和BSO在24小時內也可以導致田蟻有100％的死亡率。
表E
表F使用用BSO處理的盤研究BSO驅除螞蟻的殘餘效果。根據上述的驅除方法每天時用五隻螞蟻。同時確定BSO的毒性的時程。在毒性實驗中，將螞蟻暴露於同一個處理表面大約10秒，然後轉移到新鮮容器中，暴露後大約24小時記錄死亡數據。每天用五隻螞蟻。如表G所示，BSO可以驅除螞蟻達4天。
表G
實施例16d-檸檬烯，α-松萜，和p-百裡香素單獨或組合使用對于田蟻的驅除效果用所檢油處理濾紙以檢測不同植物香精油的驅除效果。室溫放置5分鐘後，將濾紙置於盤中，一次性放入螞蟻。如上述實施例14所述確定驅除性。每種油單獨檢測。此外，還將各種油混合成組合物並進行檢測。
參照表16H，d-檸檬烯，α-松萜，和p-百裡香素每種單獨都具有驅除性。而將油混合成組合物A，一種包括d-檸檬烯，α-松萜和p-百裡香素大約各三分之一的組合物，具有協同效果，驅除百分率大大增加。
表H同樣地，參照表I，d-檸檬烯和α-松萜每種單獨都有驅除性。而將這些油混合成組合物B，一種含有d-檸檬烯和α-松萜各一半的組合物，具有協同效果，驅除百分率大大增加。
表I實施例17沉香醇，d-檸檬烯，α-松萜，p-百裡香素和百裡香油單獨或組合使用對于田蟻的驅除效果用所檢油處理濾紙以檢測不同植物香精油的驅除效果。室溫放置5分鐘後，將濾紙置於盤中，一次性放入螞蟻。如上述實施例14所述確定驅除性。每種油單獨檢測。此外，還將各種油混合成組合物並進行檢測。
參照表J，雖然d-檸檬烯，α-松萜，p-百裡香素和百裡香油每種單獨都具有驅除性，組合物C，一種包括每種油各大約25％的組合物，的驅除性超過任何一種組分油單獨使用的效果。
表J同樣地，如表K所示，雖然沉香醇，α-松萜，p-百裡香素和百裡香油每種單獨都具有驅除性，組合物D，一種包括每種油各大約25％的組合物，的驅除性超過任何一種組分油單獨使用的效果。
表K
類似地，如表L所示，雖然沉香醇，α-松萜，和p-百裡香素每種單獨都具有驅除性，組合物E，一種包括每種油各大約三分之一的組合物，的驅除性超過任何一種組分油單獨使用的效果。
表L實施例18α-松萜，百裡香油，α-側柏酮，檜萜單獨或組合使用對于田蟻的驅除效果用所檢油處理濾紙以檢測不同植物香精油的驅除效果。室溫放置5分鐘後，將濾紙置於盤中，一次性放入螞蟻。如上述實施例14所述確定驅除性。每種油單獨檢測。此外，還將各種油混合成組合物並進行檢測。
雖然α-松萜，百裡香油，α-側柏酮和檜萜每種單獨都具有驅除性，如表M所示，組合物F，一種其中包括每種油各大約25％的組合物，驅除性增強。
表M實施例19d-檸檬烯，p-百裡香素，百裡酚，香芹酚和香葉醇單獨或組合使用對于田蟻的驅除效果用所檢油處理濾紙以檢測不同植物香精油的驅除效果。室溫放置5分鐘後，將濾紙置於盤中，一次性放入螞蟻。如上述實施例14所述確定驅除性。每種油單獨檢測。此外，還將各種油混合成組合物並進行檢測。
如表N所示，雖然d-檸檬烯，p-百裡香素，百裡酚和香芹酚每種單獨都具有驅除性，組合物G，一種包括每種油各大約25％的組合物，的驅除性超過任何一種組分油單獨使用的效果。
表N類似地，如表O所示，雖然d-檸檬烯，p-百裡香素和百裡酚每種單獨都具有驅除性，組合物H，一種包括每種油各大約三分之一的組合物，的驅除性超過任何一種組分油單獨使用的效果。
表O
類似地，如表P所示，雖然d-檸檬烯，p-百裡香素，百裡酚和香葉醇每種單獨都具有驅除性，組合物I，一種包括每種油各大約25％的組合物，的驅除性超過任何一種組分油單獨使用的效果。
表P實施例20鄰氨基苯甲酸沉香酯，α-松萜，d-檸檬烯，p-百裡香素，和香葉醇單獨或組合使用對于田蟻的驅除效果用所檢油處理濾紙以檢測不同植物香精油的驅除效果。室溫放置5分鐘後，將濾紙置於盤中，一次性放入螞蟻。如上述實施例14所述確定驅除性。每種油單獨檢測。此外，還將各種油混合成組合物並進行檢測。
如表Q所示，雖然香葉醇，d-檸檬烯，p-百裡香素和鄰氨基苯甲酸沉香酯每種單獨都具有驅除性，組合物J，一種含有大約40％香葉醇，大約30％d-檸檬烯，大約10％p-百裡香素，大約10％α-松萜和大約10％鄰氨基苯甲酸沉香酯的組合物，的驅除性超過任何一種組分油單獨使用的效果。
