肌醇六磷酸酶多肽的製作方法

2023-06-25 19:41:41 2

專利名稱：肌醇六磷酸酶多肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及具肌醇六磷酸酶活性的分離的多肽，相應的克隆的DNA序列，產生這種多肽的方法，以及其在各種工業應用中的用途。尤其是，本發明涉及衍生自擔子菌類群(phyllum Basidiomycota)的肌醇六磷酸酶，特定共有序列的肌醇六磷酸酶以及真菌6-肌醇六磷酸酶。
肌醇六磷酸或肌醇-1，2，3，4，5，6-六二氫磷酸鹽(或簡稱為肌醇六磷酸鹽)是植物種子中肌醇的主要來源和磷酸鹽的主要貯藏形式。實際上，其是在種子和穀粒成熟過程中天然形成的。在豆類種子中其佔了磷酸鹽含量的約70％，並與蛋白體如肌醇六磷酸鈣鎂在結構上整合在一起，肌醇六磷酸鈣鎂是肌醇的鉀、鎂、鈣的混合鹽。種子、穀粒和豆類是食物和飼料製品的重要成分，尤其是動物飼料製品。而且在人類食品中，穀物和豆類已變得越來越重要了。
肌醇六磷酸中的磷酸部分螯合二價或三價的陽離子例如金屬離子，即營養基本離子鈣、鐵、鋅和鎂以及微量礦物質錳、銅和鉬。
此外，在某種程度上肌醇六磷酸還通過靜電作用與蛋白質結合在一起。在蛋白質等電點pI以下的pH中，帶正電的蛋白質與肌醇六磷酸直接結合。在pI以下的pH中，帶負電的蛋白質通過金屬離子與肌醇六磷酸結合。
肌醇六磷酸及其鹽肌醇六磷酸鹽常常是非代謝性的，原因是其不能從胃腸系統吸收，即其三價磷形式，螯合的金屬離子，結合蛋白都不是營養上有用的。
因此，由於磷對所有有機體的生長都是必需的因子，那麼就有必要對食物和飼料製品補充以無機磷酸鹽。極常見的情況是也必須加入營養基本離子例如鐵和鈣。而且此外，給定的食物的營養價值降低了，因為蛋白質被肌醇六磷酸結合了。因此肌醇六磷酸常被稱之為一種抗營養因子。
而且，既然肌醇六磷酸是非代謝性的，肌醇六磷酸磷經過這種動物的胃腸道並與糞便一同排洩，導致了所不期望的環境的磷酸汙染，例如導致了水環境的營養化或藻類的廣泛生長。
肌醇六磷酸或肌醇六磷酸鹽，這兩個所說的術語除非另外指出，在本發明範圍內是作為同義詞或隨機使用的，都是可被肌醇六磷酸酶降解的。
在含有肌醇六磷酸的絕大部分植物種子中也發現了內源的肌醇六磷酸酶。這些酶是在種子萌發過程中形成的並可釋放磷酸鹽而且釋放植物生長過程中所需的終產物-游離的肌醇。
消化時，食品或飼料成分的肌醇六磷酸鹽在理論上是可被所討論的種子中的內源植物肌醇六磷酸酶水解的，被來源於腸中的微生物菌落的肌醇六磷酸酶和被腸黏膜肌醇六磷酸酶所水解。但在實踐中，如果存在有內源的植物肌醇六磷酸酶和腸黏膜肌醇六磷酸酶的水解能力的話，是遠遠不足以顯著地增加肌醇六磷酸鹽的結合或組成成分的生物有效性的。然而當製備食品或飼料的過程涉及萌發，發酵和浸泡時，內源的肌醇六磷酸酶就有可能對肌醇六磷酸的降解產生更大的作用。
在反芻或復胃動物例如馬和牛中，胃腸系統中存在著大量的能夠降解肌醇六磷酸的微生物。但是，在單胃的動物例如人、家禽和豬中並非如此。因此，上述的問題對這類單胃的動物是非常重要的。
已經有用植物以及微生物來生產肌醇六磷酸酶的報導。在微生物中，生產肌醇六磷酸酶的細菌和真菌是已知的。
從植物界來說，例如麥麩肌醇六磷酸酶是已知的(Thomlinson等，生物化學(Biochemistry)，1(1962)，166-171)。Barrientos等(Plant Physiol.，106(1994)，1489-1495)也描述了來自於百合花粉的鹼性肌醇六磷酸酶。
在細菌中，已經有來自枯草芽孢桿菌(Paver和Jagannathan，1982，Journal of Bacteriology 1511102-1108)和假單孢菌(Cosgrove，1970，Australian Journal of Biological Sciences 231207-1220)的肌醇六磷酸酶的報導。而且，Greiner等(Arch.Biochem.Biophys.，303，107-113，1993)已經純化和表徵了來自大腸桿菌的肌醇六磷酸酶。但是該酶可能是一種酸性磷酸酶。
對產生肌醇六磷酸酶的酵母也已有描述，例如啤酒糖酵母(Nayini等，1984，Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 1724-26)。但是，這種酶可能是一種肌醇單磷酸酶(Wodzinski等，Adv.Appl.Microbiol.，42，263-303)。AU-A-24840/95描述了酵母菌西方許旺氏酵母的肌醇六磷酸酶的克隆和表達。
對產生肌醇六磷酸酶的絲狀真菌也有一些描述，但僅是屬於子囊菌類(ascomycotes)的真菌群。尤其是，有幾篇參考文獻涉及了產生肌醇六磷酸酶的麴黴屬的子囊菌類，例如土麴黴(Yamada等，1986，Agric.Biol.Chem.3221275-1282)。而且，也已經描述了來自於黑色麴黴泡盛變種的肌醇六磷酸黴基因的克隆和表達(Piddington等，1993，基因(Gene)13355-62)。EP0 420 358描述了無花果(黑色)麴黴的肌醇六磷酸酶的克隆和表達。EP 0684 313描述了子囊菌類嗜熱毀絲菌(Myceliophthora thermophila)和大麴黴的肌醇六磷酸酶的克隆和表達。
在本說明書範圍內，肌醇六磷酸酶是催化肌醇六磷酸鹽(肌醇六磷酸鹽)水解為(1)肌醇和/或(2)其單-、二-、三-、四-和/或五-磷酸鹽及(3)無機磷酸鹽的酶。在下文中，上述的化合物有時分別被簡寫為IP6、I、IP1、IP2、IP3、IP4、IP5和P。這就意味著通過肌醇六磷酸酶的作用，IP6被降解為P+一個或多個IP5、IP4、IP3、IP2、IP1和I成分。可替代地，帶有在位置p、q、r...上總共結合有n個磷酸根的肌醇被稱之為Ins(p、q、r....)Pn。為了簡便起見，Ins(1，2，3，4，5，6)P6(肌醇六磷酸)被簡寫為PA。
根據酶命名資料庫ExPASy(一個主要根據生物化學和分子生物學國際聯合會(IUBMB)命名委員會的推薦的描述已提供了EC(酶委員會)編號的各種已表徵的酶的關於酶的命名的信息庫)，已知有兩種不同類型的肌醇六磷酸酶所謂的3-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸3-磷酸水解酶，EC 3.1.3.8)和所謂的6-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸6-磷酸水解酶EC 3.1.3.26)。3-肌醇六磷酸酶首先在第3位上水解酯鍵，而6-肌醇六磷酸酶首先在第6位上水解酯鍵。肌醇磷酸命名考慮到肌醇六磷酸酶作用於肌醇六磷酸的一級水解產物，所得到的酯有些是非對映體，而有一些是對映體。一般而言，區分非對映體更容易一些，因為它們有不同的物理特性，但是要區分互為鏡象的對映體就更加困難一些。
因此，Ins(1，2，4，5，6)P5(除去了3-磷酸)和Ins(1，2，3，4，5)P5(除去了6-磷酸)是非對映體而易於區分，而Ins(1，2，4，5，6)P5(除去了3-磷酸鹽)和Ins(2，3，4，5，6)P5(除去了1-磷酸鹽)是對映體。對Ins(1，2，3，4，5)P5(除去了6-磷酸鹽)和Ins(1，2，3，5，6)P5(除去了4-磷酸鹽)這一對來說同樣也是正確的。因此，對來自於肌醇六磷酸的肌醇六磷酸酶催化水解的第一步所得的6個五磷酸酯中，人們可以很容易地區分已除去了2-，3-，5-和6-磷酸鹽，即人們可僅得到4個非對映體，所得的餘下的兩個酯都是這些化合物中的一個對映體(4-和6-是對映體，如1-和3-一樣)。最低位次原則的應用此處應當注意到，當使用Ins(2，3，4，5，6)P5和Ins(1，2，3，5，6)P5的命名時，放寬了先前對肌醇原子編號的推薦。這種最低位次原則的放寬是由國際生化聯合會命名委員會推薦的(Biochem.J.(1989)258，1-2)，其在作者意欲引入結構關係的任何時候均可應用。
在此最低位次原則中，推薦了L-和D-命名肌醇磷酸鹽、肌醇的磷酸酯常常被命名為1D-(或1L-)-InS(r，s，t，u，w，x)Pn，n指磷酸根的數目，位次r，s，t，u，w，x指其位置。位置的編號是根據上述引述(及其中的參考文獻)的國際生物化學聯合會命名委員會(NC-IUB)而來的，1D或1L用來形成具有最低可能的位次或編號的取代基(「最低位次原則」)。因此，1L-肌醇-1-磷酸(1L-Ins(1)P，肌醇生物合成的中間產物)和1D-肌醇-1-磷酸鹽(1D-Ins(1)P，磷脂的成分)，是按圖38所顯示的那樣來編號的。肌醇六磷酸酶特異性如上所述，肌醇六磷酸酶是根據其在起初水解步驟中的特異性區分的，即根據其首先水水解哪一個磷酸酯基團。
關於已知肌醇六磷酸酶的特異性，植物肌醇六磷酸酶一般被稱之為6-肌醇六磷酸酶。然而百合花粉肌醇六磷酸酶據說是5-肌醇六磷酸酶。衍生自微生物的肌醇六磷酸酶主要稱為3-肌醇六磷酸酶。例如上述的ExPASy資料庫所指的3-肌醇六磷酸酶是泡盛麴黴(ALK 0243株)和黑色麴黴(NRRL3135株)(基因(Gene)13355-62(1993)和基因12787-94(1993))的四種肌醇六磷酸酶。
現在使用D-/L-記號(其中D-和L-構象指的是1位)，麥麩肌醇六磷酸酶首先水解L-6位的磷酸酯基團，而3-肌醇六磷酸酶首先水解的是D-3位的磷酸酯基團。
可以通過各種方法例如HPLC或NMR質譜來測定其特異性。但這些方法並不能立即區分D-6和L-6位上磷酸酯基團的水解，由於水解產物D-Ins(1，2，3，4，5)P5和L-Ins(1，2，3，4，5)P5是對映體(鏡像)，因此具有相同的NMR譜。
換言之，本文中6-肌醇六磷酸酶指L-6-或D-6-肌醇六磷酸酶或指二者，即為L-6-肌醇六磷酸酶、D-6-肌醇六磷酸酶或((D-6-)+(L-6-))-肌醇六磷酸酶(具兩種活性)的肌醇六磷酸酶。後者有時也被命名為D/L-6-肌醇六磷酸酶。
本發明的目的之一是提供一種可替代的肌醇六磷酸酶，尤其是具有優良特性例如增加了的熱穩定性或磷酸從肌醇六磷酸中更快的釋放，並能以商業有用量來生產的肌醇六磷酸酶。
本發明人意外地發現了具有有趣特徵的整個亞族的真菌肌醇六磷酸酶。該亞族的肌醇六磷酸酶的特徵在於具有一個高度保守的區域或部分相同的序列(共有序列)。該亞族的代表與已知肌醇六磷酸酶在各種酶特性，例如位置特異性和比活性等方面相比被證明是優異的。
現在考慮本發明的肌醇六磷酸酶共有序列對所有的擔子菌肌醇六磷酸酶都是相同的。
本文中擔子菌綱指的是擔子菌類(phyllum Basidiomycota)的微生物。該類群的擔子菌與例如子囊菌類(Ascomycota)一起屬於真菌界。參考文獻有Julich，1981，Higher Taxa of Basidiomycetes；AinsworthBisby，1995，Dictionary of the Fungi；HansenKnudsen(Eds.)，NordicMacromycetes，Vol.2(1992)和3(1997)。另外，真菌分類學資料庫(NIH DataBase(Entrez))可通過國際網際網路上下列網址的internet上得到http//www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxanomy/tax.html。
另外也給出了用PCR篩選這種肌醇六磷酸酶的方法，以及利用重組DNA技術分離和純化這些肌醇六磷酸酶的基本程序。
首先，本發明涉及具有肌醇六磷酸酶活性且衍生自擔子菌類群的分離的多肽。
其次，本發明涉及具肌醇六磷酸酶活性且包含幾個共有序列中的至少一個的分離的多肽。
第三，本發明涉及具有肌醇六磷酸酶活性並由在中度到高度嚴緊條件下與用合適的引物由此處公開的序列排列和靶序列例如DNA文庫衍生的PCR反應產物雜交的DNA編碼的分離的多肽。
第四，本發明涉及具6-肌醇六磷酸酶活性並衍生自真菌的分離的多肽。
第五，本發明涉及具肌醇六磷酸酶活性並與五個特異序列同源的分離的多肽。
另一方面，本發明提供了編碼上述多肽的克隆的DNA序列，以及含有這些克隆的DNA序列的載體和宿主細胞。
在本發明範圍內，在又一方面是本發明的肌醇六磷酸酶從肌醇六磷酸中釋放無機磷酸鹽的用途，以及一些更特定的用途和組合物，尤其是含有本發明的肌醇六磷酸酶的食品和飼料製品和添加劑。
一般而言，此處所用的名詞和短語都是按本領域習慣解釋的。但如有疑問，則應當使用本說明書的定義。
短語「具有/表現出肌醇六磷酸酶活性的分離的多肽/酶」或「分離的肌醇六磷酸酶」意指具肌醇六磷酸酶活性(參看下文)的任何多肽或蛋白質並且其基本上沒有其它非肌醇六磷酸酶多肽，例如由SDS-PAGE測定時至少為約20％純，優選至少約40％純，更優選約60％純，進一步優選約80％純，再優選約90％純，最優選約95％純。有時這種多肽可替代地被稱之為「純化的」肌醇六磷酸酶。
「分離的多肽」的定義還包括融合的多肽或可裂解的融合多肽，其中另外一個多肽被融合到該多肽的或其片段的N端或C端。融合的多肽是由將編碼另一多肽的核酸序列(或其部分)融合到本發明的核酸序列(或其部分)上而產生的。生產融合多肽的技術是本領域已知的，且包括將編碼該多肽的編碼序列連接起來從而其位於框內並且該融合多肽的表達是在同一啟動子和終止子的控制之下。
短語「表現出肌醇六磷酸酶活性的多肽或酶」或「肌醇六磷酸酶」意在包括任何能使無機磷酸鹽或三價磷從各種肌醇磷酸鹽中釋放出來的酶。這種肌醇磷酸鹽(肌醇六磷酸酶底物)是肌醇六磷酸及其任何鹽，例如肌醇六磷酸鈉和肌醇六磷酸鉀或其混合鹽。同樣地，任何肌醇的單-、二-、三-、四-或五-磷酸鹽均有可能作為肌醇六磷酸酶的底物。
根據上述定義，可在使用這些底物中的某一個的任何實驗中測定肌醇六磷酸酶活性。在本文(除非另作規定)中，肌醇六磷酸酶活性是按FYT的單位確定的，一個FYT指的是每分鐘釋放1μmol無機正硫酸鹽的酶量，釋放條件如下pH5.5；溫度37℃；底物肌醇六磷酸鈉(C6H6O24P6Na12)的濃度為0.0050mol/l。實驗部分描述了合適的肌醇六磷酸酶實驗。
「多肽同源性」或「胺基酸同源性」是定義為兩個序列之間相同的程度。同源性可通過本領域已知的適當的電腦程式如GCG第8版程序包(Wisconsin包程序手冊，第8版，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)所提供的GAP來確定。使用GAP時，以下述設定來進行多肽比較GAP創新補償(Creation Penalty)為5.0而GAP延展補償(extenson Penalty)為0.3。
本文中「6-肌醇六磷酸酶」指的是在肌醇六磷酸中首先在6位進行水解的肌醇六磷酸酶或偏愛這些位置的肌醇六磷酸酶(由於此術語包括兩個位置所以用了複數)。尤其是，超過50％的第一步的水解產物是Ins(1，2，3，4，5)P5和/或Ins(1，2，3，5，6)P5。優選這兩種化合物組成至少60％，更優選至少至少70％，再優選80％，尤其優選至少90％以及最優選超過95％的PA的起始水解步驟的產物。
其它的特異性術語例如像「3-肌醇六磷酸酶」，「(3+6)-肌醇六磷酸酶」「6D-肌醇六磷酸酶」和「6L-肌醇六磷酸酶」都作相應的解釋，包括相同的優選實施方案。
術語「克隆到在保藏的E.coli菌株中存在的質粒中的編碼肌醇六磷酸酶的DNA序列部分」以及「在序列表中的編碼肌醇六磷酸酶的相應的DNA序列部分」目前據認為是相同的，因此它們可以互換使用。
首先，與DNA序列一起使用的術語「編碼肌醇六磷酸酶的部分」指的是翻譯成具肌醇六磷酸酶活性的多肽序列的DNA序列的區域。常常這是一個位於第一個「ATG」起始密碼子(mRNA中的「AUG」密碼子)和其後第一個終止密碼子(「TAA」、「TAG」或「TGA」)之間的區域。
但是，按上述翻譯的多肽常常在表現肌醇六磷酸酶活性的成熟序列之外包括一個N-末端信號序列和/或前肽序列。一般而言，該信號肽指導了多肽的分泌，而前肽則指導該多肽的摺疊。進一步的資料請參見Egnell，P.等.Molecular Microbiol.6(9)1115-19(1992)或Stryer，L.，「Biochemistry」W.H.，Freeman和Company/New York，ISBN 0-7167-1920-7。因此，術語「編碼肌醇六磷酸酶的部分」還意在包括相應於翻譯後的多肽的成熟部分的或如果有多個的話，每個這種成熟部分的DNA序列。
而且，編碼仍然保留某些肌醇六磷酸酶活性的多肽片段的這種序列的任何片段都將包括在本定義之內。
分離的DNA分子或者，可替代地，「克隆的DNA序列」「DNA構建體」、「DNA片段」或「分離的DNA序列」指的是根據遺傳工程中所用的標準克隆方法可以克隆的DNA分子或者序列，其中將該DNA片段從其天然位置重新放置到一個不同的位點上，而在該位點上其將被複製。該術語一般指的是基本不含其它核酸序列的核酸序列，例如，以瓊脂糖電泳測定，其至少約為20％純，優選至少約40％純，更優選約60％純，再優選約80％純，還優選約90％純，最優選約95％純。這種克隆方法可能會涉及包括編碼多肽的核酸序列的所需核酸片段的切除和分離，涉及該片段在載體分子中的插入，以及重組載體在宿主細胞中的摻入，而在宿主細胞中該核酸序列的重複拷貝或克隆將會被複製。該核酸序列可能是基因組、cDNA、RNA、半合成的、合成的或其任何組合。
在兩個核酸序列之間的一致性或「同源性」程度可通過本領域已知的電腦程式如GCG程序包(Wisconsin程序包手冊，第8版，GeneticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needlenan，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)Journal of Molecular Biology，48，443-453)所提供的GAP來確定，使用GAP時，以下述設定來進行多肽比較GAP新生補償(Creation Penalty)為5.0而GAP延展補償(extensionPenalty)為0.3。
用於確定給定的DNA或RNA序列是否與特定的核苷酸或寡核苷酸探針「雜交」的合適的實驗條件涉及將含有用以測定雜交的DNA片段或RNA的濾膜預先浸泡在5×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)，(J.Sambrook，E.F.Fritsch，以及T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor，New York)10分鐘、在5×SSC溶液、5×Denhardt′s溶液(Sambrook等，1989)，0.5％SDS和100μg/ml變性的超聲波破碎的鮭魚精DNA(Sambrook等，1989)中將膜進行預雜交，隨後在含有濃度為10ng/ml的隨機引發的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)And.Biochem.1326-13)、32P-dCTP-標記(比活性＞1×109cpm/μg)探針的相同溶液中在約45℃下雜交12小時。
然後將膜在2×SSC、0.5％SDS、至少55℃(低嚴緊度)至少60℃(中度嚴緊度)、至少65℃(中/高嚴緊度)、至少70℃(高嚴緊度)、至少75℃(極高嚴緊度)下洗滌兩遍。
用X-光膜可以檢測到在這些條件下寡核苷酸探針雜交的分子。
已發現有可能在理論上來預測兩個給定的DNA序列是否會在確定的條件下雜交。
因此，作為上述實驗方法的替代手段，對類似的DNA序列是否會與上述的核苷酸探針雜交的確定可以根據在特定條件下(例如於陽離子濃度和溫度)兩個具有已知序列的異源DNA序列將會雜交時的Tm(解鏈溫度)關的理論計算而得。
為了測定異源DNA序列的解鏈溫度(Tm(異))，首先需要測同源DNA序列的解鏈溫度(Tm(同))。
在兩條完全互補的DNA鏈(同源雙鏈形成)之間的解鏈溫度(Tm(同))可用下列公式確定Tm(同)＝81.5℃+16.6(logM)+1.41(％GC)-0.61(％form)-500/L(「現代分子生物學技術」(Current Protocols in Molecular Biology」。JohnWileySons，1995)，其中「M」指的是洗滌緩衝液中的陽離子摩爾濃度，「％GC」DNA序列中鹼基總數裡鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的百分數，「％form」洗滌緩衝液中甲醯胺的百分數，以及「L」DNA序列的長度。
通過上述公式確定的Tm是兩條完全互補的DNA序列間同源雙鏈形成的Tm(Tm(同))。為了將該Tm值適合於兩個異源的DNA序列，可以假定兩條異源序列之間1％的核苷酸差異等於Tm下降1℃(現代分子生物學技術.John WileySons，1995)。因此，發現異源的鏈形成的Tm(異)是從Tm(同)上減去所研究的類似序列和上述的核苷酸探針之間的差異百分數。所要減去的DNA同源百分數是按此處所述(參見上文)來計算的。
術語「載體」意在包括這類術語/物質例如「核酸構建體」、「DNA構建體」、「表達載體」或「重組載體」。
核酸構建體包括本發明的核酸序列，其可操作地連到一個或更多個在與控制序列相容的條件下在適當的宿主細胞中能指導編碼序列表達的控制序列上。
此處所確定的「核酸構建體」是單鏈或雙鏈的核酸分子，其從天然存在的基因中分離到，或者其已被修飾為含有在自然界中不存在的方式結合和並列的核酸區段。
術語核酸構建體可以與表達盒同義，其條件是當核酸構建體含有本發明的編碼序列的表達所必須的全部控制序列。
此處定義的術語「編碼序列」主要包括當置於上述控制序列的控制之下時轉錄成mRNA並翻譯成本發明的多肽的序列。編碼序列的邊界一般通過5′末端的翻譯起始密碼子ATG和3′末端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可以包括但不限於DNA、cDNA和重組核酸序列。
此處所說的「控制序列」包括對核酸序列的編碼序列的表達是必需或有益的所有組分。每個對照序列對編碼多肽的核酸序列而言，可能是天然也可能是外源的。這種控制序列包括但不限於，前導序列，多聚腺苷酸化序列，前肽序列，啟動子，信號序列以及轉錄終止子。至少，控制序列包括啟動子、轉錄和翻譯終止信號。控制序列可能包括用於導入幫助將控制序列和編碼多肽的核酸序列連接起來的特定限制性位點的接頭。
在表達載體中，編碼肌醇六磷酸酶的DNA序列應當可操作地連到適當的啟動子和終止子序列上。啟動子可以是任何在所選擇的宿主細胞中表現出了轉錄活性的DNA序列，而且可能會是衍生自編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質的基因。用於連接編碼肌醇六磷酸酶的DNA序列的方法、啟動子和終止子及將它們插入到的適當的載體對本領域的人是熟知的(參見例如Sambrook等，(1989)，分子克隆實驗室手冊，冷泉港，紐約)。
重組表達載體可以是能夠方便地用於重組DNA程序並可使得核酸序列表達的任何載體(例如，質粒或病毒)。
不止一個拷貝的編碼本發明的多肽的核酸序列可插入到宿主細胞中以擴增核酸序列的表達。核酸序列的穩定擴增可通過本領域熟知的方法將至少一個該序列的額外拷貝整合到宿主細胞基因組中並選擇轉化體而獲得。
用於連接上述元件以構建本發明的重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，同上)。
「宿主細胞」或「重組體宿主細胞」包括由於在複製期間發生突變而與親本細胞不同的親本細胞的任何後代。
細胞優選以包含本發明的核酸序列的載體轉化然後將載體整合到宿主染色體中。
「轉化」意指將含有本發明的核酸序列的載體導入到宿主細胞中，從而載體可保留為染色體整合體或染色體外自我複製載體。整合常被認為是有利的，因為該核酸序列更易於穩定地保持在細胞中。載體在宿主染色體上的整合可按上述通過同源或非同源重組而實現。
宿主細胞可以是單細胞微生物，例如，原核生物，或者非單細胞微生物，例如，真核生物。真核細胞的實例是哺乳動物細胞，昆蟲細胞，植物細胞或真菌細胞。有用的哺乳動物包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，海拉(Hela)細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、COS細胞或者任何其它可獲得的例如來自於美國典型培養物保藏中心無限增殖化細胞系的成員。
在一個優選的實施方案中，宿主細胞是真菌細胞。此處所用的「真菌」包括擔子菌類群、子囊菌類群、壺菌類(Chytridiomycota)和接合菌類(Zygomycota)(如Hawksworth等定義，見Ainsworth and Bisby′s Dictionary ofthe Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK)以及卵菌類(Hawksworth等引用，1995，同上，第171頁)以及所有的有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，同上)。
可通過以本身已知的方式涉及原生質體形成、原生質體轉化以及細胞壁再生的方法來轉化真菌細胞。
本發明還涉及轉基因植物、植物部分，例如植物種子或植物細胞，其已用編碼本發明的肌醇六磷酸酶的DNA序列轉化以來表達或產生該酶。同樣，這類植物或植物部分的成分和用途也包括在本發明的範圍內，尤其是其作為飼料或食品或添加劑，按照本發明的用途和食品/飼料權利要求所述。
該轉基因植物可以是雙子葉也可以是單子葉的，簡稱為單子葉或雙子葉。最大的興趣是這類植物是潛在的食品或飼料成分並包含肌醇六磷酸。飼料成分中正常的肌醇六磷酸水平是0.1-100g/kg，或更常見為0.5～50g/kg，最常見為0.5～20g/kg。單子葉植物的實例是草，例如草坪草(早熟禾屬Poa)，飼料草例如羊茅屬、黑麥草屬、溫和草(temperate grass)，例如剪股積屬以及穀類，例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、水稻、高梁和玉米(玉蜀黍)。
雙子葉植物的實例是豆類、例如羽扇豆屬、豌豆屬、大豆和十字花科(十字花科)、例如花椰菜、油菜和緊密相關的模式生物擬南芥。
例如這些轉基因植物能降解其本身的肌醇六磷酸，因此在含有這些植物的食品或飼料中就有必要減少這些酶的加入量。優選地，植物或植物部分例如種子是碾磨碎的，並且在其被加入到食品或飼料中或使用例如攝取之前還有可能經過浸泡，目的是使酶解的速率調節到實用的程度。
如果需要，也可從植物中回收植物產生的酶。在特定的情況下，從植物中的回收在考慮到隨後可能的壓丸過程中保證熱穩定成分時是優選的。