表O實施例21d-檸檬烯，百裡酚，α-松油醇，醋酸胡椒酯，胡椒胺，和胡椒醛單獨或組合使用對于田蟻的驅除效果用所檢油處理濾紙以檢測不同植物香精油的驅除效果。室溫放置5分鐘後，將濾紙置於盤中，一次性放入螞蟻。如上述實施例14所述確定驅除性。每種油單獨檢測。此外，還將各種油混合成組合物並進行檢測。
如表R所示，雖然d-檸檬烯，百裡酚，α-松油醇，醋酸胡椒酯，胡椒胺和胡椒醛每種單獨都具有驅除性，組合物K，一種含有大約20％d-檸檬烯，大約30％百裡酚，大約20％α-松油醇，大約10％醋酸胡椒酯，大約l0％胡椒胺和大約10％胡椒醛的組合物，的驅除性超過任何一種組分油單獨使用的效果。
表R實施例22香葉醇，d-檸檬烯，丁香酚，lindenol和苯乙醛單獨或組合使用對于田蟻的驅除效果用所檢油處理濾紙以檢測不同植物香精油的驅除效果。室溫放置5分鐘後，將濾紙置於盤中，一次性放入螞蟻。如上述實施例14所述確定驅除性。每種油單獨檢測。此外，還將各種油混合成組合物並進行檢測。
如表S所示，雖然香葉醇，d-檸檬烯，丁香酚，lindenol，和苯乙醛每種單獨都具有驅除性，組合物L，一種含有大約50％香葉醇，大約20％d-檸檬烯，大約10％丁香酚，大約10％lindenol，和大約10％苯乙醛的組合物，的驅除性超過任何一種組分油單獨使用的效果。
表S實施例23香葉醇，檸檬草油，丁香酚和礦物油單獨或組合使用對于田蟻的驅除效果用所檢油處理濾紙以檢測不同植物香精油的驅除效果。室溫放置5分鐘後，將濾紙置於盤中，一次性放入螞蟻。如上述實施例14所述確定驅除性。每種油單獨檢測。此外，還將各種油混合成組合物並進行檢測。
如表T所示，雖然香葉醇，檸檬草油和丁香酚每種都具有驅除性，組合物M，一種含有大約50％香葉醇，大約40％檸檬草油，和大約10％丁香酚的組合物，的驅除性超過任何一種組分油單獨使用的效果。香葉醇，檸檬草油和丁香酚都是環境保護機構(EPA)和食品和藥品管理局(FDA)一般認為安全的(GRAS化合物)，並且獲得了EPA的殺蟲劑註冊豁免。
表T同樣地，如表U所示，雖然香葉醇和檸檬草油每種都具有驅除性，組合物N，一種含有大約70％香葉醇和大約30％檸檬草油的組合物，的驅除性超過任何一種組分油單獨使用的效果。
表U
此外，如表V所示，加入礦物油形成組合物O，一種包括大約60％香葉醇，大約30％檸檬草油，和大約10％礦物油的組合物，不會影響香葉醇和檸檬草油的協同作用。礦物油單獨沒有驅除性，但是可以使組合物穩定，限制了活性成分的揮發。礦物油與香葉醇和檸檬草油一樣都是GRAS化合物。
表V實施例24香葉醇，百裡酚，檸檬草油和礦物油單獨或組合使用對于田蟻的驅除效果用所檢油處理濾紙以檢測不同植物香精油的驅除效果。室溫放置5分鐘後，將濾紙置於盤中，一次性放入螞蟻。如上述實施例14所述確定驅除性。每種油單獨檢測。此外，還將各種油混合成組合物並進行檢測。
如表W所示，雖然香葉醇，百裡酚和檸檬草油每種都具有驅除性，組合物P，一種含有大約50％香葉醇，大約20％百裡酚，大約20％檸檬草油，和大約10％礦物油的組合物，的驅除性超過任何一種組分油單獨使用的效果。香葉醇，百裡酚，檸檬草油，丁香酚和礦物油都是環境保護機構(EPA)和食品和藥品管理局(FDA)一般認為安全的(GRAS化合物)，並且獲得了EPA的殺蟲劑註冊豁免。
表W實施例25黑籽油(BSO)，公丁香油(LFO)，香葉醇，百裡酚，檸檬草油和礦物油單獨或組合使用對於木蟻的驅除效果用所檢油處理濾紙以檢測不同植物香精油的驅除效果。室溫放置5分鐘後，將濾紙置於盤中，一次性放入螞蟻。如上述實施例14所述確定驅除性。每種油單獨檢測。此外，還將各種油混合成組合物並進行檢測。
如表X所示，香葉醇，百裡酚和百裡香油每種都具有驅除性。如表Y所示，組合物Q到V，含有BSO，LFO，香葉醇，百裡酚，百裡香油，礦物油，紅花油和蓖麻油的不同組合，驅除性都有所增強。
表X
表Y實施例26商品化的驅除劑29％DEET對於木蟻的驅除效果為了與由不同植物香精油組成的不同化合物的驅除效果相比較，檢測了昆蟲控制試劑，商品化的驅除劑29％DEET，商品名為REPEL(Wisconsin Pharmacal Company，Inc，Jackson，WY)，對於木蟻的驅除性，方法是用29％DEET處理濾紙。室溫放置5分鐘後，將濾紙置於盤中，一次性放入螞蟻。如上述實施例14所述確定驅除性。如表Z所示，29％DEET在第0天的驅除百分率為大約98.4％。LFO，BSO和本發明的組合物的驅除百分率相當，有時比29％DEET的驅除率高。