植物的部分的實例是莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子、塊莖等。而且任何植物組織也包括在本定義中。
不管其組織來源如何，任何植物細胞都包括在上述植物細胞的定義之中。
還包括在本發明的範圍之內的是這些植物、植物部分和植物細胞的後代。
本領域的技術人員知道如何構建DNA表達載體用於插入到所研究的植物中，尤其注意的是是否該酶應當以組織特異性的方法來分泌。與此評價相關的是肌醇六磷酸酶在植物的表達區室中的穩定性(pH穩定性、通過內源蛋白酶等的可降解性)。本領域的技術人員還應當選擇適當的調控序列例如啟動子和終止子序列，以及，有必要，還有信號和轉運序列(Tague等，Plant Phys.86，506，1988)。
植物、植物部分等可使用任何已知的方法以本DNA構建體轉化。這類方法的一個實例是通過病毒或細菌載體例如通過遺傳手段製備的含有編碼本發明的肌醇六磷酸酶的基因的土壤桿菌屬的細菌轉化。直接將肌醇六磷酸酶DNA導入植物細胞或植物組織的方法也是本領域已知的，例如微注射和電穿孔(Gasser等，Science，244，1293；Potrykus，Bio/Techn.8，535，1990；Shimamoto等，Nature，338，274，1989))。
在轉化之後，轉化體用任何本領域技術人員已知方法篩選，隨後再生為整個植株。
這些植物等以及其後代於是就攜帶上了作為其遺傳成分的一部分的編碼肌醇六磷酸酶的DNA。
一般而言，參考文獻見於WO 91114782A和WO 9114772A。
根瘤土壤桿菌介導的基因轉移是選擇用於產生轉基因雙子葉的方法(綜述見HooykasSchilperoort，1992.Plant Mol.Biol.1915-38)。由於宿主範圍的限制，一般而言不可能用根瘤土壤桿菌的幫助來轉化單子葉。所選的用於產生轉基因的單子葉的方法是粒子轟擊法(微粒金或鎢粒，用轉化DNA包裹)胚愈傷組織或發育的胚(Christou，1992.Plant J.2275-281；Shimamoto，1994.Curr.Opin.Biotechnol.5158-162；Vasil等.，1992.Bio/Technology 10667-674)。
還有其它的系統也可用於將游離的DNA運輸到這些植物中，包括病毒載體(JoshiJoshi，1991.FEBS Lett.2811-8)，通過聚乙二醇或電穿孔的原生質體轉化(綜述見Potyrkus，1991.Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.42205-225)，DNA到葉肉原生質體中的微注射(Crossway等，1986.Mol.Gen.Genet.20279-85)，DNA到禾穀植物幼嫩成花分櫱中的宏注射(macroinjection)(de la Pena等，1987.Nature 325274-276)為優選方法。
一般而言，編碼本發明的肌醇六磷酸酶的cDNA或基因是置於一個表達盒(例如Pietrzak等，1986-Nucleic Acids Res.145857-5868)中的，該盒由在靶植物中有活性的一個合適的啟動子以及一個合適的終止子(轉錄的終止)組成。這個盒(當然包括合適的選擇性標記，見下)轉入植物中的方法與單子葉植物通過粒子轟擊轉化的方法類似。在雙子葉的情況下，首先將表達盒置於合適的提供T-DNA邊界和合適的選擇性標記的載體中，然後將該載體轉入根瘤土壤桿菌中。通過標準方法(例如Akama等，1992。Plant CellReports 127-11)通過攜帶表達盒和側面帶有T-DNA的選擇性標記的土壤桿菌轉化雙子葉。最近已綜述了T-DNA從農桿菌到植物細胞的轉化(ZupanZambryski，1995.Plant Physiol.1071041-1047)。用於通過土壤桿菌進行植物轉化的載體是市場上可以買到的並且可以從構建這類載體的許多實驗室獲得(例如Deblaere等，1985，Nucleic Acids Res.134777～4788；綜述參見Klee等，1987。Annu.Rev.Plant Physiol.38467-486)。
可獲得的植物啟動子取決於所使用的方法，可能需要器官和/或細胞特異性表達以及適當的發育和環境對照。例如，期望在玉米胚乳等中表達肌醇六磷酸酶cDNA。最常用的啟動子是組成型的35S-CaMV啟動子(Franck等，1980.Cell 21285-294)。在整個植株中表達將大體上是平均的。該啟動子已成功地用於製備抗除草劑或抗病原植物(綜述於StittSonnewald，1995.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.46341-368)。已有報導說可將特異性的啟動子用於保藏貯存光合產物的植株部分組織，例如種子、馬鈴薯塊莖和水果(EdwardsCoruzzi，1990.Annu.Rev.Genet.24275-303)，以及用於代謝貯存光合產物的植株部分組織例如分生組織(Ito等，1994.PlantMol.Biol.24863-878)。
用於培養轉化的宿主細胞的培養基可以是任何適於所研究的宿主細胞生長的常規培養基。所表達的肌醇六磷酸酶可以方便地分泌到培養基中並且可能通過熟知的方法回收，這些方法包括離心或過濾、用鹽例如硫酸銨沉澱培養基中的蛋白質組分，隨後進行色譜分析，例如離子交換色譜、親和色譜，諸如此類。
優選的宿主細胞是鐮孢屬、木黴屬和麴黴屬的菌株，尤其是禾穀鐮孢、Fusarium Venenatum、Fusarium Cerealis、具有與鐮孢屬ATCC 20334相同的特徵的鐮孢菌，其進一步描述於PCT/US/95/01743中，Trichodermaharzianum或Trichoderma reesei，黑色麴黴或米麴黴。
附圖簡要描述在下面的本發明的詳細描述中，參考見附圖，其中

圖1為phy AcDNA的核苷酸序列以及來自於Peniophora lycii(信號肽帶框，用於cDNA克隆的限制性位點有下劃線)的PHYA肌醇六磷酸酶的推斷的一級結構；圖2為來自於平田頭菇(Agrocybe pediades)的肌醇六磷酸酶的核苷酸序列，如圖1；圖3為第一個肌醇六磷酸酶的核苷酸序列，該酶為PHYA1，來自於Paxillus involtus，如圖1，不過框表示的是信號肽的Signal PV1.1預測；圖4為第二個肌醇六磷酸酶PHYA2的核苷酸序列，其來自於Paxillusinvoltus，如圖3；圖5為來自於絨毛栓菌的肌醇六磷酸酶的核苷酸序列，如圖3；圖6為圖1～5編碼的肌醇六磷酸酶的推斷的胺基酸序列的序列對比，在至少三個序列中的相同殘基以灰色方框示之；圖7為圖6的5個肌醇六磷酸酶與全部屬於子囊菌的真菌類群5個已知肌醇六磷酸酶的序列對比，在至少七個序列中相同的殘基用灰色方框示之；圖8為隔孢伏革菌屬肌醇六磷酸酶的pH活性曲線；圖9為其pH穩定性曲線；
圖10為其溫度活性曲線；圖11為其溫度穩定性曲線；圖12為其差示掃描量熱法(DSC)曲線；圖13～14 NMR譜，堆積圖(stacked plot)(至24小時)，分別顯示了黑色麴黴和隔孢伏革菌屬肌醇六磷酸酶的產品分布(product profiling)；圖15～16如上的NMR譜，但堆積繪圖至4.5小時；圖17～19分別為20分鐘(pH5.5)，24小時(pH5.5)和20分鐘(pH3.5)後觀察所得的NMR曲線；圖20為分別顯示了Ins(1，2)P2和Ins(2)P的濃度對時間的曲線；圖21～22為分別顯示了在pH5.5和pH3.5時無機磷酸從玉米中的釋放對時間的曲線；圖23為田頭菇屬肌醇六磷酸酶的pH活性曲線；圖24為其pH穩定性曲線；圖25為其溫度活性曲線；圖26為其溫度穩定性曲線；圖27為其差示溫度量熱法(DSC)曲線；圖28-29為分別顯示黑色麴黴和田頭菇屬肌醇六磷酸酶的產品分布的NMR譜，堆積圖(至24小時)；圖30～31為上述的NMR譜，但層積圖為至4.5小時；圖32-33分別為20分鐘和24小時後觀察所得的NMR曲線；圖34～35分別為顯示Ins(1，2)P2和Ins(2)P的濃度對時間的曲線；圖36-37分別為顯示無機磷酸在pH5.5和pH3.5下從玉米中的釋放對時間的曲線；以及圖38 1D-和1L-肌醇-1-磷酸鹽(P＝-OPO3-2)的結構。
保藏得到的本發明的肌醇六磷酸酶的Peniophora lycii，平田頭菇(Agrocybepediades)、Paxillus involtus和絨毛栓菌(Tranetes pubescens)菌株的分離物已根據《國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約》保存於真菌菌種保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures，P.O.Box 273，3740 AGBaarn，荷蘭)，(CBS)，如下所示保藏日1996年12月4日保藏人號NN 006113CBS編號Peniophora lycii CBS No.686.96保藏日1996年12月4日保藏人號NN 009289CBS編號平田頭菇(Agrocybe pediades)CBS號900.96保藏日1997年11月28日保藏人號NN 005693CBS編號Paxillus involtus CBS No.100231保藏日1997年11月28日保藏人號NN 009343CBS編號絨毛栓菌(Trametes pubescens)CBS No.100232而且，含有編碼本發明的這些肌醇六磷酸酶的全長cDNA序列的表達質粒(穿梭載體)pYES 2.0已被轉化到大腸桿菌菌株中，而此菌株已根據《國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約》保存於德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikcroorganismen und Zellkulturen GmbH.Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德國，(DSM)，分別如下(Paxillus involtus的兩個肌醇六磷酸酶)；保藏日1996年12月2日保藏人號NN 049282DSM編號大腸桿菌DSM No.11312保藏日1996年12月2日保藏人號NN 049283DSM編號大腸桿菌DSM No.11313保藏日1997年11月12日保藏人號NN 049342
DSM編號大腸桿菌DSM No.11842保藏日1997年11月12日保藏人號NN 049343DSM編號大腸桿菌DSM No.11843保藏日1997年11月12日保藏人號NN 049344DSM編號大腸桿菌DSM No.11844發明詳述衍生自擔子菌綱的本發明的肌醇六磷酸酶優選衍生自腹菌類(Gasteromycetes)、層菌類(Hymenomycetes)、Urediniomycetes、Ustilaginomycetes或來自於未分類的擔子菌類(Basidiomycota)，更優選來自於層菌綱類(Hymenomycetes)。
衍生自層菌綱的肌醇六磷酸酶優選來自以下各目中的菌株蘑菇目、Aphyllophorales、木耳目(Auriculatiales)、Boletales、Cantharellales、Ceratobasidiales、Dacrymycetales、Echinodontiaceae、Hericiales、Stereales、Thelephorales、Tremellales、Tulasnellales或來自於有絲分裂孢子的層菌綱。
其它優選的目是Coriolales、Hyphodermatales、Schizophyllales、Hymeno chaetales和Phanerochaetales。
在下文中列舉了這些目中一些優選的科，在每個科名後面的括號中還附加了各科中的優選的屬的實例。
優選的Aphyllophorales目的科有多孔菌科(polyporaceae)(例如栓菌屬、煙管菌屬、耙菌屬、銳孔菌屬、Trichaptum、迷孔菌屬、層孔菌屬)，粉孢革菌科(Coniophoraceae)(例如粉孢革菌屬)、伏革菌科(例如hyphoderma屬、trechispora屬、Steccherinum屬Merulius屬、隔孢伏革菌屬)，裂褶菌科(例如裂褶菌屬)。
優選的蘑菇目的科有Bolbitiaceae(例如田頭菇屬、Conocybe屬、Bolbitius屬)、Coprinaceae(例如Coprinus屬、Panacolus屬)、Pluteaceae(例如Volvariella屬)、蓑蕈菌科(例如Podaxis屬)、口蘑菌科(Tricholomataceae)(例如Marasmiellus屬、Strobilurus屬、Lyophyllum屬、Cystoderma屬、Merismodes屬)、Strophariaceae科(例如Stropharia屬、Hypholoma屬)。
優選的Auriculariales目的科有Exidiaceae科(例如Exidia屬)。
優選的Dacrymetales目的科有Dacrymycetaceae科(例如Femsjonia屬)。
優選的Stereales目的科是Hyphodermataceae(例如Hyphodontia屬)和Stereaceae科(例如Amylostereum和Stereum屬)。
優選的Boletales目的科是Paxillaceae(例如Paxillus屬和Hygrophoropsis屬)。
優選的Thelophorales目的科是Thelephoraceae(例如Typhula屬)。
上述屬中一些優選菌株的實例為Stropharia cubensis(尤其是ATCC13966)，平田頭菇(尤其是CBS 900.96)，黑刺煙管菌(尤其是CBS 580.95)，Trametes Zonatella，絨毛栓菌(尤其CBS100232)，Paxillus involtus(尤其CBS100231)，Trametes hirsuta(尤其是DSM 2987)，櫟隔孢伏革菌，Hyphoderma argillaceum，裂褶菌(尤其是CBS 443.97)，Peniphora lycii(尤其是CBS 686.96)，Amylostereum Chailletii，銳孔菌(尤其是CBS 422.97)。優選菌株的進一步的實例列於實施例5，表6中。
權利要求2的肌醇六磷酸酶有14個相同的部分胺基酸序列中至少一個，即所謂的共有序列，即在序列表中為序列號1-14。
在序列表中，使用三字母的胺基酸編碼，一些胺基酸被命為Xaa，其基本意義為「任何胺基酸」，解釋如下。然而在一些這種Xaa位置上，在序列表中使用了標註以用例如在NN位置上的X表明任何兩個胺基酸，參見下文。名在權利要求中，在這些序列中使用了胺基酸單字母編碼，「X」代表任何胺基酸，包括任何非天然的胺基酸以及包括任何其結構或功能上的相似變體。編號例如「[A/E]」意指胺基酸A和E中的任何一個。因此，如果在任何給定的式子的部分序列中有兩個這種的多重選擇存在，式子覆蓋的序列數為22。類似地，如果在一個給定的式子中有「N」這樣的多重選擇，這種式子數為覆蓋的序列數為2N。
序列號1-9從多肽的N端到C端的順序排列。序列號10到14為相應於實施例5中具體所列的PCR探針的胺基酸序列(即分別相應於522有義和540反義；537有義；538有義；525反義和539反義引物)。
在優選實施方案中，分離的多肽包括序列號1-14的至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個或所有十四個序列，其優選在權利要求3中所顯示的位置上。權利要求3也可參考圖6的序列對比。
權利要求4的胺基酸序列對涉及實施例5和6的PCR實驗(即所建議的那些引物對)。
另外，有些缺失看起來是此肌醇六磷酸酶亞群的特徵。在權利要求5中列出了一些特定缺失的區域。該權利要求也可參見圖6的序列對比。
尤其根據圖7所示的序列對比鑑定了這些部分序列。在這些序列對比中，上面的5個肌醇六磷酸酶，即phyA1_P.involtus，phyA2_P.involtus，phyA_T.pubescens，phyA_A.pediades和phyA_P.lycii都衍生自擔子菌綱並如此處的實驗部分所述進行克隆。在序列對比的底部所列的5個肌醇六磷酸酶均衍生自子囊菌綱並且其序列在前面所提到的現有技術中是已知的。有關此序列對比的進一步的細節和解釋請參見實施例4，篩選此亞群的肌醇六磷酸酶的一種方法請參見實施例5。實施例8-18描述了本發明的5個肌醇六磷酸酶的純化和表徵，即Peniophora lycii，平田頭菇、Paxillus involtus和Trametes Pubescens的肌醇六磷酸酶。
權利要求6-8涉及實施例5、6和7的實驗。相應於術語「中到高度嚴緊度」的條件可見於上述的基本定義中，即洗滌條件為2×SSC及65℃的溫度。優選地，洗滌溫度為65℃或更高，例如70、75、80或甚至85℃，相當於高嚴緊度、相當高的嚴緊度和極高嚴緊度。
優選地，PCR反應可用模板或靶序列，例如核苷酸序列，其可以是例如基因組DNA或cDNA。然而，例如也可將mRNA用作模板。基因組DNA不必進行分離，PCR反義也可直接在例如真菌菌絲體上進行。
可替換地，PCR反應也可用其任何PE變體的野生型基因進行。尤其是，在野生型基因上用至少一個引物對得到了至少一條PCR帶。
在實驗部分建議了用於PCR反應的一些特定引物。但是，本領域技術人員首先能夠從圖6的序列對比(擔子菌綱肌醇六磷酸酶)中提出其它特定的引物，其引物看起來是擔子菌綱肌醇六磷酸酶的特徵，即他也必須考慮圖7的序列對比(表明了擔子菌綱肌醇六磷酸酶以及已知的子囊菌綱肌醇六磷酸酶)。因此，權利要求6一般指的是這些引物，即根據其基本常識及圖6和7的序列對比，本領域技術人員將會提出的對子囊菌肌醇六磷酸酶特異性的引物。
關於6-肌醇六磷酸酶，本發明涉及這類衍生自任何真菌的肌醇六磷酸酶。「真菌的」根據上面描述而且該術語包括尤其是擔子菌綱。在此文的一般定義部分有如何理解該特異性的解釋。在本文中應注意到「6-肌醇六磷酸酶」的概念意指D6-、L6-或D/L-6-肌醇六磷酸酶。令人驚奇的是，已證明這類真菌6-肌醇六磷酸酶與已知的真菌3-肌醇六磷酸酶相比具有極優異的表現，此處對實施例10-12的參考文獻揭示了隔孢伏革菌屬肌醇六磷酸酶是一種6-肌醇六磷酸酶以及與已知的麴黴屬肌醇六磷酸酶相比具極優異的表現。尤其是，例如PA水解的起始速率上升了並且此事實的一個相當令人信服的解釋是這種肌醇六磷酸酶是一種6-肌醇六磷酸酶，其原因是這些位置(PA的4-和6-位)比任何其它位置的空間阻礙都要少。
優選地，真菌6-肌醇六磷酸酶是擔子菌類肌醇六磷酸酶，更優選是標題為「發明詳述」的本部分開始時中所描述的綱、亞綱、目、種和菌株的。在另外的優選的實施方案中該肌醇六磷酸酶是D6-肌醇六磷酸酶。在另外再一個實施方案中該肌醇六磷酸酶是L6-肌醇六磷酸酶。
如權利要求32-36所明確的一樣，該申請也涉及例如真菌6-肌醇六磷酸酶在飼料和食物中的用途，含有這類真菌6-肌醇六磷酸酶的組合物，尤其是食物和飼料添加劑，以及在從肌醇六磷酸和肌醇六磷酸鹽中釋放無機磷酸鹽中這種真菌6-肌醇六磷酸酶的用途。
在權利要求1-8的優選實施方案中，該肌醇六磷酸酶為(3+6)-肌醇六磷酸酶，即任何D3-/D6-；L3-/L6-；D3-/L6-；L3-/D6-肌醇六磷酸酶，參考尤其見於本文中涉及田頭菇屬肌醇六磷酸酶的實施例15～17，該酶與已知的麴黴肌醇六磷酸酶相比也有更優越的表現。
優選地，(3+6)-肌醇六磷酸酶為擔子菌類肌醇六磷酸酶，更優選地為標題為「發明詳述」的本部分開始時的綱、亞綱、目、種和菌株的。
更優選地，(3+6)-肌醇六磷酸酶稍優選這些位置中的一個，尤其是6-位。
權利要求11、14、17、19和21的肌醇六磷酸酶分別與平田頭菇、Peniophora lycii、Paxillus involtus(phyA1和phyA2)以Trametes pubescens的分離的肌醇六磷酸酶，分別相應於序列號22，24，26，28和30(或其成熟的多肽或仍然保留了肌醇六磷酸酶活性的任何片段)有50％同源性。「同源的」定義請參見標題為「基本定義」的部分。與已知肌醇六磷酸酶的同源性可尤其從實施例4中的表1中顯現出來了。優選地，參見上文的片段的胺基酸的數目至少為50％，更優選為至少60％，還優選至少為70％，又優選至少80％，尤其至少為90％的序列表中所列的序列的胺基酸數目。這也用於公開於本文的任何多肽片段。
優選地，本申請的所有胺基酸同源性至少為55％，或至少為60％，或至少為65％，尤其為至少為70％。優選地，同源性的程度至少為80％，更優選至少90％，再優選至少95％，尤其至少97％。
權利要求12涉及衍生自田頭菇屬的序列號22的胺基酸序列的特定片段，然而這些片段仍然表現了肌醇六磷酸酶活性。如在下面的實施例部分(實施例13-15)描述了更多的細節，當在酵母中表達時，約80％的田頭菇屬肌醇六磷酸酶具有Val的N端胺基酸(序列號22的胺基酸號27)，然而約有20％的N端胺基酸為Thr(序列號22的胺基酸號25)。當在麴黴屬中表達時，約2/3的N端胺基酸為Phe(序列號22中的胺基酸號31)，然而約1/3具有Gln的N端胺基酸(序列號22中的胺基酸28)。因此，至少有這些四個可能的成熟的胺基酸序列。
類似地，權利要求15涉及衍生自隔孢伏革菌屬的序列號24的胺基酸的片段，然而還表現出了肌醇六磷酸酶活性。如同下文的實施例所描述的細節一樣，當在麴黴中表達時，隔孢伏革菌屬肌醇六磷酸酶的N端胺基酸序列為Leu-Pro-Ile-Pro-Ala-Gln-Asn-(序列號24中胺基酸號31-37)。因此序列號24胺基酸號31-439的序列目前據信是成熟的肌醇六磷酸酶序列。
權利要求13、16、18、20和22涉及分別與平田頭菇、Peniophoralycii、Paxillus involtus(phyA1和phyA2)和Trametes pubescens的分離的肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶。
這些肌醇六磷酸酶此處定義是被肌醇六磷酸酶編碼部分所編碼的，這些部分為i)分別為序列表中序列號為21、23、25、27和29(Paxillus involtus的phyA1和phyA2)的DNA序列；或者ii)分別克隆到大腸桿菌DSM 11313、11312、11842、11843和11844中存在的質粒pYES 2.0中的DNA序列；或至少與其有50％同源性的其類似物或衍生物。
有關「肌醇六磷酸酶編碼部分」的定義請參見基本定義部分。
該5個DNA序列可直接得自於保藏的親本菌株或得自保藏大腸桿菌，方法為通過本領域已知的方法從質粒DNA中提取(Sambrook等(1989)分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)。
權利要求23-26涉及編碼本發明的肌醇六磷酸酶的核苷酸序列，尤其涉及DNA分子。
權利要求24的DNA分子包括至少一個此處暗示的特定引物。在優選的實施方案中，其包括至少兩個、三個、四個、五個或六個這些序列。
此處通過編碼肌醇六磷酸酶定義的權利要求25的DNA分子，選自(a)田頭菇屬、Peniophora、Paxillus和Trametes肌醇六磷酸酶(Paxillus的phyA1和phyA2)的特定的核苷酸序列，例如在序列表中所示的具有所示的序列號的DNA(或它們的互補鏈)；(b)與(a)所示的相同的序列但通過保藏的質粒克隆表達；(c)與這些序列至少有55％同源性的序列；(d)在低嚴緊條件下與(a)或(b)的序列雜交的序列；(e)由於遺傳密碼的簡併性不雜交但編碼特定多肽或其肌醇六磷酸酶活性片段的序列。
對於「雜交」的定義，請參考標題為「基本定義」的部分，其中也列舉了一些優選的雜交條件。
對於特徵(c)中的同源部分，其與標題(a)和(b)下所確定的核酸序列的同源性程度至少約為55％(還編碼一條展現肌醇六磷酸酶活性的多肽)。尤其是，該同源性至少為60％，或至少為65％，尤其至少為70％，優選至少約80％，更優選至少約90％，再優選至少約95％，最優選至少約97％。尤其是，同源性的程度是根據與所列的全序列或它們的互補鏈或其相應於「成熟」肌醇六磷酸酶的任何亞序列相比較而來的。
本發明的所選擇的肌醇六磷酸酶的DNA與已知肌醇六磷酸酶的同源性尤其顯示於實施例4的表1中。
核苷酸權利要求26涉及多肽權利要求6-8，而且關於這些權利要求的相應的優選實施方案也在此處併入涉及此DNA權利要求(參考實施例5、6和7；「中到高嚴緊度」指的是洗滌條件為2×SSC和65℃的溫度，優選為65℃或更高，例如70、75、80或甚至85℃；PCR反應優選以靶核苷酸序列進行，例如DNA，像基因組DNA或cDNA(或mRNA)；任何其PE變體的野生型基因)。
本發明的DNA序列也可通過任何基本的方法克隆，這些方法涉及·從任何期望可產生所研究的肌醇六磷酸酶的生物體中將cDNA文庫克隆到適當的載體中，·用所說載體轉化適當的酵母宿主細胞，·在適當條件下培養宿主細胞以表達cDNA文庫中的克隆所編碼的所研究的任何酶，·通過測定由這類克隆所產生的酶的任何肌醇六磷酸酶活性而篩選陽性克隆，以及·從這類克隆中分離編碼該酶的DNA。
在WO 93/11249和WO 94/14953中已公開了基本的分離方法，其內容在此處用作參考。在實驗部分給出了篩選方法的詳細描述。
權利要求27涉及可衍生自圖6的序列對比的引物、探針、寡核苷酸分子/DNA分子。只有特異於或獨特於本發明的新的肌醇六磷酸酶當然包括於本文中，即人們也必須考慮圖7的序列對比(參見上述權利要求6-8的標註)。
鑑定進一步產生肌醇六磷酸酶的細胞，尤其是微生物的方法公開於權利要求31中。尤其是該方法也是一種選擇或篩選產生肌醇六磷酸酶的微生物的方法。此處的「細胞」的概念一般被定義為基本定義部分的術語「宿主細胞」。優選的細胞是微生物細胞，尤其是真菌細胞，優選是擔子菌類。更優選的擔子菌細胞列於本發明的詳述的最開始部分。
任何來源，尤其是任何微生物能被選擇以提供模板或靶序列，通常以基因組DNA、cDNA或mRNA的形式。
有關PCR反應的一般參考包括標準反應條件可見於實驗部分。關於適當的引物的選擇可參考上述對權利要求6-8的標註。
優選地，必須確證衍生自模板的擴增的PCR片段是特異性的。
適當的鑑定程序的一些實施例為a)在瓊脂糖凝膠中的電泳表明相應於擴增的PCR片段的PCR帶的存在；以及，如果有必要，還有