表Z
實施例27商品化的驅除劑DEET，單獨或與香葉醇，百裡酚，和檸檬草油或香葉醇，D-檸檬烯，丁香酚，LINDENOL，和苯乙醛組合使用對於木蟻的驅除效果用所檢油處理濾紙以檢測商品化的驅除劑DEET和不同植物香精油的驅除效果。室溫放置5分鐘後，將濾紙置於盤中，一次性放入螞蟻。如上述實施例14所述確定驅除性。每種油單獨檢測。此外，還將各種油混合成組合物並進行檢測。
如表AA和BB所示，用濃度為大約5-10％的DEET處理沒有表現出驅除的跡象。但是，如表AA所示，當與組合物W，一種含有大約25％香葉醇，10％百裡酚，10％檸檬草油和礦物油(45％到55％，取決於DEET的最終濃度)的組合物組合使用的時候，驅除性接近100。同樣地，如表BB所示，當與組合物X，一種含有大約25％香葉醇，10％d-檸檬烯，5％丁香酚，5％lindenol，5％苯乙醛和礦物油(45％到55％，取決於DEET的最終濃度)的組合物組合使用的時候，驅除性接近97％到98％。而且，如圖AA和BB所示，各種油與DEET組合使用的時候驅除性增加。
表AA
表BB實施例28組合物對於頭蝨的殺蟲效果從生活在埃及亞歷山大港Karmos地區的年齡在4到11歲之間的女童和男童身上收集活的成年頭蝨Pediculus humanus。用細密齒的探蝨梳收集所述昆蟲，聚集在一起。將收集到的蝨子置於盤中，在收集後大約30分鐘內用於本研究。
在水中製備用於檢測的不同濃度的組合物。為了將這些組合物的殺蟲效果與商業可獲得的殺蝨試劑的效果相比較，將伊維菌素溶於水。在盤上施用大約1ml的每種濃度的組合物，大約1ml的伊維菌素水溶液，在對照盤上施用大約1ml水。在每個盤中放入大約10隻成年頭蝨。
持續觀察處理和對照盤，並觀察LT100。LT是指殺死給定百分比的昆蟲所需要的時間；因此LT100是指殺死100％的蝨子所需要的時間。如果頭蝨對於硬物沒有反應則視為其死亡。
實施例29包括香葉醇，D-檸檬烯，苯甲醇，P-百裡香素，和公丁香油的組合物對於頭蝨的殺蟲效果用上述實施例28中所述的方法研究組合物Y，一種包括大約20％p-百裡香素，大約40％公丁香油(LFO)，大約30％苯甲醇，和大約10％礦物油的組合物，的殺蟲效果。將該組合物的LT100與商業可獲得的殺蝨試劑，伊維菌素相比。如表CC所示，用組合物Y處理的蝨子比用伊維菌素處理的蝨子死亡的更快。
表CC實施例30組合物對於蚊子的驅除效果A.口服遞送用無毛的或刮過毛的小鼠和豚鼠檢測口服遞送的組合物的驅除效果。給大約10隻齧齒動物口服給予檢測油(例如公丁香油(LFO)或黑籽油(BSO))或檢測組合物(例如含有香葉醇，d-檸檬烯，丁香酚，和lindenol的組合物)。給大約10隻齧齒動物口服給予對照物質，例如礦物油。大約30分鐘後，將每隻齧齒動物置於封閉的容器內。向每個容器中放入大約20隻蚊子。觀察每個容器大約1小時。記錄每隻昆蟲在齧齒動物身上停留的時間以及所述昆蟲在齧齒動物的皮膚上留下的傷口的數目。所述昆蟲在接受了檢測組合物的齧齒動物身上停留的時間比在接受了對照物質的齧齒動物上停留的時間少。接受檢測組合物的齧齒動物身上的傷口比接受對照物質的齧齒動物少。
B.局部遞送用無毛的或刮過毛的小鼠和豚鼠檢測局部遞送的組合物的效果。給大約10隻齧齒動物的皮膚局部給予檢測油(例如公丁香油(LFO)或黑籽油(BSO))或檢測組合物(例如含有香葉醇，d-檸檬烯，丁香酚，和lindenol的組合物)。給大約10隻齧齒動物的皮膚局部給予對照物質，例如礦物油。大約30分鐘後，將每隻齧齒動物置於封閉的容器內。向每個容器中放入大約20隻蚊子。觀察每個容器大約1小時。記錄每隻昆蟲在齧齒動物身上停留的時間以及所述昆蟲在齧齒動物的皮膚上留下的傷口的數目。所述昆蟲在接受了檢測組合物的齧齒動物身上停留的時間比在接受了對照物質的齧齒動物上停留的時間少。接受檢測組合物的齧齒動物身上的傷口比接受對照物質的齧齒動物少。
實施例31組合物對於蚊子的驅除效果大約三個籠子，每個裝有大約100隻大約7到10天齡的熱帶家蚊(culex quinquefasciatus)。使蚊子餓大約12個小時。每個籠子有四個容器，每個容器都充滿了浸有糖水的棉花。
將四個容器中的三個用1000ppm(大約1mg/l)的檢測組合物任意處理，另一個容器作為未處理的對照。將容器置於每個籠子中四個相對的角上，在向每個容器加入檢測組合物後大約0，1，2，4，和6小時的時間區間中對蚊子的落下進行計數。在暴露的時間區間之間將容器從籠中移出。每次暴露的時間區間持續大約5分鐘。
用此方法檢測表DD中所述的組合物的驅除效果。
表DDLFO，枯茗油，香葉醇，百裡香油，和檸檬草油都是環境保護機構(EPA)和食品和藥品管理局(FDA)一般認為安全的(GRAS化合物)，並且獲得了EPA的殺蟲劑註冊豁免。
在向每個容器加入檢測組合物後大約0，1，2，4，和6小時的時間區間中對蚊子的落下進行計數，如表DD所示。落下的數目如表EE所示。用此數據和表FF中的數據計算驅除百分數。在每一個暴露的時間區間中，組合物EE，AA和BB都表現出幾乎100％的驅除性。甚至在6個小時以後，所述組合物對蚊子還有100％的驅除性。
表EE
表FF實施例32含有植物香精油的組合物對於紅蟻的驅除效果和殺蟲效果的檢測方法含有植物香精油的不同組合物對於紅蟻的殺蟲效果通過下述方法檢測。用大約20μl的每種檢測組合物處理紙板，處理後的紙板每個小瓶中放一張。將未處理的紙板放在對照瓶中。再用大約20μl的100％DEET處理紙板並放置在小瓶中以比較組合物和DEET，一種已知商品昆蟲控制試劑的殺蟲效果。在每個小瓶中放入大約三隻紅蟻，用棉花封住瓶口防止昆蟲逃走。將昆蟲暴露於所述組合物大約一個小時或更短時間並記錄死亡率。
含有植物香精油的不同組合物對於紅蟻的驅除效果通過下述方法檢測。用大約200μl的每種檢測組合物處理紙板並將紙板放在盤中。將未處理的紙板放在對照盤中。再用大約200μl的100％DEET處理紙板並放置在盤中以比較組合物和DEET的驅除效果。在每個盤中放入紅蟻。對昆蟲的行為和昆蟲在處理過的紙板上逗留的次數監測大約5分鐘。記錄一隻紅蟻逗留的次數。
殘餘殺蟲效果和驅除效果的檢測是用檢測組合物處理紙板，將處理過的紙板在實驗室條件下保持預定的一段時間(例如0分鐘，6小時，1天，3天，5天，7天)，用上述方法使紅蟻暴露於處理過的紙板。
實施例33含有植物香精油的組合物對於紅蟻的驅除效果和殺蟲效果用實施例32中所述的方法檢測組合物的殺蟲效果和驅除效果，如表GG所示。未處理的盤既對紅蟻沒有毒性也沒有驅除紅蟻。
表GG在用所述組合物處理過紙板後，當暴露於紙板大約0分鐘，6小時，1天，3天，5天，或7天時，每一種組合物都能導致100％的死亡率，與DEET相當。
如表HH所示，紅蟻被用於處理紙板的組合物所驅除。此外，在殘餘能力方面，所述組合物優於DEET，它們在應用於紙板後驅除能力保持了至少一周，而DEET在1天後就失去了驅除能力。表HH顯示了紅蟻在處理過的紙板上逗留的次數。表中列出的時間，0分鐘，6小時，1天，3天，5天，或7天，是指用所述組合物處理所述紙板與將紅蟻暴露於所處理紙板之間經過的近似時間。
表HH
實施例34含有植物香精油的組合物對紅蟻的驅除效果和殺蟲效果用實施例32中所述的方法檢測組合物的殺蟲效果和驅除效果，如表JJ所示。用每種組合物處理都具有驅除效果和殺蟲效果。
表JJ
本領域技術人員應當明白，可以對本發明進行各種修改和變化而不會背離本發明的範圍和精神。說明書和實施例僅是示例，而並非是限制本發明的範圍和精神。本文索引用的參考文獻和出版物在此都引入作為參考。
應當理解，除非另外指出，說明書，實施例和權利要求中所使用的所有表示成分，特性如反應條件，等的數量的數字在所有的實例中通過引入術語「大約」都可以變化。相應地，除非另外指出，說明書，實施例和權利要求中出現的數字參數都是近似值，可以根據本發明所確定的所需特性而變化。
權利要求
1.一種控制昆蟲的組合物，包括至少兩種油，其中所述組合物靶定所述昆蟲的選自酪胺受體，Or83b嗅覺受體，和Or43a嗅覺受體的至少一個受體，可使得所述昆蟲的胞內cAMP，Ca2+，或二者的水平發生改變。