b)按預期控制擴增的PCR片段的大小；以及如果有必要，還有c)分離並測序該PCR片段或帶以表明與親本序列的高度同源性，而引物衍生於該親本序列。
增b)內含子的潛在存在(一個實例300個鹼基中的50個)是使得序列大小不完全一致的原因之一。優選地，所擴增的PCR片段(包括內含子)例如通過鹼基的數目測定大小，該數目在親本序列的引物之間的鹼基/核苷酸數目的50-150％、60-140％、70-130％、80-120％、85-115％、90-110％、95-105％的範圍內(圖6)，引物衍生自該親本序列。在另外的優選實施方案中(除去了內含子)，所擴增的PCR片段的大小在親本序列的引物之間的鹼基數目的80-120％、85-115％、90-110％、95-105％的範圍內(圖6)，引物衍生自該親本序列。
增c)優選同源性的程度超過50、60、70、75、80、85、90、95％的同源性(如上述所確定)。可替換地，還要檢定所擴增的PCR片段是否包括引物對間的至少一個保守區域，所說的保守區域示於圖6中的灰色陰影。優選地，該片段包括至少兩個、三個、四個、五個等或所有這些保守區域。檢測同源性的其它方法是通過檢測作為圖6的親本序列的特徵的缺失區域的存在。另一種檢測同源性的方法是檢測保守區域之間的特徵距離，參見例如權利要求5。
權利要求34涉及製備肌醇六磷酸酶的多肽的方法，所說的方法邏輯上類似於權利要求31的篩選方法。
權利要求34的步驟a)+d)涉及從野生型細胞，尤其是微生物菌株中製備肌醇六磷酸酶。
步驟b)+d)涉及從a)鑑定的生產肌醇六磷酸酶的細胞，尤其是微生物克隆編碼全長肌醇六磷酸酶的基因，並將此基因轉入到異源或同源宿主細胞中，其可以使用任何傳統的重組DNA技術，例如此前所述的和一般所指的例如Maniatis(上面引用)。
步驟c)+d)涉及使用擴增的PCR片段作為雜交探針來識別和分離編碼肌醇六磷酸酶的DNA分子(編碼肌醇六磷酸酶的基因或基因的編碼肌醇六磷酸酶的部分)的用途。這種DNA分子可從任何來源(靶序列，模板)，包括多核苷酸，例如基因組DNA，cDNA，mRNA中分離。
雜交實驗尤其是雜交條件，包括優選條件，以及分離程序基本描述於前文中。
一旦分離出來，就將該DNA分子轉到宿主細胞中，並且也基本描述於前文中。
最後，本發明還一般涉及根據權利要求1-22中任一項的多肽從任何肌醇六磷酸酶底物中釋放(或催化其釋放)三價磷，尤其是從肌醇六磷酸鹽或肌醇六磷酸中釋放無機磷酸鹽的用途；可替換地將肌醇六磷酸轉化為無機磷酸本發明的肌醇六磷酸酶鹽和(肌醇和/或其單、二、三、四、五磷酸酯)的用途。該權利要求包括其中能表現如前述的肌醇六磷酸酶活性的任何方法。
根據本發明的更具體的用途是人類食品或動物飼料製品或用於此類製品的添加劑，其中肌醇六磷酸酶尤其用於以下目的(i)降低糞尿中的肌醇六磷酸水平；(ii)增進消化、刺激生長，或促進食品和飼料的利用或其轉化效率，尤其是通過製備可獲得的蛋白質，否則其已被肌醇六磷酸結合，(iii)預防營養不良或疾病例如由缺乏必需離子和磷酸鹽引起的貧血，即促進礦物質的生物利用率或增加其吸收，使其不再有必要加入額外的磷酸鹽和離子等。
尤其是，本發明的肌醇六磷酸酶也可用於雞食中以提高蛋殼質量(減少由於破裂引起的損失)，參見例如The Merk Veterinary Manual，(第七版，MerckCO.，Inc.，Rahway，N.J.，U.S.A.，1991；第1268頁)；Jeroch等；Bodenkultur第45卷，第4冊第361-368頁(1994)；Poultry Science，第75卷，第一冊，第62-68頁(1996)；Canadian Journal of Animal Science第75卷，第3冊，第439-444頁(1995)；Poultry Science第74卷，第5冊，第784-787頁(1995)和Poultry Science第73卷，第10冊，第1590-1596頁(1994)。
「飼料」或「食品」分別意指任何天然或人工的食物、飲食等或飲食成分，其分別被動物或人打算或適於食用、吸收、消化。
肌醇六磷酸酶可在體外或體內發生作用，即分別在個體的攝入前或胃中發揮作用。同樣，結合的作用也是可能的。
根據本發明的肌醇六磷酸酶組合物總是包括至少一個本發明的肌醇六磷酸酶。
一般而言，肌醇六磷酸酶組合物是液體或乾物質。
液體組合物不必含有任何肌醇六磷酸酶之外的物質，優選以高純的形式。然而常常也會加入穩定劑例如甘油、山梨醇或單丙二醇。該液體組合物還可能包括其它添加劑，例如鹽、糖、防腐劑、pH調節劑、蛋白質、肌醇六磷酸鹽(肌醇六磷酸酶底物)。典型的液體組合物是基於水或油的漿料。在食品或飼料的一個可選的壓片過程後可在其中加入該液體組合物。
乾物質組合物可以是噴霧乾燥的組合物，其中該組合物無需含有除乾燥形式的酶之外的任何其它物質。然而乾燥組合物是所謂的顆粒，其常常可方便地與例如食品或飼料成分混合，或更優選地，形成預混物的組分。酶顆粒的顆粒大小優選與混合物中的其它成分相容。這提供了一種方便安全的方法來將酶摻到例如動物飼料中。
在高切力混合器(例如Lodige)中用附聚技術製備附聚顆粒，其中填充材料和酶共聚在一起形成顆粒。通過將載體材料核心來吸收或以酶包被製備吸收顆粒。
典型的填充材料是鹽例如硫酸二鈉。其它的填充劑為高嶺土、滑石、矽鋁酸鎂和纖維素纖維。可選地，結合劑例如糊精也包括在附聚顆粒中。
典型的載體材料是澱粉，例如以木薯、玉米、馬鈴薯、水稻和小麥的形式。也可以使用鹽。
可選地，顆粒以包被混合物包裹。這類混合物包括包被劑、優選憎水包被劑、例如氫化棕櫚油和牛脂，而且如果有必要，其它添加劑，例如碳酸鈣或高嶺土。
額外地，肌醇六磷酸酶組合物可包含其它取代成分，例如著色劑、香味化合物、穩定劑、維生素、礦物質、其它飼料或食品增進酶等。這就是特別地所謂的預混物。
「食品或飼料添加劑」是基本上純的化合物或多成分組合物，其打算或適於加到食品或飼料中。尤其硫是其為一種其目的是作為食品或飼料產品的成分或影響食品或飼料產品的任何特徵的物質。其製備如上述的肌醇六磷酸酶組合物。典型的添加劑常常含有一種或多種化合物例如維生素、礦物質或飼料增進酶並有適當的載體和/或賦形劑。
在一個優選的實施方案中，本發明的肌醇六磷酸酶組合物額外包括有效量的一種或更多的飼料增進酶，尤其是選自包括下列組中的酶的飼料增進酶，這些酶包括α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶，尤其乳糖酶，其它肌醇六磷酸酶、β-葡聚糖酶、尤其內-β-1，4-葡聚糖酶和內-β-1，3(4)-葡聚糖酶、纖維素酶、木糖苷酶(Xylosidases)，半乳聚糖酶，尤其是阿拉伯半乳聚糖內-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖內-1，3-β-半乳糖苷酶，內葡聚糖酶，尤其是內-1，2-β-匍聚糖酶，內-1，3-α-葡聚糖酶，以及內-1，3-β-葡聚糖酶，果膠降解酶，尤其是果膠酶、果膠酯酶、果膠裂解酶、聚半乳糖醛酸酶，阿拉伯聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸乙醯酯酶、鼠李半乳糖醛酸-α-鼠李糖苷酶，果膠酸酯裂解酶，以及α-半乳糖醛苷酶(galacturonisidases)、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙醯酯酶、木聚糖乙醯酯酶、蛋白酶、木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶及脂解酶例如脂酶、磷脂酶及角質酶(Cutinases)。
本發明的動物飼料添加劑在進食之前或同時補充到單胃動物。優選地，本發明的動物飼料添加劑是在進食的同時添加給單胃動物的。在一個更優選的實施方案中，加到飲食中的動物飼料添加劑的形式是顆粒或穩定的液體。
食品或飼料中有效量的肌醇六磷酸酶從約10～20.000；優選從約10到15.000，更優選從約10到10.000，尤其從約100到5.000，特別從約100到約2.000FYT/kg飼料或食品。
本發明的肌醇六磷酸酶的其它特定用途的實例是在大豆加工和在肌醇或其衍生物生產之中。
本發明還涉及降低動物糞尿中肌醇六磷酸酶水平的方法，其中用含有有效量的本發明的肌醇六磷酸酶的飼料來餵養動物。如在本申請開頭時所指出的，其一個重要的效應是減少環境中的磷酸鹽汙染。
也在本發明的範圍內的是本發明的肌醇六磷酸酶在製備食品或飼料製品或添加劑時的用途，即肌醇六磷酸酶僅在製備時發揮其肌醇六磷酸酶活性而在成品食品或飼料產品中是無活性的。這方面涉及例如生麵團製備和烘烤。
本發明還涉及所保藏的微生物的基本純淨的生物培養物和包含作為其遺傳部件一部分的編碼本發明的肌醇六磷酸酶的DNA序列的菌株。包括在基本純淨的生物培養物的定義範圍內的保持了編碼肌醇六磷酸酶的能力的所說菌株的任何突變體。
在下面的實施例中進一步描述了本發明的細節，實施例在任一方面都並非意在限制本發明的範圍。實施例材料和方法培養基是肌醇六磷酸複製板加到200ml融化的SC瓊脂上20ml 20％半乳糖800μl 5％蘇氨酸25ml溶液A25ml溶液B200μl微量元素溶液(DSM目錄141)溶液A6克CaCl2，2H2O8克MgCl2，6H2O加入ddH2O到1升pH＝6.5溶液B35.12克肌醇六磷酸鈉加入H2O到1升pH＝6.5培養基A酵母氮鹼基W/O胺基酸(Difco 0919)7.5g/l琥珀酸(Merck 822260) 11.3g/lNaOH(Merck 6498) 6.8g/l酪蛋白水解物W/O維生素(Difco 0288) 5.6g/l色氨酸(Merck 8374) 0.1g/l蘇氨酸 1.0g/l肌醇六磷酸鈉(35.12g/l pH6.5) 125ml/l半乳糖 20.0g/l微量金屬(DSM 141) 1.0ml/l加H2O至1升微量金屬溶液次氮基三乙酸1.50gMgSO4，7H2O 3.00gMnSO4·2H2O 0.50gNaCl1.00gFeSO4，7H2O 0.10gCoSO4·7H2O 0.18gCaCl2，2H2O 0.10gZnSO4，7H2O 0.18gCuSO4，5H2O 0.01gKAl(SO4)2，12H2O0.02gNa2MoO4，2H2O 0.01gNiCl2，6H2O 0.025gNa2Se3O，5H2O 0.30g無菌水 至1升pH7.0首先溶解次氮基三乙酸並用KOH調至pH6.5，然後加入礦物質。終pH7.0(用KOH)。培養基B除了所加的碳源為葡萄糖而非半乳糖之外，類似於培養基A。YPD10克酵母提取物，20克腖，加H2O至900ml。高壓滅菌，加入100ml20％葡萄糖(無菌過濾過的)。
YPM10克酵母提取物，20g腖，加H2O到900ml。高壓滅菌，加入100ml 20％麥牙糖糊精(天菌過濾的)10×Basal鹽75克酵母氮鹼，113克琥珀酸，68克NaOH，加H2O到1000ml，無菌過濾。SC-URA100ml 10×Basal鹽，28ml 20％無維生素酪蛋白水解物，10ml 1％色氨酸，加水至900ml，高壓滅菌，3.6ml 5％蘇氨酸和100ml 20％葡萄糖或20％半乳糖。
SC-瓊脂SC-URA，20g/l瓊脂加入。
SC-變體瓊脂20g瓊脂，20ml 10×Basal鹽、H2O加至900ml，高壓滅菌肌醇六磷酸酶活性測試可通過下述試驗來測定肌醇六磷酸酶活性將10μl稀釋過的酶樣品(稀釋於0.1M乙酸鈉，0.01％Tween 20，pH5.5)加到溶於0.1M乙酸鈉、0.01％Tween 2.0、pH5.5(溶於肌醇六磷酸鈉後調節pH，底物先預熱)的250μl 5mM肌醇六磷酸鈉(Sigma)中並於37℃預熱30分鐘。加入250μl 10％TCA終止反應並加入溶於100ml鉬酸鹽試劑(2.5g(NH4)6Mo7·4H2O，溶於8ml H2SO4中，稀釋至250ml)中的500μl7.3克FeSO4來測定游離的磷酸根。在96孔微滴板上測定200μl樣品在750nm處的吸收。包括底物和酶的空白。也包括磷酸的標準曲線(0-2mM磷酸鹽)。1FYT等於在給定條件下釋放1μmol磷酸/分鐘的酶量。一般分子生物學方法除非另外提及，DNA操作和轉化使用分子生物學標準方法進行(Sambrook等.(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；Ausubel，F.M.等(編)「現代分子生物學方法」。John Wiley and Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(編)「芽孢桿菌分子生物學方法」。John Wileyand Sons，1990)。
除非另作說明，所有用於DNA操作，例如限制性內切酶、連接酶等酶都得自於New England Biolabs，Inc.。酶的使用根據產商建議。實施例1源於Peniophora lycii CBS No.686.96的肌醇六磷酸酶的克隆和表達保藏的微生物Peniophora lycii CBS No.686.96含有編碼肌醇六磷酸酶的本發明的DNA序列。
大腸桿菌DSM NO 11312含有在穿梭載體pYES 2.0中包含的編碼本發明的肌醇六磷酸酶的全長cDNA序列的質粒。
其它菌株酵母菌菌株所用的啤酒糖酵母菌株是W3124(Van den Hazel，H.B.；Kielland-Brandt，M.C.；Winther，J.R.Eur.J.Biochem.，207，277-283，1992；(MATa；ura 3-52；leu2-3，112；his 3-D200；pep4-1137；prc1∷HIS3；prb1∷LEU2；cir+)。
大腸桿菌菌株DH10B(Life Technologies)質粒麴黴屬表達載體pHD 414是質粒p775的衍生物(描述於EP 238 023中)。pHD 414的構建進一步描述於WO 93/1249。
pYES 2.0(Invitrogen)pA2phy2(見實施例1)酵母中表達克隆酵母中表達克隆根據H.Dalboege等的描述(H.Dalboege等Mol.Gen.Genet(1994)243253-260；WO 93/11249；WO 94/14953)進行；其在此處用作參考。所有的各步驟總RNA提取、cDNA合成、綠豆核酸酶處理、用T4DNA聚合酶平端化以及文庫構建均按照上述文獻進行。用於mRNA分離的Peniophora lycii CBS No.686.96的發酵程序從長有菌絲體的板中將Peniophora lylii 686.96接種到含100ml培養基B(大豆30g/l、麥芽糖糊精15g/l，細菌腖5g/l，Pluronic 0.2g/l)。該培養物26℃下靜止溫育15天。所得的培養基肉湯通過miracloth過濾將將黴菌絲在液氮中冷凍。
如H.Dalboege等Mol.Gen.Genet(1994)243253-260.；WO 93/11249；WO 94/14953所述從該培養物中自菌絲提取mRNA。
總RNA提取以硫氰酸胍進行然後在5.7M CsCl墊層中超離心，用WO94/14953所述方法通過寡聚(dT)-纖維素親和層析分離Poly(A)+RNA。cDNA合成通過RNase H法(Gubler和Hoffman(1983)Gene 25；263-269，Sambrook等(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)從5mg polyA+RNA合成雙鏈cDNA。該Poly A+RNA(在5μl DEPC-處理過的水中5μg)70℃加熱8分鐘，反應體系為預先矽烷化的無RNase的Eppendorph管，在冰上猝滅，將其以終體積為50μl與反轉錄酶緩衝液(50mM Tris-Cl，pH8.3，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM DTT，Bethesda Research Laboratories)，其含有1mM的dATP，dGTP和dTTP和0.5mM 5-甲基-dCTP(Pharmacia)，40單位的人胎盤核糖核酸酶抑制劑(RNasin，Promega)，1.45μg Oligo(dT)18-Not I引物(Pharmacia)和1000單位的SuperScript II RNase H反轉錄酶(BethesdaResearch Laboratories)。將反應混合物在45℃溫育1小時合成第一鏈cDNA。合成後，根據產商建議通過MicroSpin S-400 HR(Pharmacia)旋轉柱將mRNAcDNA雜交混合物進行凝膠過濾。
凝膠過濾後，將雜交物稀釋於250μl的第二鏈緩衝液(20mMTris-Cl，pH7.4，90mM KCl，4.6mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，0.16mMbNAD+)中，其含200μl的每種dNTP，60個單位的大腸桿菌DNA聚合酶I(Pharmacia)，5.25單位的RNase H(Promega)和15單位的大腸桿菌DNA連接酶(BoehringerMannheim)。第二鏈的cDNA合成是將反應管在16℃溫育2小時額外再在25℃15分鐘完成的。加入EDTA至終濃度20mM終止反應，然後以酚/氯仿抽提。綠豆核酸酶處理加入2倍體積的96％EtOH，0.2體積的10M NH4Ac，於-20℃將雙鏈cDNA進行12小時沉澱，通過離心回收，在70％EtOH中洗滌，乾燥並懸浮於含有25個單位的綠豆核酸酶(Pharmacia)的30μl綠豆核酸酶緩衝液(30mM NaAc，pH4.6，300mM NaCl，1mM ZnSO4，0.35 mM DTT，2％甘油)中。通過在30℃溫育該反應物30分鐘，接著，加入70μl 10mM Tris-cl，PH7.5，1mM EDTA，酚抽提並用2倍體積的96％EtOH和0.1體積3MNaAc，PH5.2在冰上30分鐘沉澱。用T4DNA多聚酶平端化雙鏈cDNA通過離心回收，並在含有0.5mM每種dNTP和5個單位的T4DNA多聚酶(New England Biolabs)的30ml T4DNA多聚酶緩衝液(20mMTris-乙酸鹽，pH7.9，10mM MgAc，50mM KAc，1mM DTT)中通過在16℃下將反應混合物溫育1小時進行平端化。通過加入EDTA至終濃度為20mM終止反應，隨後以酚和氯仿提取，加入2體積的96％EtOH和0.1體積的3MNaAc pH5.2以沉澱之。銜接頭連接，NotI消化和長度選擇補平反應後，通過離心回收cDNA，在70％EtOH中洗滌並乾燥。將cDNA沉澱重新懸浮於含2.5μg非回文BstXI接頭(Invitrogen)和30單位T4連接酶(Promega)的25μl連接緩衝液(30mM Tris-Cl，pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM ATP)中並在16℃下溫育12小時。在65℃下加熱20分鐘中止反應，然後在冰上冷卻5分鐘。加入20μl水、5μl 10×Not I限制性酶緩衝液(New England Biolabs)和50單位Not I(New England Biolabs)以Not I限制酶消化接頭後的cDNA，隨後在37℃溫育2.5小時。通過65℃加熱10分鐘中止反應。在1×TBE的0.8％ SeaPlaque GTG低融點瓊脂膠(FMC)上通過凝膠電泳分離未連接的銜接頭和小cDNA。在0.7kb處切除選擇cDNA長度，並根據產商建議使用b-Agarase(New England Biolabs)從凝膠中回收，然後通過加入2體積的96％EtOH和0.1體積的3M NaAc pH5.2在-20℃下沉澱12小時。文庫構建離心回收經定向的、長度選擇過的cDNA，在70％EtOH中洗滌，乾燥並重懸浮於30μl 10mM Tris-Cl，pH7.5，1mM EDTA中。根據產商建議通過Microspin S-300 HR(Pharmacia)旋轉柱凝膠過濾將cDNA脫鹽。在含5μl雙鏈cDNA(反應管#1和#2)，15單位T4連接酶(Promega)和30ng(試管#1)；40ng(試管#2)和40ng(試管#3，載體背景對照)Bst XI-Not I切割的pYES 2.0載體的10μl連接緩衝液(30mM Tris-Cl，pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM ATP)中進行三項試驗連接。連接反應在16℃溫育12小時，在70℃加熱20分，並在每個試管中加入10μl水。將1μl每種連接混合物電穿孔至40μl電感受態的大腸桿菌DH 10B細胞(Bethesda researchLaboratories)，方法如所述(Sambrook等(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)。用最佳條件在由集合體(pool)組成的大腸桿菌中建立文庫。每個集合體(pool)通過在LB+氨苄青黴素瓊脂板上在37℃下溫育24小時擴展轉化的大腸桿菌得到15.000-30.000克隆/板。將20ml LB+氨苄青黴素加到板中，並且在其中懸浮該細胞。細胞懸浮液在50ml試管中於37℃振蕩1小時。利用QIAGEN質粒試劑盒根據產商建議從細胞中分離質粒DNA。
將從單獨的集合體(pool)中得到1μl份的純化的質粒DNA(100ng/ml)的通過電穿孔(Becker和Guarante(1991)Methods Enzymol.194182-187)轉化到S.Cerevisiae W 3124，並且將轉化體塗於含2％葡萄糖的SC瓊脂上並在30並℃下溫育。陽性菌落的鑑定生長3-5天之外，將瓊脂板複製塗於一套肌醇六磷酸酶複製板，並於30℃溫育3-5天。將含0.2M CaCl2的1％LSB-瓊脂糖(Sigma)傾於板上，1-4天之後，鑑定肌醇六磷酸酶陽性菌落，即那些由透明區包圍的菌落。
從酶陽性菌落得到的細胞在瓊脂上擴展單菌落分離，並且對所鑑定的每種產生肌醇六磷酸酶的菌落選擇產生酶的單菌落。在麴黴中表達的cDNA基因的分離將產生肌醇六磷酸酶的酵母菌落接種到50ml玻璃試管中的20ml YPD肉湯中。將試管在30℃振蕩2天。在3000rpm離心10分鐘收穫細胞。
根據WO 94/14953分離DNA並溶於50ml水中。通過標準方法將DNA轉化到大腸桿菌中。以標準方法從大腸桿菌中分離質粒DNA，並通過限制酶分析來分析。
用限制酶Hind IIT和Xba I切除cDNA插入片段，並且連接到麴黴表達載體pHD414中得到質粒pA2phy2。
將pA2phy2的Qiagen純化的質粒DNA的cDNA插入物用Taq脫氧末端循環測序試劑盒(Perkin Elmer，USA)，同時使用合成寡核苷酸引物，根據產商建議用Applied Biosystems ABI PRISMTM377 DNA測序儀測序。米麴黴和黑色麴黴的轉化如WO 95/02043，第16頁，第21行-第17頁，第12行所述製備原生質體。
將100μl的原生質體懸浮液與10μl中的STC(1.2M山梨醇，10mMTris-HCl，pH＝7.5，100mM CaCl2)的5-25μg的適當的DNA混合。將原生質體與p3SR2(攜帶構巢麴黴amds基因的質粒)混合(Tove Christensen等，Bio/Technology，第1419-1422頁，第6卷，1988年12月)。將混合物置於室溫下25分鐘。將0.2ml的60％PEG 4000(BDH 29576)，10mM CaCl2和10mMTris-HCl，pH7.5加入並小心混合(兩次)並最終加入0.85ml的相同溶液，同時小心混合。將混合物置於室溫下25分鐘，在2500g旋轉15分，將沉澱重新懸浮於2ml的1.2M山梨醇中。再沉澱一次後將原生質體平展於含1.0M蔗糖，pH7.0，10mM作為氮源的乙醯胺和20mM CsCl的極限板(Cove，Biochem.Biophys.Acta 113(1996)51-56)上抑制背景生長。在37℃溫育4-7天後排出孢子並擴展單菌落。重複該程序並將第二輪再分離的單菌落的孢子保存為確定的轉化體。米麴黴轉化體測試將每個米麴黴轉化體接種於10ml YPM(參見下文)中並增殖。30℃溫育2-5天後除去上清。
將20μl的上清加到在含0.1M乙酸鈉pH4.5和0.1％肌醇六磷酸的1％LSB瓊脂糖凝膠中打出的直徑為4mm的孔中以鑑定肌醇六磷酸酶活性。將板於37℃放置過夜。將含有0.1M CaCl2和0.2M乙酸鈉pH4.5的緩衝液傾於板上並將板置於室溫1小時。將該肌醇六磷酸酶活性定為透明區域。批量進料發酵在含作為碳源的麥芽糖糊精、作為氮源的尿素和酵母提取物的培養基中進行批量進料發酵。將所研究的米麴黴宿主細胞的搖瓶培養物接種到含3.5％該碳源和0.5％該氮源的培養基中進行批量進料發酵。於34℃和pH7.0培養24小時後，開始連續地供給額外的碳和氮源。將碳源作為限制因子，並保證氧是過量的。批量進料培養持續4天。SEQ ID No.23所示的DNA序列的分離SEQ ID No.23所示的編碼本發明的肌醇六磷酸酶的DNA序列的肌醇六磷酸酶編碼部分可通過本領域已知的方法提取質粒DNA而從保藏的微生物大腸桿菌DSM 11312中得到(Sambrook等(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)。
以上述在酵母中表達克隆技術進行了克隆和表達。
從Peniophora lycii，CBS No.686.96中分離mRNA，其如上進行培養。
生長15天後收穫菌絲(Mycelia)，立即冷凍於液氮中並保存於-80℃。來自於Peniophora lycii，CBS No.686.96，由約9×105單獨克隆組成的文庫在有1％載體背景的情況下於大腸桿菌中構建。將來自於一些集合體(pool)的質粒DNA轉化到酵母中，並從每個集合體(pool)中得到了含250-400個酵母菌落的50～100個板。
如上所述鑑定和分離肌醇六磷酸酶陽性菌落並接種於50ml玻璃試管中的20mlYPD肉湯中。將試管在30℃振蕩2天。於300rpm離心10分收穫細胞。根據WO 94/14953分離DNA並溶於50μl水中。通過標準方法將DNA轉化到大腸桿菌中。用標準方法從大腸桿菌中分離質粒DNA，並根據產商建議用Applied Biosystems ABI PRISMTM377 DNA測序儀以Taq脫氧末端循環測序試劑盒(Perkin Elmer，USA)和合成的寡核苷酸引物對編碼肌醇六磷酸酶的cDNA的DNA序列進行測序。SEQ ID No.23中顯示了編碼肌醇六磷酸酶的cDNA的DNA序列，相應的胺基酸序列示於SEQ ID No.24中。在SEQ ID No.23中從第1至第1320的核苷酸確定了編碼肌醇六磷酸酶的區域。