2.權利要求1的組合物，其中所述的至少兩種油包括選自t-anthole，黑籽油，莰烯，香芹酚，d-香芹酮，1-香芹酮，1，8-桉樹腦，p-百裡香素，酞酸二乙酯，丁香酚，香葉醇，枸櫞酸異丙酯，檸檬草油，公丁香油，白檸檬油，d-檸檬烯，鄰氨基苯甲酸沉香酯，沉香醇，lindenol，檸檬酸甲酯，二氫茉莉酮酸甲酯，香葉烯，紫蘇子醇，苯乙醛，α-松萜，β-松萜，胡椒醛，胡椒基，醋酸胡椒酯，胡椒醇，胡椒胺，奎寧，檜寧，α-松油烯，松油烯900，α-松油醇，gamma-松油醇，2-叔丁基-p-苯醌，α-側柏酮，百裡香油，和百裡酚。
3.如權利要求2所述的組合物，其中用所述組合物處理具有驅除效果。
4.如權利要求2所述的組合物，其中用所述組合物處理具有殺蟲效果。
5.如權利要求2所述的組合物，進一步包括至少一種不揮發性油。
6.如權利要求5所述的組合物，其中所述的至少一種不揮發性油選自蓖麻油，玉米油，枯茗油，礦物油，橄欖油，花生油，紅花油，芝麻油，和大豆油。
7.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括公丁香油；香葉醇，和百裡香油。
8.如權利要求3所述的組合物，其中所述油包括公丁香油，香葉醇，和百裡香油。
9.如權利要求6所述的組合物，其中所選擇的油包括公丁香油，香葉醇，百裡香油，和枯茗油。
10.如權利要求9所述的組合物，其中所選擇的油包括按重量計大約44％的公丁香油，按重量計大約10％的香葉醇，按重量計大約2％的百裡香油，和按重量計大約44％的枯茗油。
11.如權利要求1所述的組合物，其中所選擇的油包括d-檸檬烯，百裡香油，香葉醇，α-松萜，和p-百裡香素。
12.如權利要求3所述的組合物，其中所選擇的油包括d-檸檬烯，百裡香油，香葉醇，α-松萜，和p-百裡香素。
13.如權利要求11所述的組合物，其中所述油包括按重量計大約20％的d-檸檬烯，按重量計大約20％的百裡香油，按重量計大約20％的香葉醇，按重量計大約20％的α-松萜，和按重量計大約20％的p-百裡香素。
14.如權利要求11所述的組合物，進一步包括苯乙醛。
15.如權利要求12所述的組合物，進一步包括苯乙醛。
16.如權利要求14所述的組合物，其中所選擇的油包括按重量計大約10％的d-檸檬烯，按重量計大約30％的百裡香油，按重量計大約35％的香葉醇，按重量計大約10％的α-松萜，和按重量計大約5％的苯乙醛。
17.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括香葉醇，百裡香油，和檸檬草油。
18.如權利要求3的組合物，其中所選擇的油包括香葉醇，百裡香油，和檸檬草油。
19.如權利要求17所述的組合物，其中所選擇的油包括按重量計大約50％的香葉醇，按重量計大約40％的百裡香油，按重量計大約10％的檸檬草油。
20.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括d-檸檬烯，lindenol，丁香酚，苯乙醛，和香葉醇。
21.如權利要求3所述的組合物，其中所選擇的油包括d-檸檬烯，lindenol，丁香酚，苯乙醛，和香葉醇。
22.如權利要求20所述的組合物，其中所選擇的油包括按重量計大約20％的d-檸檬烯，按重量計大約10％的lindenol，按重量計大約10％的丁香酚，按重量計大約10％的苯乙醛，和按重量計大約50％的香葉醇。
23.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括d-檸檬烯，香葉醇，α-松萜，p-百裡香素，和苯乙醛。
24.如權利要求3所述的組合物，其中所選擇的油包括d-檸檬烯，香葉醇，α-松萜，p-百裡香素，和苯乙醛。
25.如權利要求23所述的組合物，其中所選擇的油包括按重量計大約15％的d-檸檬烯，按重量計大約50％的香葉醇，按重量計大約15％的α-松萜，按重量計大約15％的p-百裡香素，和按重量計大約5％的苯乙醛。
26.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括d-檸檬烯和p-百裡香素。
27.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括d-檸檬烯，p-百裡香素，和α-松萜。