SEQ ID NO 23中的DNA序列的部分，其編碼肌醇六磷酸酶的成熟部分，是位置91至1320，其相應於SEQ ID NO 24的胺基酸位置31-439。
該cDNA可得自於DSM 11312的質粒。
總DNA可分離自酵母菌落，並且質粒DNA可如上述通過大腸桿菌的轉化拯救。為了在麴黴中表達該肌醇六磷酸酶，用適當的限制酶消化該DNA，片段長度於凝膠上分離，並純化相應於肌醇六磷酸酶基因的片段。隨後將基因連到pHD414上，以適當的限制酶消化，得到了質粒pA2phy2。
DNA在大腸桿菌中擴增後，如上述將質粒轉化到米麴黴中。米麴黴轉化體測試如上述將每個轉化體進行酶活性測試。一些轉化體其肌醇六磷酸酶活性明顯大於米麴黴的背景。這證實了在米麴黴中肌醇六磷酸酶的有效表達。實施例2來自於平田頭菇CBS No.900.96的肌醇六磷酸酶的克隆和表達保藏的微生物平田頭菇CBS No.900.96含有本發明的編碼肌醇六磷酸酶的DNA序列。
大腸桿菌DSM No 11312在穿梭載體pYES 2.0中含有包括編碼本發明的肌醇六磷酸酶的全長cDNA序列的質粒。SEQ ID No 21所示的DNA序列的分離SEQ ID No.21所示的編碼本發明的肌醇六磷酸酶的DNA序列的肌醇六磷酸酶編碼部分可用本領域已知的質粒DNA的提取方法(Sambrook等(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)從保藏的微生物大腸桿菌DSM 11313中得到。
用實施例1所述的在酵母中表達克隆的技術進行克隆和表達。
mRNA從平田頭菇，CBS No.900.96中分離，其生長如上述並攪拌以保證足夠的通氣。
3-5天生長之後收穫菌絲體(mycelia)，立刻冷凍於液氮中並保存於-80℃。將來自平田頭菇，CBS No.900.96，由約9×105個單獨克隆組成的文庫如上述以1％的載體背景構建於大腸桿菌中。將來自於一些集合體(pool)的質粒DNA轉化至酵母中，並從每個集合體(pool)中得到了含250-400個酵母菌落的50～100個板。
肌醇六磷酸酶陽性菌落如上所述進行鑑定和分離。cDNA插入物的從酵母中的直接克隆和表徵如上述的材料和方法部分所述。編碼肌醇六磷酸酶的cDNA的DNA序列示於SEQ ID No.21中，相應的胺基酸序列示於SEQID No.22中。在SEQ ID No.21中，從第1號至第1362號的DNA核苷酸確定了肌醇六磷酸酶編碼區。
編碼肌醇六磷酸酶的成熟部分的SEQ ID NO 21中的DNA序列部分是位置79到1362，其相應於SEQ ID NO 22中的胺基酸位置27-453。
cDNA可得自於DSM 11313的質粒。
總DNA從酵母菌落中分離並通過如上述的大腸桿菌的轉化拯救質粒DNA。為了在麴黴中表達肌醇六磷酸酶，該DNA用適當的限制酶消化，片段大小在凝膠上分離，純化相應於肌醇六磷酸酶基因的片段。隨後將該基因連到pHD 414，並用適當的限制酶消化，得到了質粒pA3phy3。
該DNA在大腸桿菌中擴增後，如實施例1所述將質粒轉化到米麴黴中。米麴黴轉化體測試如實施例1所述測試每個轉化酶的酶活性。具有肌醇六磷酸酶活性的一些轉化體其活性明顯高於米麴黴背景。這證實了肌醇六磷酸酶在米麴黴中有效表達。實施例3源於Paxillus involtus CBS 100231和絨毛栓菌CBS 100232的肌醇六磷酸酶的克隆和表達保藏的微生物Paxillus involtus CBS No.100231包括本發明的兩個編碼肌醇六磷酸酶的DNA序列，絨毛栓菌CBS 100232包括本發明的肌醇六磷酸酶。
大腸桿菌DSM編號11842，11843和11844在穿梭載體pYES 2.0中含有包含全長cDNA序列的質粒，該序列編碼本發明的這些肌醇六磷酸酶，尤其是分別為Paxillus involtus的phyA1，phyA2和絨毛栓菌的肌醇六磷酸酶。SEQ ID Nos.25，27和29所示的DNA序列的分離SEQ ID Nos.25，27和29所示的編碼本發明的肌醇六磷酸酶的DNA序列的編碼肌醇六磷酸酶的部分可通過本領域已知的質粒DNA提取技術(Sambrook等(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)分別得自於保藏的微生物大腸桿菌DSM 11842，11843和11844。
以實施例1所述的在酵母中表達和克隆的技術進行克隆和表達。
mRNA從各個微生物中分離，該微生物生長於產生肌醇六磷酸酶的條件下，例如上面所述的以攪拌確保足夠的通氣。
3-5天生長後收穫菌絲體，立刻於液氮上冷凍並保存於-80℃。文庫，包含約9×105個單獨的菌落組成，以1％的載體背景按所述構建於大腸桿菌中。將來自於一些集合體(pool)的質粒DNA轉化到酵母中，並且從每個集合體(pool)中得到含250-400個酵母菌落的50～100個板。
如上述鑑定和分離肌醇六磷酸酶陽性菌落。cDNA插入物從酵母克隆中直接克隆，並如上面材料和方法進行表徵。編碼肌醇六磷酸酶的cDNA的DNA序列示於SEQ ID Nos.25，27和29，並且相應的胺基酸序列分別示於SEQ ID Nos 26，28和30。
該cDNA可得自於DSM 11842、11843和11844的質粒。
總DNA分離自酵母菌落，並通過如上所述大腸桿菌的轉化拯救質粒DNA。為了在麴黴中表達肌醇六磷酸酶，DNA以適當的限制酶消化，片段大小在凝膠上分離，並純化相應於肌醇六磷酸酶基因的片段。隨後將該基因連到pHD 414上，並用適當的限制酶消化。
在DNA在大腸桿菌中擴增後，將該質粒轉化到實施例1所述的米麴黴中。米麴黴轉化體的測試如實施例1所述測試每個轉化體的酶活性。一些轉化體的肌醇六磷酸酶活性明顯高於米麴黴背景。這證實了肌醇六磷酸酶在米麴黴中的有效表達。
Paxillus involtus CBS 100231(phyA1P.i.和phyA2P.i.)的兩個肌醇六磷酸酶以及絨毛栓菌CBS 100232(phy AT.P.)的肌醇六磷酸酶具有下述特徵
實施例4來自4個擔子菌綱平田頭菇、Peniophora lycii、Paxillus involtus和絨毛栓菌的5個肌醇六磷酸酶(phyA)cDNA的表達克隆和表徵。
如前面實施例所述，從來自4個擔子菌綱平田頭菇、P.lycii，P.involtus和絨毛栓菌的肌醇六磷酸酶誘導的菌絲體在酵母表達載體pYES 2.0中構建定向cDNA文庫。
篩選這些cDNA文庫的肌醇六磷酸酶活性，所得到了5種不同的肌醇六磷酸酶cDNA，phy A P.lycii，phyA A.Pediades，phyA1 P.involtus，phyA2P.involtus，and phyA T.pubescens的分離。
來自這些克隆的phy A cDNA的表徵揭示保守區域似乎是擔子菌肌醇六磷酸酶特異性的。這表明擔子菌肌醇六磷酸酶屬於真菌肌醇六磷酸酶中的自身亞族。
為了方便地純化和表徵該重組酶，將該5種新的肌醇六磷酸酶在米麴黴中轉化和超量表達。
通過在酵母菌中的表達克隆分離phyAcDNA將真菌菌株平田頭菇、P.lycii、P.involtus和絨毛栓菌固定培養於FG-4培養基(30g/l大豆面、15g/l麥芽糖糊精、15g/l細菌腖、0.2g/l Pluronic)。
如實施例1「米麴黴轉化體測試」部分所述在平板測試檢測培養上清中總肌醇六磷酸酶活性的累積。
生長5到15天之後檢測到了最高水平的肌醇六磷酸酶活性，從而，根據此收穫的菌絲體中分離的poly(A)+RNAs被用於在酵母表達載體pYES2.0中構建4個cDNA文庫。將這些文庫的等分試樣轉化到S.CerevisiaeW3124中，並將轉化體塗平板至含2％葡萄糖的SC瓊脂上並於30℃溫育。
根據實施例1中所述的進行poly(A)+RNA的分離和cDNA文庫的構建(「用於mRNA分離的Peniophora lycii CBS號686.96的發酵程序」部分到「黑色麴黴或米麴黴的轉化」部分)。陽性菌落的鑑定如實施例1相同標題下的描述鑑定陽性克隆。
將從每個文庫所得的20000到30000個酵母克隆篩選其肌醇六磷酸酶活性並在每個文庫中發現了1到4個肌醇六磷酸酶陽性酵母克隆。該陽性菌落相應於5個不同的肌醇六磷酸酶基因，phyA P.lycii(pC1phy2)，phyAA.pediades(pC1phy3)，phy A1 P.involtus(pC1phy5)，phy A2P.involtus(pC1phy7)，以及phy A T.pubescens(pC1phy6)。phyAcDNAs的表徵圖1顯示了Peniophora lycii的編碼PhyA的phyAcDNA的一級結構。來自於pC1phy2的1593bp的cDNA含有1320bp的開放閱讀框(ORF)，編碼439殘基的多肽，計算的分子量為47560。該phyAcDNA編碼一個30個胺基酸的信號肽。該成熟的蛋白質具有計算為44473的分子量以及pI 4.15的等電點。該cDNA和胺基酸序列分別包括於序列表中的SEQ ID NO23和SEQ ID NO24中。
圖2中顯示了得自平田頭菇的phyA的cDNA序列和PHYA的推定序列。得自pC1phy3的1501bp的cDNA含有編碼有帶31胺基酸長信號肽的453殘基的1362 ORF。該422胺基酸成熟蛋白質的計算分子量為46781，其等電點為pI 4.82。該cDNA和胺基酸序列分別包括於序列表SEQ IDNO21和SEQ ID NO22中。
圖3和圖4分別顯示了從Paxillus involtus克隆的phy A1和phy A2cDNA的核苷酸序列和PHY1和PHY2的推定序列。
pC1phy5(phyA1)中的1522bp的插入物含有編碼442胺基酸多肽的1329bp的ORF。根據Signal P V1.1預測(Henrik Nielsen，Jacob Engelbrecht，Stren Brunak和Gunnar Von Heijine「真核和原核信號肽的鑑定及其切割位點的預測」，蛋白質工程(Protein Engineering)10，1-6(1997))，該信號肽由19個胺基酸組成。因此該成熟的蛋白質的預測的分子量為45932；pI為6.39。該cDNA和胺基酸序列分別包括於序列表的SEQ ID NO25和SEQ IDNO26中。
質粒pC1phy7(phy A2)含有1642bp的插入物，並同時有編碼442個殘基的多肽的1329bp的ORF。上文提到的Signal P V1.1程序預測其假定的信號肽酶切割位點位於phy A2編碼的前蛋白的Ala-19和Ala-20中，並且該成熟蛋白質的預測的分子量為45466以及預測的等電點為4.50。該cDNA和胺基酸序列分別包括於序列表的SEQ ID NO27和SEQ ID NO28中。
圖5中顯示了來自絨毛栓菌的phyAcDNA序列和PHYA的推斷序列。pC1phy6中的1536bp的插入物含有編碼一個443殘基多肽的1332bp的ORF。根據上述的Signal P V1.1預測，該信號肽由17個殘基構成。因此該成熟蛋白質由426個胺基酸構成，並具有預測分子量45905和pI 4.34。其cDNA和胺基酸序列分別包含於序列表SEQ ID NO29和SEQ ID NO30中。保守的擔子菌肌醇六磷酸酶區域下面的表1中顯示了子囊菌類群已知的的肌醇六磷酸酶和本發明的擔子菌類群的肌醇六磷酸酶的總的一致性(「X/Y」意指由GAP GCG v8確定的「DNA/多肽」一致性)。
此表中，最左邊的欄的頭5個肌醇六磷酸酶為擔子菌肌醇六磷酸酶，剩餘的為子囊菌肌醇六磷酸酶。
表1子囊菌和擔子菌肌醇六磷酸酶的同源性(比較了完全的cDNA)
在本實驗中比較了完全的cDNA序列。根據表1，擔子菌類群(basidiomycetes group)內的肌醇六磷酸酶的DNA同源性是在81％到56％範圍的一致性，子囊菌類群(ascomycetes group)內的肌醇六磷酸酶的為在約65％到55％的範圍內的一致性。因此，與子囊菌類群的肌醇六磷酸酶相比，擔子菌類群的肌醇六磷酸酶的組內同源性更高。
但是，擔子菌類群的肌醇六磷酸酶對子囊菌類群的肌醇六磷酸酶的CNA同源性公在從大約54％到48％的範圍內。因此，這兩個類群互相之間的差異性比各自類群內所觀察到的差異性要大，而且以這點來區分子囊菌肌醇六磷酸酶和擔子菌肌醇六磷酸酶是合理的。
這種關係也可從圖6和圖7的序列對比中看出來。
對表1的一些肌醇六磷酸酶，下面的表2顯示了ORF的cDNA序列和成熟蛋白質(信號肽已切除)的肽序列的對比結果。
表2所選擇的子囊菌和擔子菌肌醇六磷酸酶的同源性(比較了ORF cDNA和成熟肽)
在本表中，肽的同源性在表的右上半部標出，而DNA同源性在左下半部標出(二者的一致性百分數均根據GAP GCGv8)。
圖6和7的序列對比表明一些序列的基序在5個擔子菌肌醇六磷酸酶內是保守的。根據此序列對比衍生了幾個保守的部分序列(SEQ ID NO1-14)。而且，一些在擔子菌肌醇六磷酸酶中也是保守的缺失區域也已被推出(參見例如權利要求5)。
一些特別高度保守的序列的實例是下文中所謂的共有序列I、II和III，其相應的序列對比見下文的表3和4。在這些表中，以灰色方塊指出這些在至少9個序列中相同的殘基，來自於擔子菌類的肌醇六磷酸酶的相同序列以白色方塊表示。共有序列II-Q-R-H-G-A-R-[F/W]-P-T-S-G-A-X-X-R(SEQ ID NO3)共有序列IIN-W-T-[A/E]-G-F-X-X-A-S(SEQ ID NO5)共有序列IIIF-V-E-S-Q-X-[Y/F]-A-R-X-X-G-X-G-D-F-[E/A]-K-C(SEQ ID NO9)表3相應於共有序列I和II的部分序列對比
表4相應於共有序列III的部分序列對比
下面的表5還顯示了一些圖7的序列對比的共有序列，尤其分別是SEQID NO2、SEQ ID NO5和SEQ ID NO9。
表5序列對比中的擔子菌肌醇六磷酸酶共有序列
圖7中PHYAP.lycii的殘基位置的編號為68到83的在共有序列I(SEQID NO3)位於活性位點附近，而且所有五個擔子菌肌醇六磷酸酶都有此共有序列I-Q-R-H-G-A-R-[F/W]-P-T-S-G-A-X-X-R及13個保守殘基。而且，五個肌醇六磷酸酶中的四個都有一個第14位的共有殘基F75。這與子囊菌肌醇六磷酸酶形成對比，其在相同的區域僅有8個保守殘基。
當將P.lycii的 胺基酸位置162-171共有序列II(SEQ ID NO5)與子囊菌肌醇六磷酸酶進行比較時，可看出擔子菌肌醇六磷酸酶缺乏P.lyciiF167(A.nigerF177)到P.lycii P177(A.niger P194)(參見圖7)之間的6到7個殘基，而且總體而言擔子菌綱肌醇六磷酸酶具有更高程度的保守性，其在10個殘基中有7個相同殘基(表3)。在相同區域，子囊菌綱肌醇六磷酸酶在17個殘基中只有3個保守殘基。
P.lycii的胺基酸位置415-433的共有序列III(SEQ ID NO9)在擔子菌綱肌醇六磷酸酶由19個殘基組成，其中13個殘基是保守的。在所有的真菌肌醇六磷酸酶中的共有序列中有3個殘基是保守的。在P.lycii序列中，該殘基是A422，G428和C433，對黑色麴黴而言，是A454、G458和C463。所有的擔子菌肌醇六磷酸酶都具有保守的丙氨酸和甘氨酸之間的5個殘基，而在全部的子囊菌肌醇六磷酸酶中僅有3個(表4)。PHYA在米麴黴中的表達為了得了用於蛋白質的進一步純化和表徵的米麴黴中PHYA肌醇六磷酸酶的高水平表達，將來自平田頭菇、P.lycii，P.involtus和絨毛栓菌的5個phy AcDNA亞克隆到pHD 414中(pHD 414為一真菌表達載體)。此處的phyA cDNA被插入到TAKA-澱粉酶啟動子序列的3′和polyA的5′以及黑色麴黴葡糖澱粉酶基因的終止子序列中。該pHD 414 phyA構建體被轉化到米麴黴中，轉化時使用amdS選擇質粒進行共轉化(參見實施例1的「米麴黴或黑色麴黴的轉化」部分)。在上清中選擇轉化體的肌醇六磷酸酶活性，選出最高產的轉化體用於發酵。結論在擔子菌肌醇六磷酸酶類群內的高度保守的區域表明其屬於真菌肌醇六磷酸酶類群內其自身的亞族。
根據這些區域，可以設計用於相關肌醇六磷酸酶的分子篩選特異性的PCR引物(實施例5)。實施例5分子篩選(引物對522/538)已經設計了用於分子篩選的編碼五個擔子菌肌醇六磷酸酶內的高度保守區域的下述簡併核苷酸引物522有義引物5′-CCC AAG CTT AAY TGG ACN GMN GGN TT-3′(SEQ ID NO15)相應於胺基酸N-W-T-[A，E，D]-G-[F，L]，其帶有CCC和Hind III位點5′尾；537有義引物5′-CCC AAG CTT GAY AAR TWY GGN AC-3′(SEQ ID NO16)相應於胺基酸D-K-[F，Y]-Y-G-T，其有CCC和Hind III位點5′尾；538反義引物5′-GCT CTA GAC RTA RWA YTT RTC NAR RTC-3′(SEQ ID NO17)相應於胺基酸D-[F，L]-D-K-[F，Y]-Y-G，其有一GC和Xba I位點5′尾；525反義引物5′-GCT CTA GAC AYT TNK CRA ART CNC C-3′(SEQ ID NO18)
相應於胺基酸G-D-F-[A，D，E]-K，其帶有GC及XbaI位點5′尾；539有義引物5′-CCC AAG CTT CAR GTN MAY MTN ATH CA-3′(SEQ ID NO19)相應於胺基酸Q-V-[N，H]-[I，L，M]-I-[Q，H]，其帶一個CCC和Hind III位點5′尾(SEQ ID NO15)；540反義引物5′-GCT CTA GAC RAA NCC NKC NGT CCA RTT-3′(SEQ ID NO20)相應於胺基酸N-W-T-[A，D，E]-G-F，其帶一個GC和XbaI位點5′尾；其中N＝A，C，G或T；R＝A或G；Y＝C或T；M＝A或C；W＝A或T。
引物的設計根據圖7的序列對比。
關於PCR反應的基本參考文獻可見於Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，第2版；或Lubert Stryer生物化學，第4版；FreemanCompany，New York，1995，例如第132-134頁。
首先，在下文的表6中所示的選出的子囊菌綱和擔子菌綱得到的基因組DNA上測試522/538引物對。
根據下述程序分離基因組DNA真菌基因組DNA的分離程序1.在研缽中將菌絲體於液氮中研磨2.將菌絲體轉移至2.0ml Eppendorf管中至0.5ml刻度處3.加入1.0ml裂解緩衝液並混合4.加入10μl 4mg/ml無DNase的RNase A(New England Bislabs)5.於37℃溫育30分6.加入40μl 16mg/ml蛋白酶K(New England Biolabs)7.於50℃下溫和振蕩溫育1小時8.於微量離心機中全速離心15分
9.將上清加至QIAprep-旋轉柱上。旋轉1分鐘並棄去濾過物10.以0.5ml緩衝液PB洗滌，旋轉1分鐘棄去濾過物11.以0.75ml緩衝液PE洗滌，旋轉1分鐘並棄去濾過物12.快速旋轉抽除任何存留的PE緩衝液並使之完全乾燥13.將旋轉柱置於潔淨的微量離心管(microfuge tube)中並加入125μlH20。靜置5分鐘，然後旋轉3分裂解緩衝液100mM EDTA10mM Tris pH81％Triton X-100200mMNaCl500mM鹽酸胍更多的有關QIAprep旋轉柱、PB緩衝液和PE緩衝液的信息請參考購自QIAGEN GmbH的QIAPrepTM質粒手冊。實驗程序將約100到200ng基因組DNA或10～20ng雙鏈cDNA用作模板用於PCR擴增，PCR緩衝液(10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl)含200μM每種dNTP，3.5mM MgCl2，2.5單位AmpliTaq GoldTM，以及100pmol每種簡併引物522和538。總體積為50μl。PCR反應在Perkin-Elmer GeneAmpPCR System 2400上進行。所用的PCR反應的循環程序為94℃-10分；1循環94℃-1分，60℃-1分，72℃-30秒；2循環94℃-1分，59℃-1分，72℃-30秒；2循環94℃-1分，58℃-1分，72℃-30秒；2循環94℃-1分，52℃-1分，72℃-30秒；2循環94℃-1分，50℃-1分，72℃-30秒；14循環72℃-7分；1循環在1.5％瓊脂膠上通過電泳分析5μl的擴增樣品的等分試樣。
下文的表6顯示了這套引物的試驗結果，尤其是檢測或未檢測到了特定的PCR帶。表6用522/538引物套對子囊菌和擔子菌的基因組DNA的試驗
實施例6分子篩選(其它引物對)引物對522/525，539/540，539/538，539/525和537/525按實施例5中描述的方法進行檢測，每一個有義和反義的簡併引物的量為100pmol。用針對於AmpliTaq Gold(TM)進行改進的Touchdown PCR進行擴增(參見R.H.Don等(1991)，Nucleic Acid Research，Vol.19，No.14)。PCR反應程序如下94℃-10分鐘；1個循環94℃-1分鐘，60℃-1分鐘，72℃-1.5分鐘；2個循環94℃-1分鐘，59℃-1分鐘，72℃-1.5分鐘；2個循環94℃-1分鐘，58℃-1分鐘，72℃-1.5分鐘；2個循環94℃-1分鐘，52℃-1分鐘，72℃-1.5分鐘；2個循環94℃-1分鐘，50℃-1分鐘，72℃-1.5分鐘；14個循環72℃-7分鐘；1個循環實施例7PCR條帶純化和測序根據生產商的指導，PCR片段可以用Jet Sorb凝膠提取試劑盒(Genomed GmbH，Germany)進行純化和測序。以200-300ng純化的PCR產物為模板，使用Taq脫氧末端循環測序試劑盒(Perkin-Elmer，美國)，螢光標記的終止子和5pmol測序引物在Perkin-Elmer的ABI PRISMt 377 DNA測序僅，擴增PCR片段的核苷酸序列可以直接測定。
由引物對522/538，用10-20ng來自Schizophyllum sp.CBS 443.97的雙鏈cDNA做模板產生的PCR片段，按以上描述進行純化和測序，所推定的DNA序列如下(5′-到3′-)TCTGCCGCATCTGACGGTGTCTATAACCCCGTCCTCAACCTGATTATATCAGAAGAGCTTAACGACACCCTCGATGATGCGATGTGCCCGAACGTCGGCGAATCGGACGCCCAAACGGACGAATGGACGTCTATTTACGCAGCGCCCATCGCTGAGCGTCTGAACAACAACGCCGTGGGCGCTAACCTGACCACCACGAACGTTTACAACCTCATGTCTTTATGCCCCTTCGACACGCTTGCGAAGGAGACGCCGAGCCCCTTCTGCGATCTCTTT(SEQ ID NO31)將所得DNA序列翻譯成胺基酸序列為SAASDGVYNPVLNLIISEELNDTLDDAMCPNVGESDAQTDEWTSIYAAPIAERLNNNAVGANLTTTNVYNLMSLCPFDTLAKETPSPFCDLF(SEQ ID NO32)。
雙鏈cDNA的合成按實施例1進行。實施例8在米麴黴中表達的來自Peniophora lycii的肌醇六磷酸酶的純化和鑑定Peniophora lycii肌醇六磷酸酶在米麴黴IFO 4177中表達並分泌。
加入助濾劑到肉湯培養物中，而其培養物已用一個濾布進行過濾。這個溶液進一步用Seitz深層過濾平板過濾，就得到了澄清的溶液。濾液在3kDa排阻聚醚碸膜上進行超濾，使其濃縮，然後用蒸餾水進行滲濾以減少導電率。濃縮後的酶的pH值調整到7.5。濃縮酶的導電率為1.2mS/cm。
將肌醇六磷酸酶通過用20mM Tris/CH3COOH，pH7.5平衡Q-瓊脂糖FF柱，然後用漸增的線形NaCl梯度(0→0.5M)洗脫。肌醇六磷酸酶活性按單峰洗脫。將峰收集起來，加入(NH4)2SO4使終濃度達到1.5M。將Phenyl Toyopearl650S柱用1.5M(NH4)2SO4、10mM琥珀酸/NaOH(pH6.0)平衡，然後將肌醇六磷酸酶加入，再用逐漸降低的線性(NH4)2SO4梯度(1.5→0M)洗脫。將包含肌醇六磷酸酶的分餾物合併，並將緩衝液在一個葡聚糖凝膠G25柱上交換為20mM Tris/CH3COOH(pH7.5)。在一個用20mM Tris/CH3COOH(pH7.5)平衡的Q-瓊脂糖FF柱上加入G25濾液。用平衡緩衝液充分洗柱，然後把肌醇六磷酸酶在逐漸增加的線性NaCl梯度(0→0.5M)上洗脫。將肌醇六磷酸酶活性收集，通過透析，將緩衝液交換為20mM Tris/CH3COOH(pH7.5)，透析的肌醇六磷酸酶加到用pH7.5的20mM Tris/CH3COOH平衡的SOURCE 30Q柱上。仔細用平衡緩衝液洗柱之後，用逐漸增加的線性NaCl梯度(0→0.3M)洗脫肌醇六磷酸酶。來自SOURCE 30Q的分餾物用SDS-PAGE分析，將純的肌醇六磷酸酶分餾物收集。
Peniophora肌醇六磷酸酶在膠上遷移為帶，Mr＝67kDa，67kDa組分的N端胺基酸序列測定通過SDS-PAGE，然後電印跡到PVDF膜上進行。推定的N端胺基酸序列如下Leu-Pro-Ile-Pro-Ala-Gln-Asn-此序列相當於由cDNA得到的胺基酸序列中的胺基酸殘基31-37。
由此，一個成熟的肌醇六磷酸酶胺基酸序列，當在麴黴屬中表達時，可假定為SEQ ID no 24的no.31-439。實施例9Peniophora lycii的純化肌醇六磷酸酶的進一步鑑定Peniophora lycii肌醇六磷酸酶在麴黴屬中的表達和純化按實施例8的描述進行。
肌醇六磷酸酶活性按如下分析進行測定將10μl稀釋的酶樣品(用0.1M乙酸鈉、0.01％吐溫20，pH5.5稀釋)加到250μl 5mM肌醇六磷酸鈉(sigma)溶液中，該肌醇六磷酸鈉溶液用0.1M乙酸鈉、0.01％吐溫20，pH5.5(在乙酸鈉溶解後調節pH值，底物預熱)配製，然後將含有酶樣品的肌醇六磷酸鈉溶液在37℃保溫30分鐘。加入250μl 10％TCA使反應停止，通過加入500μl在100ml鉬酸鹽試劑(2.5g(NH4)6Mo7O24·4H2O加在8ml H2SO4中，稀釋到250ml)中溶解7.3g FeSO4，測定游離磷酸鹽。將96孔微滴平板中的200μl樣品，測定750nm的吸收值。底物和酶空白被包括在內。磷酸鹽標準曲線也被包括在內(0-2mM磷酸鹽)。1FYT等於在指定條件下每分鐘釋放1μmol磷酸鹽的酶量。
通過在不同溫度下(預熱底物)進行檢測得到了溫度曲線。
通過在檢測殘留活性前對0.1M磷酸鈉(pH5.5)中的肌醇六磷酸酶在不同溫度下進行預保溫，對溫度穩定性進行了檢測。
在檢測殘基活性前，將酶在pH3(25mM甘氨酸-HCl)，pH4-5(25mM乙酸鈉)，pH6(25mM MES)，pH7-9(25mM Tris-HCl)中於40℃下保溫1小時，進行pH穩定性的檢測。
使用相同的緩衝液系統(50mM，底物溶解時重新調整pH值)，在不同pH值的條件下進行檢測，得到pH曲線。
以上pH曲線，pH穩定性、溫度曲線和溫度穩定性的研究結果分別見圖8、9、10和11。從圖9可以看出，在pH3-9的整個範圍內40℃1小時，Peniophora lycii的肌醇六磷酸酶是非常穩定的(即超過了80％的最大活性仍有保留)。關於溫度穩定性的結果見圖11，圖中表明在60-80℃，有50-60％的殘基活性仍有保留。這個結果是可以認為是因為熱變性之後令人驚奇地能重新摺疊的酶。重新摺疊的程度與精確的條件(pH、酶濃度)有關。
圖12表明了對Peniophora肌醇六磷酸酶進行差示掃描熱量測定(DSC)的結果。在DSC中，通過熱量消耗使樣品池中保持一個恆定的溫度增長，這個熱量相對於一個參照池來測定。保持恆定的加熱速率(例如90℃/小時)。為了保持恆定溫度增長，吸熱過程(熱量消耗過程-例如酶/蛋白的伸展)被檢測為轉移到池中的熱量的增加。DSC使用MicroCal的MC2設備來進行。在以掃描速率為90/小時掃描到90℃前，將池在20℃平衡20分鐘。約2.5mg/mlPeniophora肌醇六磷酸酶(0.1M乙酸鈉，pH5.5中)的樣品被負載。實施例10Peniophora肌醇六磷酸酶的比活性的鑑定比活性通過肌醇六磷酸酶一個高度純化的樣品來測定(純度預先在SDS聚丙烯醯胺凝膠上檢測，表明僅一個組分的存在)。
肌醇六磷酸酶樣品的蛋白濃度按如下胺基酸分析決定肌醇六磷酸酶樣品的等分試樣在含有6N HCl、0.1％酚的一個抽真空的玻璃試管內於110℃下水解16小時。由此而得胺基酸由Applied Biosystems 420A胺基酸分析系統進行定量，操作按操作指導進行。從胺基酸的量中，水解的等分試樣中蛋白質的總量-及濃度-可以計算出。
活性可以按FYT單位來測定。一個FYT相當於在pH5.5、37℃條件下每分鐘自肌醇六磷酸(5mM肌醇六磷酸)釋放1微摩爾無機磷酸的酶量；分析見如例11中的描述。
比活性計算為987 FYT/mg酶蛋白。實施例11通過1H NMR光譜學測定的肌醇六磷酸酶催化的肌醇六磷酸水解的時間-分解產物曲線被Peniophora肌醇六磷酸酶和一個商品黑色麴黴肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸酶NovoR)催化的肌醇六磷酸(PA)水解可通過24小時的過程中1H NMR測定產物混合物進行檢測(27mM肌醇六磷酸，1FYT/ml，pH5.5和3.5，27℃)。
如下，(Ins(p，q，r，...)Pn代表myo-肌醇，它攜帶著分別結合在p、q、r...位置上的總共n個磷酸根。為方便起見，Ins(1，2，3，4，5，6)P6(肌醇六磷酸)簡寫為PA。但是請參見這一申請中綜述部分中的「肌醇六磷酸酶命名和位置特異性」一節。
本技術提供關於在PA分子上酶攻擊的起始位點的特定信息，同時也提供關於終產物鑑定的信息。另一方面，反應中間產物的混合物組成的峰演化模式提供了一個定性檢測，一個指紋，其適合於進行不同酶個體間的相似性和差異性鑑定。
NMR，像大多數其它分析方法一樣，能區分非對映體的立體異構體，但不能區分是對映體的一系列異構體，因為它們顯示相同的NMR光譜。
因此，由於該異構體是非對映體，Ins(1，2，4，5，6)P5(除去3-磷酸)顯示的NMR光譜不同於Ins(1，2，3，4，5)P5(除去6-磷酸)。
但是，由於異構體是對映體，Ins(1，2，3，4，5，6)P5和Ins(2，3，4，5，6)P5(除去1-磷酸)的NMR光譜是相同的。Ins(1，2，3，4，5)P5和Ins(1，2，3，5，6)P5(除去4-磷酸)的光譜也是相同的。
因此，通過NMR不能區分3-和1-磷酸，同樣也不能區分6-和4-磷酸(或使用最低位點規則的L-6-和D-6-磷酸)。
由於文獻中3-和6-磷酸的描述的偏頗，我們對我們的酶使用了術語3-和6-肌醇六磷酸酶，但是，雖然不太可能，我們實際上並不知道我們是否使用的是1-和4-肌醇六磷酸酶。實驗NMR光譜用一個裝有5mm選擇性反探頭的Bruker DRX 400在300K(27℃)下進行記錄。在4個模擬掃描後的16掃描用一個被8K數據點覆蓋的2003Hz(5ppm)的掃描寬度進行積累。通過一個3秒的預飽和時期達到殘餘HDD共振衰減。光譜參見HOD信號(δ4.70)。
NMR分析的PA樣品按如下製備將PA(100mg，肌醇六磷酸二鉀鹽，Sigma P-5681)溶於去離子水(4.0ml)中，用液體NaOH(4N)調節pH值至5.5或3.5。加入約5ml去離子水並將每一個相應於20mg肌醇六磷酸的1ml的部分轉移到螺旋蓋小瓶中，將溶劑蒸發(真空離心機)。乾燥的樣品溶於重水(2ml，Merck 99.5％D)，然後再次乾燥(使用前貯藏在-18℃)。
進行NMR分析時，每20mg肌醇六磷酸樣品溶於重水(1.0ml，Merck99.95％D)。將溶液轉移到一個NMR試管中，計錄1H NMR光譜。加入酶溶液(1FTU，溶解/適當稀釋於重水中)，仔細混勻(1分鐘)。加入酶溶液後立刻開始記錄1H NMR光譜(t＝0)，然後5、10、15、20、25、30、45、60、75、90、105、120、135、150、165、180、195、210分鐘(＝3.5小時)、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、11.5、13.5、15.5、17.5、19.5、21.5和23.5小時。測量NMR試管中的pH值。在48和120小時(5天)後獲得了其它光譜，此時加一部分底物(PA，6mg)以探測酶是否保留催化活性。
通過由對PA部分消化所得的肌醇磷酸鹽混合物的2D NMR分析，以及公開的NMR數據(Scholz，P.；Bergmann，G.，和Mayr，G.W.；Methods inInositide Research(Ed.Irvine，R.F.)，第65-82頁，Reven Press，Ltd.，NewYork(1990))，可歸於Ins(1，2，3，4，5，6)P6(PA)，Ins(1，2，4，5，6)P5，Ins(1，2，3，4，5，6)P5，Ins(1，2，5，6)P4，Ins(1，2，6)P3、Ins(1，2)P2和Ins(2)P的特徵性的1H NMR信號被鑑定，並可在反應過程中對這些種進行相對定量。
麴黴屬肌醇六磷酸酶和隔孢伏革菌屬(Peniophora)肌醇六磷酸酶在pH5.5中反應24小時的產物分布的堆積圖分別見圖13和圖14。
δ3.25(t)的信號代表Ins(1，2)P2的H-5，δ3.18(t)的信號代表Ins(2)P的H-5。與麴黴屬肌醇六磷酸酶反應約4小時後Ins(1，2)P2開始積累，而在與Peniophora肌醇六磷酸酶反應約1小時後Ins(1，2)P2開始積累。在與麴黴屬肌醇六磷酸酶反應10小時後可觀察到Ins(2)P，而在Peniophora肌醇六磷酸酶反應中是3小時後。反應24小時後，兩種肌醇六磷酸酶的Ins(1，2)P2量水平都很低，而反應24小時後，兩種肌醇六磷酸酶的Ins(2)P量都達到最高值。
因此，反應24小時後觀察到的曲線表明這兩種肌醇六磷酸酶都將PA降解為Ins(2)P。
這兩種酶24小時後的反應混合物中除Ins(2)P外還含有少量的Ins(1，2)P2。延長反應時間(幾天)導致了殘餘Ins(1，2)P2的消失，但完全脫磷酸的肌醇(Ins)卻根本沒有發現。這個發現不能用酶的不可逆抑制/變性來解釋，因為酶在延長的時期內仍保留有催化活性，就象如下實驗證明的一樣在室溫放置5天後，將新的一部分PA加入NMR試管中，酶仍能對其進行消化。
圖15和16詳細地描述了在起始4.5個小時內pH5.5的條件下變化的曲線。從圖10可推論Ins(1，2，4，5，6)P5(命名為A)的H-3表現出在δ 3.66(dd)的一個信號，Ins(1，2，3，4，5)P5(B)的H-6表現出在δ3.87(t)的一個信號，而Ins(1，2，5，6)P4(C)的H-3表現出在δ3.56(dd)的一個信號。現在，化合物A相應於位置3被水解的磷酸鹽，B相應於位置6的，C相應於位置3和4的。
從圖15可明顯發現，當使用麴黴肌醇六磷酸酶時，組合物A是主要的初級產物(t＝5分鐘)，而組合物B並未出現。組合物C在20-25分鐘之後出現。
圖16(Peniophora肌醇六磷酸酶)表明，當使用Peniophora肌醇六磷酸酶時，組合物B是主要的初級產物(t＝5分鐘)。
δ4.82(dt，H-2)，4.38(q，H-4/H-6)，4.13(q，H-5)和4.11(dt，H1/H3)的信號可歸因於底物、肌醇六磷酸、PA。對圖15和16進行比較，可明顯地發現，對於Peniophora肌醇六磷酸酶，這些峰消失的要比曲酶屬肌醇六磷酸酶的快。
這些差異在圖17中很顯著，圖17顯示了在pH5.5條件下20分鐘後被觀察到的用如上所指的診斷信號(A，B，C)標記的曲線。
圖18表明了肌醇六磷酸在pH5.5條件下(即相應於圖13和14的上線)水解的最終結果(在這些條件下)。在上部Peniophora實施方案的所有標記信號代表了化合物Ins(2)P，尤其是其質子，從右到左為H-5，H1和H3，H4和H6及最終的H-2。相對強度1∶2∶2∶1。相應的信號在下部的Aspergillus的實施方案中被發現。這就表明Ins(2)P實施方案中都有終產物。但是，在兩個實施方案中還同時都發現了一小部分的Ins(1，2)P2，相應的峰只在麴黴屬實施方案中有發現。觀察到的顯著差異麴黴屬最初的主產物被鑑定為Ins(1，2，4，5，6)P5(A)，然後出現Ins(1，2，5，6)P4(C)和Ins(1，2，6)P3(D)(H-3在δ3.49(dd)，1.5小時後)，相應於連續除去3-，4-和5-位置的磷酸根。Ins(1，2)P2(E)的濃度從4小時後開始緩慢增加，在12到14小時之間徒然減少，在12到14小時之間同時還有Ins(2)P(F)水平的迅速增加。這從圖11可以看出，它分別代表了時間依賴的Ins(1，2)P2和Ins(2)P的濃度，這由分別相應於Ins(1，2)P2(δ3.25(t))和Ins(2)P(δ3.18(t))的信號的面積相對於相應於底物信號(t＝0)的面積測定來決定。隔孢伏革菌屬在pH5.5條件下，最初僅有位置6被攻擊。一個典型特徵是相對於Aspergillis肌醇六磷酸酶，PA以更快的速率被消化。另一個典型特徵是終產物Ins(2)P(F)出現很早(3小時)，並且緩慢增加，這相對於麴黴屬肌醇六磷酸酶所觀察到的反應終點中Ins(2)P水平的非常急劇的增長。
圖19是與圖17相同的曲線，但是在pH3.5條件下。但令人驚訝的是，在此PH下Peniophora肌醇六磷酸酶既對PA的位置6有很高的啟始親和力，又對位置3有同樣的親和力(B和A都被觀察)，可能對位置6有輕微的優先選擇。
產生的數據可得到例如如下結論在pH5.5和pH3.5的條件下，麴黴屬肌醇六磷酸酶以高度選擇性攻擊PA的位置3，而隔孢伏革菌屬肌醇六磷酸酶在pH5.5條件下以高度選擇性攻擊PA的位置6，但在pH3.5的條件下，它似乎以類似的速率水解位置3和6的磷酸基。
在pH5.5條件下，隔孢伏革菌屬肌醇六磷酸酶以比麴黴屬肌醇六磷酸酶更快的速度消化PA。
在pH3.5和5.5，在所用的條件下終產物為Ins(2)P(F)。
總反應速度是類似的，約20小時(圖20；pH5.5)。
於是，麴黴肌醇六磷酸酶被認為是基本上純淨的3-肌醇六磷酸酶，而隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶在pH5.5條件下表現為基本上純淨的6-肌醇六磷酸酶，在pH3.5條件現表現為迄今為止的未知類型，即一個3+6-肌醇六磷酸酶。
由隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶的肌醇六磷酸部分水解得到的肌醇四磷酸鹽可按如下概述決定其準確構型，而且也可以確定隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶是D-，L-或D/L-6-肌醇六磷酸酶。
其它對準確特性的確定方法可以通過旋光度或使用一個手性HPLC柱來確定。1.隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶的肌醇六磷酸部分降解產生的肌醇四磷酸鹽的HPLC-分離。脫鹽(鐵交換，透析，(2)，(4)和(9)及本文的參考文獻)。2.通過NMR分析檢查純度(i)，決定是否產生了幾個非對映體四磷酸(ii)，決定產生了其中的哪一個(iii)3.使用相應的碳水化物(10)的氫化硼(BH)的還原而進行相關多元醇的合成。4.用高碘酸進行分解，按(2)用氫化硼進行還原和脫磷酸作用。用HPLC進行多元醇的鑑定。5.用L-艾杜糖醇脫氫酶進行多元醇的氧化，使用HPLC最終鑑定碳氫化物。參考文獻(2)Van der Kaay等，Biochem.J.，312(1995)，907-910(4)Irving等，J.Bacteriology，112(1972)，434-438(9)Stevens，L.R.，見「Methods in Inositide Research」(Irvine R.F.編)，9-30(1990)，Raven Press，Ltd.，New York(10).Stephens，L.等，Biochem.J.，249(1988)，271-282實施例12麴黴和隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶從穀物中釋放無機磷酸鹽的比較分析本實施例對於在pH3.5和5.5條件下肌醇六磷酸酶對穀物中三價磷的催化釋放進行了一個簡單的分析。分析集中於兩個參數-P-釋放的速度和水平。材料和方法穀物來自北卡羅萊那州立大學(樣品號R27)，在6.8點的磨粉器(BuhlerUniversal)中研磨。稱取20g研磨的穀物，將其加入1個250ml的藍色有蓋瓶中，加入100ml緩衝液，從而得到了穀物懸浮液(16.7％，w/w)。
所用緩衝液為pH5.5；0.22M乙酸鹽緩衝液。
用8N HCl/NaOH調節pH到3.5。
測定的酶測定了兩個肌醇六磷酸酶一個黑色麴黴(肌醇六磷酸酶Novo)的商品肌醇六磷酸酶(phytase Novo)和一個本發明的隔孢伏革菌屬肌醇六磷酸酶，按實施例2進行純化。
劑量所有的酶都以25FYT/20g穀物(相應於1250FYT/kg)應用。
用瓶蓋封上裝有穀物懸浮液的瓶，立即放入37℃水浴中，持續攪拌。此時測定pH，並於24小時後再次測定。攪拌30分鐘後可收集到一個5ml的樣品。
然後將肌醇六磷酸酶按25FYT/20g穀物的劑量加入。
在加入肌醇六磷酸酶後，分別在5，10，1 5，20，25，30，40，50，60和120分鐘時收集樣品，釋放的P的含量按如下進行測定含有肌醇六磷酸酶的樣品按1+4用緩衝液稀釋。然後將樣品在3000rpm下離心5分鐘，收集1.0ml上清液。加入2.0ml緩衝液和2.0ml MoV終止溶液(參閱實施例6中的FYT分析)。樣品放在3-5℃冰箱中，直至所有樣品都能用分光光度計在415nm下進行分析。
在0和20小時中測定pH值。
用於測定，使用50mM的標準磷酸鹽溶液或貯存溶液。0.5，1.0，1.5和2.0ml貯存溶液用緩衝液稀釋到總體積50ml。在每一個溶液中取3.0ml，加入2.0ml MoV終止溶液。
進行了兩個實驗在pH5.5和pH3.5的條件下。分析結果見圖21和22(分別是pH5.5和3.5)。在這些圖中，符號「◆」代表對照實驗，「▲」代表隔孢伏革菌屬肌醇六磷酸酶和「■」代表麴黴屬肌醇六磷酸酶。結果和討論圖21(pH5.5)表明，在這個pH值條件下，隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶相對於麴黴肌醇六磷酸酶以顯著增加的速度釋放穀物中的P。
圖22(pH5.5)明顯地表示，在這一pH值條件下，對於研磨的穀物中磷的釋放，隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶明顯快於麴黴肌醇六磷酸酶(0-120分鐘)。
例如小雞/童子雞(broiler)的消化系統的經歷時間通常在30分鐘到2小時的數量級，因而無論pH值是多少，觀察到的差異是真正重要的。儘管如此，pH3.5在此方面仍比pH5.5更合適。
這暗示作為在如童子雞消化系統中的P-釋放者，隔孢伏革菌酶令人驚訝地比已知的麴黴肌醇六磷酸酶更高效。實施例13在酵母中表達的平田頭菇的肌醇六磷酸酶的發酵、純化和鑑定通過將酵母菌株在100ml培養基A中，250rpm，30℃過夜培養來準備種子培養。100ml培養基B接種入2ml種子培養物，菌株在30℃，250rpm下培養7到12天。
按照實施例2的描述，平田頭菇肌醇六磷酸酶在酵母中表達。酵母克隆中含有一個編碼本發明中含有胺基酸序列SEQ ID No 22的肌醇六磷酸酶的克隆序列。
向用濾布過濾的培養的上清液中加入助濾劑。這一溶液進一步用Seitz深度過濾板過濾，得到一個澄清溶液。濾液在3kDa排阻聚醚碸膜上通過超過濾進行濃縮，然後在一個微生物過濾平板上重新過濾。將濾液的pH值調到pH7.5，通過用蒸餾水稀釋將導電率調節到2ms/cm。
將肌醇六磷酸酶加在用20mM Tris/CH3COOH(pH7.5)平衡的Q-瓊脂糖FF柱上，然後用遞增的線性NaCl梯度(0→0.5M)把酶洗脫。合併來自Q-瓊脂糖的含有肌醇六磷酸酶的餾分，加入(NH4)2SO4，使終濃度達到1.3M。將Phenyl Toyopearl 650S柱用1.3M(NH4)2SO4、10mM琥珀酸/NaOH，pH6.0平衡，把該酶加在這個柱上，用遞減線性(NH4)2SO4梯度(1.3→0M)洗脫。合併含有肌醇六磷酸酶的餾分，在一個葡聚糖凝膠G25柱上將緩衝液交換為pH7.5的20mM Tris/CH3COOH。在用由pH7.5的20mMTris/CH3COOH平衡的SOURCE Q柱上進一步純化肌醇六磷酸酶，並用線性NaCl梯度(0→0.5M)洗脫。最後，合併來自SOURCE Q柱的包含肌醇六磷酸酶的餾分。在一個10kDa排阻再生纖維素膜上濃縮，然後加到用25mMCH3COOH/NaOH，100mM NaCl，pH5.0平衡的葡聚糖凝膠200柱上。
來自葡聚糖凝膠200柱的餾分用SDS-PAGE分析。肌醇六磷酸酶在膠上遷移形成一個非常寬而且擴散的條帶，大約為Mr＝150kDa，表明這個酶是高度糖基化的。
150kDa組分的N-端胺基酸測序以SDS-PAGE，然後電轉到一個PVDF膜上進行。
兩個N-端序列可被推斷為大約比率4∶1(上部序列下部序列)的相對量Val-Gln-Pro-Phe-Phe-Pro-Pro-Gln-Ile-Gln-Asp-Ser-Trp-Ala-Ala-Tyr-Thr-Pro-Tyr-Tyr-Pro-Val-Gln-和Thr-Phe-Val-Gln-Pro-Phe-Phe-Pro-Pro-Gln-Ile-Gln-Asp-Ser-Trp-Ala-Ala-Tyr-Thr-Pro-Tyr-Tyr-Pro-在SEQ ID NO 22中，分別在位置27和25上發現了兩個N-端胺基酸「Val」和「Thr」。這表明當在酵母中表達時本發明中成熟的肌醇六磷酸酶，在SEQ ID NO 22的位置27或25開始。
因此，當在酵母中表達時，肌醇六磷酸酶的成熟胺基酸序列被假定為SEQ ID no 22的no.27-453或25-453實施例14在米麴黴中表達的來自平田頭菇的肌醇六磷酸酶的純化和鑑定平田頭菇肌醇六磷酸酶在米麴黴IFO 4177中表達並分泌。
將培養的肉湯在濾布上過濾，加入助濾劑。溶液進一步用一個Seitzdepth過濾平板過濾，從而得到一個澄清的溶液。將濾液在3kDa排阻聚醚碸膜上通過超過濾進行濃縮，然後用蒸餾水進行滲濾，以降低導電率。將濃縮酶的pH值調到pH7.5。
把肌醇六磷酸酶加到一個用pH7.5的20mM Tris/CH3COOH平衡的Q-瓊脂糖FF柱上，然後用遞增線性NaCl梯度(0→0.5M)洗脫。肌醇六磷酸酶活性洗脫為單峰。收集此峰並加入(NH4)2SO4，使終濃度達到1.3M。一個Phenyl Toyopearl 650S柱用1.3M(NH4)2SO4，10mM琥珀酸/NaOH，pH6.0平衡，將肌醇六磷酸酶加在此柱上，並用遞減的線性(NH4)2SO4梯度(1.3→0M)洗脫。收集包含肌醇六磷酸酶的餾分，用透析將緩衝液交換為pH7.5的20mM Tris/CH3COOH。將酶加到一個用pH7.5的2mMTris/CH3COOH平衡的SOURCE 30Q柱上，並用遞增線性NaCl梯度(0→0.25M)洗脫。收集肌醇六磷酸酶活性，加入(NH4)2SO4，使終濃度達到1.6M。將SOURCE Phenyl柱用1.6M(NH4)2SO4，25mM琥珀酸/NaOH，pH6.0平衡，把肌醇六磷酸酶加到此柱上，然後用一個遞減線性(NH4)2SO4梯度(1.6→0M)洗脫。來自SOURCE Phenyl柱的部分用SDS-PAGE分析，收集純的肌醇六磷酸酶餾分。肌醇六磷酸酶合併液用pH7.5的20mM Tris/CH3COOH進行透析，然後加到用相同緩衝液平衡的HighTrap Q柱上，再用20mMTris/CH3COOH，0.5M NaCl，pH7.5逐步洗脫。
田頭菇肌醇六磷酸酶在SDS-PAGE上遷移成一條帶，其Mr＝60kDa。
60kDa組分的N-端胺基酸測序在SDS-PAGE並電轉到一個PVDF膜上進行。兩個N-端胺基酸序列的相對量可推定為大約2∶1(上部序列下部序列)。Phe-Pro-Pro-Gln-Ile-Gln-Asp-Ser-Trp-Ala-Ala-Tyr-Thr-Pro-Tyr-Tyr-Pro-Val-Gln-和Gln-Pro-Phe-Phe-Pro-Pro-Gln-Ile-Gln-Asp-Ser-Trp-Ala-Ala-Tyr-Thr-Pro-Tyr-Tyr-上部序列相應於由cDNA得到的胺基酸序列中的胺基酸殘基31-49，而下部序列則相應於胺基酸殘基28-46。
因此，當在麴黴中表達時，肌醇六磷酸酶成熟的胺基酸序列可被假定為SEQ ID no 22中的no.31-453或28-453。
因此，總結實施例13和本實施例的結果，可發現在SEQ ID NO 21中，以下序列是編碼肌醇六磷酸酶的亞序列位置79到1362，73-1362，91-1362或82-1362(如在SEQ ID NO 22中分別相應於胺基酸位置27-453，25-453，31-453或28-453)。
於是，成熟肌醇六磷酸酶的N-端序列有輕度的可變性。這種可變性可在當酶在一個單菌株上表達時被發現，也可在當在不同菌株上表達時被發現。在酵母中，成熟肌醇六磷酸酶在胺基酸no.27或25處開始(相對豐度分別為約80％∶20％)；在麴黴屬中，成熟肌醇六磷酸酶開始在胺基酸no.31或28(相對豐度分別約65％∶35％)。實施例15平田頭菇的純化肌醇六磷酸酶的鑑定平田頭菇肌醇六磷酸酶在麴黴中表達，並按實施例14的描述進行純化。
肌醇六磷酸酶活性按如下分析進行測定將10μl稀釋的酶樣品(在0.1M乙酸鈉，0.01％吐溫20，pH5.5中稀釋)加入在0.1M乙酸鈉、0.01％吐溫20，pH5.5(在肌醇六磷酸鈉溶解後調整pH值；底物預熱)中的250μl 5mM肌醇六磷酸鈉中，37℃保溫30分鐘。通過加入250μl10％TCA使反應終止，然後加入在100ml鉬酸鹽試劑(8ml H2SO4中2.5g(NH4)6Mo7O24稀釋到250ml)中500μl 7.3g FeSO4以測定游離磷酸基。在750nm的吸收在96孔微滴定平板上的200μl樣品測定。一個磷酸鹽標準曲線也包括進來(0-2mM磷酸鹽)。1FYT相當於在指定條件下釋放1μmol磷酸/分鐘的酶量。
溫度曲線可通過在不同溫度(預熱底物)下分析樣品而得到。
在測量殘留活性前，通過在0.1M磷酸鈉，pH5.5中於不同溫度下對肌醇六磷酸酶進行預溫育檢測了溫度穩定性。
在測定殘留活性前，將酶在pH3(25mM甘氨酸-HCl)，pH4-5(25mM乙酸鈉)，pH6(25mM MES)，pH7-9(25mM Tris-HCl)條件下，40℃保溫1小時，可檢測pH穩定性。
在相同的緩衝液系統(50mM，在底物溶解時調節pH)，於不同pH條件下分析樣品，獲得了pH曲線。
以上pH曲線，pH穩定性，溫度曲線和溫度穩定性的研究結果分別見圖23、24、25和26。
圖23表明，平田頭菇肌醇六磷酸酶在pH3-6具有相當好的活性(即超過最高活性50％)。在pH4-6超過最高活性的70％，在pH5-6超過90％。適宜的pH似乎在pH5.5-6之間。
從圖24可明顯發現，平田頭菇肌醇六磷酸酶在pH3-9的整個範圍內於40℃下1小時，40℃是非常穩定(即保留了超過最高活性的80％的)。
關於溫度曲線，從圖25可明顯發現，平田頭菇肌醇六磷酸酶在35-55℃間有很好的活性(例如超過最高活性的60％)，而在40-52℃間，活性超過最高活性的70％，最適溫度接近於50℃。
最後，關於溫度穩定性的結果見圖26，肌醇六磷酸酶在0到約55℃(例如超過60％的殘餘活性)的條件下非常穩定。在60℃預保溫後可發現殘餘活性急劇下降。無論如何，在60℃時至少20％，優選25％，更優選30％殘餘活性仍保留。在預保溫溫度超過60℃，如70℃和80℃時，令人驚訝的是，殘餘活性仍保留驚人地高，尤其是超過20％，優選超過30％，更特別的是保留超過40％的殘餘活性。
這一事實經思考被認為是由於酶在熱變性之後仍能令人驚訝的重新摺疊。重新摺疊的程度依靠於精確的條件(pH、酶濃度)。
圖27表明對田頭菇屬肌醇六磷酸酶的差異掃描熱量儀(DSC)進行測定的結果。
在DSC中，用於保持樣品室恆定溫度增長所消耗的熱量相對於一個參照室進行測定。保持恆定的加熱速率(如90℃/小時)。當轉移到室中以保證恆定溫度增長的熱量增加時，可發現吸熱過程(熱消耗過程-例如酶/蛋白的解摺疊)也增長。
DSC用來自Microcal的MC2-儀進行。在掃描速度90℃/h，掃描到90℃前，室在20℃平衡20分鐘。所負載樣品是在pH5.5的0.1M乙酸鈉中約2.5mg/ml田頭菇肌醇六磷酸酶。