28.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括d-檸檬烯和α-松萜。
29.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括d-檸檬烯和百裡香油。
30.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括α-松萜和百裡香油。
31.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括p-百裡香素，α-松萜和百裡香油。
32.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括p-百裡香素和α-松萜。
33.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括沉香醇，p-百裡香素，百裡香油，和α-松萜。
34.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括沉香醇，p-百裡香素，和α-松萜。
35.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括d-檸檬烯，p-百裡香素，和百裡酚。
36.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括d-檸檬烯，p-百裡香素，百裡酚和香葉醇。
37.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括α-側柏酮，α-松萜，檜萜，β-松萜，p-百裡香素和檸檬烯。
38.如權利要求3所述的組合物，其中所選擇的油包括α-側柏酮，α-松萜，檜萜，β-松萜，p-百裡香素和檸檬烯。
39.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括酞酸二乙酯，α-松油醇，胡椒醛，沉香醇，γ-松油醇，二氫茉莉酮酸甲酯，檸檬酸甲酯和枸櫞酸異丙酯。
40.如權利要求3所述的組合物，其中所選擇的油包括酞酸二乙酯，α-松油醇，胡椒醛，沉香醇，γ-松油醇，二氫茉莉酮酸甲酯，檸檬酸甲酯和枸櫞酸異丙酯。
41.如權利要求2所述的組合物，其中所選擇的油包括d-檸檬烯和p-百裡香素，α-松萜，百裡香油，沉香醇，百裡酚，和香葉醇。
42.如權利要求3所述的組合物，其中所選擇的油包括d-檸檬烯和p-百裡香素，α-松萜，百裡香油，沉香醇，百裡酚，和香葉醇。
43.如權利要求2所述的組合物，其中所述化合物包括至少兩種選自下述物質的油d-檸檬烯，p-百裡香素，α-松萜，百裡香油，百裡酚，香葉醇，檸檬草油，黑籽油，公丁香油，礦物油，和苯乙醛。
44.如權利要求3所述的組合物，其中所述化合物包括至少兩種選自下述物質的油d-檸檬烯，p-百裡香素，α-松萜，百裡香油，百裡酚，香葉醇，檸檬草油，黑籽油，公丁香油，礦物油，和苯乙醛。
45.一種控制昆蟲的組合物，包括至少兩種選自下述物質的油黑籽油，莰烯，d-香芹酮，1-香芹酮，1，8-桉樹腦，枸櫞酸異丙酯，檸檬草油，公丁香油，白檸檬油，鄰氨基苯甲酸沉香酯，檸檬酸甲酯，二氫茉莉酮酸甲酯，香葉烯，紫蘇子醇，苯乙醛，α-松萜，β-松萜，胡椒基，胡椒胺，奎寧，檜寧，α-松油烯，松油烯900，γ-松油醇，2-叔丁基-p-苯醌，和α-側柏酮。
46.如權利要求45所述的組合物，進一步包括至少一種不揮發性油。
47.如權利要求46所述的組合物，其中所述的至少一種不揮發性油選自蓖麻油，玉米油，枯茗油，礦物油，橄欖油，花生油，紅花油，芝麻油，和大豆油。
48.如權利要求47所述的組合物，其中所選擇的油包括公丁香油和枯茗油。
49.一種控制昆蟲的組合物，包括選自下述的至少一種油黑籽油和公丁香油。
50.如權利要求49所述的組合物，進一步包括至少一種植物香精油。