DSC證明了溫度穩定性的研究，因為在圖5中顯而易見的是，田頭菇肌醇六磷酸酶在pH5.5，約58℃下有一個變性或「解鏈」溫度。對田頭菇肌醇六磷酸酶的重新掃描呈現在58℃的一個小峰，這也可以表明，酶的一部分確實重新摺疊，摺疊了第一次掃描中的熱失活。實施例16通過1H NMR光譜測定的肌醇六磷酸酶催化的肌醇六磷酸水解的時間-分解產物曲線對由田頭菇肌醇六磷酸酶和一個商業黑色麴黴肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸酶Novo)催化的肌醇六磷酸(PA)水解進行研究(27mM肌醇六磷酸酶，1FYT/ml，pH5.5，27℃)，研究通過24小時過程中產物混合物的1H NMR曲線進行。
如下(Ins(p，q，r...)Pn代表共攜帶n個依附在位置p，q，r，...上的磷酸基的肌醇，為方便起見，將Ins(1，2，3，4，5，6)P6(肌醇六磷酸)簡寫為PA。但是，請參照本申請中通論部分的「肌醇六磷酸酶的命名和位置特異性」。
本技術提供了關於酶在PA分子上攻擊的起始位點的具體信息，此外還有關於終產物鑑定的信息。另一方面，反映中間產物混合物的組成的峰的演化模式，提供了一個定量測定，一個指紋，其適合於不同酶個體之間相似性和差異性的鑑定。
NMR，像大多數其它分析方法一樣，能區別非對映體的立體異構體，但不能區分是對映體的異構體，因為它們顯示相同的NMR光譜。
因此，由於異構體是非對映體，Ins(1，2，4，5，6)P5(除3-磷酸)顯示的NMR光譜不同於Ins(1，2，3，4，5)P5(除6-磷酸)。
但是，由於異構體是對映體，Ins(1，2，4，5，6)P5和Ins(2，3，4，5，6)P5(除1-磷酸)的NMR光譜是相同的。Ins(1，2，3，4，5)P5和Ins(1，2，3，5，6)P5(除4-磷酸)的也相同。
因此，通過NMR不能區分3-和1-肌醇六磷酸酶，也不能區分6-和4-肌醇六磷酸酶(或L-6-和D-6-肌醇六磷酸酶，使用最低位點規則)。
鑑於參考文獻中3-和6-肌醇六磷酸酶的描述的偏頗，我們對我們的酶使用術語3-和6-肌醇六磷酸酶，但是，儘管可能性不大，實際上，我們卻不知道我們是否有替代的1-和4-肌醇六磷酸酶。實驗在一個有5mm選擇性反向探針頭的Bruker DR×400儀器上，300K(27℃)，記錄NMR光譜。使用一個8K數據點覆蓋的掃描寬度2003Hz(5ppm)，在4模擬掃描後積累16次掃描。殘餘HOD共振的衰減可通過一個3秒的預飽和時期達到。光譜參照HOD信號(δ4.70)。
NMR分析的PA樣品按如下準備PA(100mg，肌醇六磷酸二鉀鹽，Sigma P-5681)溶於去離子水(4.0ml)，用液體NaOH(4N)調節pH至5.5。加入去離子水(5ml)並將每一個相應於20mg肌醇六磷酸的1ml部分轉移到螺旋蓋的小瓶中，蒸發溶劑(真空離心)。乾燥的樣品溶於重水(2ml，Merck 99.95％D)，並再次蒸發乾燥(使用前貯藏在-18℃)。
為進行NMR分析，將1個20mg的肌醇六磷酸樣品溶於重水(1.0ml，Merck 99.95％D)。將溶液轉移到一個NMR管中，記錄1H NMR光譜。後加入酶溶液(1FTU，按適宜方式溶解/稀釋在重水中)並充分混合(1分鐘)。加入酶後立即開始記錄1H NMR光譜(t＝0)，然後是5，10，1 5，20，25，30，45，60，75，90，105，120，135，150，165，180，190，210分鐘(＝3.5小時)，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，11.5，13.5，15.5，17.5，19.5，21.5和23.5小時。測定NMR管內的pH值。48和120小時(5天)後獲得額外光譜，此時加入一份底物(PA，6mg)以探測酶是否保留催化活性。
通過對由PA部分消化獲得的肌醇磷酸混合物的2D NMR分析，及公布的NMR數據(Scolz，P.；Bergmann，G.，和Mayr，G.W.；Methods inInositide Research(Invine，R.F.編)，pp.65-82，Raven Press，Ltd.，NewYork(1990))，可歸於Ins(1，2，3，4，5，6)P6(PA)，Ins(1，2，4，5，6)P5，Ins(1，2，3，4，5)P5，Ins(1，2，5，6)P4，Ins(1，2，6)P3，Ins(1，2)P2和Ins(2)p的特徵性的1H NMR信號可被鑑定，並可在此反應過程中對這些種進行相關定量分析。
24小時反應時間內，麴黴和田頭菇肌醇六磷酸酶產物分布的堆積圖分別見圖28和圖29。
δ3.25(t)的信號代表Ins(1，2)P2的H-5，而δ3.18(t)的信號代表Ins(2)P的H-5。在與麴黴肌醇六磷酸酶反應4小時後Ins(1，2)P2開始積累，對于田頭菇肌醇六磷酸酶則是2小時後。與麴黴肌醇六磷酸酶反應大約10小時，田頭菇肌醇六磷酸酶反應大約5小時後，可觀察到Ins(2)P。反應24小時後，Ins(1，2)P的量對兩種酶都很低，而此時Ins(2)P量對兩種酶為最高。
於是，反應24小時後觀察到的曲線表明兩種肌醇六磷酸酶都能將PA降解為Ins(2)P。完全脫磷酸的種類，肌醇(Ins)，根本沒有被發現。
對於兩種酶來說，反應24小時的反應混合物中除Ins(2)P外，還有少量的Ins(1，2)P2。延長反應時間(幾天)導致了殘餘Ins(1，2)P2的消失，但未發現完全脫磷酸的種類，肌醇(Ins)。這個發現不能用酶的不可逆抑制/變性來解釋，因為酶在延長期仍保留其催化活性，這可通過在室溫保持5天後在NMR試管加入新的PA而酶仍能將其消化而得到證明。
圖30和31詳細描述了在起始4.5小時內變化的曲線。從圖32可得到，Ins(1，2，4，5，6)P5(命名為A)的H-3在δ3.66(dd)有一個信號，Ins(1，2，3，4，5)P5(B)的H-6在δ3.87(t)有一個信號，Ins(1，2，5，6)P4(C)的H-3在δ3.56(dd)有一個信號。現在，化合物A相應於位置3上被水解的磷酸鹽，B相應於位置6，C相應於3和4。
從圖30可明顯看到，使用麴黴肌醇六磷酸酶時，化合物A呈現為主要初產物(t＝5分鐘)，而化合物B並未出現。化合物C在20-25分鐘後出現。
從圖31(田頭菇肌醇六磷酸酶)可發現，化合物A及B出現很早，即在最初的15分鐘，可能化合物B多於A。
δ4.82(dt，H-2)，4.38(q，H-4/H-6)，4.13(q，H-5)和4.11(dt，H1/H3)的信號可歸於底物，肌醇六磷酸，PA。比較圖30和31可明顯發現，對于田頭菇屬肌醇六磷酸酶，這些峰比麴黴肌醇六磷酸酶的更快地消失。
這些差異在圖32中很顯著，圖32顯示了20分鐘後觀察到的用上述診斷信號(A，B，C)標記的曲線。
圖33表明了植酸水解(例如，相應於圖28和29的上線)的最終結果(在這些條件下)。所有在上部田頭菇實施方案中標記的信號都代表化合物Ins(2)P，也就是質子，其從右到左為H-5，H1和H3，H4和H6及最後的H-2。相對強度1∶2∶2∶1。相應信號在下部的麴黴屬的實施方案中被發現。這意味著終產物在所有兩個實施方案中都是Ins(2)P。但是，在兩個實施方案中還檢測有少量的Ins(1，2)P2，相應的峰僅在麴黴屬中出現。觀察到的明顯差異麴黴屬起始主要產物被鑑定為Ins(1，2，4，5，6)P5(A)，然後出現Ins(1，2，5，6)P4(C)和Ins(1，2，6)P3(D)(1.5小時後在δ3.49(dd)的H-3)，相應於連續除去位置3，4，5上的磷酸基。Ins(1，2)P2(E)的濃度在2小時時開始緩慢增加，在12小時到14小時間急劇降低，同時伴隨著Ins(2)P(F)水平的快速增長。在圖34和35中可看到這一點，該圖分別代表依賴於時間的Ins(1，2)P2和Ins(2)P濃度，並分別繪製於圖28-29中沿著時間軸的Ins(1，2)P2和Ins(2)P中H-5的化學位移值(δ)處的塊(slices)(說明時間比例僅在節段中是線性的)。
田頭菇屬位置3和6在最初都被攻擊，對位置6有一些優先選擇。一個典型特點是PA的消化速度比麴黴肌醇六磷酸酶快。其它典型特徵是終產物Ins(2)P(F)出現很早(5小時)，並且緩慢增長，這正與麴黴肌醇六磷酸酶所測的反應末端的Ins(2)P水平的急劇增長相反。
通過產生的數據尤其可得如下結論麴黴肌醇六磷酸酶以高度選擇性攻擊PA的位置3，而田頭菇肌醇六磷酸酶沒有這麼專一。
相對於麴黴肌醇六磷酸酶，田頭菇肌醇六磷酸酶對PA的消化速度更快。
在所使用的條件下，兩種情況的終產物都是Ins(2)P(F)。
總反應速度(PA→Ins(2)P)是相當的，約20小時(圖35)。
因此，麴黴肌醇六磷酸酶被證明是一個基本純淨的3-肌醇六磷酸酶，而田頭菇肌醇六磷酸酶則專一性較小，但是有些傾向於位置6。
應用2D-同和異核(1H，13C)相關性技術，通過利用13C-核的較大的化學位移色散以及合適的計算機軟體，帶有嚴重重疊的1H-共振的後者佔優勢的問題，從理論上可以鑑定和定量在任何時間存在的中間物，因此可完全做出反應順序圖。換句話說，象圖34和35的反映濃度時間函數的曲線理論上能用於其它中間體肌醇磷酸的構建。實施例17麴黴屬和田頭菇屬肌醇六磷酸酶從穀物釋放無機磷酸的比較分析本實施例對在pH3.5和5.5的條件下肌醇六磷酸酶催化穀物釋放三價磷進行了一個簡單分析。研究集中於兩個參數-P-釋放速度和水平。材料和方法穀物來自北卡羅萊那大學(樣品號R27)，在研磨器(Buhler Universal)內於點6.8研磨。
將稱取20g研磨的穀物放入一個250ml的藍色有蓋瓶中，加入100ml緩衝液，形成穀物懸浮液(16.7％w/w)。
所使用的緩衝液見下pH5.50.22M乙酸鹽緩衝液pH3.50.05M檸檬酸鹽緩衝液測定的酶對兩種肌醇六磷酸酶進行測定一個商品黑麴黴肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸酶Novo)和一個本發明的田頭菇屬肌醇六磷酸酶，按實施例3和4的描述進行純化。劑量所有的酶用量都為250FYT/20g穀物(相應於1250FYT/kg)。
蓋上裝有穀物懸浮液的瓶子的蓋，立即放入37℃水浴中，持續攪拌。在此時測定pH值，並在24小時後再次測定。攪拌30分鐘後收集5ml樣品。
然後以25FYT/20g穀物的劑量加入肌醇六磷酸酶。
在加入肌醇六磷酸酶後，分別在10，20，30，40，50，60，120分鐘和約20小時時收集樣品，而其釋放的磷的量按如下測定包含肌醇六磷酸酶的樣品在緩衝液中按1+4稀釋。然後樣品在3000rpm離心5分鐘，收集1.0ml上清液。加入2.0ml緩衝液和2.0ml MoV終止溶液(參照實施例15的FYT分析)。把樣品放在3-5℃冰箱中，直至所有樣品都能用分光光度計在415nm進行測定。
在0和20小時時測定pH值。
為測定，使用製備50mM的磷酸鹽標準或貯存液。用緩衝液將0.5，1.0、1.5和2.0ml貯藏溶液稀釋到總體積50ml。每一個溶液取3.0ml，加入2.0mlMoV終止溶液。
進行了兩個實驗pH5.5和pH3.5的條件下。分析結果見圖36和37(分別是pH5.5和pH3.5)。在這些圖中，符號「◆」代表對照實驗，「▲」代表田頭菇屬肌醇六磷酸酶，「■」代表麴黴屬肌醇六磷酸酶。結果和討論圖36和37清楚地表明，在pH5.5和3.5的條件下，田頭菇屬肌醇六磷酸酶從研磨的穀物中起始釋放三價磷的速度比麴黴屬快。
但是，在pH5.5的條件下40分鐘後(圖36)和在pH3.5的條件下120分鐘後(圖37)，麴黴屬肌醇六磷酸酶和田頭菇屬肌醇六磷酸酶釋放磷酸的水平大致相同。
但是考慮到諸如小雞/童子雞的消化系統的通過時間，其正常在30分鐘到2小時的數量級，這一差異確實是很重要的。除此之外，還應提到，在這一方面pH3.5比pH5.5更合適。
這意味著在如童子雞的消化系統中，作為P-釋放者，田頭菇屬酶令人驚訝地比已知的麴黴屬酶更有效。實施例18來自Paxillus involtus和Trametes pubescens的肌醇六磷酸酶的純化和鑑定Paxillus involtus PhyAl肌醇六磷酸酶按實施例3和1的描述在米麴黴IFO 4177中表達和分泌。
對培養的肉湯通過濾布過濾並加入助濾劑。進一步用一個Seitz depth濾板過濾，從而得到一個澄清的溶液。濾液用3kDa排阻聚醚碸膜超過濾而得到濃縮，然後將肌醇六磷酸酶轉到一個葡聚糖G 25柱上的10mM琥珀酸/NaOH，pH6.0。將G25濾液的pH調到pH7.0。
將肌醇六磷酸酶加到用20mM HEPES/NaOH，pH7.0平衡的一個Q-瓊脂糖FF柱上。發現該酶在該柱的洗脫液中把(NH4)2SO4加入洗脫液中，所終濃度達到2.0M。將Butyl Toyopearl 650S柱用2.0M(NH4)2SO4，10mMCH3COOH/NaOH，pH7.5平衡，把酶加到此柱上，用遞減線性(NH4)2SO4梯度(2.0→0M)洗脫。合併包含肌醇六磷酸酶的餾分，在葡聚糖G25柱上將緩衝液交換為pH7.5的20mM HEPES/NaOH。將G25濾液加在用pH7.5的20mM HEPES/NaOH平衡的Q-瓊脂糖FF柱上。用平衡緩衝液充分洗柱後，用遞增線性NaCl梯度(0→0.5M)把肌醇六磷酸酶洗脫。收集肌醇六磷酸酶活性，並在一個葡聚糖G25柱上將緩衝液交換為pH8.0的20mMTris/CH3COOH。把G25濾液加到一個用pH8.0的20mM Tris/CH3COOH平衡的SOURCE 30Q柱上。仔細用平衡緩衝液衝洗柱後，將肌醇六磷酸酶用遞增線性NaCl梯度(0→0.3M)洗脫。收集包含肌醇六磷酸酶的餾分，加入(NH4)2SO4使終濃度達到2.0M。把Phenyl Toyopearl 650S柱用2.0M(NH4)2SO4，10mM CH3COOH/NaOH，pH5.5平衡，將肌醇六磷酸酶加到這個柱上，用遞減線性(NH4)2SO4梯度(2.0→0M)洗脫。收集包含肌醇六磷酸酶的餾分，加入(NH4)2SO4以終濃度達到2.0M後重新加到相同的Phenyl Toyopearl柱上。來自第二個Phenyl Toyopearl柱的餾分用SDS-PAGE分析，合併純的肌醇六磷酸酶餾分。
Paxillus involtus PhyAl肌醇六磷酸酶在SDS-PAGE上遷移一條為Mr＝65kDa的帶。65kDa組分的N-端胺基酸測序在SDS-PAGE，然後電轉移到一個PVDF膜上後進行。可得到如下N-端胺基酸序列Ser-Val-Pro-Lys-Asn-Thr-Ala-Pro-Thr-Phe-Pro-Ile-Pro此序列相應於來自cDNA的胺基酸序列中的胺基酸殘基21-33。
因此，當在麴黴屬表達時，一個肌醇六磷酸酶的成熟胺基酸序列可被假定為SEQ ID no.26的no.21-442。於是，當這個肌醇六磷酸酶在麴黴屬中表達時，預測的圖3中的信號肽並不相應於實際的信號肽。這對於序列表中標題SEQ ID NOs25和26下的成熟肽序列的說明也是同樣的。來自Paxillus involtus的PhyA2肌醇六磷酸酶按實施例3和1的描述，Paxillus involtus PhyA2肌醇六磷酸酶在米麴黴IFO4177中表達並分泌。
對培養的肉湯用濾布過濾並加入助濾劑。將此溶液進一步用一個Seitzdepth濾板過濾，從而得到一個澄清的溶液。濾液在一個3kDa排阻聚醚碸膜上進行超過濾以濃縮，然後加入(NH4)2SO4使終濃度達到2.0M。
將肌醇六磷酸酶加到一個用2.0M(NH4)2SO4，20mM CH3COOH/NaOH，pH5.5平衡的Phenyl瓊脂糖FF柱上，然後把酶用一個遞減線性(NH4)2SO4梯度(2.0→0M)洗脫。肌醇六磷酸酶活性按單峰洗脫。收集此峰，加入(NH4)2SO4使終濃度達到2.0M。把Butyl Toyopearl 650S柱用2.0M(NH4)2SO4，10mM CH3COOH/NaOH，pH5.5平衡，把肌醇六磷酸酶加入此柱，然後用一個遞減線性(NH4)2SO4梯度(2.0→0M)洗脫。收集包含肌醇六磷酸酶的餾分，將緩衝液在一個Q-瓊脂糖FF柱上交換為pH7.0的20mM HEPES/NaOH。把G25濾液加到用pH7.0的20mM HEPES/NaOH平衡的Q-瓊脂糖FF柱上。用緩衝液充分洗柱後，用增加的線性NaCl梯度(0→0.5M)洗脫肌醇六磷酸酶。收集肌醇六磷酸酶活性，並將緩衝液通過透析交換為20mM HEPES/NaOH，pH7.0。透析過的肌醇六磷酸酶置於平衡於20mM HEPES/NaOH，pH7.0的SOURCE 30Q柱上。以平衡緩衝液徹底洗滌該柱之後，以增加的線性NaCl梯度(0→0.3M)洗脫肌醇六磷酸酶。以SDS-PAGE分析來自SOURCE 30Q柱的餾分並合併純淨的肌醇六磷酸酚餾分。
Paxillus involtus PhyA2肌醇六磷酸酶在SDS-PAGE上遷移的帶為Mr＝52kDa。在SDS-PAGE並電轉至PVDF膜上之後進行52kDa組分的N端胺基酸序列分析。下面的N-端胺基酸序列可進行推定。Asn-Ile-Ala-Pro-Lys-Phe-該序列相應於由cDNA衍生的胺基酸序列的胺基酸殘基25-30。
因此，當在麴黴中表達時成熟的肌醇六磷酸酶的胺基酸序列據認為是SEQ ID no.28的no.25-442。因此，當該肌醇六磷酸酶在麴黴中表達時，圖4中所預測的信號肽並不相應於實際的信號肽。對有關序列表中標題為SEQID NOs27和28的成熟肽的說明也是一樣的。
來自於絨毛栓菌的肌醇六磷酸酶絨毛栓菌肌醇六磷酸酶在米麴黴IFO 4177中表達並自其中分泌。
將自濾布濾過的培養肉湯中加入過濾助劑。該溶液進一步通過Seitz濾板過濾得到了澄清的溶液。將過濾物通過10kDa排阻聚醚碸膜超濾進行濃縮，然後以蒸餾水滲濾以降低其導電率。將濃縮酶的pH調至pH6.0，將導電率以無離子水調至10mM琥珀酸/NaOH、pH6.0的導電率。
將肌醇六磷酸酶置於以10mM琥珀酸/NaOH、pH6.0平衡的Q-瓊脂糖凝膠FF柱上，並將酶以漸增的線性NaCl梯度(0→0.5M)洗脫。肌醇六磷酸酶活性作為單峰洗脫。收集該峰，並加入(NH4)2SO4至終濃度為2.0M。將Butyl Toypoearl 650S柱於2.0M(NH4)2SO4、10mM CH3COOH/NaCl、pH5.5中平衡並將該肌醇六磷酸酶置於該柱上並以降低的線性(NH4)2SO4梯度(2.0→0M)洗脫。含肌醇六磷酸酶的餾分被收集起來並於Q-瓊脂糖凝膠FF柱上將緩衝液交換為10mM琥珀酸/NaOH、pH6.5。將柱用平衡緩衝液充分洗滌之後，用漸增的線性NaCl梯度(0→0.3M)收集肌醇六磷酸酶活性並將緩衝液在Sephadex G25柱上交換為10mM琥珀酸/NaOH、pH7.0。將G25過濾物置於平衡於10mM琥珀酸/NaOH、pH7.0的SOURCE 30Q柱上。用平衡緩衝液充分洗滌該柱之後，將增加的線性NaCl梯度(0→0.2M)洗脫總肌醇六磷酸酶。以SDS-PAGE多析洗脫自SOURCE 30Q柱的餾分並收集純的肌醇六磷酸酶餾分。
絨毛栓菌肌醇六磷酸酶於SDS-PAGE上遷移的帶為Mr＝57kDa。在SDS-PAGE並電轉至PVDF膜上之後將該57kDa組分進行N端胺基酸測充。可推斷如下的N端胺基酸序列。
Xxx-Ala-Cys-Leu-Asp-Val-Thr-Arg-Asp-(Ala/Val)-Gln-該序列相應於由cDNA衍生的胺基酸序列的胺基酸殘基31-41。
因此，當在麴黴中表達時，該肌醇六磷酸酶的成熟的胺基酸序列據信是SEQ ID no.30的no.31-443。因此圖5中的預測的信號肽當在麴黴中表達時並不相應於實際的信號肽。當涉及到序列表中標題為SEQ ID NOs20和30的成熟肽的說明時，也是如此。
絨毛栓菌的三個肌醇六磷酸酶和Paxillus involtus的PhyA2和PhyA1的分子量(kDa)分別是65、55和65kDa。
這三個肌醇六磷酸酶的pH曲線類似於圖8和23中的隔孢伏革菌和田頭菇肌醇六磷酸酶的(最佳pH約為5-6左右；pH高於7時有很小的活性)。與已知的無花果麴黴的肌醇六磷酸酶(在本實驗中其最佳溫度約為50℃左右)相比，Paxillus involtus的PhyA1具有一個稍高一些的最佳溫度，約為60℃左右，而PhyA2的最佳溫度卻在40℃左右。Paxillus involtus的PhyA1肌醇六磷酸酶的熱穩定性(termostability)與無花果麴黴肌醇六磷酸酶的活性是相當的，並且優於Paxillus involtus的PhyA2肌醇六磷酸酶和絨毛栓菌的肌醇六磷酸酶的熱穩定性。分別在70℃和80℃溫育10分鐘後，PhyA1的殘餘活性分別為60％和40％左右。
在DSC中，發現在48℃、59℃和55℃左右的Td’s分別是Paxillusinvoltus的肌醇六磷酸酶PhyA和PhyA1以及絨毛栓菌的肌醇六磷酸酶的。
對所有的這些肌醇六磷酸酶而言，其比活性都是出乎意料的高，即對絨毛栓菌的肌醇六磷酸酶、Paxillus involtus PhyA2和PhyA1分別是1450、1370和810FYT/mg酶蛋白(A280為3.58；5.72和3.08；FYT/ml分別為5184、7808和2497；假定消光係數分別為1升(g×cm))。
序列表(1)基本信息(i)申請人(A)姓名Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市DK-2880 Bagsvaerd(D)州名Denmark(E)國家Denmark(F)郵編2880(G)電話+45 4444 8888(H)傳真+45 4449 3256(ii)發明名稱肌醇六磷酸酶多肽(iii)序列數32(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)序列號1的信息(i)序列特徵(A)長度12個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置2(D)其它信息/產品＝「其它」/注＝「位置2上的X是Y或F」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置3(D)其它信息/產品＝「其它」/注＝「位置3上的X是F或Y」(xi)序列描述SEQ ID NO1Pro Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Pro Pro1 5 10(2)序列號2的信息(i)序列特徵(A)長度17個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置3(D)其它信息/注＝「位置3上的是N或H」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置4(D)其它信息/注＝「位置4上的X是I或L」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置12(D)其它信息/注＝「位置12上的X是F或W」(xi)序列描述SEQ ID NO2Gln Val Xaa Xaa Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Xaa Pro Thr Ser Gly1 5 10 15Ala(2)序列號3的信息(i)序列特徵(A)長度16個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置8(D)其它信息/注＝「位置8上的X是F或W」(xi)序列描述SEQ ID NO3Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Xaa Pro Thr Ser Gly Ala Xaa Xaa Arg1 5 10 15(2)序列號4的信息(i)序列特徵(A)長度13個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置4(D)其它信息/注＝「位置4上的X是D或A」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置5(D)其它信息/注＝「位置5上的X是S或T」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置6(D)其它信息/注＝「位置6上的X是A或S」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置7(D)其它信息/注＝「位置7上的X是T或N」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置11(D)其它信息/注＝「位置11上的X是A或E」(xi)序列描述SEQ ID NO4Arg Val Val Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Trp Thr Xaa Gly Phe1 5 10(2)序列號5的信息(i)序列特徵(A)長度10個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置4(D)其它信息/注＝「位置4上的X是A或E」(xi)序列描述SEQ ID NO5Asn Trp Thr Xaa Gly Phe Xaa Xaa Ala Ser1 5 10(2)序列號6的信息(i)序列特徵(A)長度12個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQ ID NO6Gly Phe Xaa Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro1 5 10(2)序列號7的信息(i)序列特徵(A)長度16個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置2(D)其它信息/注＝「位置2上的X是N或D」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置3(D)其它信息/注＝「位置3上的X是P或E」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置6(D)其它信息/注＝「位置6上的X是T或L」(ix)特徵
(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置7(D)其它信息/注＝「位置7上的X是W或F」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置10(D)其它信息/注＝「位置10上的X是S或K」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置13(D)其它信息注＝「位置13上的X是V或T」(xi)序列描述SEQ ID NO7Pro Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Phe Ser1 5 10 15(2)序列號8的信息(i)序列特徵(A)長度11個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置2(D)其它信息/注＝「位置2上的X是Q或A」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置3(D)其它信息/注＝「位置3上的X是V或L」(ix)特徵
(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置11(D)其它信息/注＝「位置11上的X是G或A」(xi)序列描述SEQ ID NO8Asp Xaa Xaa Gln Pro Leu Xaa Phe Cys Gly Xaa1 5 10(2)序列號9的信息(i)序列特徵(A)長度19個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置7(D)其它信息/注＝「位置7上的X是Y或F」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置17(D)其它信息/注＝「位置17上的X是E或A」(xi)序列描述SEQ TD NO9Phe Val Glu Ser Gln Xaa Xaa Ala Arg Xaa Xaa Gly Xaa Gly Asp Phe1 5 10 15Xaa Lys Cys(2)序列號10的信息(i)序列特徵(A)長度6個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置4(D)其它信息/注＝「位置4上的X是A或E」(xi)序列描述SEQ ID NO10Asn Trp Thr Xaa Gly Phe1 5(2)序列號11的信息(i)序列特徵(A)長度6個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置3(D)其它信息/注＝「位置3上的X是F或Y」(xi)序列描述SEQ ID NO11Asp Lys Xaa Tyr Gly Thr1 5(2)序列號12的信息(i)序列特徵(A)長度7個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置5(D)其它信息/注＝「位置5上的X是F或Y」(xi)序列描述SEQ ID NO12Asp Leu Asp Lys Xaa Tyr Gly1 5(2)序列號13的信息(i)序列特徵(A)長度5個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置4(D)其它信息/注＝「位置4上的X是A或E」(xi)序列描述SEQ ID NO13Gly Asp Phe Xaa Lys1 5(2)序列號14的信息(i)序列特徵(A)長度6個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置3(D)其它信息/注＝「位置3上的X是N或H」(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞修飾位點(B)位置4(D)其它信息/注＝「位置4上的X是I或L」xi)序列描述SEQ ID NO14Gln Val Xaa Xaa Ile Gln1 5(2)序列號15的信息(i)序列特徵(A)長度26鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「有義引物」(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO15CCCAAGCTTA AYTGGACNGM NGGNTT(2)序列號16的信息(i)序列特徵(A)長度23鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「反義引物」(iv)反義有(xi)序列描述SEQ ID NO16CCCAAGCTTG AYAARTWYGG NAC(2)序列號17的信息(i)序列特徵(A)長度27鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「反義引物」(iv)反義有(xi)序列描述SEQ ID NO17GCTCTAGACR TARWAYTTRT CNARRTC(2)序列號18的信息(i)序列特徵(A)長度25鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「反義引物」(iv)反義有(xi)序列描述SEQ ID NO18GCTCTAGACA YTTNKCRAAR TCNCC(2)序列號19的信息(i)序列特徵(A)長度26鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「有義引物」(iv)反義無(xi)序列描述SEQ ID NO19CCCAAGCTTC ARGTNMAYMT NATHCA(2)序列號20的信息(i)序列特徵(A)長度27鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「反義引物」(iv)反義有(xi)序列描述SEQ ID NO20GCTCTAGACR AANCCNKCNG TCCARTT(2)序列號21的信息(i)序列特徵(A)長度1501鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(vi)來源(A)微生物平田頭菇(B)菌株CBS 900.96(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置17..1375(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞信號-肽(sig-peptide)
(B)位置17..94(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞成熟-肽(mat-peptide)(B)位置95..1375(xi)序列描述SEQ ID NO21GGATCCGAAT TCACTT ATG TCC CTC TTC ATC GGC GGC TGT TTG CTC GTG 49Met Ser Leu Phe Ile Gly Gly Cys Leu Leu Val-26 -25 -20TTT TTA CAG GCG AGC GCA TAC GGC GGC GTC GTG CAG GCC ACA TTC GTG97Phe Leu Gln Ala Ser Ala Tyr Gly Gly Val Val Gln Ala Thr Phe Val-15 -10 -5 1CAG CCG TTT TTC CCT CCA CAG ATT CAG GAC TCT TGG GCA GCT TAT ACA 145Gln Pro Phe Phe Pro Pro Gln Ile Gln Asp Ser Trp Ala Ala Tyr Thr5 10 15CCA TAT TAT CCT GTT CAG GCG TAC ACG CCT CCC CCG AAG GAT TGC AAG 193Pro Tyr Tyr Pro Val Gln Ala Tyr Thr Pro Pro Pro Lys Asp Cys Lys20 25 30ATC ACA CAA GTT AAC ATT ATT CAA CGA CAT GGT GCC CGC TTT CCG ACA 241Ile Thr Gln Val Asn Ile Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Phe Pro Thr35 40 45TCG GGG GCA GGC ACA AGG ATC CAA GCA GCT GTG AAG AAG CTT CAA TCA 289Ser Gly Ala Gly Thr Arg Ile Gln Ala Ala Val Lys Lys Leu Gln Ser50 55 60 65GCT AAA ACC TAT ACG GAT CCT CGT CTC GAC TTT CTG ACC AAC TAT ACC 337Ala Lys Thr Tyr Thr Asp Pro Arg Leu Asp Phe Leu Thr Asn Tyr Thr70 75 80TAT ACC CTT GGT CAC GAC GAT CTC GTA CCG TTT GGA GCG CTT CAA TCA 385Tyr Thr Leu Gly His Asp Asp Leu Val Pro Phe Gly Ala Leu Gln Ser85 90 95TCA CAA GCT GGA GAG GAA ACG TTT CAA CGA TAC TCG TTT CTG GTG TCC 433Ser Gln Ala Gly Glu Glu Thr Phe Gln Arg Tyr Ser Phe Leu Val Ser100 105 110AAA GAG AAC TTA CCT TTT GTA AGA GCT TCG AGT TCC AAT CGA GTC GTC 481Lys Glu Asn Leu Pro Phe Val Arg Ala Ser Ser Ser Asn Arg Val Val115 120 125GAC TCA GCT ACC AAC TGG ACG GAA GGT TTT TCT GCG GCC AGT CAC CAC 529Asp Ser Ala Thr Asn Trp Thr Glu Gly Phe Ser Ala Ala Ser His His130 135 140 145GTC TTG AAT CCC ATT CTC TTT GTA ATC CTC TCA GAA AGT CTC AAT GAC 577Val Leu Asn Pro Ile Leu Phe Val Ile Leu Ser Glu Ser Leu Asn Asp150 155 160ACG CTT GAC GAT GCC ATG TGC CCT AAC GCG GGC TCC TCC GAC CCG CAG 625Thr Leu Asp Asp Ala Met Cys Pro Asn Ala Gly Ser Ser Asp Pro Gln165 170 175ACT GGT ATC TGG ACC TCG ATA TAC GGG ACG CCT ATT GCC AAC CGA CTA 673Thr Gly Ile Trp Thr Ser Ile Tyr Gly Thr Pro Ile Ala Asn Arg Leu180 185 190AAT CAG CAG GCT CCG GGT GCA AAT ATT ACA GCT GCC GAT GTG TCG AAC 721Asn Gln Gln Ala Pro Gly Ala Asn Ile Thr Ala Ala Asp Val Ser Asn195 200 205CTT ATA CCG CTT TGC GCA TTC GAG ACG ATA GTA AAG GAG ACG CCA AGT 769Leu Ile Pro Leu Cys Ala Phe Glu Thr Ile Val Lys Glu Thr Pro Ser210 215 220 225CCT TTC TGT AAT TTG TTC ACC CCC GAA GAG TTC GCA CAG TTT GAA TAT817Pro Phe Cys Asn Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Ala Gln Phe Glu Tyr230 235 240TTC GGT GAC CTG GAC AAG TTC TAT GGG ACA GGT TAT GGA CAA CCG TTA865Phe Gly Asp Leu Asp Lys Phe Tyr Gly Thr Gly Tyr Gly Gln Pro Leu245 250 255GGA CCT GTG CAA GGT GTC GGC TAC ATC AAT GAA CTT CTT GCC CGA CTC913Gly Pro Val Gln Gly Val Gly Tyr Ile Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu260 265 270ACA GAA ATG CCA GTT CGA GAT AAC ACC CAG ACG AAC AGG ACA CTC GAC961Thr Glu Met Pro Val Arg Asp Asn Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp275 280 285TCT TCT CCG CTT ACA TTT CCC CTC GAC CGC AGT ATC TAC GCT GAC CTC 1009Ser Ser Pro Leu Thr Phe Pro Leu Asp Arg Ser Ile Tyr Ala Asp Leu290 295 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Ser Asn Arg Val Val Asp Ser Ala Thr Asn120 125 130Trp Thr Glu Gly Phe Ser Ala Ala Ser His His Val Leu Asn Pro Ile135 140 145 150Leu Phe Val Ile Leu Ser Glu Ser Leu Asn Asp Thr Leu Asp Asp Ala155 160 165Met Cys Pro Asn Ala Gly Ser Ser Asp Pro Gln Thr Gly Ile Trp Thr170 175 180Ser Ile Tyr Gly Thr Pro Ile Ala Asn Arg Leu Asn Gln Gln Ala Pro185 190 195Gly Ala Asn Ile Thr Ala Ala Asp Val Ser Asn Leu Ile Pro Leu Cys200 205 210Ala Phe Glu Thr Ile Val Lys Glu Thr Pro Ser Pro Phe Cys Asn Leu215 220 225 230Phe Thr Pro Glu Glu Phe Ala Gln Phe Glu Tyr Phe Gly Asp Leu Asp235 240 245Lys Phe Tyr Gly Thr Gly Tyr Gly Gln Pro Leu Gly Pro Val Gln Gly250 255 260Val Gly Tyr Ile Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Glu Met Pro Val265 270 275Arg Asp Asn Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ser Ser Pro Leu Thr280 285 290Phe Pro Leu Asp Arg Ser Ile Tyr Ala Asp Leu Ser His Asp Asn Gln295 300 305 310Met Ile Ala Ile Phe Ser Ala Met Gly Leu Phe Asn Gln Ser Ser Pro315 320 325Leu Asp Pro Ser Phe Pro Asn Pro Lys Arg Thr Trp Val Thr Ser Arg330 335 340Leu Thr Pro Phe Ser Ala Arg Met Val Thr Glu Arg Leu Leu Cys Gln345 350 355Arg Asp Gly Thr Gly Ser Gly Gly Pro Ser Arg Ile Met Arg Asn Gly360 365 370Asn Val Gln Thr Phe Val Arg Ile Leu Val Asn Asp Ala Leu Gln Pro375 380 385 390Leu Lys Phe Cys Gly Gly Asp Met Asp Ser Leu Cys Thr Leu Glu Ala395 400 405Phe Val Glu Ser Gln Lys Tyr Ala Arg Glu Asp Gly Gln Gly Asp Phe410 415 420Glu Lys Cys Phe Asp425(2)序列號23的信息(i)序列特徵(A)長度1593鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(vi)來源(A)微生物Peniophora lycii(B)菌株CBS 686.96(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞信號-肽(sig-peptide)(B)位置123..212(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞成熟-肽(mat-peptide)(B)位置213..1439(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置123..1439(xi)序列描述SEQ ID NO23GGATCCGAAT TCCATCTTCT GCTCTGACCT CCATCTCGCT GAGCGGCCGA CGAGAACCTA60GGGGCTCTAA GTCCACGTAC TATCGCCGCG CCTGTGAAGG CCCCATACCA GCCCTTATCG 120AT ATG GTT TCT TCG GCA TTC GCA CCT TCC ATC CTA CTT AGC TTG ATG 167Met Val Ser Ser Ala Phe Ala Pro Ser Ile Leu Leu Ser Leu Met-30 -25 -20TCG AGT CTT GCT TTG AGC ACG CAG TTC AGC TTT GTT GCG GCG 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Ser Asp Pro Gln Val Asp Ala Trp175 180 185Leu Ala Ser Ala Phe Pro Ser Val Thr Ala Gln Leu Asn Ala Ala Ala190 195 200 205Pro Gly Ala Asn Leu Thr Asp Ala Asp Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu210 215 220Cys Pro Phe Met Thr Val Ser Lys Glu Gln Lys Ser Asp Phe Cys Thr225 230 235Leu Phe Glu Gly Ile Pro Gly Ser Phe Glu Ala Phe Ala Tyr Ala Gly240 245 250Asp Leu Asp Lys Phe Tyr Gly Thr Gly Tyr Gly Gln Ala Leu Gly Pro255 260 265Val Gln Gly Val Gly Tyr Ile Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Asn270 275 280 285Ser Ala Val Asn Asp Asn Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ala Ala290 295 300Pro Asp Thr Phe Pro Leu Asn Lys Thr Met Tyr Ala Asp Phe Ser His305 310 315Asp Asn Leu Met Val Ala Val Phe Ser Ala Met Gly Leu Phe Arg Gln320 325 330Ser Ala Pro Leu Ser Thr Ser Thr Pro Asp Pro Asn Arg Thr Trp Leu335 340 345Thr Ser Ser Val Val Pro Phe Ser Ala Arg Met Ala Val Glu Arg Leu350 355 360 365Ser Cys Ala Gly Thr Thr Lys Val Arg Val Leu Val Gln Asp Gln Val370 375 380Gln Pro Leu Glu Phe Cys Gly Gly Asp Gln Asp Gly Leu Cys 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AAT CAG GTC CAC ATC ATC CAA CGT CAT GGT 303Pro Ala Ser Cys Gln Ile Asn Gln Val His Ile Ile Gln Arg His Gly45 50 55GCA CGC TTT CCC ACG TCT GGC GCA GCA AAG CGC ATC CAG ACA GCA GTA 351Ala Arg Phe Pro Thr Ser Gly Ala Ala Lys Arg Ile Gln Thr Ala Val60 65 70GCG AAG CTG AAG GCC GCG TCC AAC TAC ACC GAT CCC CTG CTC GCG TTC 399Ala Lys Leu Lys Ala Ala Ser Asn Tyr Thr Asp Pro Leu Leu Ala Phe75 80 85 90GTT ACG AAC TAC ACC TAC AGC TTA GGT CAG GAC AGC CTC GTT GAA CTC 447Val Thr Asn Tyr Thr Tyr Ser Leu Gly Gln Asp Ser Leu Val Glu Leu95 100 105GGT GCG ACT CAG TCC TCC GAA GCG GGC CAG GAG GCA TTC ACG CGG TAC 495Gly Ala Thr Gln Ser Ser Glu Ala Gly Gln Glu Ala Phe Thr Arg Tyr110 115 120TCA TCC CTC GTG AGC GCG GAC GAG CTT CCC TTC GTT CGG GCG TCG GGC 543Ser Ser Leu Val Ser Ala Asp Glu Leu Pro Phe Val Arg Ala Ser Gly125 130 135TCA GAT CGC GTC GTT GCG ACT GCC AAC AAC TGG ACT GCA GGT TTC GCG591Ser Asp Arg Val Val Ala Thr Ala Asn Asn Trp Thr Ala Gly Phe Ala140 145 150CTT GCG AGC TCA AAC AGC ATC ACG CCC GTG CTC TCA GTC ATC ATT TCC639Leu Ala Ser Ser Asn Ser Ile Thr Pro Val Leu Ser Val Ile Ile Ser155 160 165 170GAA GCG GGC AAT GAC ACC CTC GAC GAC AAC ATG TGC CCC GCT GCA GGC687Glu Ala Gly Asn Asp Thr Leu Asp Asp Asn Met Cys Pro Ala Ala Gly175 180 185GAT TCG GAT CCC CAG GTC AAT CAA TGG CTC GCG CAG TTC GCA CCG CCG735Asp Ser Asp Pro Gln Val Asn Gln Trp Leu Ala Gln Phe Ala Pro Pro190 195 200ATG ACT GCT CGC CTC AAC GCA GGC GCG CCC GGC GCG AAC CTC ACG GAC783Met Thr Ala Arg Leu Asn Ala Gly Ala Pro Gly Ala Asn Leu Thr Asp205 210 215ACG GAC ACC TAC AAC CTG CTC ACG CTA TGC CCG TTC GAG ACT GTA GCC831Thr Asp Thr Tyr Asn Leu Leu Thr Leu Cys Pro Phe Glu Thr Val Ala220 225 230ACC GAG CGG CGT AGT GAA TTC TGC GAC ATC TAC GAG GAG CTG CAG GCG879Thr Glu Arg Arg Ser Glu Phe Cys Asp Ile Tyr Glu Glu Leu Gln Ala235 240 245 250GAA GAC GCC TTC GCG TAC AAT GCC GAT CTC GAC AAG TTC TAC GGC ACT927Glu Asp Ala Phe Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Asp Lys Phe Tyr Gly Thr255 260 265GGA TAC GGC CAG CCC CTC GGA CCC GTG CAA GGC GTC GGG TAC ATC AAC975Gly Tyr Gly Gln Pro Leu Gly Pro Val Gln Gly Val Gly Tyr Ile Asn270 275 280GAG CTC ATC GCG CGC CTC ACC GCG CAG AAC GTG TCC GAC CAG ACG CAG 1023Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr Ala Gln Asn Val Ser Asp His Thr