51.如權利要求50所述的組合物，其中至少一種植物香精油包括選自下述的油t-anthole，黑籽油，莰烯，香芹酚，d-香芹酮，1-香芹酮，1，8-桉樹腦，p-百裡香素，酞酸二乙酯，丁香酚，香葉醇，枸櫞酸異丙酯，檸檬草油，公丁香油，白檸檬油，d-檸檬烯，鄰氨基苯甲酸沉香酯，沉香醇，lindenol，檸檬酸甲酯，二氫茉莉酮酸甲酯，香葉烯，紫蘇子醇，苯乙醛，a-松萜，β-松萜，胡椒醛，胡椒基，醋酸胡椒酯，胡椒醇，胡椒胺，奎寧，檜寧，α-松油烯，松油烯900，α-松油醇，γ-松油醇，2-叔丁基-p苯醌，α-側柏酮，百裡香油，百裡酚，蓖麻油，玉米油，枯茗油，礦物油，橄欖油，花生油，紅花油，芝麻油，和大豆油。
52.如權利要求51所述的組合物，其中所選擇的油包括公丁香油和枯茗油。
53.如權利要求51所述的組合物，其中所選擇的油包括公丁香油；香葉醇，和百裡香油。
54.如權利要求53所述的組合物，其中所選擇的油包括公丁香油，香葉醇，百裡香油，和枯茗油。
55.一種控制昆蟲的組合物，包括至少一種植物香精油；和一種昆蟲控制試劑，其中所述昆蟲控制試劑的最終濃度小於所述昆蟲控制試劑單獨使用時具有昆蟲控制活性所需的濃度。
56.如權利要求50所述的組合物，其中所述至少一種植物香精油包括選自下述的油t-anthole，黑籽油，莰烯，香芹酚，d-香芹酮，1-香芹酮，1，8-桉樹腦，p-百裡香素，酞酸二乙酯，丁香酚，香葉醇，枸櫞酸異丙酯，檸檬草油，公丁香油(LFO)，白檸檬油，d-檸檬烯，鄰氨基苯甲酸沉香酯，沉香醇，lindenol，檸檬酸甲酯，二氫茉莉酮酸甲酯，香葉烯，紫蘇子醇，苯乙醛，a-松萜，β-松萜，胡椒醛，胡椒基，醋酸胡椒酯，胡椒醇，胡椒胺，奎寧，檜寧，α-松油烯，松油烯900，α-松油醇，γ-松油醇，2-叔丁基-p苯醌，α-側柏酮，百裡香油，和百裡酚。
57.如權利要求56所述的組合物，其中所述昆蟲控制試劑是DEET。
58.如權利要求55所述的組合物，其中所述昆蟲控制試劑是DEET。
59.如權利要求58所述的組合物，其中DEET的最終濃度至少低到10％。
60.如權利要求59所述的組合物，其中DEET的最終濃度至少低到5％。
61.如權利要求57所述的組合物，進一步包括不揮發性油。
62.如權利要求61所述的組合物，其中所述不揮發性油選自蓖麻油，玉米油，枯茗油，礦物油，橄欖油，花生油，紅花油，芝麻油，和大豆油。
63.如權利要求62所述的組合物，其中所選擇的油包括DEET，公丁香油，和枯茗油。
64.如權利要求63所述的組合物，其中所選擇的油包括按重量計大約10％的DEET，按重量計大約45％的公丁香油和按重量計大約45％的枯茗油。
65.如權利要求57所述的組合物，其中所選擇的油包括DEET，d-檸檬烯，百裡香油，香葉醇，α-松萜，和p-百裡香素。
66.如權利要求65所述的組合物，其中所選擇的油包括按重量計大約10％的DEET，按重量計大約18％的d-檸檬烯，按重量計大約18％的百裡香油，按重量計大約20％的香葉醇，按重量計大約20％的α-松萜，和按重量計大約18％的p-百裡香素。
67.一種控制昆蟲的方法，包括提供一種組合物，其含有選自下述的至少兩種油t-anthole，黑籽油，莰烯，香芹酚，d-香芹酮，1-香芹酮，1，8-桉樹腦，p-百裡香素，酞酸二乙酯，丁香酚，香葉醇，枸櫞酸異丙酯，檸檬草油，公丁香油，白檸檬油，d-檸檬烯，鄰氨基苯甲酸沉香酯，沉香醇，lindenol，檸檬酸甲酯，二氫茉莉酮酸甲酯，香葉烯，紫蘇子醇，苯乙醛，a-松萜，β-松萜，胡椒醛，胡椒基，醋酸胡椒酯，胡椒醇，胡椒胺，奎寧，檜寧，α-松油烯，松油烯900，α-松油醇，γ-松油醇，2-叔丁基-p苯醌，α-側柏酮，百裡香油，和百裡酚；將所述昆蟲暴露於其濃度足以具有驅除效果的所述組合物。
68.如權利要求67所述的方法，其中所選擇的油包括公丁香油；香葉醇，和百裡香油。
69.如權利要求67所述的方法，其中所選擇的油包括α-側柏酮，α-松萜，檜萜，β-松萜，p-百裡香素和檸檬烯。
70.如權利要求67所述的方法，其中所選擇的油包括酞酸二乙酯，α-松油醇，胡椒醛，沉香醇，γ-松油醇，二氫茉莉酮酸甲酯，檸檬酸甲酯和枸櫞酸異丙酯。
71.一種控制昆蟲的方法，包括提供一種組合物，其含有至少一種選擇下述的油黑籽油和公丁香油；將所述昆蟲暴露於其濃度足以具有驅除效果的所述組合物。
72.如權利要求71所述的方法，其中所述組合物進一步包括至少一種其它的植物香精油。