Gln285 290 295ACG AAC AGC ACA CTC GAC TCC TCG CCC GAG ACG TTC CCG CTG AAC CGG 1071Thr Asn Ser Thr Leu Asp Ser Ser Pro Glu Thr Phe Pro Leu Asn Arg300 305 310ACG CTC TAC GCG GAC TTC TCG CAC GAC AAC GAG ATG GTC GCG ATC TTC 1119Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn Gln Met Val Ala Ile Phe315 320 325 330TCG GCC ATG GGT CTC TTC AAC CAG TCC GCG CCG CTC GAC CCG ACG ACG 1167Ser Ala Met Gly Leu Phe Asn Gln Ser Ala Pro Leu Asp Pro Thr Thr335 340 345CCC GAC CCC GCG CGC ACG TTC CTC GTC AAG AAG ATC GTG CCG TTC TCC 1215Pro Asp Pro Ala Arg Thr Phe Leu Val Lys Lys Ile Val Pro Phe Ser350 355 360GCG CGC ATG GTC GTC GAG CGC CTC GAC TGC GGC GGT GCG CAG AGC GTG 1263Ala Arg Met Val Val Glu Arg Leu Asp Cys Gly Gly Ala Gln Ser Val365 370 375CGC CTG CTC GTG AAC GAC GCA GTG CAG CCG CTG GCG TTC TGC GGG GCG 1311Arg Leu Leu Val Asn Asp Ala Val Gln Pro Leu Ala Phe Cys Gly Ala380 385 390GAC ACG AGC GGG GTG TGC ACG CTG GAC GCG TTT GTC GAG AGC CAG GCG 1359Asp Thr Ser Gly Val Cys Thr Leu Asp Ala Phe Val Glu Ser Gln Ala395 400 405 410TAC GCG CGG AAC GAT GGC GAG GGC GAC TTC GAG AAG TGC TTC GCG ACA 1407Tyr Ala Arg Asn Asp Gly Glu Gly Asp Phe Glu Lys Cys Phe Ala Thr415 420 425TAGTTCCAGG TGTAGATACC CGGGGAAGAT GTACTCTCTA GACACCTCGC ATGTACTTAT 1467CGATTAGAAA GAGACCCTGG CTGCTCTGCC CTCAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAATTCC 1527TGCGGCCGC 1536(2)序列號30的信息(i)序列特徵(A)長度443個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO30Met Ala Phe Ser Ile Leu Ala Ser Leu Leu Phe Val Cys Tyr Ala Tyr-17 -15 -10 -5Ala Arg Ala Val Pro Arg Ala His Ile Pro Leu Arg Asp Thr Ser Ala1 5 10 15Cys Leu Asp Val Thr Arg Asp Val Gln Gln Ser Trp Ser Met Tyr Ser20 25 30Pro Tyr Phe Pro Ala Ala Thr Tyr Val Ala Pro Pro Ala Ser Cys Gln35 40 45Ile Asn Gln Val His Ile Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Phe Pro Thr50 55 60Ser Gly Ala Ala Lys Arg Ile Gln Thr Ala Val Ala Lys Leu Lys Ala65 70 75Ala Ser Asn Tyr Thr Asp Pro Leu Leu Ala Phe Val Thr Asn Tyr Thr80 85 90 95Tyr Ser Leu Gly Gln Asp Ser Leu Val Glu Leu Gly Ala Thr Gln Ser100 105 110Ser Glu Ala Gly Gln Glu Ala Phe Thr Arg Tyr Ser Ser Leu Val Ser115 120 125Ala Asp Glu Leu Pro Phe Val Arg Ala Ser Gly Ser Asp Arg Val Val130 135 140Ala Thr Ala Asn Asn Trp Thr Ala Gly Phe Ala Leu Ala Ser Ser Asn145 150 155Ser Ile Thr Pro Val Leu Ser Val Ile Ile Ser Glu Ala Gly Asn Asp160 165 170 175Thr Leu Asp Asp Asn Met Cys Pro Ala Ala Gly Asp Ser Asp Pro Gln180 185 190Val Asn Gln Trp Leu Ala Gln Phe Ala Pro Pro Met Thr Ala Arg Leu195 200 205Asn Ala Gly Ala Pro Gly Ala Asn Leu Thr Asp Thr Asp Thr Tyr Asn210 215 220Leu Leu Thr Leu Cys Pro Phe Glu Thr Val Ala Thr Glu Arg Arg Ser225 230 235Glu Phe Cys Asp Ile Tyr Glu Glu Leu Gln Ala Glu Asp Ala Phe Ala240 245 250 255Tyr Asn Ala Asp Leu Asp Lys Phe Tyr Gly Thr Gly Tyr Gly Gln Pro260 265 270Leu Gly Pro Val Gln Gly Val Gly Tyr Ile Asn Glu Leu Ile Ala Arg275 280 285Leu Thr Ala Gln Asn Val Ser Asp His Thr Gln Thr Asn Ser Thr Leu290 295 300Asp Ser Ser Pro Glu Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Leu Tyr Ala Asp305 310 315Phe Ser His Asp Asn Gln Met Val Ala Ile Phe Ser Ala Met Gly Leu320 325 330 335Phe Asn Gln Ser Ala Pro Leu Asp Pro Thr Thr Pro Asp Pro Ala Arg340 345 350Thr Phe Leu Val Lys Lys Ile Val Pro Phe Ser Ala Arg Met Val Val355 360 365Glu Arg Leu Asp Cys Gly Gly Ala Gln Ser Val Arg Leu Leu Val Asn370 375 380Asp Ala Val Gln Pro Leu Ala Phe Cys Gly Ala Asp Thr Ser Gly Val385 390 395Cys Thr Leu Asp Ala Phe Val Glu Ser Gln Ala Tyr Ala Arg Asn Asp400 405 410 415Gly Glu Gly Asp Phe Glu Lys Cys Phe Ala Thr420 425(2)序列號31的信息(i)序列特徵(A)長度276鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(vi)來源(A)微生物Schizophyllum sp.
(B)菌株CBS 443.97(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞混雜(misc-)特徵(B)位置1..276(D)其它信息/產物＝「由SEQ ID NOs 15和17產生的PCR片段」(xi)序列描述SEQ ID NO31TCTGCCGCAT CTGACGGTGT CTATAACCCC GTCCTCAACC TGATTATATC AGAAGAGCTT 60AACGACACCC TCGATGATGC GATGTGCCCG AACGTCGGCG AATCGGACGC CCAAACGGAC 120GAATGGACGT CTATTTACGC AGCGCCCATC GCTGAGCGTC TGAACAACAA CGCCGTGGGC 180GCTAACCTGA CCACCACGAA CGTTTACAAC CTCATGTCTT TATGCCCCTT CGACACGCTT 240GCGAAGGAGA CGCCGAGCCC CTTCTGCGAT CTCTTT 276(2)序列號32的信息(i)序列特徵(A)長度92個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內部(vi)來源(A)微生物Schizophyllum sp.
(B)菌株CBS 443.97(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞區域(B)位置1..92(D)其它信息/注＝「SEQ ID NO31的推定的胺基酸序列」Ser Ala Ala Ser Asp Gly Val Tyr Asn Pro Val Leu Asn Leu Ile Ile1 5 10 15Ser Glu Glu Leu Asn Asp Thr Leu Asp Asp Ala Met Cys Pro Asn Val20 25 30Gly Glu Ser Asp Ala Gln Thr Asp Glu Trp Thr Ser Ile Tyr Ala Ala35 40 45Pro Ile Ala Glu Arg Leu Asn Asn Asn Ala Val Gly Ala Asn Leu Thr50 55 60Thr Thr Asn Val Tyr Asn Leu Met Ser Leu Cys Pro Phe Asp Thr Leu65 70 75 80Ala Lys Glu Thr Pro Ser Pro Phe Cys Asp Leu Phe85 90
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權利要求
1.分離的多肽，其表現出肌醇六磷酸酶活性並衍生自擔子菌類群。
2.分離的多肽，其表現出肌醇六磷酸酶活性並包括至少一個下列胺基酸序列P-[Y/F]-[F/Y]-P-X-X-X-Y-X-X-P-P(SEQ ID NO1)Q-V-[N/H]-[I-L]-I-Q-R-H-G-A-R-[F/W]-P-T-S-G-A(SEQ ID NO2)I-Q-R-H-G-A-R-[F/W]-P-T-S-G-A-X-X-R(SEQ ID NO3)R-V-V-[D/A]-[S/T]-[A/S]-[T/N]-N-W-T-[A/E]-G-F(SEQ ID NO4)N-W-T-[A/E]-G-F-X-X-A-S(SEQ ID NO5)G-F-X-X-A-S-X-X-X-X-X-P(SEQ ID NO6)P-[N/D]-[P/E]-X-R-[T/L]-[W/F]-X-X-[S/K]-X-X-[V/T]-P-F-S(SEQ ID NO7)D-[Q/A]-[V/L]-Q-P-L-X-F-C-G-[G/A](SEQ ID NO8)F-V-E-S-Q-X-[Y/F]-A-R-X-X-G-X-G-D-F-[E/A]-K-C(SEQ ID NO9)N-W-T-[A/E]-G-F(SEQ ID NO10)D-K-[F/Y]-Y-G-T(SEQ ID NO11)D-L-D-K-[F/Y]-Y-G(SEQ ID NO12)G-D-F-[A/E]-K(SEQ ID NO13)Q-V-[N/H]-[I/L]-I-Q(SEQ ID NO14)其中「X」代表任何胺基酸。
3.根據權利要求2的多肽，包括下列胺基酸序列中的至少一個，參考圖7的序列對比，並使用相應於phyA_P_lycii的編號(SEQ ID NO1)從位置46到57(SEQ ID NO2)從位置64到80(SEQ ID NO3)從位置68到83(SEQ ID NO4)從位置155到167(SEQ ID NO5)從位置162到171(SEQ ID NO6)從位置166到177(SEQ ID NO7)從位置358到373(SEQ ID NO8)從位置395到405(SEQ ID NO9)從位置415到433(SEQ ID NO10)從位置162到167(SEQ ID NO11)從位置273到278(SEQ ID NO12)從位置271到277(SEQ ID NO13)從位置428到432(SEQ TD NO14)從位置64到69
4.根據權利要求3的多肽，包括下列胺基酸序列對中的至少一個(SEQ ID NO10)和(SEQ ID NO12)(SEQ ID NO10)和(SEQ ID NO13)(SEQ ID NO14)和(SEQ ID NO10)(SEQ ID NO14)和(SEQ ID NO12)(SEQ ID NO14)和(SEQ ID NO13)(SEQ ID NO11)和(SEQ ID NO13)
5.根據權利要求1-4任一項的多肽，包括滿足下列條件中的一個或多個的胺基酸序列，參考圖7的序列對比並使用相應於phyA_P_lycii的編號(a)有P46和P57之間的10個胺基酸殘基；(b)有F167和P177之間的9個胺基酸殘基；(c)有P177和N188之間的10個胺基酸殘基；(d)有C196和D203之間的6個胺基酸殘基；(e)有L353和P371之間的17個胺基酸殘基。
6.表現肌醇六磷酸酶活性和由一個DNA序列編碼的分離的多肽，該DNA序列在中到高度嚴緊條件下與用任何適當的特異性引物所得的PCR反應產物雜交，其中引物衍生自圖6的序列對比。
7.根據權利要求6的多肽，其中引物對由一個有義引物和反義引物組成，這些引物選自5′-CCC AAG CTT AAY TGG ACN GMN GGN TT-3′(SEQ ID NO15)作為有義引物；5′-CCC AAG CTT GAY AAR TWY GGN AC-3′(SEQ ID NO16)作為有義引物；5′-GCT CTA GAC RTA RWA YTT RTC NAR RTC-3′(SEQ ID NO17)作為反義引物；5′-GCT CTA GAC AYT TNK CRA ART CNC C-3′(SEQ ID NO18)作為反義引物；5′-CCC AAG CTT CAR GTN MAY MTN ATH CA-3′(SEQ ID NO19)作為有義引物；5′-GCT CTA GAC RAA NCC NKC NGT CCA RTT-3′(SEQ ID NO20)作為反義引物，其中N代表A，C，G，T中的任一個；R代表A和G中任何一個；Y代表C和T中任何一個；M代表A和C中任何一個；以及W代表A和T中任何一個；
8.根據權利要求6-7中任何一個的多肽，其中引物對選自包括下列配對(SEQ ID NO15)和(SEQ ID NO17)(SEQ ID NO15)和(SEQ ID NO18)(SEQ ID NO19)和(SEQ ID NO20)(SEQ ID NO19)和(SEQ ID NO17)(SEQ ID NO19)和(SEQ ID NO18)(SEQ ID NO16)和(SEQ ID NO18)
9.表現肌醇六磷酸酶活性的分離的多肽，其為真菌6-肌醇六磷酸酶。
10.根據權利要求1-8中任一項的多肽，其為(3-6)-肌醇六磷酸酶。
11.分離的多肽，其表現出肌醇六磷酸酶活性並包括SEQ ID NO 22的胺基酸序列或與此序列至少有50％同源性的胺基酸。
12.分離的多肽，其表現出肌醇六磷酸酶活性並包括SEQ ID NO.22的從胺基酸no.25、27、28或31到453的胺基酸序列或與這些序列中任一個至少有50％同源性的胺基酸序列。
13.表現出肌醇六磷酸酶活性並由編碼肌醇六磷酸酶的部分所編碼的分離的多肽，這些編碼部分為i)SEQ ID NO 21，或ii)克隆到存在於大腸桿菌DSM 11313中的質粒pYES 2.0中的DNA序列，或其與所說的多肽至少有50％同源性的類似物或衍生物。
14.表現出肌醇六磷酸酶活性的並包括SEQ ID NO 24的胺基酸序列或與該序列有至少50％同源性的胺基酸序列的分離的多肽。
15.表現出肌醇六磷酸酶活性的並包括SEQ ID NO 24的胺基酸號31到439的胺基酸序列或與此序列至少有50％同源性的胺基酸序列的分離的多肽。
16.表現出肌醇六磷酸酶活性的並由編碼肌醇六磷酸酶的部分所編碼的分離的多肽，這些編碼部分為i) SEQ ID NO 23，或ii)克隆到存在於大腸桿菌DSM 11312中的質粒pYES 2.0中的DNA序列，或其與所說的多肽至少有50％同源性的類似物或衍生物。
17.表現出肌醇六磷酸酶活性的並包括SEQ ID NO 26胺基酸序列或與該序列至少有50％同源性的胺基酸序列的分離的多肽。
18.表現出肌醇六磷酸酶活性的並由編碼肌醇六磷酸酶的部分所編碼的分離的多肽，這些編碼部分為i)SEQ ID NO 25，或ii)克隆到存在於大腸桿菌11842中的質粒pYES 2.0中的DNA序列，或其與所說的多肽至少有50％同源性的類似物或衍生物。
19.表現出肌醇六磷酸酶活性並包括SEQ ID NO 28的胺基酸序列或與此序列至少有50％同源性的胺基酸序列的分離的多肽。
20.表現出肌醇六磷酸酶活性並由編碼肌醇六磷酸酶的部分所編碼的分離的多肽，這些編碼部分為i) SEQ ID NO 27，或ii)克隆到存在於大腸桿菌DSM11843中的質粒pYES 2.0中的DNA序列，或者其與所說的多肽有至少50％同源性的類似物或衍生物。
21.表現出肌醇六磷酸酶活性並包括SEQ ID NO 30的胺基酸序列或與此序列至少有50％同源性的胺基酸序列的分離的多肽。
22.表現出肌醇六磷酸酶活性並由編碼肌醇六磷酸酶的部分所編碼的多肽，這些編碼部分為i) SEQ ID NO 29，或ii)克隆到存在於大腸桿菌DSM11844中的質粒pYES 2.0中的DNA序列，或其與所說的多肽有至少50％同源性的類似物或衍生物
23.編碼根據權利要求1-22中任一項的多肽的DNA分子。
24.編碼表現出肌醇六磷酸酶活性的多肽並含有下列DNA序列中至少一個的DNA分子5′-CCC AAG CTT AAY TGG ACN GMN GGN TT-3′(SEQ ID NO15)5′-CCC AAG CTT GAY AAR TWY GGN AC-3′(SEQ ID NO16)5′-GCT CTA GAC RTA RWA YTT RTC NAR RTC-3′(SEQ ID NO17)5′-GCT CTA GAC AYT TNK CRA ART CNC C-3′(SEQ ID NO18)5′-CCC AAG CTT CAR GTN MAY MTN ATH CA-3′(SEQ ID NO19)5′-GCT CTA GAC RAA NCC NKC NGT CCA RTT-3′(SEQ ID NO20)其中N代表A，C，G，T中的任一個；R代表A和G中的任一個；Y代表C和T中的任一個；M代表A和C中的任一個；以及W代表A和T中的任一個。
25.編碼表現出肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA分子，其具有選自下列的DNA序列(a)SEQ ID NOs21、23、25、27或29中任一個的編碼肌醇六磷酸酶的部分；(b)克隆到存在於大腸桿菌DSM 11313、11312、11842、11843或11844任一個中的質粒pYES 2.0中的編碼肌醇六磷酸酶的部分；(c)(a)或(b)中所確定的DNA序列的類似物，其與所說DNA序列至少有55％同源性；(d)能與(a)或(b)的序列在低嚴緊條件下雜交的DNA序列；(e)由於遺傳密碼的簡併性而不與(a)或(b)的序列雜交，但編碼包括SEQ ID NOs.22、24、26、28或30中任一所示的胺基酸序列的多肽或其片段的DNA序列。
26.編碼表現肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA分子，該DNA分子在中度/高度嚴緊條件下可與使用任何衍生自圖6的序列對比的合適的特定引物對或權利要求7或8中的引物對所得的PCR反應產物雜交。
27.適用於PCR反應並衍生自圖6的序列對比的特定引物。
28.根據權利要求27的引物，其選自5′-CCC AAG CTT AAY TGG ACN GMN GGN TT-3′(SEQ ID NO15)5′-CCC AAG CTT GAY AAR TWY GGN AC-3′(SEQ ID NO16)5′-GCT CTA GAC RTA RWA YTT RTC NAR RTC-3′(SEQ ID NO17)5′-GCT CTA GAC AYT TNK CRA ART CNC C-3′(SEQ ID NO18)5′-CCC AAG CTT CAR GTN MAY MTN ATH CA-3′(SEQ ID NO19)5′-GCT CTA GAC RAA NCC NKC NGT CCA RTT-3′(SEQ ID NO20)其中N代表A，C，G，T中任一個；R代表A和G中任一個；Y代表C和T中任一個；M代表A和C中的任一個；以及W代表A和T中任一個。
29.包括根據權利要求23-26中任一項的DNA分子的載體。
30.包括根據權利要求23-26中任一項的DNA分子或根據權利要求29的載體的宿主細胞。
31.鑑定產生肌醇六磷酸酶的細胞的方法，包括以下步驟i)選擇細胞以提供模板；ii)根據圖6的序列對比選擇適於PCR的特定引物對；iii)用所說引物在該模板上進行PCR反應以得到衍生自所說模板的擴增的PCR片段；iv)確證該PCR片段是特異性的；以及v)鑑定提供該模板的細胞作為肌醇六磷酸酶產生者。
32.根據權利要求31的方法，其中的引物對由選自下列的一個有義引物和一個反義引物組成5′-CCC AAG CTT AAY TGG ACN GMN GGN TT-3′(SEQ ID NO15)為有義引物；5′-CCC AAG CTT GAY AAR TWY GGN AC-3′(SEQ ID NO16)為有義引物；5′-GCT CTA GAC RTA RWA YTT RTC NAR RTC-3′(SEQ ID NO17)為反義引物；5′-GCT CTA GAC AYT TNK CRA ART CNC C-3′(SEQ ID NO18)為反義引物；5′-CCC AAG CTT CAR GTN MAY MTN ATH CA-3′(SEQ ID NO19)化為有義引物；5′-GCT CTA GAC RAA NCC NKC NGT CCA RTT-3′(SEQ ID NO20)化為反義引物，其中N代表A，C，G，T中任一個；R代表A和G中的任一個；Y代表C和T中的任一個；M代表A和C中的任一個；以及W代表A和T中的任一個。
33.根據權利要求32的方法，其中引物對選自下列配對(SEQ ID NO15)和(SEQ ID NO17)(SEQ ID NO15)和(SEQ ID NO18)(SEQ ID NO19)和(SEQ ID NO20)(SEQ ID NO19)和(SEQ ID NO17)(SEQ ID NO19)和(SEQ ID NO18)(SEQ ID NO16)和(SEQ ID NO18)
34.製備表現肌醇六磷酸酶活性的多肽的方法，該方法包括下列步驟a)用權利要求31-33中任一項的方法鑑定產生肌醇六磷酸酶的細胞；或b)實施步驟a)並從所說的產生肌醇六磷酸酶的細胞中克隆編碼肌醇六磷酸酶的DNA分子並用所說的DNA分子轉化宿主細胞；或c)用根據權利要求31-33中任一項的方法所得的擴增的PCR片段作為雜交探針來分離編碼肌醇六磷酸酶多肽的DNA分子，並用所說的DNA分子來轉化宿主細胞；以及d)將上述a)、b)或c)所得的細胞在允許多肽產生的條件下培養並從培養肉湯中回收多肽。
35.製備表現肌醇六磷酸酶活性的多肽的方法，該方法包括將根據權利要求30的宿主細胞在允許多肽產生的條件下進行培養，並從培養肉湯中回收多肽。
36.包含權利要求1-22中任一項的至少一種多肽或根據權利要求33-34中任一項的可獲得的至少一種多肽的飼料或食物。
37.製備根據權利要求36的飼料或食物的方法，其中將至少一種多肽加到食物或飼料組分中。
38.包含權利要求1-22中任一項的至少一種多肽或至少一種根據權利要求33-34中任一項可得的多肽的組合物。
39.根據權利要求38的適用於食品或飼料製品的組合物。
40.根據權利要求38-39中任一項的組合物，其作為動物飼料添加劑。
41.減少動物糞尿中肌醇六磷酸的水平的方法，包括用有效量的根據權利要求36的飼料或根據權利要求37的可得到的飼料對動物進行餵養。
42.權利要求1-22中任一項的多肽或根據權利要求34-35中任一項可獲得的多肽或者權利要求38-39中任一項組合物 用於將三價磷從肌醇六磷酸酶底物中釋放出來的用途。
43.根據權利要求1-22中任一項的多肽；或者根據權利要求34-35中任一項可獲得的多肽；或者根據權利要求38-39中任一項的可獲得的組合物用於改進食物或飼料的利用的用途。
全文摘要
本發明涉及具肌醇六磷酸酶活性的分離的多肽,相應的克隆的DNA序列,製備這種多肽的方法,以及其在許多工業應用中的用途。尤其是,本發明涉及衍生自擔子菌類群的肌醇六磷酸酶、特定共有序列的肌醇六磷酸酶和真菌6－肌醇六磷酸酶。
文檔編號C12N9/16GK1240477SQ97180793
公開日2000年1月5日 申請日期1997年12月15日 優先權日1996年12月20日
發明者索倫·F·拉森, 利斯貝思·貝克, 安德斯·奧曼, 詹斯·布雷恩霍爾特, 克勞斯·C·富格爾桑 申請人:諾沃挪第克公司