73.一種控制昆蟲的方法，包括提供一種如權利要求52所述的組合物；將所述昆蟲暴露於其濃度足以具有驅除效果的所述組合物。
74.如權利要求73所述的方法，其中所述組合物的昆蟲控制試劑是DEET。
75.一種控制昆蟲的方法，包括提供一種組合物，其含有選自下述的至少兩種油t-anthole，黑籽油，莰烯，香芹酚，d-香芹酮，1-香芹酮，1，8-桉樹腦，p-百裡香素，酞酸二乙酯，丁香酚，香葉醇，枸櫞酸異丙酯，檸檬草油，公丁香油，白檸檬油，d-檸檬烯，鄰氨基苯甲酸沉香酯，沉香醇，lindenol，檸檬酸甲酯，二氫茉莉酮酸甲酯，香葉烯，紫蘇子醇，苯乙醛，α-松萜，β一松萜，胡椒醛，胡椒基，醋酸胡椒酯，胡椒醇，胡椒胺，奎寧，檜寧，α-松油烯，松油烯900，α-松油醇，γ-松油醇，2-叔丁基-p苯醌，α-側柏酮，百裡香油，和百裡酚；將所述昆蟲暴露於其濃度足以具有殺蟲效果的所述組合物。
76.一種控制昆蟲的方法，包括提供一種組合物，其包括至少一種植物香精油；和一種昆蟲控制試劑，其中所述昆蟲控制試劑的最終濃度小於所述昆蟲控制試劑單獨使用時具有昆蟲控制活性所需的濃度；並且將所述昆蟲暴露於其濃度足以具有驅除效果的所述組合物。
77.如權利要求76所述的方法，其中所述組合物的昆蟲控制試劑是DEET。
78.如權利要求77所述的方法，其中所述至少一種植物香精油包括選自下述的油t-anthole，黑籽油，莰烯，香芹酚，d-香芹酮，1-香芹酮，1，8-桉樹腦，p-百裡香素，酞酸二乙酯，丁香酚，香葉醇，枸櫞酸異丙酯，檸檬草油，公丁香油(LFO)，白檸檬油，d-檸檬烯，鄰氨基苯甲酸沉香酯，沉香醇，lindenol，檸檬酸甲酯，二氫茉莉酮酸甲酯，香葉烯，紫蘇子醇，苯乙醛，a-松萜，β-松萜，胡椒醛，胡椒基，醋酸胡椒酯，胡椒醇，胡椒胺，奎寧，檜寧，α-松油烯，松油烯900，α-松油醇，γ-松油醇，2-叔丁基-p苯醌，α-側柏酮，百裡香油，和百裡酚。
79.一種篩選具有昆蟲控制活性的組合物的方法，包括提供能表達選自下述受體的受體的昆蟲細胞酪胺受體，Or83b嗅覺受體，和Or43a嗅覺受體；向細胞中加入所述組合物；檢測所述組合物與所述受體的結合親和力；並且選擇與所述受體具有親和力的組合物。
80.一種篩選具有昆蟲控制活性的組合物的方法，包括提供能表達選自下述受體的受體的昆蟲細胞酪胺受體，Or83b嗅覺受體，和Or43a嗅覺受體；向細胞中加入所述組合物；從細胞中提取胞內cAMP或Ca2+；檢測胞內cAMP或Ca2+的水平；將用所述組合物處理過的細胞中的胞內cAMP或Ca2+水平與未處理細胞中的胞內cAMP或Ca2+水平相比較；並且選擇用它們處理能夠引起胞內cAMP或Ca2+或二者的水平變化的組合物。
81.一種由下述方法產生的報告，包括提供能表達選自下述受體的受體的昆蟲細胞酪胺受體，Or83b嗅覺受體，和Or43a嗅覺受體；向細胞中加入所述組合物；檢測所述組合物與所述受體的結合親和力；並且選擇與所述受體具有親和力的組合物。
82.一種由下述方法產生的報告，包括提供能表達選自下述受體的受體的昆蟲細胞酪胺受體，Or83b嗅覺受體，和Or43a嗅覺受體；向細胞中加入所述組合物；從細胞中提取胞內cAMP或Ca2+；檢測胞內cAMP或Ca2+的水平；將用所述組合物處理過的細胞中的胞內cAMP或Ca2+水平與未處理細胞中的胞內cAMP或Ca2+水平相比較；並且選擇用它們處理能夠引起胞內cAMP或Ca2+或二者的水平變化的組合物。
83.一種Schneider果蠅，包括如圖31A和31B所示的酪胺受體的核酸序列。
84.一種Schneider果蠅，包括如圖32A和32B所示的Or43a嗅覺受體的核酸序列。
85.一種Schneider果蠅，包括如圖33A和33B所示的Or83b嗅覺受體的核酸序列。
全文摘要
本發明包括與控制昆蟲有關的組合物，方法和細胞系。組合物的一個實施方案包括植物香精油，其靶定昆蟲的至少一個選自酪胺受體，Or83b嗅覺受體，和Or43a嗅覺受體的受體，其可以導致昆蟲的cAMP，Ca2+或二者胞內水平的改變。
文檔編號A61K36/00GK1809368SQ200480017369
公開日2006年7月26日 申請日期2004年4月26日 優先權日2003年4月24日
發明者伊塞姆·伊那恩 申請人:範德比爾特大學